Her foreslår vi en metode for effektivt å få enkeltmuskelfibre på tidlige postnatal utviklingsstadier fra homozygot mutant Lamin Δ8-11 mus modell, en svært alvorlig modell for Emery-Dreifuss muskeldystrofi (EDMD).
Autosomal dominant Emery-Dreifuss muskeldystrofi (EDMD) er forårsaket av mutasjoner i LMNA genet, som koder A-type kjernefysiske lamins, mellomliggende filament proteiner som opprettholder atomkonvolutten og komponentene i nukleoplasma. Vi har nylig rapportert at muskel svekk i EDMD kan tilskrives iboende epigenetiske dysfunksjoner påvirker muskel (satellitt) stamceller regenerativ kapasitet. Isolasjon og kultur av single myofibers er en av de mest fysiologiske ex-vivo tilnærminger for å overvåke satellittceller atferd i sin nisje, som de forblir mellom basal lamina rundt fiber og sarcolemma. Derfor representerer det et uvurderlig eksperimentelt paradigme for å studere satellittceller fra en rekke murine modeller. Her beskriver vi en re-tilpasset metode for å isolere intakte og levedyktige enkelt myofibers fra postnatal hindlimb muskler (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius og Soleus). Etter denne protokollen kunne vi studere satellittceller fra Lamin Δ8-11 -/- mus, en alvorlig EDMD-murinmodell, bare 19 dager etter fødselen.
Vi beskriver isolasjonsprosedyren, samt kulturforholdene for å oppnå en god del myofibers og deres tilhørende satellittceller-avledet avkom. Når dyrket i vekstfaktorer rik medium, satellittceller avledet fra vill type mus aktivere, spre, og til slutt differensiere eller gjennomgå selvfornyelse. I homozygots Lamin Δ8-11 -/- muterte mus er disse evnene alvorlig svekket.
Denne teknikken, hvis strengt fulgt, gjør det mulig å studere alle prosesser knyttet til myofiber-assosiert satellittcelle selv i tidlige postnatal utviklingsstadier og i skjøre muskler.
Skjelettmuskulatur er et differensiert vev med en av de mest utvidede evnen til å regenerere etter trening eller traumer1. Denne egenskapen skyldes hovedsakelig tilstedeværelsen av stamceller, kalt satellittceller på grunn av deres perifere posisjon mellom basal lamina og plasmalemma av myofiber2. Under postnatal utvikling, satellittceller spre seg og gradvis differensiere, og dermed bidra til skjelettmuskulatur vekst. En gang i voksen alder, satellittceller inn en reversibel quiescent tilstand, og på fysiologiske eller patologiske traumer, de aktiverer, spre og differensiere for å reparere de skadede musklene3. Defekter i kapasiteten til satellittceller å riktig transitt gjennom disse forskjellige regenerative faser og å gjennomgå selvfornyelse har vært fast knyttet til muskel svinning, enten under fysiologisk aldring4,,5,6 eller i muskel degenerative sykdommer, som muskel dystrofies7,8,9,10.
To viktigste kultur tilnærminger eksisterer for å studere satellittceller ex-vivo: primære myogene kulturer fra mononucleated celler, mekanisk og kjemisk dissosiert fra hele muskel11,12; eller kultur av isolerte myofibers13,14,15,16,17,18,19,20. I det første tilfellet innebærer prosessen med satellittceller isolasjon triturasjon av hele muskler hentet fra musen, en kjemisk fordøyelse, filtrering og fluorescerende aktivert cellesortering (FACS)21. Denne prosedyren, selv om den er effektiv i å isolere satellittceller fra en rekke modeller, innebærer flere variabler som utsetter satellittceller for stress og forstyrrer deres fysiologiske nisje22,23. Derimot innebærer myofiber isolasjon en mildere fordøyelse av muskelvev med matriseforringelsesenzymer og en mekanisk makulering som forårsaker redusert traumer til stamceller20. Denne andre tilnærmingen tillater en mye mer effektiv gjenfinning av levedyktige satellittceller, som forblir fysisk festet til deres myofiber mellom basal lamina og sarcolemma, og dermed tillater analyse i deres fysiologiske nisje19,20.
Mange forskjellige protokoller har blitt foreslått i løpet av de siste årene for å isolere enkelt myofibere fra skjelettmuskler. Allerede i 1986 foreslo Bischoff en protokoll for å isolere fibre fra Flexor Digitorum Brevis13 og senere, i 1995, endret Rosenblatt et al. protokollen for å oppnå en mer effektiv separasjon av myofibers14. Siden da har mange andre forfattere foreslått justerte prosedyrer på andre muskler, for eksempel Extensor Digitorum Longus (EDL) og Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, som er lengre, selv om mer skjøre, muskler14. Isolerte myofibers kan deretter dyrkes både i vedheft, for å tillate utvidelse av satellittceller-avledede myoblasts, eller i flytende forhold, opptil 96 timer, for å følge avkom avkom fra enkeltsatellittceller19 (Figur 1). Variable konsentrasjoner av serum innenfor kulturmediet brukes til å utløse satellittceller aktivering, spredning og / eller differensiering, for å studere deres evne til å riktig transitt gjennom disse forskjellige faser1.
Vi har nylig beskrevet epigenetic mekanismen bak utmattelse av satellitt stamcelle bassenget i musemodellen av EDMD, Lamin Δ8-11 -/- mus7. Siden disse musene vanligvis dør mellom 4-8 uker i alderen24, på grunn av alvorlig muskeltap, ble det gjort et forsøk på å fange molekylære defekter som ligger til grunn for tidlig sykdom ved å fokusere vår analyse på postnatal muskelutvikling. Flytende single myofibers ble isolert og dyrket fra vill type og Lamin Δ8-11 -/- mutant7 19 dager gamle mus. På dette stadiet er muskelfeil allerede tydelige, men mus er fortsatt levedyktige. Men siden alle ovennevnte protokoller for enkelt myofibers utvinning ble optimalisert for skjelettmus av voksne mus, måtte vi tilpasse dem til våre formål: svært små mus i alder og størrelse, og svært skjøre myofibers. Dermed beskriver vi her vår re-tilpasning av protokollen foreslått av Rudnicki-laboratoriet19 for å få et betydelig antall enkelt levedyktige myofibers fra mus under postnatal utvikling og fra alvorlige dystrofiske muskler, slik som de avledet fra Lamin Δ8-11 -/- mus24. Det endelige målet med denne tilnærmingen er å gi en standardisert prosedyre for studiet av myofibers-tilknyttede muskelstamceller i en hvilken som helst annen musemodell når de tidlige stadiene av postnatal utvikling er av interesse, eller i tilfelle av musemodeller som bærer noen spesifikk sykdom som gjør myofibers mer utsatt for mekanisk stress.
Isolering av intakte enkelt myofibers er en viktig metode innen myogenese når hovedmålet er å karakterisere celle-autonome regenerative kapasiteter av muskel stamceller i deres nisje, i sunne og patologiske forhold. Men når biokjemiske eller genomiske studier er av interesse, FACS-isolerte satellittceller kan være det beste alternativet.
Single myofibers isolasjon gjør det mulig å følge ex-vivo, men på den mest fysiologiske måten, dynamikken i alle trinnene enkelt satellittceller gjennomgå under muskel regenerering, det vil si: aktivering, celledeling (asymmetrisk og symmetrisk), differensiering og gå tilbake til quiescence av selvfornyelse. Når myofibers er dyrket i flytende forhold, de enkelte satellittceller aktivere og utvide danner en klynge av celler, alle stammer fra samme satellittcelle. Immunofluorescensanalyse for spredning, differensiering, aktivering eller stemness markører er deretter optimal for å kvantifisere andelen mellom cellestadier.
Det viktigste trinnet i vår protokoll for å oppnå levedyktig og intakt myofibers kan betraktes som den raske, men milde muskeldisseksjonen, ved sene-til-sene isolasjon, for å unngå muskelskader. Vårt råd er å bruke bare skarp saks og små skarpe pinsett og å begrense hele muskeldisseksjonsprosedyren til ti minutter. When it is difficult to isolate very small muscles (i.e., EDL and TA), it is possible to cut them together and to later divide them by using fine scissors cutting along the longitudinal plan following the fibers. Denne strategien vil til slutt gi mindre intakte myofibers, men levedyktighet vil ikke bli kompromittert. Det samme må utføres på store muskler som Gastrocnemius for å lette fordøyelsen. Optimalisering av fordøyelsestiden, som må empirisk valideres, og minimal manipulering av isolerte fibre er også to avgjørende aspekter for det positive resultatet av påfølgende analyse.
Fordelen med protokollen rapportert her er at den kan brukes på svært små mus (i alder og dimensjon), selv når musklene er ekstremt skjøre. Selv om det ikke er nevnt ovenfor, er det mulig å følge denne protokollen for disseksjon til da kultur levedyktige myofibers for lengre periode ved hjelp av kjellermembran-belagt retter18,19. Det er viktig å vurdere at denne situasjonen er helt forskjellig fra flytende tilstand, hvor vedheft stimuli og nærhet stimuli er fraværende.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Andrea Bianchi, det italienske nettverket av laminopatier og medlemmene av laboratoriet for støtten og alle konstruktive kommentarer. Vi er takknemlige til Chiara Cordiglieri for den dyrebare hjelpen på konfusisk mikroskop. Forfatterne takker Dr. Beatrice Biferali for hennes hjelp til å ta bilder for figurer. Arbeidet som ble presentert her ble støttet av My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, den italienske helseministeren n. GR-2013-02355413 og Cariplo 2017-0649 til C.L. C.M. støttes av My First AIRC grant n.18993 og AFM-Telethon n. 22489.
4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
Lab equipment | Manufacturer | ||
Bunsen burner | |||
Confocal microscope | Leica | ||
Diamond pen | bio-optica | ||
Dissection pins | |||
FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
Glass coverslips | Thermofisher | ||
Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
Glass slides | Thermofisher | ||
Micro dissecting scissors | |||
Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
Micropipette tips | Corning | ||
Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
Rubber pipette bulbs | VWR | ||
Sharp tweezers | |||
Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
Water bath at 37°C | VWR |