Summary
Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.
Abstract
Autosomal dominante Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD) wird durch Mutationen im LMNA-Gen verursacht, das die A-Typ-Kernlamine, Zwischenfilamentproteine, die die Kernhülle und die Komponenten des Nukleoplasmas unterstützen, kodiert. Wir berichteten vor kurzem, dass Muskelschwund in EDMD kann intrinsische epigenetische Dysfunktionen beeinflussen Muskel (Satelliten) Stammzellen regenerative Kapazität zugeschrieben werden. Isolation und Kultur einzelner Myofiber ist einer der physiologischen Ex-vivo-Ansätze zur Überwachung des Verhaltens von Satellitenzellen in ihrer Nische, da sie zwischen den Basallamina, die die Faser umgibt, und dem Sarcolemma verbleiben. Daher stellt es ein unschätzbares experimentelles Paradigma dar, um Satellitenzellen aus einer Vielzahl von murinen Modellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine neu angepasste Methode, um intakte und lebensfähige einzelne Myofiber von postnatalen HinterbeinerMuskeln zu isolieren (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius und Soleus). Nach diesem Protokoll konnten wir satellitenzellen von Lamin 8-11 -/- Mäusen, einem schweren EDMD-Murine-Modell, nur 19 Tage nach der Geburt untersuchen.
Wir beschreiben das Isolationsverfahren sowie die Kulturbedingungen für die Beschaffung einer guten Menge von Myofibers und der damit verbundenen Satellitenzellen-abgeleiteten Nachkommen. Wenn sie in wachstumsfaktorreichen Medien kultiviert werden, aktivieren, vermehren sich Satellitenzellen, die von Wildtypmäusen abgeleitet wurden, und differenzieren sich oder unterziehen sich schließlich selbst. Bei homozygoten Lamin-Ampon-Mäusen sind diese Fähigkeiten stark beeinträchtigt. Lamin
Diese Technik, wenn sie streng befolgt wird, erlaubt es, alle Prozesse zu untersuchen, die mit der myofiberassoziierten Satellitenzelle verbunden sind, auch in frühen postnatalen Entwicklungsstadien und in fragilen Muskeln.
Introduction
Skelettmuskel ist ein differenziertes Gewebe mit einer der am weitesten ausgedehnten Fähigkeit, sich nach dem Training oder Trauma zu regenerieren1. Diese Eigenschaft ist hauptsächlich auf das Vorhandensein von Stammzellen zurückzuführen, die wegen ihrer peripheren Position zwischen der Basallamina und dem Plasmalemma des Myofibers2als Satellitenzellen bezeichnet werden. Während der postnatalen Entwicklung vermehren sich Satellitenzellen und differenzieren sich nach und nach und so zum Skelettmuskelwachstum. Einmal im Erwachsenenalter, Satellitenzellen in einen reversiblen Ruhezustand, und bei physiologischen oder pathologischen Traumata, sie aktivieren, vermehren und differenzieren, um die beschädigten Muskeln zu reparieren3. Defekte in der Fähigkeit von Satellitenzellen, diese verschiedenen regenerativen Phasen richtig zu durchlaufen und sich selbst zu erneuern, wurden fest mit Muskelschwund verbunden, entweder während der physiologischen Alterung4,5,, 6 oder bei Muskeldegenerativen Erkrankungen, wie Muskeldystrophien7,8,9,10.
Es gibt zwei Hauptkulturansätze zur Untersuchung von Satellitenzellen ex-vivo: primäre myogene Kulturen aus mononukleierten Zellen, mechanisch und chemisch vom ganzen Muskel11,12getrennt; oder Kultur der isolierten Myofiber13,14,15,16,17,18,19,20. Im ersten Fall beinhaltet der Prozess der Isolierung von Satellitenzellen die Triturierung ganzer Muskeln, die aus der Maus extrahiert werden, eine chemische Verdauung, Filtration und fluoreszierende aktivierte Zellsortierung (FACS)21. Dieses Verfahren, obwohl wirksam bei der Isolierung von Satellitenzellen aus einer Vielzahl von Modellen, beinhaltet mehrere Variablen, die Satellitenzellen Stress aussetzen und ihre physiologische Nische stören22,23. Im Gegensatz dazu beinhaltet die Myofiber-Isolation eine schonendere Verdauung von Muskelgewebe mit matrixabbauenden Enzymen und eine mechanische Zerkleinerung, die zu einem reduzierten Trauma der Stammzellen20führt. Dieser zweite Ansatz ermöglicht eine viel effizientere Rückgewinnung lebensfähiger Satellitenzellen, die physisch an ihrem Myofiber zwischen der Basallamina und dem Sarcolemma befestigt bleiben, wodurch analysen innerhalb ihrer physiologischen Nische19,20ermöglicht werden.
In den letzten Jahren wurden viele verschiedene Protokolle vorgeschlagen, um einzelne Myofiber richtig und effizient von den Skelettmuskeln zu isolieren. Bereits 1986 schlug Bischoff ein Protokoll zur Isolierung von Fasern aus dem Flexor Digitorum Brevis13 vor und später, 1995, modifizierten Rosenblatt et al. das Protokoll, um eine effizientere Trennung von Myofibers14zu erhalten. Seitdem schlugen viele andere Autoren angepasste Verfahren für andere Muskeln vor, wie Extensor Digitorum Longus (EDL) und Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, die länger sind, wenn auch zerbrechlicher, Muskeln14. Isolierte Myofiber können dann sowohl in der Haftung kultiviert werden, um die Ausdehnung von Satellitenzellen abgeleiteten Myoblasten zu ermöglichen, oder unter schwimmenden Bedingungen, bis zu 96 Stunden, um der Nachkommenschaft zu folgen, die aus einzelnen Satellitenzellen abgeleitet ist19 (Abbildung 1). Variable Serumkonzentrationen innerhalb des Kulturmediums werden verwendet, um die Aktivierung, Proliferation und/oder Differenzierung von Satellitenzellen auszulösen, um ihre Fähigkeit zu untersuchen, diese verschiedenen Phasen ordnungsgemäß zu durchlaufen1.
Kürzlich beschrieben wir den epigenetischen Mechanismus hinter der Erschöpfung des Satellitenstammzellpools im Mausmodell von EDMD, dem Lamin 8-11 -/- Maus7. Da diese Mäuse in der Regel zwischen 4-8 Wochen im Alter von24Jahren sterben, aufgrund eines schweren Muskelverlustes, wurde versucht, die molekularen Defekte zu erfassen, die dem frühen Beginn der Krankheit zugrunde liegen, indem unsere Analyse auf die postnatale Muskelentwicklung konzentriert wird. Schwimmende Einzelne Myofiber wurden isoliert und kultiviert von wildem Typ und Lamin 8-11 -/- mutierte7 19 Tage alte Mäuse. In diesem Stadium sind Muskeldefekte bereits offensichtlich, aber Mäuse sind immer noch lebensfähig. Da jedoch alle oben genannten Protokolle für die Extraktion einzelner Myofiber für Skelettmuskeln erwachsener Mäuse optimiert wurden, mussten wir sie an unsere Zwecke anpassen: sehr kleine Mäuse in Alter und Größe und sehr zerbrechliche Myofiber. So beschreiben wir hier unsere Neuanpassung des vom Rudnicki-Labor19 vorgeschlagenen Protokolls, um eine signifikante Anzahl von einzelnen lebensfähigen Myofiden von Mäusen während der postnatalen Entwicklung und von schweren dystrophischen Muskeln zu erhalten, wie sie von Lamin -/- Mäusen 24abgeleitet wurden. Das Endziel dieses Ansatzes ist es, ein standardisiertes Verfahren für die Untersuchung von Myofibers-assoziierten Muskelstammzellen in jedem anderen Mausmodell bereitzustellen, wenn die frühen Stadien der postnatalen Entwicklung von Interesse sind, oder im Falle von Mausmodellen, die eine bestimmte Krankheit tragen, die Myofibers anfälliger für mechanische Belastung macht.
Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden unter der ethischen Genehmigung des italienischen Gesundheitsministeriums und des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung durchgeführt (Genehmigung N. 83/2019-PR). Die Tiere wurden in einer autorisierten Einrichtung im Krankenhaus San Raffaele, Mailand, Italien gehalten (Genehmigung N. N. 127/2012-A).
1. Muskelsektion und Myofiberkultur
- Gerätevorbereitung.
- Bevor Sie beginnen, bereiten Sie alle notwendigen Lösungen vor, wie in Tabelle 1beschrieben. Diese Lösungen müssen frisch vorbereitet werden.
- Reinigen Sie alle Oberflächen und Werkzeuge, die während des Verfahrens verwendet werden, mit 70% Ethanol.
- Bevor Sie mit Mäusen Opfer beginnen, führen Sie Beschichtung von 100 mm und 35 mm Petrischalen mit Horse Serum (HS). Mantel alle Gerichte, um myofibers von der Befestigung am Kunststoff zu verhindern. Erwägen Sie die Verwendung einer 100-mm-Schale und vier 35-mm-Schalen pro Maus.
- Nach dem Entfernen des HS-Überschusses, lagern Sie beschichtete Gerichte in einem Inkubator bei 37 °C für 30 min. Dann füllen Sie es mit Waschlösung oder Kulturmedium (zwei 35 mm Geschirr pro Maus).
HINWEIS: Alternativ kann eine Lösung von 10% HS in Dulbeccos modifiziertem Eagle es Medium (DMEM) verwendet werden, um Geschirr zu beschichten. Verwenden Sie immer beschichtete Gerichte. Es ist möglich, Kulturgerichte unterschiedlicher Größe zu verwenden, aber kleine Dimension Petri-Gerichte werden empfohlen. - Für die Isolierung von Fasern, bereiten Sterilpasteur Pipetten wie in Abbildung 2gezeigt. Für jede Maus bereiten Sie eine große Bohrung Pipette für Muskelhandhabung und mechanische Disaggregation (Abbildung 2A) und eine kleine Lochpipette für faserauswahl (Abbildung 2B). Schneiden Sie jede Glaspipette, möglicherweise mit einem Diamantstift, auf die gewünschte Länge und glatte Pipettenkanten auf einer Flamme.
- Beschichten Sie jede Pipette, indem Sie sie vor Gebrauch kurz mit HS benetzen.
- Mausopfer und Muskelsektion
- Vor dem Beginn des Dissektionsvorgangs die Verdauungslösung bei Raumtemperatur 10 min vorwärmen. Polypropylen FACS Rundbodenrohre sind die am besten geeigneten Behälter für diesen Zweck.
- Unmittelbar vor Beginn der Muskelabrufung, opfern Sie die Maus nach der richtigen nationalen IACUC Empfehlung.
- Befeuchten Sie seinen Unterkörper mit 70% Ethanol, bevor Sie die Haut schneiden, um die Entfernung des Haares zu erleichtern.
- Setzen Sie die Maus in eine anfällige Position auf einer Stütze von Polystyrol mit Aluminiumpapier bedeckt und schneiden Sie die Haut von der Mitte des Rückens längs und in Richtung der Beine.
- Entfernen Sie vorsichtig die Haut, ohne die Muskeln und Sehnen zu berühren. Es ist möglich, die ganze Haut abzuzocken.
- Schneiden Sie die beiden Beine der Maus und gehen Sie schnell mit der Zerlegung.
HINWEIS: Wenn es bequemer ist, ist es möglich, die Sezieren auf der gesamten Maus fortzusetzen, aber die Arbeit am Bein ermöglicht mehr Mobilität und Präzision in den späteren Schnitten. - Fixieren Sie das Bein auf der Stütze auf der Ebene des Fußes mit einem Stift und beginnen Sie, Skelettmuskeln von Interesse in dieser Reihenfolge zu isolieren: TA, EDL, Gastrocnemius und Soleus.
- Heben Sie die untere Sehne von TA mit einer scharfen Pinzette in Knöchelhöhe und schneiden Sie sie, dann schneiden Sie mit feiner Schere rund um den TA-Muskel auf die andere Sehne auf der Ebene der Patella(Abbildung 3A). Transfer in die Verdauungslösung.
- Heben Sie die untere Sehne von EDL und trennen Sie sie von anderen Muskeln, indem Sie sie sanft nach oben zur anderen Sehne ziehen. Schneiden und in die Verdauungslösung geben.
HINWEIS: Da EDL extrem klein sein kann, um getrennt von TA geschnitten zu werden, können sie zusammen seziert werden (Abbildung 3B). Dann, wenn der gesamte Muskel zu groß ist, schneiden Sie ihn in 2-3 Stücke ab der Sehne und folgen Sie den Fasern in Längsrichtung (Abbildung 3C). - Drehen Sie das Bein, das die Rückenmuskulatur zeigt, und fixieren Sie den Fuß mit dem Stift. Heben Sie die Sehne des Achille, Gastrocnemius wird automatisch von anderen Muskeln trennen. Die obere Sehne befindet sich im hinteren Teil der Patella. Schneiden Sie es und fügen Sie den Muskel zur Verdauung hinzu.
- Heben Sie die äußere Sehne des Beins (in Bezug auf den Körper) und erhalten Sie den Soleus. Trennen Sie es vorsichtig von den anderen Muskeln, indem Sie mit der Pinzette unterblättern.
- Gleiches gilt für die andere Etappe (Schritte von 1.2.7. bis 1.2.11.).
- Muskelverdauung
- Inkubieren Sie die Verdauungslösung, die alle Muskeln in einem Wasserbad bei 37 °C für ca. 45-50 min enthält. Während der Verdauungszeit, regelmäßig überprüfen Sie den Muskel, um eine Überverdauung zu vermeiden. Alle 10 min invertieren die Verdauungsröhren 10x mit einer energetischen Bewegung (Wirbel vermeiden).
- Stoppen Sie die Verdauung, wenn sich die Muskeln zu lockern beginnen und Myofiber sichtbar sind.
- Ganz am Ende der Verdauungszeit schütteln die Proben.
- Um die Verdauung zu stoppen, übertragen Sie die Verdauungssuspension vorsichtig auf eine vorgewärmte 100 mm Petrischale mit 10 ml Waschlösung.
HINWEIS: Vermeiden Sie eine Muskelüberverdauung, da dies unweigerlich zur Isolierung von hyperkontrahierten Myofibianen führen wird. Normalerweise mit diesem Protokoll, Muskeln von homozygoten mutierten Mäusen nehmen 45 min verdaut werden, während Muskeln von wilden Typ Mäuse nehmen 50-55 min. Verdauungszeit muss experimentell validiert werden.
- Einzelne Myofibers-Isolierung
- Isolieren Sie zunächst die Fasern, die bereits unter einem Seziermikroskop dissoziiert sind, indem Sie sie einzeln mit einer beschichteten P200 Pipette oder einem kleinen Loch Pasteur pflücken und vom 100 mm Petri in eine neue 35 mm Petrischale mit 5 ml vorgewärmter Waschlösung übertragen.
- Um weitere Myofiber s zu lösen, pipette den Muskel auf und ab mit einer großen Lochbohrung Glaspipette mit warmem Medium, bis Fasern mechanisch freigesetzt werden. Seien Sie nicht zu hartnäckig, da dies zu schädlichen Fasern führt.
- Fahren Sie fort, Myofibers aus dem Muskel zu lösen, bis die Schale eine wünschenswerte Menge enthält. Wenn die Petrischale länger als 8 min bei Raumtemperatur gehalten wird, stoppen Sie und führen Sie mindestens 5 min Inkubation bei 37 °C durch, 5%CO2, um das Medium wieder auszubessern.
- Bevor Sie die einzelnen Myofiber auf das Kulturmedium übertragen, lassen Sie sie bei 37 °C, 5%CO2 in der Waschschüssel für mindestens 1 h. Dies hilft Myofibers, sich an den In-vitro-Zustand anzupassen.
HINWEIS: Erwachsene Myofiber sind weniger anfällig für Stress und können 2-3x gewaschen werden. Jedoch, in diesem Zustand (bei 19 Tagen nach dem Geburtsalter) ist es besser, nur einen Waschschritt durchzuführen, um Myofiberschäden zu verhindern. Achten Sie daher immer darauf, ausgewählte Myofiber ausreichend sauber zu halten, indem Sie keine Trümmer oder Hyper-Vertragsfasern tragen.
- Einzelne myofiber ische Kultur
- Übertragen Sie einzelne Myofiber auf ein neues vorgewärmtes Gericht mit dem entsprechenden Kulturmedium (hohes Serummedium, um die Aktivierung von Satellitenzellen zu ermöglichen, siehe Abbildung 1).
- Ändern Sie das Medium zu den isolierten Myofibers, indem Sie sie auf ein neues beschichtetes Gericht mit neuem Kulturmedium übertragen, erst nach 48-72 h Kultur, um jeglichen Stress zu vermeiden, der zu Myofibers Hyperkontraktion und Störung führen wird.
2. Nachgelagerte Anwendungen: Myofibers Vernetzung und Immunfluoreszenz
HINWEIS: Die myofibers-assoziierten Satellitenzellen können zum Zeitpunkt des Interesses durch Immunfluoreszenz (IF) visualisiert werden. Da die meisten der veröffentlichten Protokolle für die Durchführung von IF auf erwachsenen Myofiberen optimiert sind, wird hier ein detailliertes Protokoll vorgestellt, um zuverlässige Ergebnisse auch auf Myofibiden zu erhalten, die von postnatalen Muskeln isoliert sind.
- Myofiber-Vernetzung
- Bevor Sie beginnen, bereiten Sie alle notwendigen Lösungen vor, wie in Tabelle 2beschrieben.
- Vorbeschichtung mit HS so viele 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre wie die Anzahl der Proben. Achten Sie darauf, alle HS zu entfernen, bevor Sie fortfahren. Da vernetzte Fasern härter als die lebenden und schwieriger zu pipette sind, achten Sie darauf, etwa 200-300 Fasern separat pro Rohr zu vernetzen.
- Sammeln Sie unter einem Sezieren des Mikroskops alle Fasern, die als gesund angesehen werden können, übertragen Sie sie in das Mikrozentrifugenrohr und lassen Sie das Rohr für 5 min im Inneren des Inkubators vertikal, damit sich die Fasern absetzen können.
- Entfernen Sie den Überstand sehr langsam aus dem Rohr.
- Vernetzung von Fasern durch Zugabe von 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT in das Rohr. Tun Sie es vorsichtig, um Fasern Not zu vermeiden.
- Um zu verhindern, dass sich Fasern während der Vernetzung verweben, halten Sie das Rohr 10 min in sehr sanfter Rührung.
- Halten Sie das Rohr in einer vertikalen Position für 5 min bei RT, damit sich die Fasern absetzen können, und entsorgen Sie dann den Überstand, um sicherzustellen, dass der Großteil des PFA-Volumens entfernt wird.
- Fügen Sie 1 ml Phosphat gepufferte Saline (PBS) hinzu und halten Sie die Rohre 5 min bei RT vertikal, um die Fasern sedimentieren zu lassen.
- Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang (Schritt 2.1.8.) zweimal.
- Verlinkte Proben bei 4 °C aufbewahren.
HINWEIS: Es ist möglich, vernetzte Myofiber eine Woche lang bei 4 °C zu halten. Wenn die Fasern mehr als eine Woche in diesem Zustand bleiben, wird dies unweigerlich zu Myofibers Verflechtung führen.
- Immunofluoreszenz
- Halten Sie die Rohre, die die Fasern enthalten, mindestens 5 min bei RT stehen, um eine Fasersedimentation zu ermöglichen.
- Entfernen Sie den Überstand, so dass nur ein kleines Volumen, um sicher zu sein, keine Faser zu entfernen.
- 1 ml 0,5% Triton X-100 in PBS geben und 5 min mit sanfter Rührung brüten.
- Legen Sie Rohre in vertikale Position für 5 min, dann entfernen Überstand.
- 1,5 ml PBS hinzufügen und mit sanfter Rührung 5 min inkubieren.
- Halten Sie Rohre in vertikaler Position für 5 min, dann entfernen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 1 ml Blockierlösung hinzu und brüten Sie für 1 h bei RT mit sanfter Rührung.
- Halten Sie Die Rohre 5 min in vertikaler Position, dann entfernen Sie den Überstand.
- Primäre Antikörper in der Blockierlösung verdünnen, in die Schläuche geben und über Nacht bei 4 °C in sanfter Rührung brüten (für empfohlene Konzentrationen siehe Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Alternativ kann der primäre Antikörper für 3 h bei RT inkubiert werden. Die nächtliche Inkubation sorgte jedoch für eine optimale Färbung. Das Inkubationsvolumen für primäre und sekundäre Antikörper sollte 300 l betragen, wenn Sedimentfasern die 100-L-Kerbe des 1,5 ml Mikrozentrifugenrohrs erreichen. Wenn Fasern weniger reichlich vorhanden sind, wird ein Volumen von 100-200 l empfohlen. - Lassen Sie die Rohre 5 min in vertikaler Position und entfernen Sie dann den Überstand.
- Führen Sie 3 Wäbungen in 1 ml 0,25% Tween-20 in PBS durch, inkubieren Sie 5 min in sanfter Rührung und lassen Sie dann die Rohre jedes Mal für 5 min stehen.
HINWEIS: Führen Sie von hier aus alle Schritte im Dunkeln aus, um das Bleichen von Fluorchromen zu vermeiden. - Sekundärantikörper in der Blockierlösung verdünnen, in die Schläuche geben und bei RT mit sanfter Rührung 1 h brüten (für Konzentrationen siehe Materialtabelle).
- Zweimal in 1 ml 0,1% Tween-20 in PBS waschen, 5 min mit sanfter Rührung inkubieren und dann die Rohre 5 min stehen lassen.
- Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml DAPI-Lösung hinzu und brüten Sie für 5 min mit sanfter Rührung.
- Lassen Sie die Rohre vertikal in einem Rack für 5 min stehen, dann entfernen Sie den Überstand.
- Mit 1 ml PBS waschen, 5 min mit sanfter Rührung inkubieren und dann die Rohre 5 min in einem Rack stehen lassen.
- Entfernen Sie den Überstand, so dass ein Volumen von etwa 50 l.
- Montage von fluoreszierend beschrifteten Myofibiden auf Mikroskopschlitten
- Schneiden Sie eine P200 Pipettenspitze und beschichten Sie sie mit einer Blockierenden Lösung
HINWEIS:Um die Spitze zu beschichten, Pipette die Lösung auf und ab mehrmals vor der Kommissionierung der Fasern, wird dies vermieden, Fasern an der Spitze Wand zu kleben. - Sammeln Sie die Fasern aus dem Rohr und verteilen Sie sie auf einem Mikroskop-Glasschlitten.
- Verwenden Sie unter einem Sezierendes Mikroskop, das nur das natürliche Licht verwendet, das vom Spiegel reflektiert wird, eine neue (nicht geschnittene) P200-Pipettenspitze, um die Fasern zu verteilen und die überschüssige Flüssigkeitslösung zu entfernen.
- Lassen Sie die Dias im Dunkeln ca. 10-15 min trocknen, bis eine sehr geringe Lösungsmenge verbleibt.
- Fügen Sie das Montagemedium auf dem Schlitten hinzu (die richtige Menge des Montagemediums sollte auf die Dimension des Deckels kalibriert werden: für einen 24 x 40 mm Abdeckzettel, 20 l ist genug) und dann langsam ein Deckglas auf den Bereich legen, der die Fasern enthält. Achten Sie darauf, keine Blasen zwischen den Gläsern zu schaffen.
- Drücken Sie den Deckel, so dass die Fasern auf einem einzigen horizontalen Plan liegen.
- Fixieren Sie den Coverslip mit Nagellack.
- Bewahren Sie die Proben bis zu 4 Wochen bei 4 °C auf.
- Erfassen Sie die gewünschten Bilder von fluoreszierend beschrifteten Myofiberen mit einem konfokalen Mikroskop.
- Schneiden Sie eine P200 Pipettenspitze und beschichten Sie sie mit einer Blockierenden Lösung
Representative Results
Wir verdauen in der Regel vier verschiedene Muskeln (TA, EDL, Soleus und Gastrocnemius), um eine gute Menge an langen und lebensfähigen Fasern, die 96 h in wachstums-Faktoren reichen Medium überleben könnte (Abbildung 4A,B). Nur die intaktesten Fasern sollten in Kulturmedium übertragen werden, da sie überleben werden; alle anderen, die leicht zu unterscheiden und auszuwählen sind, müssen verworfen werden.
Wenn Myofiber in einem wachstumsfaktorreichen mittelgroßen Satellitenzellen, die von Wildtypmäusen abgeleitet wurden, zu aktivieren und zu vermehren, siehe Abbildung 1. Nach 48 h Kultur, in gesundem Zustand(Lamin 8-11 +/+), regulieren Satellitenzellen MyoD und durchlaufen ihre erste Division. Aktivierte Pax7+/MyoD+ Satellitenzellen vermehren sich dann und erzeugen um 72 h in der Kultur Zellaggregate, die an den Myofiber gebunden sind, die bei 96 h noch sichtbarer sind (Abbildung 5). Während dieser Divisionen können einige von ihnen den MyoD-Ausdruck unterdrücken und sich selbst erneuern, um den Stammzellenpool wieder zu bevölkern, während diejenigen, die MyoD beibehalten, sich der Differenzierung verpflichten, indem sie den Pax7-Ausdruck regulieren. Nach 96 h enthalten Satellitenzellen-Cluster deutlich sichtbare MyoG+-gebundene Zellen, die sich in neue Myofiber differenzieren können (Abbildung 1 und Abbildung 6). Bemerkenswert ist, dass wir mit diesem Experiment eine verzögerte Dynamik der Satellitenzelldifferenzierung bei homozygoten mutierten Lamin-Mäusen (-/-) im Vergleich zu ihren wilden Typ-Gegenstücken (+/+) beschrieben haben, siehe Abbildung 6.
Das Endergebnis jedes einzelnen Experiments lässt uns denken, dass das Protokoll, das für einzelne Myofibers Isolation und Kultur aus diesem Modell der schweren Muskeldystrophie entwickelt wurde, eine gute Qualität myofibers für alle weiteren Anwendungen gewährleistet.
Abbildung 1: Grafische Darstellung der regenerativen Phasen von Satellitenzellen, die in schwebenden Myofiden modelliert sind. Nach 48 h Kultur in wachstumsfaktorreichen Medien werden Pax7+-Zellen aktiviert und durchlaufen die erste Division, was zu einem Doublet von Pax7+/MyoD+ Zellen führt. MyoD-positive Zellen vermehren sich dann und dehnen sich aus, was in 72 h Kultur zu einem Cluster von mehreren Zellen führt, die die Nachkommen einer einzelnen Satellitenzelle sind. Nach 96 h Kultur werden Pax7+/MyoD+ Zellen zu differenzierenden Pax7-/MyoG+-Zellen. Während der Expansionsphase reguliert eine Teilmenge der Pax7+/MyoD+-Zellen die MyoD-Expression, die sich selbst erneuert, in die Ruhe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vorbereitung von Bohrungpasteurpipetten. (A) Längs- und Frontalansicht, wie die große Lochbohrungpipette erscheinen muss. (B) Längs- und Frontalansicht, wie die kleine Lochbohrungpipetette endlich erscheinen muss. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder der einzelnen Muskelsektion. (A) Isolierung des TA-Muskels. Die Vermeidung der Entfernung der dünnen Schicht, die den Muskel bedeckt, schützt die Myofiber im Inneren. (B) TA- und EDL-Muskeln, die zusammen isoliert sind, sind noch an ihrer oberen Sehne auf der Ebene der Patella befestigt. (C) Teilung von TA und EDL nach Isolierung durch Schneiden entlang der Längsachse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beispiele für gesunde und lebensfähige Myofiber. Repräsentative Phase Kontrast Bilder von lebensfähigen Myofibiden in Suspension. (A) Der rote Pfeil zeigt einen Myofiber mit sichtbarer Sarcomere-Organisation und einer Satellitenzelle auf seiner Seite; die orangenPfeile zeigen einige Stücke von gebrochenen Myofibers, und einige Trümmer in der ersten Schale vor der endgültigen Auswahl für Kultur vorhanden. Skala bar 100 'm. (B) Vollständigere Ansicht anderer Myofiber unter einer kleineren Vergrößerung. Skala Bar 500 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Unterschied in der Dimension von Stammzellclustern in Wt- und Mutantenmäusen. Immunfluoreszenzfärbung von Myofibiden, extrahiert von 19 Tagen Lamin-8-11-Mäusen (+/+ und -/-) nach 96 h Kultur. Pax7+ Satellitenzellen werden angezeigt. Die Dimension des Zellclusters war in den meisten Fällen in Lamin 8-11 +/+ signifikant größer als in Lamin -/- in Bezug auf die Anzahl der Zellen. Maßstab bar 10 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentatives Immunfluoreszenzexperiment. Immunfluoreszenz-Experiment durchgeführt, nach 96 h Kultur, auf Myofibers extrahiert von 19 Tagen Lamin 8-11 Mäuse (+/+ und -/-). Pax7+/MyoG- (rot) und Pax7-/MyoG+ (grün) Zellen wurden beobachtet. Bilder, die mit einem konfokalen Mikroskop erhalten wurden. Skala Bar 25 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Name der Lösung im Text | Komponente | Prozentsatz | vorgeschlagenes Endvolumen/Probe | Notizen | |
| Waschlösung | DMEM hohe Glukose | 90% | 4 ml | Steril aufbewahren, bei 4°C bis zum Gebrauch | |
| Pferdeserum (HS) | 10% | ||||
| Verdauungslösung | DMEM hohe Glukose | 9.80% | 20 ml | Extrem schädliches Pulver. Filterlösung mit 0,22 m Filter und dann steril halten. Bei 4°C bis zur Nutzung | |
| Kollagenase I | 0.20% | ||||
| Kulturmedium | DMEM hohe Glukose | 78% | 10 ml | Steril aufbewahren, bei 4°C bis zum Gebrauch | |
| Fetales Rinderserum (FBS) | 20% | ||||
| Hühner-Embryo-Extrakt (CEE) | 1% | ||||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | ||||
Tabelle 1: Rezepte für Lösungen, die in Abschnitt 1 verwendet werden.
| Name der Lösung im Text | Komponente | Prozentsatz | vorgeschlagenes Endvolumen/Probe | Notizen | |
| 4% PFA | Paraformaldehyd (PFA) | 4% | 2-3 ml | Pulver und dann Lösung sind extrem schädlich | |
| Pbs | 96% | ||||
| 0,5% Triton X-100 | Triton X-100 | 0.50% | 2-3 ml | Triton X-100 ist extrem zähflüssig, schneiden Sie bevorzugt die Spitze der Pipette, um sie zu aliquot | |
| Pbs | 99.50% | ||||
| 0,25% Tween-20 | Tween-20 | 0.25% | 10 ml | Tween-20 ist extrem zähflüssig, schneiden Sie bevorzugt die Spitze der Pipette, um sie zu aliquot | |
| Pbs | 99.75% | ||||
| 0,1% Tween-20 | Tween-20 | 0.10% | 10 ml | Tween-20 ist extrem zähflüssig, schneiden Sie bevorzugt die Spitze der Pipette, um sie zu aliquot | |
| Pbs | 99.90% | ||||
| Blockierlösung | Fetales Rinderserum (FBS) | 10% | 10 ml | Frische Lösung vorbereiten und bei 4°C nicht länger als 3 Wochen lagern (immer vor Gebrauch die Klarheit überprüfen) | |
| Pbs | 90% | ||||
| Dapi | Dapi | 0.10% | 2-3 ml | Bleiben Sie im Dunkeln | |
| Pbs | 99.90% | ||||
Tabelle 2: Rezepte für Lösungen, die in Abschnitt 2 verwendet werden.
Discussion
Die Isolierung intakter Einzelmyofiber ist eine wesentliche Methode auf dem Gebiet der Myogenese, wenn das Hauptziel darin besteht, zellautonome Regenerationskapazitäten von Muskelstammzellen innerhalb ihrer Nische unter gesunden und pathologischen Bedingungen zu charakterisieren. Wenn jedoch biochemische oder genomische Studien von Interesse sind, könnten FACS-isolierte Satellitenzellen die beste Option sein.
Einzelne Myofibers Isolation ermöglicht ex-vivo zu folgen, aber in der physiologischsten Weise, die Dynamik aller Schritte einzelne Satellitenzellen während der Muskelregeneration durchlaufen, die sind: Aktivierung, Zellteilung (asymmetrisch und symmetrisch), Differenzierung und Rückkehr zur Ruhe durch Selbsterneuerung. Sobald Myofiber in schwebenden Bedingungen angebaut werden, aktivieren und dehnen sich die einzelnen Satellitenzellen aus einem Zellhaufen aus, die alle aus derselben Satellitenzelle stammen. Die Immunfluoreszenzanalyse für Proliferations-, Differenzierungs-, Aktivierungs- oder Stammtonmarker ist dann optimal, um den Anteil zwischen den Zellstadien zu quantifizieren.
Der schlüsselfertige Schritt in unserem Protokoll, um lebensfähige und intakte Myofiber zu erhalten, kann als die schnelle, aber schonende Muskelsektion durch Sehnen-zu-Sehnen-Isolierung betrachtet werden, um Muskelschäden zu vermeiden. Unser Rat ist, nur scharfe Schere und kleine scharfe Pinzette zu verwenden und den gesamten Muskeldissektionsvorgang auf zehn Minuten zu begrenzen. Wenn es schwierig ist, sehr kleine Muskeln zu isolieren (d.h. EDL und TA), ist es möglich, sie zusammenzuschneiden und später durch eine feine Schere zu teilen, die entlang des Längsplans nach den Fasern schneidet. Diese Strategie wird schließlich weniger intakte Myofiber geben, aber die Lebensfähigkeit wird nicht beeinträchtigt werden. Das gleiche muss auf großen Muskeln wie Gastrocnemius durchgeführt werden, um die Verdauung zu erleichtern. Die Optimierung der Verdauungszeit, die empirisch validiert werden muss, und die minimale Manipulation isolierter Fasern sind ebenfalls zwei entscheidende Aspekte für das positive Ergebnis einer späteren Analyse.
Der Vorteil des hier berichteten Protokolls ist, dass es auf sehr kleine Mäuse angewendet werden kann (im Alter und in der Dimension), auch wenn ihre Muskeln extrem zerbrechlich sind. Auch wenn oben nicht erwähnt, ist es möglich, dieses Protokoll der Zerlegung zu folgen, um dann kulturfähige Myofiber für längere Zeit mit Keller membranbeschichteten Gerichten18,19zu folgen. Es ist wichtig zu bedenken, dass diese Situation völlig anders ist als schwimmende Zustand, wo Haftungsreize und Nähe Reize fehlen.
Disclosures
Keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Andrea Bianchi, dem italienischen Netzwerk der Laminopathien und den Mitgliedern des Labors für die Unterstützung und alle konstruktiven Kommentare. Wir danken Chiara Cordiglieri für die wertvolle Hilfe beim konfokalen Mikroskop. Die Autoren danken Dr. Beatrice Biferali für ihre Hilfe beim Fotografieren von Figuren. Die hier vorgestellte Arbeit wurde von My First AIRC Grant n unterstützt. 18535, AFM-Telethon n. 21030, wird der italienische Gesundheitsminister n. GR-2013-02355413 und Cariplo 2017-0649 bis C.L. C.M. durch My First AIRC Grant n.18993 und AFM-Telethon n. 22489 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
| Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
| Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
| Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
| Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
| Lab equipment | Manufacturer | ||
| Bunsen burner | |||
| Confocal microscope | Leica | ||
| Diamond pen | bio-optica | ||
| Dissection pins | |||
| FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
| Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
| Glass coverslips | Thermofisher | ||
| Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
| Glass slides | Thermofisher | ||
| Micro dissecting scissors | |||
| Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
| Micropipette tips | Corning | ||
| Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
| Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
| Rubber pipette bulbs | VWR | ||
| Sharp tweezers | |||
| Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
| Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
| Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
| Water bath at 37°C | VWR |
References
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127 (21), 4543-4548 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 19 (6), 628-633 (2007).
- Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The Skeletal Muscle Satellite Cell: The Stem Cell That Came in From the Cold. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1177-1191 (2006).
- Franco, I., et al. Somatic mutagenesis in satellite cells associates with human skeletal muscle aging. Nature Communications. 9 (1), 800 (2018).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nature Medicine. 20 (3), 255-264 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in aged skeletal muscle. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Bianchi, A., et al. Dysfunctional polycomb transcriptional repression contributes to lamin A/C-dependent muscular dystrophy. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 2408-2421 (2020).
- Blau, H. M., Webster, C., Pavlath, G. K. Defective myoblasts identified in Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 80 (15), 4856-4860 (1983).
- Jiang, C., et al. Notch signaling deficiency underlies age-dependent depletion of satellite cells in muscular dystrophy. Disease Models & Mechanisms. 7 (8), 997-1004 (2014).
- Vallejo, D., et al. PITX2 Enhances the Regenerative Potential of Dystrophic Skeletal Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (4), 1398-1411 (2018).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal Muscle Satellite Cells: Background and Methods for Isolation and Analysis in a Primary Culture System. Methods in Molecular Biology. (798), 21-52 (2012).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Developmental Biology. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. (290), 281-304 (2005).
- Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single Muscle-Fiber Isolation and Culture for Cellular, Molecular, Pharmacological, and Evolutionary Studies. Methods in Molecular Biology. 798, 85-102 (2012).
- Verma, M., Asakura, A. Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following β-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 60-67 (2011).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. 946 (206), 431-468 (2013).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Gallot, Y., Hindi, S., Mann, A., Kumar, A. Isolation, Culture, and Staining of Single Myofibers. Bio-Protocol. 6 (19), 1942 (2016).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Machado, L., et al. In Situ Fixation Redefines Quiescence and Early Activation of Skeletal Muscle Stem Cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Lucini, F., Bianchi, A., Lanzuolo, C. Formaldehyde-mediated snapshot of nuclear architecture. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Sullivan, T., et al. Loss of a-Type Lamin Expression Compromises Nuclear Envelope Integrity Leading to Muscular Dystrophy. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 913-920 (1999).
