在这里,我们提出了一种方法,从同源突变Lamin+8-11小鼠模型,一个非常严重的模型Emery-Dreifus肌肉萎缩症(EDMD)在出生后早期发育阶段有效地获得单肌肉纤维。
自体显性Emery-Dreifus肌肉萎缩症(EDMD)是由LMNA基因的突变引起的,该基因编码A型核拉明、维持核包络的中间丝蛋白和核细胞的成分。我们最近报告说,EDMD中的肌肉消瘦可以归因于影响肌肉(卫星)干细胞再生能力的内在表观遗传功能障碍。单一肉动物的分离和培养是监测卫星细胞在其利基范围内行为的最生理外生物方法之一,因为它们仍然存在于纤维周围的基底拉米纳和肉瘤之间。因此,它代表了一个宝贵的实验范例,研究卫星细胞从各种穆林模型。在这里,我们描述了一个重新适应的方法,从产后后肢肌肉(提比亚利斯前体,外向数字龙,胃和太阳)分离完整和可行的单肌异体。按照这个协议,我们能够在出生后19天研究Lamin+8-11-/—–小鼠的卫星细胞,这是一种严重的EDMD鼠型。
我们详细介绍了隔离程序,以及获得大量 myofibers 及其相关卫星细胞衍生后代的培养条件。当在生长因子丰富的培养中培养时,来自野生型小鼠的卫星细胞会激活、增殖,并最终分化或进行自我更新。在同源Lamin+8-11-/-突变小鼠中,这些能力严重受损。 Lamin
这项技术,如果严格遵循,允许研究所有过程链接到肌纤维相关的卫星细胞,即使在产后早期发育阶段和脆弱的肌肉。
骨骼肌是一种分化组织,在运动或创伤1后具有最扩展的再生能力之一。这一特性主要是由于干细胞的存在,称为卫星细胞,因为它们在基础层和血浆之间的外围位置。在产后发育过程中,卫星细胞增殖并逐渐分化,从而促进骨骼肌生长。一旦成年,卫星细胞进入可逆的静止状态,在生理或病理创伤,他们激活,增殖和分化,以修复受损的肌肉3。卫星细胞通过这些不同的再生阶段并经历自我更新的能力的缺陷与肌肉消,瘦密切相关,无论是生理老化4、5、6,,5,还是肌肉退行性疾病,如肌肉萎缩症7、8、9、10。,89,10
研究卫星细胞外体有两种主要培养方法:来自单核细胞的原发性肌源培养物,机械和化学分离出整个肌肉11、12;11,12或孤立的 myofibers文化 13,,14,,15,,16,,17,,18,,19,,20。在第一种情况下,卫星细胞分离的过程涉及从小鼠中提取的整个肌肉的三角化,化学消化、过滤和荧光活性细胞分选(FACS)21。这个过程,虽然有效地将卫星细胞从各种模型中隔离,但需要几个变量,使卫星细胞受到压力,并破坏其生理利基22,23。22,相比之下,肌纤维分离涉及用基质降解酶更温和地消化肌肉组织,以及机械粉碎,导致干细胞20的创伤减少。第二种方法允许更有效地检索可行的卫星细胞,这些细胞在基底层和肉瘤之间物理上附着在它们的真菌纤维上,从而允许在其生理利基19,20中进行分析。
在过去的几年里,已经提出了许多不同的方案,以正确和有效地将单个肌骨与骨骼肌分离。比肖夫已经在1986年提出了一个协议,将纤维从Flexor DigitorumBrevis13分离出,后来,在1995年,罗森布拉特等人修改了协议,以获得更有效的分离肌纤维14。从那时起,许多其他作者提出了调整程序的其他肌肉,如外向数字龙us(EDL)和Tibialis前(TA)15,16,17,18,19,20,这是更长,即使更脆弱,15,16,17,18,19,20肌肉14。然后,分离的肌黄细胞可以培养既粘附,允许卫星细胞衍生的肌细胞的扩展,或在浮动条件下,长达96小时,以遵循从单个卫星细胞19(图1)派生的后代。培养培养的血清的可变浓度用于触发卫星细胞的活化、增殖和/或分化,研究它们通过这些不同阶段1中适当传递的能力。
我们最近描述了EDMD的小鼠模型,Lamin+8-11-/—小鼠7中卫星Lamin干细胞池耗尽背后的表观遗传机制。由于这些小鼠通常在24岁4-8周之间死亡,由于严重的肌肉损失,因此试图通过专注于产后肌肉发育的分析来捕捉疾病早期发病的分子缺陷。漂浮的单一动物被分离和培养从野生类型和Lamin+8-11 -/-突变7 19天大的小鼠。在这个阶段,肌肉缺陷已经很明显,但老鼠仍然是可行的。然而,由于上述单肌肌提取协议都针对成年小鼠的骨骼肌进行了优化,我们需要根据我们的目的调整它们:年龄和体型非常小的小鼠,以及非常脆弱的肌骨骼。因此,我们在这里描述我们重新适应鲁德尼基实验室19提出的协议,从产后发育过程中从小鼠和严重的营养不良肌肉,如那些从Lamin+8-11——-小鼠24获得大量的单一可行的肌黄鼠。这种方法的最终目标是在产后发育的早期阶段感兴趣时,或在小鼠模型携带任何特定疾病使肌黄鼠体更容易受到机械应力影响的情况下,为任何其他小鼠模型中的肌黄细胞相关肌肉干细胞的研究提供标准化程序。
分离完整的单肌纤维是肌生成领域的基本方法,当时主要目标是描述肌肉干细胞在健康和病理条件下的利基细胞自主再生能力。然而,当生化或基因组研究感兴趣时,FACS分离的卫星细胞可能是最佳选择。
单肌细胞隔离允许遵循前活体,但在最生理的方式,在肌肉再生过程中,单卫星细胞经历的所有步骤的动态,即:激活,细胞分裂(不对称和对称),分化和通过自我更新恢复静默。一旦在漂浮条件下生长,单个卫星细胞就激活并膨胀,形成一组细胞,所有这些细胞都来自同一个卫星细胞。增殖、分化、活化或茎性标记的免疫荧光分析是量化细胞阶段之间比例的最佳方法。
我们协议的关键步骤,以获得可行和完整的肌腱可以被认为是快速但温和的肌肉解剖,通过肌腱到肌腱隔离,以避免任何肌肉损伤。我们的建议是只使用锋利的剪刀和小锋利的钳子,并限制整个肌肉解剖程序到十分钟。当难以分离非常小的肌肉(即 EDL 和 TA)时,可以将它们切割在一起,然后沿着纤维的纵向平面图使用精细剪刀切割来分割它们。这一策略最终将给予不太完整的 myofibers,但生存能力不会受到影响。同样的大肌肉,如胃关节,以促进消化。消化时间优化,需要经验验证,对分离纤维的最小操作也是后续分析的正结果的两个关键方面。
这里报道的协议的优点是,它可以应用于非常小的小鼠(在年龄和尺寸),即使他们的肌肉是非常脆弱的。即使上面没有提及,也有可能遵循这个解剖协议,然后培养可行的 myofibers 使用地下室膜涂层的盘子18,,19 的较长时间。重要的是要考虑,这种情况是完全不同的浮动条件,其中粘附刺激和接近刺激不存在。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢安德烈·比安奇、意大利拉米诺病网络和实验室成员的支持和所有建设性意见。我们感谢基亚拉·科迪格里耶里在共声显微镜方面提供的宝贵帮助。作者感谢比阿特丽斯·比费拉利博士为拍摄照片而提供帮助。这里介绍的工作得到了我的第一个 AIRC 赠款 n 的支持。 18535, AFM-Telethon n. 21030, 意大利卫生部长 n. GR-2013-02355413 和 Cariplo 2017-0649 到 C.L. C.M. 得到我的第一个 AIRC 赠款 n.18993 和 AFM-Telethon n. 22489. 的支持。
4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
Lab equipment | Manufacturer | ||
Bunsen burner | |||
Confocal microscope | Leica | ||
Diamond pen | bio-optica | ||
Dissection pins | |||
FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
Glass coverslips | Thermofisher | ||
Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
Glass slides | Thermofisher | ||
Micro dissecting scissors | |||
Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
Micropipette tips | Corning | ||
Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
Rubber pipette bulbs | VWR | ||
Sharp tweezers | |||
Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
Water bath at 37°C | VWR |