Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Adgang til cytotoksicitet og cellerespons på biomaterialer

Published: July 8, 2021 doi: 10.3791/61512
Automatic Translation
*1,2,3,4, *2,3,4,5, 1,2,3,4, 2,3,4,5, 2,3,4,6, 2,3,4,6, 2,3,4,7, 2,3,4,5, 1,2,3,4,8, 1,2,3,4
1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal
* These authors contributed equally

Summary

Denne metode sigter mod at evaluere biomateriale cytotoksicitet gennem fremstilling af opløselige ekstrakter ved anvendelse af levedygtighedsanalyser og fænotypisk analyse, herunder flowcytometri, RT-PCR, immunocytokemi og andre cellulære og molekylærbiologiske teknikker.

Abstract

Biomaterialer kommer i direkte eller indirekte kontakt med det humane væv, hvilket gør det vigtigt at evaluere dets cytotoksicitet. Denne evaluering kan udføres ved flere metoder, men der er en stor uoverensstemmelse mellem de anvendte tilgange, hvilket kompromitterer reproducerbarheden og sammenligningen mellem de opnåede resultater. I dette papir foreslår vi en protokol til evaluering af biomaterialer cytotoksicitet ved hjælp af opløselige ekstrakter, som vi bruger til dental biomaterialer. Ekstraktpræparatet er detaljeret, fra pelletproduktion til dets ekstraktion i et dyrkningsmedium. Biomaterialernes cytotoksicitetsevaluering er baseret på metabolisk aktivitet ved anvendelse af MTT-assayet, cellelevedygtighed ved anvendelse af Sulphorhodamine B (SBR) assay, celledødsprofil ved flowcytometri og cellemorfologi ved anvendelse af May-Grünwald Giemsa. Ud over cytotoksicitetsevaluering beskrives en protokol til evaluering af cellefunktion baseret på ekspression af specifikke markører vurderet ved immunocytokemi og PCR. Denne protokol giver en omfattende vejledning til evaluering af cytotoksicitet og cellulære virkninger af biomaterialer ved hjælp af ekstraktmetoden på en reproducerbar og robust måde.

Introduction

Biokompatibilitet kan defineres som et materiales evne til at integrere væv og fremkalde et gunstigt terapeutisk respons, fri for lokale og systemiske skader 1,2,3. Biokompatibilitetsevaluering er afgørende for udviklingen af ethvert materiale beregnet til medicinsk brug. Derfor giver denne protokol en systematisk og omfattende tilgang til enhver forsker, der sigter mod at udvikle nye biomaterialer eller studere nye anvendelser af eksisterende biomaterialer.

In vitro cytotoksicitetstest anvendes i vid udstrækning som den første fase til evaluering af biokompatibilitet ved anvendelse af primære cellekulturer eller cellelinjer. Resultaterne udgør en første indikator for potentiel klinisk anvendelse. Udover at være afgørende for udviklingen af biomateriale, er denne test obligatorisk for at overholde gældende regler for markedsintroduktion fra EUA og EU-regulatorer (FDA og CE-certificering)4,5,6,7,8. Desuden giver standardiseret test inden for biomedicinsk forskning en betydelig fordel med hensyn til reproducerbarhed og sammenligning af resultater fra forskellige undersøgelser af lignende biomaterialer eller udstyr9.

International Organization for Standardization (ISO) retningslinjer bruges i vid udstrækning af flere uafhængige kommercielle, lovgivningsmæssige og akademiske laboratorier til test af materialer på en nøjagtig og reproducerbar måde. ISO 10993-5 henviser til in vitro cytotoksicitetsvurderingen og ISO 10993-12 rapporterer til prøvetagningsforberedelse10,11. Til biomaterialetest leveres tre kategorier, der skal vælges i henhold til materialetype, kontaktvæv og behandlingsmålet: ekstrakter, direkte kontakt og indirekte kontakt 8,11,12,13. Ekstrakter opnås ved at berige et cellekulturmedium med biomaterialet. Til test af direkte kontakt placeres biomaterialet direkte på cellekulturerne, og ved indirekte kontakt udføres inkubation med cellerne adskilt af en barriere, såsom en agarosegel11. Passende kontrol er obligatorisk, og der skal udføres mindst tre uafhængige forsøg 5,8,10,11,14.

Det er afgørende at simulere eller overdrive kliniske tilstande for at bestemme det cytotoksiske potentiale. I tilfælde af ekstraktafprøvning, materialets overfladeareal;  det mellemstore volumen; substratet og materialets pH-værdi forholdet mellem materialeopløselighed, osmolaritet og diffusion og ekstraktionsbetingelserne som omrøring, temperatur og tid påvirker medieberigere5.

Metoden tillader kvantitativ og kvalitativ evaluering af cytotoksicitet af flere farmaceutiske formuleringer, både faste og flydende. Flere assays kan udføres, såsom neutral rød optagelsestest, kolonidannelsestest, MTT-assay og XTT-assay 5,10,14.

De fleste offentliggjorte cytotoksicitetsvurderingsundersøgelser bruger enklere assays, nemlig MTT og XTT, som giver begrænset information. Evaluering af biokompatibilitet bør ikke kun omfatte vurdering af cytotoksicitet, men også bioaktivitet af et givet testmateriale2, som denne protokol godkender. Der bør anvendes yderligere evalueringskriterier, når det er begrundet og dokumenteret. Denne protokol har således til formål at give en omfattende vejledning, der beskriver et sæt metoder til evaluering af biomaterialets cytotoksicitet. Desuden beskrives evalueringen af forskellige cellulære processer, nemlig typen af celledød, cellemorfologi, cellefunktion i syntesen af specifikke proteiner og specifik vævsproduktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Pellets forberedelse

  1. Forbered polyvinylchloridformene (PVC) ved at udføre cirkelformede huller med kendte dimensioner i PVC-plader.
    BEMÆRK: PVC-lister kan laves i forskellige størrelser. Beregn kontaktfladen for PVC-forme ved hjælp af formlen A = h (2πr) + 2πr2 (r: cylinderens radius; h: cylinderens højde).
  2. Forbered det biomateriale, der skal testes i henhold til producentens anvisninger og så tæt som muligt på eksperimentets begyndelse.
    BEMÆRK: Til fremstilling af biomaterialer med pasta/pastaformulering blandes en tilstrækkelig mængde basepasta og katalysator manuelt med en blandespatel. For andre materialer baseret på væske- og pulverformuleringer skal manuel spatelering eller mekanisk blanding med vibrationer udføres efter producentens anvisninger eller passende for nye materialer. For flydende materialer er dette trin ikke nødvendigt. Start protokollen i trin 2.
  3. Placer biomaterialet på formene med en spatel og lad dem sætte sig i passende tid.
    BEMÆRK: Indstillingstiden og indstillingsbetingelserne for biomaterialerne skal følge producentens anvisninger eller passende for nye materialer.
  4. Efter hærdning fjernes biomaterialets pellets fra PVC-formene og placeres i en beholder (en 6-brøndplade eller en petriskål kan bruges).
  5. Steriliser pellets ved at placere dem under en ultraviolet lys (UV) lampe i 20 minutter for hver side.

2. Indhentning af biomaterialernes ekstrakter

BEMÆRK: Alle procedurer skal udføres under strenge sterile forhold.

  1. Bestem det nødvendige antal pellets ved at beregne pelletoverfladearealet baseret på formlen beskrevet i 1.1.
    BEMÆRK: Som referenceværdi opnås kontaktfladen på 250 mm2/ml11,15 ved tilsætning af 9 pellets (r 3 mm x h 1,5 mm) pr. ml af mediet.
  2. Forbered de opløselige ekstrakter (ekstrakt beriget med biomaterialet).
    1. Anbring pellets i et 50 ml rør og tilsæt det tilsvarende af cellekulturmediet. Placer rørene i 24 timer i inkubatoren ved 37 ° i konstant rotation.
      BEMÆRK: Brug det cellekulturmedium, der passer til cellekulturerne.
    2. Efter 24 timer fjernes rørene fra inkubatoren. På dette tidspunkt svarer ekstrakterne til en koncentration på 1/1 eller 100%.
    3. Der foretages fortyndinger af ekstraktet ved sekventiel tilsætning af lige store mængder konditioneret medium til cellekulturmedium.
      BEMÆRK: Der bør ikke foretages pH-justering af mediet.
      1. Tilsæt 1 ml kulturmedier til 1 ml 100% ekstrakt for at opnå et 50% ekstrakt. Tilsæt 1 ml kulturmedier til 1 ml 50% ekstrakt for at opnå et 25% ekstrakt osv. (Figur 1).
        BEMÆRK: Brug de koncentrationer, der findes relevante for hver forbindelse.

Figure 1
Figur 1: Skema for fremstilling og fortynding af opløselige ekstrakter. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Celleinkubation med biomaterialernes ekstrakter

  1. Forbered en cellulær suspension og plade den i en passende cellebeholder, såsom en multibrøndplade, i henhold til antallet af celler, der er nødvendige for eksperimenterne.
    1. Start med en kolbe af de ønskede celler med 80% til 90% sammenløb.
    2. Kassér cellekulturmediet, vask med fosfatbufret saltopløsning (PBS) og løsn cellerne med trypsin-EDTA (1 til 2 ml for en 75 cm 2-celles kulturkolbe).
    3. Cellekulturmediet tilsættes (2 til 4 ml for en 75 cm 2-celles kulturkolbe), cellesuspensionen overføres til et rør og centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter.
    4. Suspender pellet i et kendt volumen cellekulturmedier.
      BEMÆRK: Denne protokol er designet til brug af vedhængende cellekulturer; Imidlertid kan enkle tilpasninger foretages for at arbejde med suspensionscellekulturer.
    5. Tæl cellerne i hæmocytometeret og beregn cellekoncentrationen af cellesuspensionen.
    6. Den bestemte mængde cellesuspension suspenderes i dyrkningsmediet og overføres til multiwell-retter. Som referenceværdi for såtæthed skal du overveje 5 - 20 x 105 celler / cm2.
      BEMÆRK: Det tildelte antal celler skal beregnes i henhold til celletypen og cellekarakteristika, nemlig cellefordoblingstid.
  2. Inkuber cellerne i 24 timer for at tillade celleadhæsion.
  3. Efter denne periode administreres de opløselige ekstrakter i kulturpladerne.
    1. Opsug cellekulturmediet.
    2. Der tilsættes biomaterialernes ekstrakter til hvert hul i overensstemmelse med koncentrationssekvensen som beskrevet tidligere. Der tilsættes frisk cellekulturmedium til kontrolhullerne.
    3. Inkuber pladerne i 24 timer eller længere.
      BEMÆRK: Der skal udføres negative kontroller i hvert assay, svarende til ubehandlede celler, der opretholdes i dyrkningsmediet. Inkubationstiderne kan vælges i overensstemmelse med undersøgelsesmålene.

4. Evaluering af metabolisk aktivitet

  1. Efter celleinkubationen med biomaterialernes ekstrakter aspireres mediet fra pladerne og vaskes hver brønd PBS.
  2. I hvert hul anbringes et passende volumen på 0,5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolbromid (MTT) fremstillet i PBS, pH 7,4.
  3. Inkuber pladerne i 4 timer eller natten over i mørke ved 37 ° C.
  4. For at opløse de opnåede formazankrystaller tilsættes det passende volumen på 0,04 M opløsning af saltsyre i isopropanol til hver brønd og omrøres plader i 30 minutter.
    BEMÆRK: Juster mængden af MTT og isopropanol i henhold til brøndenes størrelse.
  5. Indholdet af hvert hul omrøres og homogeniseres, om nødvendigt ved pipettering op og ned, indtil der ikke ses krystaller.
  6. Absorbansen kvantificeres ved en bølgelængde på 570 nm med et 620 nm referencefilter i spektrofotometeret.
  7. For at beregne metabolisk aktivitet divideres absorbansen af de behandlede celler ved absorbansen af kontrolkulturerne. For at opnå procentværdier multipliceres med 100.

5. Evaluering af celledød

BEMÆRK: For at udføre denne evaluering skal der anvendes mindst 106 celler pr. tilstand.

  1. Brug centrifugerør korrekt identificeret i overensstemmelse med de betingelser, der evalueres.
  2. Efter celleinkubationen med biomaterialernes ekstrakter samles kulturmediet til det respektive rør.
  3. Fjern cellerne, og tilsæt cellesuspensionen til de respektive rør.
  4. Koncentrer cellesuspensionerne ved centrifugering ved 120 x g i 5 minutter.
  5. Vask pillerne med PBS. PBS fjernes ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 minutter.
  6. Tilsæt 1 ml PBS og overfør cellepillerne til identificerede cytometrirør.
  7. PBS fjernes ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 minutter.
  8. Der inkuberes med 100 μL bindingsbuffer (0,01 M HEPES, 0,14 mM NaCl og 0,25 mM CaCl2)16, og cellerne får hvile i ca. 15 minutter til cellemembrangendannelse.
  9. Der tilsættes 2,5 μL fluorescerende mærket Annexin-V og 1 μL propidiumiodid i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
  10. Efter inkubation tilsættes 400 μL PBS og analyseres på cytometeret. Til analyse og kvantificering af informationen anvendes passende software.
  11. Nuværende resultater som en procentdel af levende celler, apoptose, sen apoptose / nekrose og nekrose.

6. Morfologi evaluering

  1. Vælg den passende størrelse steriliserede glasdæksler, der passer ind i multibrøndpladen.
  2. Placer hvert dias i en brønd ved hjælp af steril pincet.
  3. En cellulær suspension i en passende koncentration fordeles i hullerne og lades natten over i en inkubator ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 95% luft og 5% CO2.
  4. Udsæt cellekulturerne for ekstrakterne, som tidligere beskrevet.
  5. Opsug mediet og vask med PBS.
  6. Lad dækslerne tørre ved stuetemperatur, og tilsæt derefter en tilstrækkelig mængde May-Grünwald-opløsning til at dække dæksedlerne; inkuber i 3 minutter.
  7. Fjern farvestoffet og vask med destilleret vand i 1 minut.
  8. Fjern vandet og tilsæt et tilstrækkeligt volumen Giemsa-opløsning til at dække dækslerne; Inkuber i 15 minutter.
  9. Vask dækslerne i rindende vand.
  10. Overfør dæksedlerne til et dias.
  11. Se under et mikroskop. Tag fotografierne med den valgte forstørrelse.

7. Vurdering af cellefunktion gennem revers transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR)

BEMÆRK: For at udføre denne evaluering skal der anvendes mindst 2x106 celler pr. tilstand. Som et eksempel præsenteres alkalisk fosfatase som et gen af interesse for evaluering af odontoblastaktivitet. Andre gener af interesse kan ses i tabel 1.

  1. Plade cellerne som beskrevet ovenfor.
    BEMÆRK: Koncentrationen af udlagte celler skal muligvis justeres i overensstemmelse med celletypen og cytotoksiciteten af de biomaterialer, der undersøges.
  2. Der inkuberes med opløselige ekstrakter som beskrevet ovenfor.
  3. Fjern cellerne for at opnå en suspension som beskrevet før.
  4. Vask cellerne to gange med PBS; Til denne centrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Lysér cellerne ved at suspendere pelleten i 1 ml RNA-oprensningsopløsning (f.eks. NZYol), intens omrøring og successiv pipettering.
  6. Prøverne inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
  7. Tilsæt 200 μL chloroform og ryst glassene i hånden i 15 sekunder.
  8. Inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur.
  9. Centrifuger lysater ved 4 °C i 15 minutter ved 12.000 x g. Under denne centrifugering stammer to faser fra prøven, hvilket efterlader RNA'et i den vandige (øvre) fase.
  10. Fjern den vandige fase til et nyt rør og tilsæt 500 μL kold isopropanol for at udfælde RNA.
  11. Prøverne inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter og centrifugeres ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  12. Supernatanten fjernes og pellets vaskes med 1 ml 75% ethanol ved centrifugering ved 7.500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  13. Tør pelleten ved stuetemperatur indtil ethanolfordampning.
  14. Suspender i RNasefrit vand.
  15. Prøvernes renhedsgrad kvantificeres og bestemmes ved hjælp af absorptionsspektrofotometri ved bølgelængderne 260 nm og 280 nm. Bestem RNA-renheden og brug prøver med et renhedsforhold (A260/280) omkring 2,0.
  16. Opbevar prøver ved -80 ° C.
  17. Fortsæt med at udføre RT-PCR efter producentens protokol17.
    BEMÆRK: I overensstemmelse med undersøgelsesmålet skal du vælge de specifikke markører, der skal evalueres.

8. Vurdering af cellefunktion gennem proteinidentifikation

BEMÆRK: I henhold til undersøgelsesmålet skal du vælge de specifikke proteiner, der skal evalueres. Som et eksempel præsenteres dentin sialoprotein (DSP) som et protein af interesse for evaluering af odontoblastaktivitet. Andre proteiner af interesse kan ses i tabel 1.

  1. Kulturceller i dæksedler og udsættes for ekstrakterne, som beskrevet før.
  2. Cellekulturerne vaskes med PBS.
  3. Fastgør med 3,7% paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur.
  4. Vask to gange med PBS.
  5. Permeabilize med 0,5% Triton i PBS i 15 minutter.
  6. Bloker peroxidasen med 0,3% hydrogenperoxid i PBS i 5 minutter.
  7. Vask to gange med PBS.
  8. Vask to gange med 0,5% bovin serumalbumin (BSA).
  9. Bloker cellekulturer med 2% BSA i 45 minutter.
  10. Vask med 0,5% BSA i PBS.
  11. Inkuber kulturer med det primære antistof ifølge det valgte protein i 60 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Denne protokol bruger det primære antistof DSP (M20) antistof (1:100) og det sekundære antistof Polyclonal Rabbit Anti-ged immunglobuliner / HRP (1:100).
  12. Vask fem gange med 0,5% BSA i PBS.
  13. Inkuber med sekundært antistof i 90 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Foretag antistoffortyndingerne ved hjælp af 0,5% BSA i PBS.
  14. Vask fem gange med 0,5% BSA i PBS i 1 minut i hver vask.
  15. Der inkuberes kulturer med et substrat og en kromogenblanding i en koncentration på 20 μL kromogen/ml substrat i 25 minutter.
  16. Vask to gange med 0,5% BSA i PBS.
  17. Modfarve med hæmatoxylin i 15 minutter.
  18. Vask med en sekvens på 0,037 mol / l ammoniak og destilleret vand i 5 minutter for at fjerne overskydende farvestof.
  19. Monter dækslerne på diasene. Brug glycerol som monteringsmedium.
  20. Lad tørring natten over.
  21. Se under et mikroskop. Tag fotografierne med den valgte forstørrelse.

9. Vurdering af mineralisering gennem Alizarin Red S-assay

  1. Forbered en Alizarin Red S-opløsning i en koncentration på 40 mM18. Rør opløsningen til homogenisering i 12 timer i mørke.
    BEMÆRK: For at forberede 100 ml Alizarin Red S-opløsning opløses 1,44 g alizarinpulver (molekylvægt: 360 g / mol) i ultrarent vand, beskyttet mod lys. For denne opløsning er pH-værdien kritisk og bør være mellem 4,1 og 4,3.
  2. Inkuber cellekultur med opløselige ekstrakter som beskrevet ovenfor.
  3. Cellekulturer vaskes tre gange med PBS.
  4. Fastgør med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur.
  5. Vask tre gange med PBS.
  6. Plet med Alizarin Red Staining-opløsning i 20 minutter ved 37 °C i mørke.
  7. Efter farvning vaskes pladerne med PBS for at fjerne overskydende farvestof.
  8. Se under et mikroskop. Tag fotografierne med den valgte forstørrelse.
  9. Der tilsættes en ekstraktionsopløsning bestående af 10% (w/v) eddikesyre og 20% (w/v) methanol til hvert hul, og lad omrøring i 40 minutter ved stuetemperatur.
  10. Absorbansen måles ved bølgelængden 490 nm på et spektrofotometer19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De repræsentative resultater her henviser til undersøgelsen af dentale biomaterialer. Ekstraktmetoden gør det muligt at opnå en cytotoksicitetsprofil og cellefunktion efter eksponering for dentalmaterialerne med hensyn til virkninger på metabolisk aktivitet (figur 2), cellelevedygtighed, celledødsprofil og cellemorfologi (figur 3) og specifik proteinekspression (figur 4).

MTT-analysen bruges til at få et hurtigt overblik over materialernes cytotoksicitet på en ligetil måde. Der kan foretages en sammenligning mellem to eller flere materialer (figur 2); en alvorlig reduktion af metabolisk aktivitet, selv ved lave (6,25%) og mellemstore koncentrationer (50%), indikerer højere toksicitet (figur 2a). Samtidig giver mindre cytotoksiske materialer kun en lettere eller ingen reduktion (figur 2b). Sammenligninger mellem forskellige tidspunkter gør det muligt at bestemme mere umiddelbare cytotoksiske virkninger eller på senere stadier.

Effekter på cellelevedygtighed giver vigtig information om levedygtig cellereduktion, som kan kompromittere vævets evne til at komme sig efter en skadelig virkning. Bestemmelsen af procentdelen af levedygtige celler gør det muligt at sammenligne materialecytotoksicitet; flere cytotoksiske materialer inducerer højere celledød for samme koncentration (figur 3a og 3b). Reduktioner på over 30 % er kritiske og definerer materialer, der risikerer lav biokompatibilitet (figur 3a). Disse oplysninger udfyldes med celledødsprofilen (figur 3a og 3b). I de repræsentative resultater er mere cytotoksiske materialer karakteriseret ved et accentueret fald i cellelevedygtighed og for en sen apoptose og nekrosecelledødsprofil (figur 3a), mens mindre cytotoksiske giver mindre celledød og en mere apoptotisk og sen apoptotisk profil (figur 3b).

Oplysningerne fra den cellulære morfologievaluering (figur 3c) supplerer evalueringen af cellelevedygtigheden. Ændringer fra cellens typiske morfologi kan indikere en apoptotisk eller nekrotisk profil16. Yderligere oplysninger kan også fås fra denne protokol, som observation af materialepartikler (røde pile, figur 3C).

Specifikke markører, der er grundlæggende for cellefunktionen, påvirket af ekstrakteksponeringen, kan evalueres ved hjælp af flere teknikker, såsom immunhistokemi, PCR, flowcytometri, blotting eller kolorimetriske assays (tabel 1). Repræsentative resultater af DSP-ekspressionen efter eksponering for ekstrakter er vist i figur 4a, og det kan ses, at nogle materialer (tricalciumsilicatercementer) stimulerer cellerne til at øge proteinekspressionen. I modsætning hertil fremmer andre (calciumhydroxidcementer) et signifikant fald i proteinekspression uafhængigt af levedygtighedstab. I begge tilfælde påvirker koncentrationen af ekstrakterne direkte proteinekspressionen.

I MDPC-23-cellelinjen af odontoblastfænotypen er dannelsen af mineraliseringsaflejringer karakteristisk. Protokollen til identifikation og kvantificering af mineraliserede aflejringer gør det muligt at evaluere den specifikke funktion af denne type specialiserede celler. I det præsenterede tilfælde blev det observeret, at tricalciumsilicatcement udover at være mindre cytotoksisk stimulerer cellefunktionen, når der blev observeret en stigning i mineraliserede aflejringer (figur 4b). Tværtimod førte den mere cytotoksiske calciumhydroxidcement til reduceret mineralaflejring på grund af cellesvigt og død (figur 4b). Ud over en kvalitativ evaluering kan der foretages en kvantitativ bestemmelse (figur 4c).

Figure 2
Figur 2: Metabolisk aktivitet. Metabolisk aktivitet af MDPC-23-celler behandlet med calciumhydroxidcement [a)] og tricalciumsilicatcement [b)] opløselige ekstrakter i 24, 72 og 120 timer. Resultaterne normaliseres til kontrolcellekulturerne med en værdi på 100%. Væsentlige forskelle er repræsenteret af *, hvor * betyder p<0, 05, ** betyder p<0, 01, og *** betyder p<0, 001. En del af denne figur er ændret fra en tidligere publikation med tilladelse fra forlaget20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Cellelevedygtighed, dødsprofil og cellemorfologi. Cellelevedygtighed, celledødsprofil og cellemorfologi i MDPC-23-celler udsat for behandling med calciumhydroxid og tricalciumsilicatbiomaterialer ved 6,25% og 50% koncentration efter 120 timers eksponering. a) og b) Resultaterne afbildes som procentdelen af levende celler i apoptose, sen apoptose eller nekrose og nekrose. Signifikante forskelle med hensyn til kontrol eller mellem betingelser er repræsenteret med *, hvor * betyder p <0,05, ** betyder p <0,01 og *** betyder p <0,001. c) Celler farvet med May-Grünwald Giemsa efter behandling med en koncentration på 50% af biomaterialer, opløselige ekstrakter. Kontrolgruppen repræsenterer celler i kultur i DMEM med 10% FBS. Billeder i venstre kolonne blev opnået med en forstørrelse på 100x, og billederne i kolonnen til højre blev opnået med en forstørrelse på 500x. Figurbjælker repræsenterer 100 μm. En del af denne figur er ændret fra en tidligere publikation med tilladelse fra forlaget20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: DSP-ekspression og mineraliseret knudedannelse. a) MDPC-23-celler mærket ved immuncytokemi til påvisning af DSP-ekspression, når de udsættes for behandling med calciumhydroxid og tricalciumsilicat i koncentrationer på 50% og 6,25% efter 96 timers inkubation. b) Billeder fra dyrkede MDPC-23-celler farvet med Alizarin Red S-plet, når de behandles med calciumhydroxid og tricalciumsilicatbiomaterialer i koncentrationer på 50% og 6,25% efter 120 timers inkubation. Alle fotografierne blev opnået med en forstørrelse på 100x. Begge figurbjælker repræsenterer 150μm. c) Dannelse af calciumaflejringer fra MDPC-23-celler behandlet med calciumhydroxid og tricalciumsilicat efter 120 timers eksponering. Resultaterne er forholdet mellem absorbanserne af prøverne og kontrollen. Væsentlige forskelle er repræsenteret af *, hvor * betyder p<0, 05, ** betyder p<0, 01, og *** betyder p<0, 001. En del af denne figur er ændret fra en tidligere publikation med tilladelse fra forlaget20. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Liste over odontoblastiske differentierings-/funktionsmarkører47-79. Denne tabel indeholder en liste over odontoblastiske markører og detektionsmetoder; Nogle af disse markører udtrykkes også af andre væv.

Gen eller protein Metode Referencer
Alkalisk fosfatase (ALP) kolorimetri 47 48
Immuncytokemi 20 49
Northern Blot 50
RT-PCR 51 52
Indretning (DCN) kolorimetrisk ELISA 53
Immuncytokemi 54 55
RT-PCR 53 56
Dentinmatrixprotein 1 (DMP-1) Flow cytometri 57
Immuncytokemi 58 59
Northern Blot 50 60
RT-PCR 47 49
Western Blot 50 60
Dentinmatrixprotein 2 (DMP-2) Immuncytokemi 60 61
RT-PCR 50 62
Northern Blot 60
Western Blot 62
Dentinphosphoprotein (DPP) Immuncytokemi 63
Northern Blot 63
Dentin Sialoprotein (DSP)* Immuncytokemi 20 60
Northern Blot 60 63
RT-PCR 50
Western Blot 64 65
Dentin Sialophosphoprotein (DSPP) Flow cytometri 57
Immuncytokemi 66 54
RT-PCR 47 49
Northern Blot 67 68
Western Blot 64 62
Enemligsin/matrixmetalloproteinase-20 (MMP-20) Northern Blot 68
RT-PCR 49 68
Nestin Immuncytokemi 54 69
RT-PCR 70 71
Western Blot 72
Osteoadherin (OSAD) Immuncytokemi 73 74
Northern Blot 73
RT-PCR 75
Western Blot 73 74
Osteopontin (OPN) Immuncytokemi 76
Northern Blot 50
RT-PCR 66 51
Western Blot 77
Osteocalcin (OCN) Immuncytokemi 52
Northern Blot 50
RT-PCR 51 52
Western Blot 77 78
Osterix (OSX)/ Transskriptionsfaktor Sp7 (Sp7) Immuncytokemi 54 58
RT-PCR 78
Western Blot 78 79
Fosfatregulerende gen med homologier til endopeptidaser på X-kromosom (Phex) Northern Blot 68
RT-PCR 49 68
Western Blot 79
Runt-relateret transkriptionsfaktor 2 (Runx2) Immuncytokemi 66 52
RT-PCR 66 70
Western Blot 62 77
*DPP og DSP er spaltningsprodukterne fra DSPP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol blev udformet under hensyntagen til ISO 10993-5, som henviser til evaluering af in vitro cytotoksicitet af biomaterialer, der kommer i kontakt med vævene, for at evaluere biokompatibiliteten og bidrage til undersøgelser af reproducerbarhed21. Dette er en voksende bekymring inden for videnskab, og mange forfattere følger allerede disse anbefalinger i det eksperimentelle design af deres in vitro-undersøgelser 15,22,23,24,25,26,27,28.

Den foreslåede metode blev valgt til at screene de mest relevante aspekter af cellebiologi. Således går denne protokol ud over anbefalingerne, når den giver en komplet tilgang til evaluering af cytotoksicitet ved hjælp af fælles assays og en komplementær evaluering, herunder flere celleparametre fra fænotype til funktion. Denne komplementære evaluering er vigtig for virkelig at vurdere biomaterialeeffekten, når levedygtigheden muligvis ikke oversætter ændringer på niveau med gen- og proteinekspression, cellecyklus eller sektome.

Ekstrakterne er fordelagtige, især i klæbende cellelinjer, fordi der ikke er nogen interferens med cellebinding til substratet og optimale dyrkningsbetingelser, i modsætning til nogle direkte kontaktmetoder, hvor materialer placeres på overfladen af kulturpladen22,28.

Desuden tillader ekstrakter celleeksponering for forskellige koncentrationer29, hvilket efterligner diffusion af stoffer i væv, hvilket simulerer den clearance, de gennemgår in vivo, især når de påføres i kontakt med ekstremt kunstvandet væv. Test af direkte kontakt vurderer muligvis ikke forskellige koncentrationer nøjagtigt, og indirekte kontakttest viste potentielle vanskeligheder med ikke-diffusion, ufuldstændig diffusion gennem membraner eller reaktion med agar.

Test, der giver en kvantitativ vurdering, foretrækkes, hvor reduktion af cellelevedygtighed med mere end 30% betragtes som cytotoksisk11,30. Ved udviklingen af nye biomaterialer, hvis en sådan reduktion opstår, bestemmer det behovet for omformulering eller opgivelse. Hvis der opnås opmuntrende resultater, bør der udføres yderligere undersøgelser med henblik på in vivo-evaluering29,31.

In vitro-forsøg bør simulere eller overdrive de kliniske tilstande. Bestemmelsen af passende overfladevolumenforhold til ekstraktpræparation er således kritisk. Overflade/volumen-forhold på 1,25-6 cm2/ml blev foreslået. I tilfælde af materialer med overfladeuregelmæssigheder som skum er 0,1-0,2 g / ml eller 6 cm 2 / ml et udgangspunkt 15,20,2. Forholdet på 250 mm2pr. ml substrat blev anvendt i repræsentative resultater anvendt i denne protokol og andre undersøgelser 15,20.

Selvom de ikke anvendes på denne måde i klinikkerne, skal prøverne steriliseres ved metoder, der ikke ændrer deres egenskaber. UV-bestråling er ofte et godt valg. Dette er af afgørende betydning for at forhindre mikrobiel kontaminering af cellekulturer 11,24,32.

Ekstraktionsmedier omfatter cellekulturmedium med eller uden serum, fysiologisk saltopløsning, dimethylsulfoxid eller renset vand, udvalgt i henhold til biomaterialernes kemiske egenskaber 11,33. Med henblik på cellekulturundersøgelser foretrækkes brugen af cellekulturmediet, da det undgår yderligere behandlingstrin. Betingelserne for ekstraktion bør tilpasses forsøgsmodellen. I de repræsentative resultater vist i denne protokol blev DMEM-dyrkningsmediet suppleret med FBS anvendt i 24 ± 2 timer ved 37 ± 1 °C.

Nogle biomaterialer kan efterlade rester i ekstraktionsmediet, hvilket kan påvirke cellekulturerne negativt. Mens filtrering og centrifugeringer bør undgås, er det muligt at lade partiklerne sedimentere før brug. Et andet problem er pH, der kan lide ændring efter ekstraktion. Da det ikke anbefales at foretage yderligere justeringer11, skal ekstrakternes pH-værdi måles, registreres, og yderligere kontroller for at isolere pH-effekten skal om nødvendigt indgå i forsøgsdesignet.

Mens denne protokol blev beskrevet for klæbende cellekulturer, kan enkle modifikationer udføres for at anvende suspensionskulturer. På samme måde er det ud over at bruge faste biomaterialer muligt at tilpasse proceduren, i det væsentlige ekstraktionstrinnene, til at studere væsker, geler eller skum 34,35,36,37.

Fremstilling af cellekulturer med passende densitet er kritisk, især på cellekulturer med høj duplikeringshastighed31. I henhold til det anbefalede såtæthedsområde for de anvendte celler, hvis der er planlagt langvarige inkubationer, skal reduktionen af den oprindelige såtæthed udføres for at undgå de problemer, der er forbundet med overdreven sammenløb. Derudover kan stærkt cytotoksiske materialer kræve højere indledende såtætheder.

Udover fordelene ved ekstraktmetoden er det ikke det bedste valg til materialer, hvor evalueringen af celleadhærens er relevant. I dette tilfælde skal undersøgelserne af direkte kontakt udføres 38,39,40,41. Selv om dette er en omfattende tilgang, er det vigtigt at huske på, at det er en in vitro-vurdering, som ikke fuldt ud afspejler in vivo-betingelserne42.

Et biomateriale bør ikke kun forårsage skade på vævet, men stimulere nogle af de antiinflammatoriske og immunmodulerende processer43,44,45,46. Således går denne protokol videre med evalueringen af cellulære mekanismer, herunder cellelevedygtighed og celledødsprofil samt andre mekanismer for proteinsyntese. Den foretagne evaluering bør gøre det muligt at drage konklusioner om biomaterialets bioaktivitet i levende væv ud over cytotoksicitet.

Med eksplosionen af nye materialer til medicinske anvendelser, ikke kun til tandpleje, men også til ortopædi, kirurgi, oftalmologi, kardiologi osv., Bør de indledende screeninger foretages systematisk. Denne protokol kan være et vigtigt redskab for forskere, der sigter mod at udvikle og karakterisere nye biomaterialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker følgende for støtte: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB finansieres af nationale midler via FCT (Foundation for Science and Technology) gennem det strategiske projekt UIDB/04539/2020 og UIDP/04539/2020 (CIBB). Vi takker Jacques Nör, University of Michigan Dental School, for at levere cellelinjen MDPC-23.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CaCl2 Sigma 10035-04-8
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
DAB + Chromogen Dako K3468
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 Santa Cruz Biotechnology LS-C20939
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Hepes 0.01 M Sigma MFCD00006158
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Giemsa Stain, modified GS-500 Sigma MFCD00081642
Glycerol Dako C0563
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
May-Grünwald Stain MG500 Sigma MFCD00131580
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 Dako G-21234
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Substrate Buffer Dako 926605
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
β-actin antibody Sigma A5316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  2. Bruinink, A., Luginbuehl, R. Evaluation of biocompatibility using in vitro methods: interpretation and limitations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 126, 117-152 (2012).
  3. Wataha, J. C. Principles of biocompatibility for dental practitioners. The Journal of Prosthetic Dentistry. 86 (2), 203-209 (2001).
  4. Mishra, S. F. D. A. CE mark or something else?-Thinking fast and slow. Indian Heart Journal. 69 (1), 1-5 (2016).
  5. Barbeck, M., et al. Balancing Purification and Ultrastructure of Naturally Derived Bone Blocks for Bone Regeneration: Report of the Purification Effort of Two Bone Blocks. Materials. 12 (19), 3234 (2019).
  6. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  7. Coelho, C. C., Araújo, R., Quadros, P. A., Sousa, S. R., Monteiro, F. J. Antibacterial bone substitute of hydroxyapatite and magnesium oxide to prevent dental and orthopaedic infections. Materials Science and Engineering: C. 97, 529-538 (2019).
  8. Jung, O., et al. Improved In Vitro Test Procedure for Full Assessment of the Cytocompatibility of Degradable Magnesium Based on ISO 10993-5/-12. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 255 (2019).
  9. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  10. ISO. I.O. for S. ISO 10993-12:2012 - part 12: Sample preparation and reference materials. ISO. , (2012).
  11. ISO. I.O. for S. ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices - part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. ISO. , (2009).
  12. Srivastava, G. K., et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxicity evaluation. Scientific Reports. 8 (1), 1425 (2018).
  13. Pusnik, M., Imeri, M., Deppierraz, G., Bruinink, A., Zinn, M. The agar diffusion scratch assay--A novel method to assess the bioactive and cytotoxic potential of new materials and compounds. Scientific Reports. 6, 20854 (2016).
  14. Spiller, K. L., et al. The role of macrophage phenotype in vascularization of tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 35 (15), 4477-4488 (2014).
  15. Zhou, H., et al. In Vitro Cytotoxicity Evaluation of a Novel Root Repair Material. Journal of Endodontics. 39 (4), 478-483 (2013).
  16. Bordron, A., et al. The binding of some human antiendothelial cell antibodies induces endothelial cell apoptosis. Journal of Clinical Investigation. 101 (10), 2029-2035 (1998).
  17. Palmini, G., et al. Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma. Journal of Visualized Experiments. (116), e53884 (2016).
  18. Gregory, C. A., Grady Gunn, W., Peister, A., Prockop, D. J. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Analytical Biochemistry. 329 (1), 77-84 (2004).
  19. Cai, S., Zhang, W., Chen, W. PDGFRβ+/c-kit+ pulp cells are odontoblastic progenitors capable of producing dentin-like structure in vitro and in vivo. BMC Oral Health. 16 (1), 113 (2016).
  20. Paula, A., et al. Biodentine Boosts, WhiteProRoot MTA Increases and Life Suppresses Odontoblast Activity. Materials. 12 (7), 1184 (2019).
  21. Chander, N. G. Standardization of in vitro studies. Journal of Indian Prosthodontic Society. 16 (3), 227-228 (2016).
  22. Cavalcanti, B. N., Rode de M, S., França, C. M., Marques, M. M. Pulp capping materials exert an effect on the secretion of IL-1β and IL-8 by migrating human neutrophils. Brazilian Oral Research. 25 (1), 13-18 (2011).
  23. Chang, S., Lee, S. Y., Ann, H. J., Kum, K. Y., Kim, E. C. Effects of calcium silicate endodontic cements on biocompatibility and mineralization-inducing potentials in human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 40 (8), 1194-1200 (2014).
  24. Daltoé, M. O., Paula-Silva, F. W. G., Faccioli, L. H., Gatón-Hernández, P. M., De Rossi, A., Bezerra Silva, L. A. Expression of Mineralization Markers during Pulp Response to Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate. Journal of Endodontics. 42 (4), 596-603 (2016).
  25. Elias, R. V., Demarco, F. F., Tarquinio, S. B. C., Piva, E. Pulp responses to the application of a self-etching adhesive in human pulps after controlling bleeding with sodium hypochlorite. Quintessence International. 38 (2), 67-77 (2007).
  26. Huang, G. T. J., Shagramanova, K., Chan, S. W. Formation of odontoblast-like cells from cultured human dental pulp cells on dentin in vitro. Journal of endodontics. 32 (11), 1066-1073 (2006).
  27. Jafarnia, B., et al. Evaluation of cytotoxicity of MTA employing various additives. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 107 (5), 739-744 (2009).
  28. Paranjpe, A., Smoot, T., Zhang, H., Johnson, J. D. Direct contact with mineral trioxide aggregate activates and differentiates human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 37 (12), 1691-1695 (2011).
  29. Spagnuolo, G., et al. In vitro cellular detoxification of triethylene glycol dimethacrylate by adduct formation with N-acetylcysteine. Dental Materials. 29 (8), 153-160 (2013).
  30. Murray, P. E., García Godoy, C., García Godoy C, F. How is the biocompatibilty of dental biomaterials evaluated. Medicina Oral, Patologia Oral y Cirugia Bucal. 12 (3), 258-266 (2007).
  31. Hanks, C. T., Wataha, J. C., Sun, Z. In vitro models of biocompatibility: a review. Dental Materials. 12 (3), 186-193 (1996).
  32. Eid, A. A., et al. In Vitro Biocompatibility and Oxidative Stress Profiles of Different Hydraulic Calcium Silicate Cements. Journal of Endodontics. 40 (2), 255-260 (2014).
  33. Nocca, G., et al. Effects of ethanol and dimethyl sulfoxide on solubility and cytotoxicity of the resin monomer triethylene glycol dimethacrylate. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 100 (6), 1500-1506 (2012).
  34. Abuarqoub, D., Aslam, N., Jafar, H., Abu Harfil, Z., Awidi, A. Biocompatibility of Biodentine with Periodontal Ligament Stem Cells: In Vitro Study. Dentistry Journal. 8 (1), 17 (2020).
  35. Coelho, A. S., et al. Cytotoxic effects of a chlorhexidine mouthwash and of an enzymatic mouthwash on human gingival fibroblasts. Odontology. 108 (2), 260-270 (2020).
  36. Wang, M. O., et al. Evaluation of the In Vitro Cytotoxicity of Cross-Linked Biomaterials. Biomacromolecules. 14 (5), 1321-1329 (2013).
  37. Tyliszczak, B., Drabczyk, A., Kudłacik-Kramarczyk, S., Bialik-Wąs, K., Sobczak-Kupiec, A. In vitro cytotoxicity of hydrogels based on chitosan and modified with gold nanoparticles. Journal of Polymer Research. 24 (10), 153 (2017).
  38. Widbiller, M., et al. Three-dimensional culture of dental pulp stem cells in direct contact to tricalcium silicate cements. Clinical Oral Investigations. 20 (2), 237-246 (2016).
  39. Pintor, A. V. B., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of ReOss in Powder and Putty Configurations. Brazilian Dental Journal. 29 (2), 117-127 (2018).
  40. Pellissari, C. V. G., et al. In Vitro Toxic Effect of Biomaterials Coated with Silver Tungstate or Silver Molybdate Microcrystals. Journal of Nanomaterials. 2020, 1-9 (2020).
  41. Collado-González, M., et al. Cytotoxicity and bioactivity of various pulpotomy materials on stem cells from human exfoliated primary teeth. International Endodontic Journal. 50, 19-30 (2017).
  42. Paula, A., et al. Direct Pulp Capping: Which is the Most Effective Biomaterial? A Retrospective Clinical Study. Materials. 12 (20), 3382 (2019).
  43. Williams, D. F. There is no such thing as a biocompatible material. Biomaterials. 35 (38), 10009-10014 (2014).
  44. Schuh, J. C. L. Medical device regulations and testing for toxicologic pathologists. Toxicologic Pathology. 36 (1), 63-69 (2008).
  45. Pizzoferrato, A., et al. Cell culture methods for testing Biocompatibility. Clinical Materials. 15 (3), (1994).
  46. Pereira Paula, A. B., et al. Direct pulp capping: what is the most effective therapy? - review and meta-analysis. Journal of Evidence Based Dental Practice. , (2018).
  47. Caiaffa, K. S., et al. Effect of analogues of cationic peptides on dentin mineralization markers in odontoblast-like cells. Archives of Oral Biology. 103, 19-25 (2019).
  48. Fujiwara, S., Kumabe, S., Iwai, Y. Isolated rat dental pulp cell culture and transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anatomica Japonica. 83 (1), 15-24 (2006).
  49. Nakashima, M., et al. Stimulation of Reparative Dentin Formation by Ex Vivo Gene Therapy Using Dental Pulp Stem Cells Electrotransfected with Growth/differentiation factor 11 (Gdf11). Human Gene Therapy. 15 (11), 1045-1053 (2004).
  50. Narayanan, K., et al. Differentiation of embryonic mesenchymal cells to odontoblast-like cells by overexpression of dentin matrix protein 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4516-4521 (2001).
  51. Kim, H. J., Yoo, J. H., Choi, Y., Joo, J. Y., Lee, J. Y., Kim, H. J. Assessing the effects of cyclosporine A on the osteoblastogenesis, osteoclastogenesis, and angiogenesis mediated by the human periodontal ligament stem cells. Journal of Periodontology. , (2019).
  52. Bou Assaf, R., et al. Healing of Bone Defects in Pig's Femur Using Mesenchymal Cells Originated from the Sinus Membrane with Different Scaffolds. Stem Cells International. , (2019).
  53. He, W., et al. Lipopolysaccharide enhances decorin expression through the toll-like receptor 4, myeloid differentiating factor 88, nuclear factor-kappa B, and mitogen-activated protein kinase pathways in odontoblast cells. Journal of Endodontics. 38 (4), 464-469 (2012).
  54. Xiong, Y., et al. Wnt Production in Dental Epithelium Is Crucial for Tooth Differentiation. Journal of Dental Research. 98 (5), 580-588 (2019).
  55. Haruyama, N., et al. Genetic evidence for key roles of decorin and biglycan in dentin mineralization. Matrix Biology. 28 (3), 129-136 (2009).
  56. Sreenath, T., et al. Dentin Sialophosphoprotein Knockout Mouse Teeth Display Widened Predentin Zone and Develop Defective Dentin Mineralization Similar to Human Dentinogenesis Imperfecta Type III. Journal of Biological Chemistry. 278 (27), 24874-24880 (2003).
  57. Yang, Y., Zhao, Y., Liu, X., Chen, Y., Liu, P., Zhao, L. Effect of SOX2 on odontoblast differentiation of dental pulp stem cells. Molecular Medicine Reports. 16 (6), 9659-9663 (2017).
  58. Tao, H., et al. Klf4 Promotes Dentinogenesis and Odontoblastic Differentiation via Modulation of TGF-β Signaling Pathway and Interaction With Histone Acetylation. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (8), 1502-1516 (2019).
  59. Massa, L. F., Ramachandran, A., George, A., Arana-Chavez, V. E. Developmental appearance of dentin matrix protein 1 during the early dentinogenesis in rat molars as identified by high-resolution immunocytochemistry. Histochemistry and Cell Biology. 124 (3-4), 197-205 (2005).
  60. Hao, J., Zou, B., Narayanan, K., George, A. Differential expression patterns of the dentin matrix proteins during mineralized tissue formation. Bone. 34 (6), 921-932 (2004).
  61. Tompkins, K., Alvares, K., George, A., Veis, A. Two related low molecular mass polypeptide isoforms of amelogenin have distinct activities in mouse tooth germ differentiation in vitro. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (2), 341-349 (2005).
  62. Zhai, Y., et al. Activation and Biological Properties of Human β Defensin 4 in Stem Cells Derived From Human Exfoliated Deciduous Teeth. Frontiers in Physiology. 10, (2019).
  63. Bègue-Kirn, C., Ruch, J. V., Ridall, A. L., Butler, W. T. Comparative analysis of mouse DSP and DPP expression in odontoblasts, preameloblasts, and experimentally induced odontoblast-like cells. European Journal of Oral Sciences. 106, 254-259 (1998).
  64. Kikuchi, H., Suzuki, K., Sakai, N., Yamada, S. Odontoblasts induced from mesenchymal cells of murine dental papillae in three-dimensional cell culture. Cell and Tissue Research. 317 (2), 173-185 (2004).
  65. Li, X., Yang, G., Fan, M. Effects of homeobox gene distal-less 3 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 38 (11), 1504-1510 (2012).
  66. Chen, S., et al. Differential regulation of dentin sialophosphoprotein expression by Runx2 during odontoblast cytodifferentiation. Journal of Biological Chemistry. 280 (33), 29717-29727 (2005).
  67. Narayanan, K., Gajjeraman, S., Ramachandran, A., Hao, J., George, A. Dentin matrix protein 1 regulates dentin sialophosphoprotein gene transcription during early odontoblast differentiation. Journal of Biological Chemistry. 281 (28), 19064-19071 (2006).
  68. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. A substractive PCR-based cDNA library from human odontoblast cells: identification of novel genes expressed in tooth forming cells. Matrix Biology. 19 (5), 421-430 (2000).
  69. Miyazaki, T., Baba, T., Mori, T., Komori, T. Collapsin Response Mediator Protein 1, a Novel Marker Protein for Differentiated Odontoblasts. Acta Histochemica et Cytochemica. 51 (6), 185-190 (2018).
  70. Yokoi, M., Kuremoto, K., Okada, S., Sasaki, M., Tsuga, K. Effect of attenuation of fibroblast growth factor receptor 2b signaling on odontoblast differentiation and dentin formation. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 55 (3), 211-219 (2019).
  71. Tohma, A., et al. Glucose Transporter 2 and 4 Are Involved in Glucose Supply during Pulpal Wound Healing after Pulpotomy with Mineral Trioxide Aggregate in Rat Molars. Journal of Endodontics. , (2019).
  72. Sueyama, Y., Kaneko, T., Ito, T., Kaneko, R., Okiji, T. Implantation of Endothelial Cells with Mesenchymal Stem Cells Accelerates Dental Pulp Tissue Regeneration/Healing in Pulpotomized Rat Molars. Journal of Endodontics. 43 (6), 943-948 (2017).
  73. Petersson, U., Hultenby, K., Wendel, M. Identification, distribution and expression of osteoadherin during tooth formation. European Journal of Oral Sciences. 111 (2), 128-136 (2003).
  74. Couble, M. L., et al. Immunodetection of osteoadherin in murine tooth extracellular matrices. Histochemistry and Cell Biology. 121 (1), 47-53 (2004).
  75. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. Expression of the small leucine-rich proteoglycan osteoadherin/osteomodulin in human dental pulp and developing rat teeth. Bone. 27 (2), 265-270 (2000).
  76. Salmon, B., et al. Abnormal osteopontin and matrix extracellular phosphoglycoprotein localization, and odontoblast differentiation, in X-linked hypophosphatemic teeth. Connective Tissue Research. 55, SUPPL. 1 79-82 (2014).
  77. Liao, C., Ou, Y., Wu, Y., Zhou, Y., Liang, S., Wang, Y. Sclerostin inhibits odontogenic differentiation of human pulp-derived odontoblast-like cells under mechanical stress. Journal of Cellular Physiology. 234 (11), 20779-20789 (2019).
  78. Deng, X., et al. The combined effect of oleonuezhenide and wedelolactone on proliferation and osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells. Phytomedicine. 153103, (2019).
  79. Choi, H., Kim, T. H., Yun, C. Y., Kim, J. W., Cho, E. S. Testicular acid phosphatase induces odontoblast differentiation and mineralization. Cell and Tissue Research. 364 (1), 95-103 (2016).

Tags

Tilbagetrækning udgave 173 biokompatibilitet biomaterialer cellekultur cytotoksicitet konditioneret medium ekstrakter
Adgang til cytotoksicitet og cellerespons på biomaterialer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho,… More

Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho, A. S., Abrantes, A. M., Gonçalves, A. C., Sarmento-Ribeiro, A. B., Ferreira, M. M., Botelho, M. F., Marto, C. M., Carrilho, E. Accessing the Cytotoxicity and Cell Response to Biomaterials. J. Vis. Exp. (173), e61512, doi:10.3791/61512 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter