Summary
我们提出了一种非致命和自动化的机制，从返回蜂巢的大黄蜂（Bombus）工人那里收集花粉。包括有关生产、准备、安装和使用设备的说明。通过使用3D打印对象，对设计的修改是及时，有效的，并允许快速周转进行测试。
Abstract
为了验证大黄蜂觅食花粉的植物来源，必须收集个体以去除其皮质花粉负荷以进行分析。 传统上，这是通过在巢穴入口处或花朵上网捕觅食者来完成的，在冰上冷却蜜蜂，然后用镊子或刷子从corbiculae中去除花粉负载。 这种方法是时间和劳动密集型的，可能会改变正常的觅食行为，并可能导致执行任务的工人发生刺痛事件。 花粉陷阱，例如用于蜜蜂蜂箱的花粉陷阱，通过在通过巢穴入口处的屏幕时将工人腿部的皮质花粉负载移开来收集花粉。 陷阱可以用最少的劳动力从返回的觅食蜂中去除大量花粉，但迄今为止还没有这样的陷阱可用于大黄蜂群落。大黄蜂蜂群内的工蚁大小可能不同，使得入口的大小选择难以使这种机制适应商业饲养的大黄蜂蜂巢。 使用3D打印设计程序，我们创建了一个花粉陷阱，成功地从返回的大黄蜂觅食者的腿上移除了皮质花粉负荷。 这种方法大大减少了研究人员从返回蜂群的大黄蜂觅食者那里收集花粉所需的时间。我们介绍了设计，花粉去除效率测试的结果，并为调查人员建议了修改区域，以使陷阱适应各种大黄蜂物种或巢箱设计。
Introduction
大黄蜂（Bombus spp.）是大型健壮的昆虫，遍布世界温带，高山和北极地区1。它们对植物群落很重要，并为它们访问的农作物提供重要的授粉服务2.最近几个物种的丰度和分布的下降使它们作为传粉媒介的重要性成为公众意识的前沿3.研究人员已经确定了几个可能导致人口下降的压力因素，包括缺乏多样和丰富的花卉资源，大黄蜂以此为食4。确定大黄蜂从哪种植物物种中觅食，使研究人员和土地管理人员能够了解大黄蜂如何应对资源可用性，竞争和人为干扰的变化5，6。
调查大黄蜂花粉觅食偏好的研究通常由研究人员进行，研究人员捕捉在花朵处觅食的个体蜜蜂，然后从标本中去除皮质花粉负荷以进行进一步处理和鉴定7，8，9，10。虽然这种方法可以深入了解一个物种或大黄蜂物种的组合如何利用区域7中的资源，但它是时间密集型的，如果没有额外的分子分析来确定觅食蜂11的起源殖民地，就无法辨别蜂巢之间偏好的潜在差异。
对于一些觅食动力学的研究，希望在单个殖民地进行研究;然而，野生大黄蜂巢通常位于地下或地面，因此很难找到12。商业生产的大黄蜂蜂巢为研究人员提供了更多的访问和更好的实验控制，并且从工人身上去除花粉仍然主要通过捕获觅食者返回蜂巢并手动去除其Corbicular花粉负载13，14。从蜜蜂的鞘翅中手工去除花粉是时间密集型的，每小时的花粉产量很低，特别是在蜂巢入口处，返回花粉觅食者的比率可能很低。此外，手动清除蜜蜂的花粉会导致受到干扰的工人被蜇伤。
花粉陷阱已被用于实验性地去除蜜蜂的花粉数十年15;然而，一种从大黄蜂中去除花粉的被动方法尚未开发出来。开发一种机制以从返回的觅食者大黄蜂中去除花粉的主要障碍是大黄蜂群中存在的工蜂大小的巨大变化16。蜜蜂花粉陷阱之所以有效，很大程度上是因为蜜蜂工人的大小变化不大。此外，这些陷阱在安装后只需要轻微的操作，并且不需要牺牲蜜蜂17。这是使用屏幕或塑料表面实现的，当工人返回蜂巢时，这些屏幕或塑料表面会将花粉从工人的后腿上移开。这些诱捕器仅从返回的觅食者身上去除一部分花粉负荷，并且这些诱捕器的各种设计导致花粉收集效率不同。当花粉从蜂腿上取出时，它通过屏幕落入蜜蜂无法进入的收集盆中，因此研究人员可以在对蜂巢产生轻微干扰的情况下将其移除。
本研究的目的是调整用于从蜜蜂蜂巢中收集花粉的技术，并使用3D打印结构将其应用于大黄蜂巢，并在 Bombus huntii的菌落上测试陷阱设计。设计过程遵循的假设是，陷阱的生产成本应该低廉，适应各种大黄蜂物种，对蜜蜂造成的伤害或干扰最小，花粉去除率应超过手工收集的花粉。三维打印技术用途广泛，易于访问，并且是一种具有成本效益的工具，允许研究人员为特定目的复制和修改对象18。这里介绍的技术指示用户建立花粉陷阱，并将它们附着在市售的大黄蜂群落上。这些陷阱不是为野生殖民地设计的。这些陷阱被动地从携带大黄蜂的花粉的后腿上去除皮质花粉负荷，因为它们返回巢箱。
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Protocol
1. 打印花粉陷阱结构
- 下载大黄蜂筑巢的巢箱的相应STL文件（例如，Biobest或Koppert风格的蜂巢，https://www.ars.usda.gov/pacific-west-area/logan-ut/pollinating-insect-biology-management-systematics-research/docs/pollen-traps/）。这些文件向公众开放，最终用户可以免费下载和修改。
- 在打印机程序中打开 STL 文件。按照打印机制造商的说明构建四个陷印组件。
注：打印疏水阀体约 3 小时，打印集水盆约 2 小时，滤镜和陷印盒闭合插入物各 30 分钟。疏水阀主体尺寸为 6 厘米 x 3.8 厘米 x 7 厘米。
2. 花粉捕集器组件
- 取下印有疏水阀体和集水池的支撑结构，包括疏水阀体的筛分结构（图1）。
- 使用安装在手钻中的 3/16 英寸（0.476 厘米）钻头清除穿过花粉过滤器凸起边缘的任何塑料股，这些塑料股可能会阻碍蜜蜂通过过滤器孔。使用箱式切割剃须刀片和砂纸，将花粉过滤器平坦侧的任何凸起或凸起的边缘均匀。
- 将花粉过滤器轻轻推过陷阱主体的一侧，将花粉过滤器放入疏水阀体中。过滤器只能以一种方式安装，因为疏水阀的左侧有一个更大的开口，以适应凸起的过滤器锥体的通过。
- 如果侧缝太小，花粉过滤器无法顺利滑过，请使用剃须刀或其他可以一次去除一小部分塑料的工具，从疏水阀体的狭缝中刮出足够的塑料。确保花粉过滤器牢固地安装到位，花粉过滤器和捕集器体之间的间隙不超过2 mm。
- 通过将捕集器主体底部的凸起边缘滑入集水盆顶部的凹槽中，将集水盆连接到捕集器主体上。集水池应直接位于疏水阀体的筛分区域下方（图 1A\u2012E）。
- 通过切割或打磨塑料进行适当的修改，以便从疏水阀体上平滑放置和移除集水盆。集水池的放置会将花粉过滤器固定到位，在收集盆被移除之前，花粉过滤器无法移除，在集水盆就位时也无法插入花粉过滤器。
注意：如果将多个蜂箱彼此靠近放置，除了部署具有不同方向的蜂巢外，为每个蜂巢提供陷阱体，集水盆和花粉过滤器结构的独特颜色组合将有助于返回的工人找到巢穴。
3. 大黄蜂蜂群准备
- 在部署菌落之前，停止花粉喂养24\u201248小时。这将导致工蚁用尽任何储存的花粉，并刺激它们离开巢穴寻找花粉。
- 通过将疏水阀闭合插件插入过滤器槽中，防止蜜蜂在安装疏水阀时逃逸，准备用于安装蜂巢陷阱体。
- 在红灯下工作以防止蜜蜂飞翔，将塑料巢箱从纸板外箱中取出。
- 找到巢前方的塑料巢入口。根据巢供应商的不同，有两种入口样式：Koppert样式的盒子（步骤3.5）和Biobest风格的盒子（步骤3.6）。
- 对于Koppert风格的蜂巢入口，通过拉动入口标签直到两个入口孔都打开，将花粉陷阱安装到巢穴入口处。
- 将花粉捕集器的两根管子插入入口孔中，确保花粉捕集器的筛子在底部。轻轻向下推塑料入口卡舌，将花粉陷阱固定到位。
- 要将花粉陷阱安装到Biobest式蜂巢入口处，请使用平头螺丝刀从巢箱中轻轻撬出塑料入口装置。将花粉陷阱插入巢穴入口孔中，直到花粉陷阱牢固地贴在巢穴上（图1E）。
- 如果需要，使用胶带或速干胶将疏水阀固定在巢穴中，陷阱与巢箱接触。
- 将塑料巢箱放回纸板箱。纸板可能需要切掉以容纳花粉陷阱。
4. 巢穴的部署
- 将巢箱放入研究区域。提供覆盖物以防止降水和风锚定，因为这些会对收集的花粉的质量和数量产生不利影响。为放置在温室中的蜂箱提供足够的阳光覆盖，以减少过热。
- 从陷阱体上取下陷阱封闭插件，让蜜蜂自由觅食，以便觅食者可以根据周围区域和巢穴的位置定位自己。在正常情况下，定向飞行时间应在24小时内完成。
5. 花粉采集
- 要接合疏水阀，请将花粉过滤器滑入过滤器槽，确保其牢固到位。
- 通过从正面将集水盆滑到疏水阀体上直到其完全关闭来安装集水盆。如果集水盆过度松动或从疏水阀体上脱落，请使用橡皮筋将其固定在疏水阀体上。
- 观察蜜蜂在首次部署时进入和退出花粉陷阱，以确保花粉过滤器孔足够大以容纳蜜蜂。
- 如果工人无法通过花粉过滤器，请取下过滤器，然后使用大于3/16英寸（0.476厘米）的钻头来增加孔的尺寸。按顺序进行，每次增加孔径1/32英寸（0.079厘米），因为太大的孔不会收集任何花粉。
- 一旦蜜蜂能够通过过滤器，继续观察入口，以确保花粉在重新进入时被去除。
注意：蜜蜂在花粉过滤器孔中移动应该有些困难，尤其是它们通过的头几次。如果它们太容易通过，花粉可能不会从corbiculae中脱落。
- 在指定的花粉收集期后，从捕集器体中滑动并取出集水盆。
- 根据您的实验设计处理花粉负载。
- 取下花粉过滤器，让工人自由觅食，直到下一个花粉采集期。在实验期间，陷阱体可能仍然附着在蜂巢上。
注意：只要研究人员希望从蜂群中收集花粉，花粉陷阱就可以参与。然而，在一周内部署花粉诱捕器超过24小时可能导致蜂巢中的育雏饥饿并延缓菌落发育。
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Representative Results
测试了八种不同的花粉过滤器设计，以确定它们在从返回的大黄蜂工人中去除皮质花粉负荷方面的功效和效率。所有设计都成功地从返回的觅食者身上消除了至少一个皮质花粉负荷。然而，有些被发现会减慢工人离开或进入蜂巢的速度，或者无法去除花粉负荷（表1）。在温室中生长的Phacelia tanacetifolia上的4个实验室饲养的B. huntii Greene菌落上依次测试了带有各种过滤器的花粉陷阱，累积总计138.5小时，并在7天内收集229个皮质花粉负荷（表1）（3/2/16\u2012\u20123/8/16）。摄像机被放置在巢穴入口前，而花粉陷阱则用于记录觅食者的活动。在此期间，疏水阀入口设计通过反复试验进行。在测试期间收集了52小时的视频观察和142个皮质花粉负荷（表1）。通过将收集的皮质花粉负荷数除以通过过滤器观察到的满载花粉的觅食者的数量来计算效率。花粉过滤器的设计效率范围为去除的全核花粉负荷的2\u258.9%。皮质花粉负荷从腿部移除，并作为粘性花粉颗粒落入集水池中。由于这种将皮质负荷作为颗粒去除的趋势，部分皮质花粉负荷去除并不常见，但一些部分负荷可能被算作完全清除，因为我们无法验证蜜蜂进入巢穴后某些花粉仍留在corbicula中。圆形的整体过滤器开口改善了花粉收集和工人进入巢穴环境的移动。此外，过滤器设计具有从巢箱延伸的结构，也改善了觅食者后腿上的花粉去除。在之前使用早期过滤器设计的实地研究中，在11个蜂巢日收集期间收集24小时后收集的花粉的平均重量为1.017克。从每个巢收集的花粉总质量之间有很高的变异（每天0.22\u2012.94克）。这些值表示可以使用此方法收集花粉的预期质量范围。下载花粉陷阱打印文件中的最终设计是设计编号8，一个带有凸起边缘的圆形陷阱入口。
图1：安装在黄蜂蜂巢上的花粉陷阱。（A）花粉陷阱的前视图，工人降落并穿过筛子朝花粉过滤器移动。（B） 组装花粉捕集器的后视图，显示疏水阀体的凹槽边缘，允许集水盆滑动并附着。（C） 组装花粉捕集器的侧视图，显示花粉过滤器狭缝，允许花粉过滤器放入疏水阀体并由集水池固定。（D） 插入花粉过滤器的捕集器体底视图，筛子使皮质花粉负载落入集水池，并限制工人接触收集的花粉。（E） 安装在巢箱上的组装花粉陷阱的侧视图。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：从工人腿上去除皮质花粉负荷的机制。 （A） 工人的侧视图及其与组装花粉捕集器的相对大小。（B） 工人接近花粉过滤孔的侧视图。（C） 工人通过花粉过滤孔的侧视图，迫使皮质花粉负载与过滤器和腹部腹面接触。（D） 工人通过花粉过滤器孔的后视图迫使皮质花粉负载接触过滤器和腹部腹侧表面。（E） 一旦皮质花粉负荷从其苜蓿中剥离并穿过筛子并落入集水盆，工人通过花粉过滤孔的后视图，以及（F）工人通过花粉过滤孔的侧视图，一旦皮质花粉荷载从其苞蓿中剥离并通过筛子落入集水池。
| 累计总计 | 视频观察 | ||||||||
| 设计标识 | 入口形状 | 部署（小时） | 收集的皮质花粉负荷 | 收集速率（花粉负荷/小时） | 观察（小时） | 收集的皮质花粉负荷 | 花粉觅食者 | 个人效率* | 总效率** |
| 1 | 钻石 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 9 | 0.11 | 5.56% |
| 2 | 钻石 | 3.5 | 2 | 0.57 | 3.5 | 2 | 50 | 0.04 | 2.00% |
| 3 | 广场 | 4.5 | 2 | 0.44 | 4.5 | 2 | 2 | 1 | 50.00% |
| 4 | 圈 | 9.5 | 7 | 0.74 | - | - | - | - | - |
| 5 | 圈 | 17.5 | 10 | 0.57 | 5.75 | 5 | 23 | 0.22 | 10.87% |
| 6 | 圈 | 18 | 36 | 2 | 13 | 35 | 54 | 0.65 | 32.41% |
| 7 | 圈 | 49.5 | 48 | 0.97 | 6.25 | 11 | 17 | 0.65 | 32.35% |
| 8 | 圈 | 35 | 123 | 3.51 | 18 | 86 | 73 | 1.18 | 58.90% |
| 总 | 138.5 | 229 | - | 52 | 142 | 228 | - | - | |
| *从返回的花粉觅食者收集的皮质花粉负荷的平均数量。 | |||||||||
| **从返回觅食者收集的皮质花粉总负荷的百分比（个体/2）。 | |||||||||
表1：总部署小时数、采集的果核花粉负荷、采集率以及小时数、花粉觅食者数量、通过视频片段验证的个人和总效率的汇总表。
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Discussion
从大黄蜂群入口收集花粉可以进行各种生态和农业研究。确定大黄蜂收集花粉的花卉来源为有助于殖民地整体饮食的植物多样性提供了有价值的信息和见解19。确定花粉来源对农业生产和野生土地生态系统服务的研究都有影响12，20。通过收集相对较大的样本大小的皮质花粉负载，研究人员可以确定大黄蜂是否在它们部署的目标作物21上觅食，大黄蜂日粮8的其他重要成分，以及区域7内特定物种的首选饲料。通过使用花粉陷阱自动从大黄蜂群中收集花粉，将允许扩大对大黄蜂觅食，营养和农药暴露的研究。
从蜜蜂身上去除花粉，已被用于大多数研究大黄蜂花粉偏好的研究，是时间和劳动密集型的10。相比之下，使用花粉陷阱设计的花粉被动收集在一周内从四个菌落收集了200多个皮质花粉负载。因此，这种方法允许研究人员从不同位置的多个蜂巢收集花粉，从而增加采样工作量和未来研究的统计稳健性。
为了开发和改进花粉过滤器的设计，必须对通过陷阱机制的大黄蜂工人进行视频记录。我们观察到，当一只大黄蜂穿过一个狭窄的空间时，后腿会延伸到腹部的后面和下面（图2C\u2012E）。对这种行为的观察导致3D打印设计和花粉过滤器的试错测试发生变化（表1）。在开始正式实验之前，建议在部署陷阱时使用视频记录进行观察，以确保陷阱正确有效地运行，以便在必要时进行修改。为了解释蜂巢内和蜂巢之间体型的差异以及研究的目标，陷阱入口大小可以变化。我们观察到，调整陷阱入口以允许较大的觅食者离开并进入蜂巢，对觅食活动的干扰最小，并且合理地提高了去除蜂群花粉负荷的效率（>50%）。3D打印的塑料很容易用手工工具进行修改，打印设计可以针对特定项目进行操作，或者随着盒子入口设计的变化而改变18。
这种方法的局限性在于花粉过滤器设计对于正在采样的大黄蜂物种是唯一的。这种方法使用均匀大小的入口孔，理论上，这可能会限制巢中较大的个体觅食，而较小的工蚁则可能无法进行取样;然而，我们的设计允许大型工人通过，我们没有根据身体尺寸量化效率。可供下载的设计是根据B. huntii工人的平均尺寸（3.22毫米胸宽22）设计的，因此需要按照B. impatiens（3.38毫米23）或B. terrestris（4.77毫米24）的工人所描述的那样进行扩展。在一项使用B. terrestris的研究中，注意到较大的个体比较小的工人更频繁地收集花粉25;然而，随后的工作发现，北美大黄蜂B.的花粉觅食次数与工人大小没有相关性。此外，在整个季节12中，工人的大小可能会有所不同，因此应定期检查花粉过滤器，以确保花粉收集有效。了解感兴趣的物种和正在解决的具体研究问题对于逐案评估这种陷阱设计的效用至关重要。
返回觅食者对参与花粉陷阱的存在所表现出的行为反应是可变的。这些包括：（i）工人适应了重新进入巢穴环境所需的额外努力，（ii）工人多次尝试通过过滤器，（iii）工人试图绕过过滤器开口，而是通过陷阱体筛，以及（iv）工人避开过滤器并切换到花蜜收集并通过巢箱底部的通风孔转移到巢穴蜜蜂。大黄蜂觅食者试图找到蜂巢的替代入口，在之前对该物种29 的研究中已经观察到，即使巢穴入口没有被阻挡。虽然观察到这些反应，但它们非常罕见，以至于我们没有量化由于陷阱的存在而改变行为的觅食者的比例，除了大多数蜜蜂在陷阱部署后不久就适应了陷阱。
该方法的未来应用包括将现有设计用于其他商业生产的大黄蜂物种，特别是B. terrestris和B. impatiens，它们主要用于全球温室作物的授粉19。将这些花粉诱捕器用于其原生范围以外的商业蜂巢上，将使研究人员能够确定与本地Bombus物种可能发生的生态位重叠和竞争性相互作用30，31。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Colby Carpenter和Spencer Mathias在3D打印设计方面的帮助。我们感谢艾伦·克林格（Ellen Klinger）协助制作摄影人物，并感谢乔纳森·B·科赫（Jonathan B. Koch）协助进行修订。资金由美国农业部 - ARS授粉昆虫生物学，管理和系统学研究部门提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MakerBot Replicator+ | MakerBot | Model PABH65 | |
| MakerBot Tough Material | PLA Filament | various colors | |
| Nest Box | Biobest | Not sold publicly without bee purchase |
References
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