Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Nuclei Isolation fra hele vevet ved hjelp av et vaskemiddel og enzymfri metode

doi: 10.3791/61471 Published: June 24, 2020

Summary

Enkeltkjerner isolasjon er avhengig av dissosiasjon og vaskemiddel-basert permeabilisering av cellemembranen, trinn som trenger optimalisering og er utsatt for å innføre tekniske artefakter. Vi demonstrerer et vaskemiddel og enzymfri protokoll for rask isolering av intakte kjerner direkte fra hele vev, noe som gir kjerner egnet for enkeltkjerne RNA-seq (snRNA-Seq) eller ATAC-seq.

Abstract

Transkripsjon av høy gjennomstrømning og epigenomprofilering krever fremstilling av en enkelt celle eller enkelt kjernesuspensjon. Utarbeidelse av suspensjon med intakt celle eller kjerner innebærer dissosiasjon og permeabilisering, trinn som kan introdusere uønsket støy og uønsket skade. Spesielt er visse celletyper som nevroner utfordrende å ta avstand til individuelle celler. I tillegg krever permeabilisering av cellulær membran for å frigjøre kjerner optimalisering ved prøving og feiling, noe som kan være tidkrevende, arbeidsintensiv og økonomisk ikke levedyktig. For å forbedre robustheten og reproduserbarheten til prøveforberedelsen for sekvensering av høy gjennomstrømning, beskriver vi en rask enzym- og vaskemiddelfri kolonnebasert isolasjonsmetode for kjerner. Protokollen muliggjør effektiv isolering av kjerner fra hele sebrafiskhjernen innen 20 minutter. De isolerte kjerner viser intakt kjernefysisk morfologi og lav tilbøyelighet til å aggregere. Videre, flow cytometri tillater kjerneberikelse og klaring av cellulære rusk for nedstrøms bruk. Protokollen, som skal fungere på bløtvev og kultiverte celler, gir en enkel og tilgjengelig metode for prøveforberedelse som kan brukes til høygjennomstrømningprofilering, noe som forenkler trinnene som kreves for vellykkede enkeltkjerne RNA-seq- og ATAC-seq-eksperimenter.

Introduction

Encellede RNA-seq (scRNA-Seq) og ATAC-seq er allsidige verktøy for å studere komplekse biologiske systemer ved encellet oppløsning. De er mye brukt til å definere celleundertyper og stater, gennettverk og for å vurdere cellulær heterogenitet. En forutsetning for å utføre scRNA-seq er utarbeidelsen av en enkelt cellesuspensjon ved vevsdissosiasjon. På grunn av variasjonen i den ekstracellulære matrisesammensetningen og mekaniske egenskaper, krever individuelle vev optimalisering av dissosiasjonsprotokollen for fremstilling av enkeltcellesuspensjon.

Dissosiasjon av vev i enkeltceller innebærer vanligvis behandling med fordøyelsesenzymer, inkludert kollagenasje, dispase eller trypsin, ved 37 °C1,,2,,3,,4. Som transkripsjonsmaskiner forblir aktive ved 37 °C, kan enzymatisk dissosiasjon introdusere mRNA-uttrykksartefakter og støy5,,6. Spesielt kan langvarig inkubasjon indusere stressresponsive gener og varmesjokkrespons på en ikke-ensartet måte - noe som fører til teknisk variasjon i eksperimentet7.

En annen ulempe med å generere en enkelt celle suspensjon er vanskeligheten med å skaffe levedyktige og intakte celletyper med komplekse morfologier. Spesielt er nevroner, adicytter og podocytes utfordrende å isolere8,9,10,11. For eksempel viste Wu og kolleger fraværet av glomerulære podocytes i scRNA-profiler fra en voksen mus nyre12. Lignende ikke-til-noen observasjoner er gjort om utvinning av sammenkoblede nevroner fra hjernevev8,13,14. I sum kan dissosiasjonsprotokoller introdusere deteksjonsbias mot lettere å dissosiere celletyper, noe som fører til en feilaktig fremstilling av organets cellulære arkitektur.

For å overvinne den tekniske støyen og skjevheten som ble introdusert under prøveforberedelse i scRNA-Seq., gir isolasjon og profilering av kjernen et attraktivt alternativ. Som kjernefysisk morfologi er lik mellom forskjellige celletyper, omgår isolasjon av kjernene spørsmålet om å isolere intakte og levedyktige celler med komplekse morfologier. For eksempel demonstrerte Wu og kolleger vellykket profilering av glomerulære podocytes med single-nucleus RNA-Seq. (snRNA-Seq.) av en voksen mus nyre, som manglet fra scRNA-Seq12. Spennende, komparative studier mellom encellede og enkjerne RNA-seq har antydet en reduksjon i induksjon av stress og varmesjokk respons gener med snRNA-Seq12. Studiene tyder videre på en høy korrelasjon mellom genene som oppdages av de to metodene. Imidlertid klarte en nylig studie på menneskelig mikroglia ikke å oppdage genetisk aktivering i Alzheimers sykdom15. Dermed i visse sammenhenger, er snRNA-Seq et egnet alternativ for scRNA-Seq16,17. I tillegg kan kjernefysisk isolasjon brukes for encellede ATAC-Seq., som gir informasjon om regionene for åpen kromatin i individuelle celler.

Protokollen for nuklei isolasjon innebærer tre hovedtrinn: i) vaskemiddelbasert lysis av cellemembran for å frigjøre kjernen; ii) vev homogenisering ved hjelp av en Dounce homogenisator; og iii) berikelse av kjerner og fjerning av celleavfall ved hjelp av gradient sentrifugering eller strømning cytometri18,,19,,20,,21,,22. Blant dette er de to første trinnene avhengig av vevstypen og må empirisk optimaliseres. Mildt vaskemiddel fører til delvis brudd på cellemembran og ineffektiv gjenfinning av kjerner fra vevet23. På den annen side fører høyt nivå av vaskemiddel og hard homogenisering til brudd på atommembranen og deres tap24,25. Sprukket kjerner har videre en tendens til å klumpe seg sammen og danne aggregater, noe som hvis ikke fjernes kan føre til gjenstander i nedstrøms profileringseksperimentet.

For å omgå problemene knyttet til rengjøringsmiddeloptimalisering for nukleisolasjon, introduserer vi en protokoll for å isolere intakte kjerner fra friske prøver ved hjelp av en vaskemiddelfri og spin-kolonnebasert metode. Protokollen gir kjerner fra hele orgelet innen 20 minutter, noe som begrenser induksjonen av artefaktiv transkripsjon. De isolerte kjernene kan berikes med FACS for single-nuclei RNA-Seq. og ATAC-seq, noe som gir en enkel og universell metode som muliggjør robust og reproduserbar høygjennomstrømningprofilering.

Protocol

Alle prosedyrene som presenteres nedenfor ble utført i samsvar med institusjonelle (Université Libre de Bruxelles (ULB)) og nasjonale etiske og dyrevelferdsretningslinjer og regulering, som ble godkjent av den etiske komiteen for dyrevelferd (CEBEA) fra Université Libre de Bruxelles (protokoller 578N-579N).

1. Forberedelse før vevsdisseksjon

  1. Forbered 0,2% Tricaine løsning i PBS for å euthanizing sebrafisk. Avkjøl løsningen på is.
  2. Forbered en 30 mm petriskål for å hakke vevet.
  3. Forbered iskald 1x PBS (10 ml per vevsprøve).
  4. Avkjøl sentrifugen til 4 °C.
  5. For nuklei isolasjon, bruk et vaskemiddelfritt nuklei isolasjonssett (Tabell over materialer).
  6. Før du starter protokollen, pre-chill buffer A og B gitt i settet ved å plassere dem på is i minst 30 minutter før kjernei isolasjon.
  7. For håndtering av de isolerte kjernene, belegge plastreagenser som rør og pipettespisser med 5% BSA-løsning. For dette, forberede løsningen ved å oppløse 2 g BSA i 40 ml PBS. Belegg plast elementer med 5% BSA reduserer kjerner stikker til plast. Dette trinnet forbedrer utvinningen av isolerte kjerner.
  8. Coat pipettespissene ved å pipe 5% BSA-oppløsning 2-3 ganger. Lufttørk tipsene i 2 timer. Forbered 10 plasttips per prøve.
  9. Coat rørene for innsamling av kjerner ved å fylle dem med 5% BSA. Snu rørene 3 ganger for å sikre et effektivt belegg. Fjern løsningen og lufttørk rørene opp ned på et rent vevspapir i 2 timer. Per prøve, belegge en samling rør i settet. I tillegg forberede belagt 1,5 ml rør for nuklei samling etter FACS.
    MERK: Glasstips er sterkt anbefalt alternativ til pipettespissene i plast for å minimere stempel.

2. Disseksjon av sebrafisk hjerne

  1. For å euthanizing sebrafisk, forberede en 90 mm Petri parabolen med 25 ml iskald Tricaine løsning.
  2. Ta sebrafisken forsiktig fra tanken ved hjelp av et fiskegarn og legg den i petriskålen.
  3. Euthanize fisken ved å forlate den i Tricaine i 5 min.
  4. Decapitate dyret med et skarpt barberblad.
  5. Ved hjelp av tang, forsiktig bryte åpne skallen og fjerne bløtvev, hud og bein fra ventral og dorsal side av skallen.
  6. Forsiktig, overfør hjernen til en frisk 30 mm tallerken som inneholder iskald PBS.
  7. Hakk hjernen i små biter ved hjelp av et barberblad for å lette lasting av prøven på spinnkolonnen.

3. Enkelt kjernei isolasjon

  1. Overfør hakket vev til filterpatronen som følger med i nukleiisolasjonssettet, og tilsett 200 μL kald buffer A for å sensibilisere vevet. Grind vevet ved hjelp av plaststangen som leveres av settet i 2 min.
  2. Tilsett 300 μL kaldbuffer A og inkuber filterpatronen på is med hetten åpen i 10 min.
  3. Hette patronen og resuspend vevet ved å invertere røret 5 ganger.
  4. Sentrifuge ved 16.000 x g for 30 s. I dette trinnet brytes celler når de passerer gjennom filteret og høyhastighets sentrifugalkraft påføres. Gjennomstrømningen gjennom inneholder intakte kjerner, som pellet på bunnen av røret.
  5. Kast filteret og resuspend pelleten ved å virvle kraftig i 10 s.
  6. Pellet kjernene ved å sentrifugere løsningen ved 500 x g i 3 min. Kast supernatanten forsiktig da kjernene pellet er fargeløs.
  7. Resuspend pellet i 0,8 ml kald buffer B og sentrifuge ved 600 x g i 10 min. I dette trinnet skilles kjerner fra membranavfall. Den fargeløse pellet oppnådd inneholder isolerte kjerner.
  8. Resuspend de isolerte kjernene i 500 μL PBS med 5% BSA. Hold kjernene suspensjon på is for å utføre FACS etter kvantifisering.

4. Visualisering av nuklei morfologi

  1. Bekreft kjernefysisk morfologi av Hoechst farging. For dette, fjern 100 μL enkelt kjerner suspensjon i et nytt rør ved hjelp av BSA belagt tips. For å farge kjernene, tilsett 0,1 μL Hoechst (1 mg/ml). Forsiktig virvle røret.
  2. Overfør nukleopphenget til bunnen av glass for avbildning.
  3. Bilde kjernene ved hjelp av et fluorescensmikroskop med lasereksitasjonsinnstillinger på ~ 405 nm (Violet) bølgelengde.

5. FACS-basert berikelse av kjerner

  1. Før du utfører FACS, filtrer kjernene ved hjelp av en 40 μm cellesil i BSA-belagt rør.
  2. Fortynn den filtrerte suspensjonen ved å legge til PBS med 5% BSA til et endelig volum på 1000 μL.
  3. Merk to runde vrangen FACS-rør som "kontroll" og "farget". "Kontroll" røret vil inneholde un-farget kjerner, mens den "farget" røret vil ha Hoechst farget kjerner.
  4. Overfør 250 μL av kjernene suspensjon til "kontroll" rør ved hjelp av BSA belagt pipette spissen.
  5. Overfør den resterende 750 μL-oppløsningen til FACS-røret merket som "farget" og tilsett 1 μL Hoechst-fargestoff for å beise kjernene. Bland ved langsom vortexing.
  6. Last inn den ikke-oppnådde kontrollprøven til cellesortering. Ta opp 5000 arrangementer.
  7. Legg i de fargede prøvene og registrer 5000 hendelser.
  8. Tegn FACS-porter som tillater identifisering av enkeltkjerner. Kjerner kan velges ved å sammenligne Hoechst fluorescenssignalet mellom kontroll og farget prøve.
  9. Sorter Hoechst-positive kjerner fra farget rør til nytt 1,5 ml rør som inneholder 50 μL PBS med 5% BSA.
    MERK: Isolerte kjerner kan samles inn i et ønsket medium i henhold til kravene i nedstrømsprogrammet.

Representative Results

--Protokollen beskrevet ovenfor ble brukt til å generere enkeltkjernesuspensjon direkte fra sebrafisk hjernevev. Isolasjonen krever vanligvis 20 minutter og unngår bruk av vaskemiddel eller fordøyelsesenzym. En skjematisk oppsummering av de individuelle trinnene i protokollen er gitt i figur 1, som kan skrives ut som skal brukes til veiledning.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk av vaskemiddelfri spin-kolonnebasert metode for nuklei isolasjon.
Grafisk representasjon av de enkelte trinnene som utføres under utvinning av kjerner fra fersk sebrafisk hjernevev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Visualisering av kjernefysisk morfologi

For kvalitativ bekreftelse av kjernefysisk morfologi ble de isolerte kjernene farget med Hoechst og visualisert ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Kjernene dukket opp intakt, rund og godt separert (Figur 2). Viktigere, kjernefysisk aggregering, et tegn på kjernefysisk membran brudd, var fraværende.

Figure 2
Figur 2: Enkelt kjernei isolasjon fra sebrafisk hjernen.
Fluorescens mikroskopi bilde av Hoechst-farget kjerner demonstrere deres intakt morfologi. Skala bar: 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

FACS-basert berikelse av de intakte kjernene

Berikelse av isolerte kjerner og fjerning av cellulære rusk ble utført av strømningscytometri ved å gating på tilstedeværelsen av et Hoechst fluorescenssignal. Hoechst-signalet ble oppdaget ved eksitasjon med fiolett, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). Ubebodde kjerner viste bakgrunnsfluorescens (Figur 3A, Supplerende figur 1A), mens farget kjerner viste sterkt fluorescerende signal (Figur 3B, Supplerende figur 1B). Som illustrert i figur 3Cvar de uberørte og Hoechst-fargede kjernene godt segregert i den fiolette kanalen.

Figure 3
Figur 3: Isolerte kjerner viser sterkt og spesifikt Hoechst fluorescerende signal i strømningscytometri.
Histogrammet plott for enkelt kjerner suspensjon viser fordelingen av Hoechst farging. Hoechst er begeistret av fiolett, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 - BV421). Den ufargede prøven (A) viser signal i området 100-103,mens Hoechst-farget kjerner (B) avgir signal i området 103-105. Et overlegg av fluorescensintensitet som slippes ut av ikke-oppnådde (grå) og farget (blå) prøver (C) viser klar separasjon mellom de to populasjonene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Supplerende figur 1: Flow cytometri gating strategi for isolerte kjerner. Representative strømningsplott for isolert kjernesuspensjon. Isolerte kjerner ble analysert ved hjelp av fremover scatter og Violet laser BV421 som interesserer Hoechst på 405 nm. Den ubebodde prøven (A) viste BV421-signalet i 100-103-området. Av 13130 hendelser ble 141 hendelser oppdaget som enkeltkjerner basert på FSC-A (totalt 1,07 % av totalen) og 0 hendelser for ikke-oppnådde kjerner basert på BV421-signal (0 % av totalen). Hoechst-farget kjerne (B) viste BV421-signalet i 103-105-området. Av 50000 hendelser ble 2418 hendelser oppdaget som enkeltkjerner basert på FSC-A (4,84 % av totalen) og 2414 hendelser for Hoechst-positive kjerner basert på BV421-signal (4,83 % av totalen). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Discussion

Profilering av transkripsjons- og epigenomet ved en enkeltcelleoppløsning har revolusjonert studien av biologiske systemer. Studier ved oppløsning av en enkelt celle for et solid vev avhenger av dissosiasjon av orgelet i individuelle celler eller kjerner. Dissosiasjon er en destruktiv prosedyre som kan introdusere tekniske gjenstander, noe som kan forhindre utvikling av en nøyaktig representasjon av systemet5,6. For eksempel kan enzymatisk dissosiasjon skade celler med komplekse morfologier, for eksempel nevroner eller podocytes, og kan indusere uttrykk for stress og varmesjokkrespons gener7,12. I tillegg kan bruk av vaskemiddel under dissosiasjon bryte atommembranen og føre til aggregering23,25. Dermed er optimalisering av dissosiasjonen for å oppnå en enkelt celle eller kjernesuspensjon av høyeste kvalitet avgjørende for suksessen til høygjennomstrømningprofileringseksperimenter.

Her demonstrerer vi en vaskemiddel- og enzymfri nukleiisolasjonsmetode som gjør det mulig å ekstrare nytte av intakte kjerner fra sebrafiskhjernen på mindre enn 20 minutter. Protokollen gir kjerner med typisk morfologi og robust integritet (figur 2). Fra en enkelt sebrafisk hjerne som veier 6 mg, gir protokollen totalt 60.000 kjerner bestemt av et hemocytometer antall. De isolerte kjernene kan brukes til flere nedstrømsapplikasjoner, inkludert snRNA-seq, ATAC-seq og immunostaining. De isolerte kjernene kan omfatte krysskontaminering fra cytoplasmatiske fraksjoner, spesielt fra komponenter av endoplasmisk retikulem og mitokondrier. For høygjennomstrømning profilering eksperimenter, clearance av cellulære rusk, spesielt mitokondrier, anbefales sterkt. Flow cytometri (figur 3) gir et levedyktig alternativ for rensing av kjerner. Alternativt kan sukrosegradienten også benyttes for fjerning av rusk.

Protokollen har blitt testet på mus skjoldbruskkjertelen (data ikke vist) og gir resultater som ligner på sebrafisk hjernevev. Samlet sett gir protokollen en robust, reproduserbar og universell metode for utarbeidelse av enkeltkjernesuspensjon, noe som bidrar til å forenkle logistikken for profileringseksperimenter med høy gjennomstrømning.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt. Betalingen for å gjøre artikkelen åpen tilgang ble gjort av Invent Biotechnologies Inc., USA.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Dr. Sabine Costagliola og Singh lab for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS under Grant nummer 34772792 – MISU til S.P.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Carl Roth 90604-29-8 Albumin fraction V
Cell sorter BD Biosciences FACSAria III
Centrifuge Sartorius A-14C
Eppendorf tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Falcon (15 mL) Corning 352096 Polypropylene centrifuge tubes
Falcon (5 mL ) Corning 352052 Polystyrene round bottom test tubes
Fine forceps Fine Science Tools 11295-10
Flowmi cell strainer (40 μm) Sigma BAH136800040
Fluorescence microscope Leica DMI6000 B
Glass bottle (250 mL) VWR 215-1593
Glass bottomed dish World Precision Instruments FD3510-100 Fluorodish 35 mm
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1701
Glass pipette socket Carl Roth 388.1 Pipetting aid pi-pump 2500
Hoechst staining dye solution Abcam ab228551 Hoechst 33342
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit Invent Biotechnologies NI-024
PBS (10X) ThermoFisher 70011069
Petri dish (30 mm) FisherScientific 11333704 Pyrex
Petri dish (90 mm) Corning 758-10178-CS Gosselin
Pipette tips VWR 89079 10 μL, 200 μL, 1000 μL
Pipettes Gilson F167380 Pipetman
Razor blade Swann-Morton 7981809
Tricaine methane sulfonate Sigma E10521
Vortex machine Scientific Industries SI-0236 Vortex-Genie 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  2. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93, (2), 287-290 (1989).
  3. Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells. Cytometry Part A. 89, (5), 443-450 (2016).
  4. Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions. Transplantation Proceedings. 29, (4), 1942-1944 (1997).
  5. Massoni-Badosa, R., et al. Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies. bioRxiv. (2020).
  6. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, (10), 935-936 (2017).
  7. O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Bioarxiv. 683227, (2019).
  8. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. Plos One. 13, (12), 0209648 (2018).
  9. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10, (1), (2019).
  10. Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, (2019).
  11. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, (10), 2746-2756 (2018).
  12. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30, (1), 23-32 (2019).
  13. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, (1), 1-13 (2016).
  14. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353, (6302), 925-928 (2016).
  15. Thrupp, N., et al. Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue. bioRxiv. (2020).
  16. Selewa, A., et al. Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation. Scientific Reports. 10, (1), 1-13 (2020).
  17. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7, (1), 1-8 (2017).
  18. Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11, (3), 499-524 (2016).
  20. Birnie, G. D. Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture. Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).
  21. Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1, (2), 139-153 (1955).
  22. Hymer, W. C., Kuff, E. L. Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100. The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).
  23. Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. Materials and Methods. 3, (2013).
  24. Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families. Plant Methods. 9, (1), 31 (2013).
  25. Graham, J., Rickwood, D. Subcellular fractionation: a practical approach. IRL Press. (1997).
Nuclei Isolation fra hele vevet ved hjelp av et vaskemiddel og enzymfri metode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eski, S. E., Dubois, C., Singh, S. P. Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method. J. Vis. Exp. (160), e61471, doi:10.3791/61471 (2020).More

Eski, S. E., Dubois, C., Singh, S. P. Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method. J. Vis. Exp. (160), e61471, doi:10.3791/61471 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter