Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولاً للحد الأدنى من الانبعاثات البويضية غير الناضجة من البويضات القطة مع وسائل الإعلام المختبرية الصنع على الدعامات التجارية. وهو يغطي كل خطوة من عزل البويضات من الزناد السابقين vivo إلى التزجيج والاحترار.
Abstract
وفي برامج حفظ الحيوانات البرية، تعتبر الخدمات المصرفية للـ "جاميت" ضرورية لحماية الموارد الوراثية للأفراد القيمين والأنواع النادرة ولتعزيز الحفاظ على التنوع البيولوجي. في felids ، ومعظم الأنواع مهددة بالانقراض ، وتستخدم السلالات المنزلية كنموذج لزيادة كفاءة بروتوكولات لsyseds. بين تقنيات الحفظ بالتبريد البويضات، التبخيل هو أكثر وأكثر شعبية في التكاثر بمساعدة الإنسان والطب البيطري. وقد ثبت أن التزجيج في محطة التبريد، الذي تم تطويره في البداية للبويضات والأجنة البشرية، مناسب تمامًا لبويضات القطط. تقدم هذه الطريقة العديد من المزايا، مثل الجدوى في ظروف الحقل وسرعة الإجراء، والتي يمكن أن تكون مفيدة عندما تحتاج عدة عينات إلى المعالجة. ومع ذلك، تعتمد الكفاءة بشدة على مهارات المشغل، ويلزم توحيد المعايير داخل المختبرات وفيما بينها، فضلا عن تدريب الموظفين. يصف هذا البروتوكول الحد الأدنى من حجم البويضات البرازية غير ناضجة على دعم تجاري في خطوة بخطوة بروتوكول ودية المجال، من جمع البويضة إلى الاحترار. وبعد البروتوكول، الحفاظ على سلامة البويضات وقابليتها للبقاء عند الاحترار (يصل إلى 90 في المائة) يمكن توقع ذلك، على الرغم من أنه لا يزال هناك مجال للتحسين في مرحلة النضج بعد الاحترار ونتائج التنمية الجنينية.
Introduction
وقد أصبح الحفظ بالتبريد خطوة رئيسية في تقنيات المساعدة على الإنجاب .. في البشر ، فإنه يسمح للحفاظ على الخصوبة أو تأجيل الأبوة لأسباب طبية أو شخصية. في الحيوانات، من الضروري التغلب على المسافة والوقت في التزاوج المخطط له، وخاصة في المزرعة والحيوانات الأليفة، أو للحفاظ على المواد الوراثية للمواضيع القيمة في برامج الحفظ، وخاصة في الأنواع البرية المهددة بالانقراض. حفظ البردي جاميت هو الخيار الأفضل عندما لم يتم اختيار الأفراد الذين سيتم تربيتهم بعد أو من أجل تجنب القضايا الأخلاقية المرتبطة بتجميد الجنين ، وخاصة في الطب البشري1. من السهل نسبيا الحفاظ على الحيوانات المنوية وإعطاء نتائج مرضية بعد ذوبان الجليد، ولكن البويضات، بسبب ميزاتها الهيكلية، قد تكون أكثر تعقيدا لتخزين. في الواقع، وانخفاض نسبة السطح/الحجم، فضلا عن وجود pellucida زونا المحيطة ooplasma، يحد من حركة المواد وايروبروت المياه عبر الخلية2. وعلاوة على ذلك، في الحيوانات الأليفة بما في ذلك felids، فهي تتميز السيتوبلازم الغنية بالدهون، والتي يعتقد لجعلها أكثر حساسية للتبريد3.
معظم felids مهددة، ويتم استخدام القط المحلي كنموذج لتطوير بروتوكولات للحفاظ على germplasm بفضل توافر السنادات من استئصال الأوفاريت الروتينية. في الحيوانات البرية، يمكن الحصول على السناد بعد العمليات الجراحية الاختيارية أو (أكثر تواترا) بعد الوفاة،ويمكن استرداد غير ناضجة (حاصلة الجرثومية) شعماش. التحفيز الهرموني تهدف إلى الحصول على ناضجة (metaphase II) البويضات ليست شائعة كما هو الحال في ARTs الإنسان بسبب القضايا الأخلاقية والأنواع الفردية استجابة محددة للعلاجات4.
ولذلك ، فإن تطوير استراتيجيات الحفظ بالتبريد قد ركز على الأمرات غير الناضجة ، والتي يمكن استردادها عادة بعد الوفاة غير المتوقعة أو المفاجئة للأفراد النادرين. من وجهة نظر بيولوجية، وهناك بعض الاختلافات في حفظ التبريد من الأمهان غير ناضجة أو ناضجة، كل له مزاياه. أولاً، الحمض النووي هو أكثر حماية في البويضات غير ناضجة، الذي الحويوش الجرثومية يحتوي على الكروموسومات محاطة غشاء نووي، في حين أن المغزل الميوتيك من البويضات الفوقية II يمكن أن تكون أكثر عرضة للتبريد5. ثانيا، قد تؤثر الأضرار الناجمة عن الهيكل الكيسي الناجم عن البرد على دوران المغزل، وبثق الجسم القطبي، والهجرة البرونوية والسيكينسيس، والتي يمكن أن يكون لها آثار مختلفة وفقا لمرحلة نمو البويض، مما يؤثر على تطور الداء الميموري أو أحداث ما بعد الإخصاب. وأخيرا، وربما الأهم من ذلك، في حين أن البويضات الناضجة هي على استعداد لتكون المخصبة، gametes غير ناضجة تعتمد على دعم الخلايا المكمّلة المحيطة بها للذهاب من خلال النووية ونضوج6السيتوبلازمية ، وهذا هو السبب في أن المجمعات كاملة cumulus-oocyte (COCs) هي cryopreserved. ومع ذلك ، فإن فقدان خلايا الركام و / أو فقدان الاتصال الوظيفي بين gamete والخلايا الجسدية المحيطة هي على الأرجح التأثير الأكثر ضررًا للالحفاظ على التبريد من COCs غير الناضجة.
من بين تقنيات الحفظ بالتبريد ، تزجيج هو واحد التي يمكن تطبيقها بسهولة أكبر في ظروف الميدان. مقارنة بالتجميد البطيء (أو المعدل الخاضع للرقابة)، فإن عملية التزجيج أسرع ولا تتطلب معدات محددة، مثل الفريزر القابل للبرمجة. من أجل تلبية المبادئ الأساسية الثلاثة للزهية (أي اللزوجة العالية ، متصلة بتركيز عالي من المواد المبردة ، وأحجام صغيرة وانخفاض درجة حرارة فائقة السرعة) ، تم تطوير العديد من الوسائط والدعم بشكل خاص واستخدامه في القطط لكل من البويضات غير الناضجة والناضجة. بدءا من القش البسيط7، ثم تم تطوير الأجهزة للوصول إلى "الحد الأدنى من حجم" الهدف. Cryoloop8، فتح سحب القش (OPS)9، المزاريب البلاستيكية (القش المعدل)10 و 11 وقد استخدمت11، حتى جهاز أكثر كفاءة (أي، Cryotop) تم توظيف11، وتحسين البقاء على قيد الحياة واستئناف meiosis. Cryotop(الشكل التكميلي 1)هو دعم متاح تجاريًا والذي أصبح نظامًا مفتوحًا اختياريًا للاختراق. وضعت ل vitrification من البويضات البشرية والأجنة ، ويتكون من شريط فيلم صغير تعلق على حامل من البلاستيك الصلب ، محمية من قبل غطاء أنبوب من البلاستيك أثناء التخزين12. بفضل سهولة الاستخدام والتخفيض الشديد في حجم التكطيب (أقل من 0.1 ميكرولتر) ، مما يؤدي أيضًا إلى معدلات تبريد والاحترار السريعة للغاية ، تم تطبيق دعم التهتر هذا بشكل متزايد في العديد من الأنواع ، بما في ذلك القط المنزلي ، والذي تم استخدامه مع مجموعة متنوعة من الوسائط13و14و,15و16و17.
الغرض من هذه المخطوطة هو وصف بروتوكول الدفء الجمعي، مع تعديلات طفيفة من واحد وضعت أصلا لبويضات الإنسان، والذي يستخدم وسائل الإعلام المختبرية الصنع والدعم التجاري للحد الأدنى من حجم التبخيل ويمكن تطبيقها بسهولة في ظروف الحقل للرفرف في التبريد من COCs القطط غير ناضجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لم تخضع الإجراءات التي تم تصويرها بموجب هذا لموافقة أخلاقية منذ أن تم جمع مبايض القطط في العيادات البيطرية كمنتجات ثانوية من استئصال الأوفاريت الروتينية التي يطلبها المالك أو استئصال المبيض.
1. جمع البويضات
- قبل البدء في التجارب، قم بإعداد حلول لجمع المبيض والبويضات. إعداد محلول جمع المبيض مع محلول ملحي الفوسفات المخزن (PBS) مع خليط من المضادات الحيوية ومضادات الميكيكواتيكس (100 وحدة دولية/ مل من البنسلين G الصوديوم، 0.1 ملغ/مل من كبريتات الستربتومايسين، 0.25 ميكروغرام/مل من الأمفوترينين ب). إعداد حل جمع البويض (أي، برنامج تلفزيوني/ PVA) مع برنامج تلفزيوني مع 100 وحدة دولية/مل من البنسلين G الصوديوم، 0.1 ملغ/مل من كبريتات الستربتوميسين و0.1٪ (ث/ الخامس) الكحول البولي فينيل (PVA).
- تخزين حلول لجمع المبيض والبويضة في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- في يوم من الزهو الملكات، قبل ساعات قليلة من معالجة العينات، واتخاذ جزء من المبيض وحلول جمع البويضات والسماح لهم الاحماء في درجة حرارة الغرفة (RT؛ 25 ± 2 درجة مئوية).
- عندما تصل العينات إلى المختبر، قم بعزل المبيضين عن النسيج الضام المحيط ومن oviduct وغسلهما في وسط جمع المبيض الطازج في طبق بيتري.
- ملء واحد 35 مم طبق بيتري لكل ملكة مع حوالي 3 مل من برنامج تلفزيوني RT / PVA، وطبق واحد أكثر لجمع البويضات.
- ضع زوجاً من المبيضين في طبق بيتري واتم بالقشرة بمشرط جراحي. تأكد من أن جميع الجريبات قد كسرت بمساعدة منظار مجسم (تكبير 8x).
- جمع COCs مع ماصة ونقلها في برنامج تلفزيوني جديد / PVA في طبق بيتري المخصصة. حدد الصفات الجيدة COCs، مع متجانسة، السيتوبلازم الظلام وتحيط بها عدة طبقات مدمجة من الخلايا الركام (الصف الأول18).
2- التزجيج
- إعداد وسائل الإعلام التوازن والتبريب.
- إعداد محلول التوازن (ES) مع 7.5٪ (v/v) جلايكول الإيثيلين (EG) و 7.5٪ (v/v) ثنائي الفينيل (DMSO) في المتوسط 199، مع 20٪ مصل الأبقار الجنين (FBS).
- تحضير محلول vitrification (VS) مع 15٪ (v/v) EG، 15٪ (v/v) DMSO و 0.5 M سكروز في المتوسط 199، مع 20٪ FBS (معدلة من 19).
- اسمحوا ES وS VS الاحماء في RT قبل الاستخدام.
ملاحظة: من المعروف أن مضادات الكري (مثل، مثلاً، على سبيل المثال، DMSO) هي السامة للخلايا. استراتيجية لمواجهة سميتها هي خفض درجة الحرارة التي تتعرض لها الخلايا20، وعادة ما تتعرض البويضات لبروتيكات التبريد في RT. وهكذا، يتم تنفيذ الإجراء بأكمله، من جمع البويضات إلى التزجيج، في RT في هذا البروتوكول لتجنب تقلبات درجة الحرارة.
- إعداد طبق التهليل (أي طبق خاص يتكون من ستة آبار مخروطية مقسمة إلى صفين، تعرف باسم "لوحة Repro"). إعداد صف واحد (ثلاثة آبار) لكل دعم التهيج.
- أضف 20 ميكرولتر من ES في الجزء السفلي من البئر الأول.
- إضافة 300 ميكرولتر من VS في الجزء السفلي من الثانية (أي 1VS) والآبار الثالثة (أي 2VS).
- Cocs توازنية في ES.
- مع ماصة صغيرة تتحمل (على سبيل المثال، ماص باستور سحبت على منقار بونسن لجعلها أرق - يجب أن يكون القطر لا يقل عن 200 ميكرومتر)، نقل واحد (أو أكثر) COC (ق) على الجزء السفلي من البئر الأول.
ملاحظة: اختر حجم الماصات وفقا لعدد من طبقات من الخلايا الكامولو المحيطة البويضات، وذلك لأبعاد COCs، تهدف إلى الحد قدر الإمكان من حجم وسائل الإعلام التي يتم نقلها مع COCs في كل خطوة. مع هذا البروتوكول، يمكن للمشغلين المدربين vitrify بنجاح تصل إلى ثمانية COCs القطط لكل دعم التبغ. - إضافة ببطء 20 μL من ES على حدود قطرة. انتظر 3 دقائق.
- إضافة ببطء أخرى 20 ميكرولتر من ES على حدود قطرة. انتظر 3 دقائق.
- إضافة ببطء 240 μL من ES على الحدود من قطرة. انتظر 9 دقائق.
- أثناء الانتظار، وإعداد مربع مع النيتروجين السائل (LN2)،تسمية دعم الtrification مع رمز تعريف التجربة / القط وتركها مفتوحة. وضع كل منهما بالقرب من منظار الميكروكروسكوب، بحيث يمكن الوصول إليها بسهولة أثناء العمل.
الحذر! ارتداء معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع LN2. - بدلاً من ذلك، إذا كان يجب أن تكون vitrified COCs عدة، تبدأ الخطوة التوازن الأولى (راجع الخطوة 2.3.1 -2.3.2) لمجموعة أخرى من COCs (التي سيتم تحميلها على دعم التبغ جديدة).
- مع ماصة صغيرة تتحمل (على سبيل المثال، ماص باستور سحبت على منقار بونسن لجعلها أرق - يجب أن يكون القطر لا يقل عن 200 ميكرومتر)، نقل واحد (أو أكثر) COC (ق) على الجزء السفلي من البئر الأول.
- Vitrify COCs في VS في أقل من 90 ثانية.
- باستخدام نفس الماصات الصغيرة، تعبئة مع 1VS، واتخاذ COCs من الجزء السفلي من البئر الأول (ES) ونقلها إلى سطح البئر الثاني (1VS).
- غسل ماصة مع 1VS.
- اتخاذ COCs ونقلها في منطقة أخرى (في الجزء السفلي) من البئر; خلط المتوسطة المحيطة بها مع ماصة.
- املأ الماصات بـ 1VS في منطقة أخرى من البئر، واصطُل إلى الـ COCs، حركها ومزج الوسيط المحيط بها مع الماصات.
- كرر الخطوة 2.4.4.
- غسل ماصة مع 2VS.
- اتخاذ COCs ونقلها في الجزء السفلي من البئر الثالث (2VS); خلط المتوسطة المحيطة بها مع ماصة.
- املأ الماصات بـ 2VS في منطقة أخرى من البئر، واصطُل إلى الـ COCs، حركها ومزج الوسيط المحيط بها مع الماصات.
- كرر الخطوة 2.4.8.
- املأ الماصات بـ 2VS في منطقة أخرى من البئر، واصطدرها على شريط دعم التزجيج، في أقرب وقت ممكن إلى الطرف. التعرق المتوسط الزائد للحد من حجم VS قدر الإمكان.
- يغرق على الفور دعم vitrification في LN2، تحريكه. إغلاقه مع مساعدة من بعض المشابك، والتأكد من أنها لا تزال دائما مغمورة في LN2.
ملاحظة: الحفاظ على التوقيت المناسب أمر بالغ الأهمية بسبب سمية الخلايا المبردة. بسبب تركيزها عالية في وسائل الإعلام vitrification، يجب أن يتم التحكم في التعرض للخلايا، وأيضا من قبل تنفيذ لا تشوبه شائبة من تقنية21. إذا كانت العينات وفيرة، والنظر في تقسيمها لمعالجتها بسرعة أكبر وتقليل مقدار الوقت من جمع البويضات إلى التزجيج.
- تخزين الtrification تحميل يدعم في goblet والاحتفاظ بها في خزان LN2 حتى الاحترار.
ملاحظة: يمكن أيضاً تطبيق كافة الخطوات السابقة من البروتوكول في حالات الحقل إذا كانLN 2 متوفراً. وسيكون من الضروري وجود شاحن جاف لنقل العينات إلى المختبر بأمان ثم المضي قدما هناك في المراحل التالية.
3. ارتفاع درجة الحرارة
- إعداد وسائل الإعلام الاحترار.
- تحضير محلول ذوبان (TS) مع 1 M سكروز في متوسط 199، مع 20٪ FBS.
- إعداد محلول التخفيف (DS) مع 0.5 M السكروز في المتوسط 199، مع 20٪ FBS.
- تحضير محلول الغسيل (WS) مع متوسط 199 مع 20٪ FBS.
- قبل الاستخدام، قم بالاحماء TS إلى 38 درجة مئوية وDS و WS في RT.
- إذا لزم الأمر، إعداد الوسط الثقافة للاستخدام اللاحق COCs ساخنة (على سبيل المثال، في نضوج، IVM).
- وضع مرحلة التدفئة على مقربة من منظار المجسم وتشغيله (38 درجة مئوية). وضع غطاء طبق بيتري للاحماء.
- عندما يكون كل شيء جاهزًا، قم بنقل دعم التزجيج الذي يجب تسخينه من خزان التخزين إلى صندوق مع LN2، ووضع المربع بالقرب من المنظار المجسم.
- إعداد "لوحة Repro". إعداد صف لكل دعم vitrification التي يجب أن تكون دافئة.
- إضافة 300 μL من DS على الجزء السفلي من البئر الأول.
- إضافة 300 ميكرولتر من WS في الجزء السفلي من الثانية (أي 1WS) والآبار الثالثة (أي 2WS).
- جعل قطرة من TS (100 μL) على غطاء طبق بيتري.
- مع المشابك، فتح دعم التهجين واحد في LN2.
- وضع إسقاط TS تحت منظار مجسم و مع حركة واحدة سريعة اتخاذ الدعم التهجين من LN2 وتزج قطاعها في قطرة، ونقله حتى كل COCs فصل. إزالة الدعم من قطرة بمجرد أن يكون فارغا، ولكن ترك COCs في TS لمدة 1 دقيقة في المجموع (من الغمر حتى الخطوة التالية).
- خذ ماصة مماثلة لتلك المستخدمة في التهيؤ وملئها بـ DS. اتخاذ COCs من قطرة (TS) ونقلها إلى أسفل البئر الأول (DS). انتظر 3 دقائق.
- غسل ماصة مع 1WS. اتخاذ COCs ونقلها في الجزء السفلي من البئر الثانية (1WS). انتظر 5 دقائق.
- غسل ماصة مع 2WS. خذ COCs ونقلها على سطح البئر الثالث (2WS). انتظرهم ليمسوا الجزء السفلي من البئر.
- كرر الخطوة 3.11 باستخدام منطقة أخرى من البئر.
- اغسلي الماصة مع الاستزراع المتوسط وحركي البويضات إلى طبق الثقافة للاستخدام التالي (على سبيل المثال، IVM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد القط بويضات البويضات والاحترار وفقا للبروتوكول الحالي(الشكل 1 والشكل التكميلي 1)،والغالبية العظمى من الأمهان البقاء على قيد الحياة. بعد التهيّم، من بين تقنيات أخرى، يمكن تقييم الجدوى في المجهر البصري على أنهانزاهة 22 أو باستخدام البقع الحيوية. واحدة من هذه الأخيرة هو الفلوريسين diacetate / بروبديسيوم يوديد (ادارة الاغذية والعقاقير / PI) ، والذي يسمح لتحديد قابلة للحياة (الفلورسين الأخضر مشرق) والخلايا الميتة (الفلورسين الأحمر). الشكل 2 يظهر صورة تمثيلية من coCs القط ساخنة vitrified ملطخة مع ادارة الاغذية والعقاقير / PI الحق بعد الاحترار. يتم الإبلاغ عن البيانات من التجارب التي تبين النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة بعد vitrification في الجدول 1، الذي يصور بيانات ما بعد الاحترار من البويضات المعدة لنضج في المختبر17 أو في المختبر إنتاج الجنين16. على العموم، في تجربتين تستخدم كمثال هنا16،17، 395 من أصل 435 البويضات نجا، وسجل إجمالي 90.8٪ بعد الاحترار البقاء.
ومع ذلك، يمكن ملاحظة بعض التغيرات المورفولوجية بعد الاحترار(الشكل 3). في الأماشعة vitrified-warmed بعد هذا البروتوكول، والتشوهات المورفولوجية الأكثر شيوعا هي التغيرات في شكل ooplasm والتحبيب، جزئي (أو، نادرا، المجموع) فقدان خلايا الكمروموليس و (نادرا) كسور pellucida زونا. من ناحية أخرى ، كما ورد في أعمالنا السابقة على الحد الأدنى من حجم الtrification مع الدعم نفسه ، يمكن لهذه COCs vitrified تنضج17 وتتطور إلى أجنة في المختبر16، حتى لو كان بمعدلات أقل من COCs الطازجة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها لا عادة ما تقدم zona pellucida تصلب (وهو آخر نتيجة معروفة من حفظ التبريد)، منذ الإخصاب في المختبر (IVF) هو نجاح16.
الشكل 1: التصوير التخطيطي لبروتوكول ificationification-trification البويضات.
يرجى الرجوع إلى نص المخطوطة للحصول على مؤشرات كاملة. COCs = مجمعات البويضات الهجم؛ ES = حل التوازن؛ VS = حل الزج؛ TS = محلول الذوبان؛ DS = محلول التخفيف؛ WS = محلول الغسيل؛ LN2= النيتروجين السائل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قابلية صلاحية بويضات القطط البويضية بعد الاحترار.
Vitrified cumulus-oocyte complexes الملطخة بالفلوريسين دياسيتات / بروبديسيوم يوديد (FDA / PI) تظهر الفلورانس الأخضر عندما تكون قابلة للحياة (A) أو الفلورس الأحمر أو الضعيف عندما الميت (B). الإثارة/أطوال الموجة للانبعاثات: 495 نانومتر/517 نانومتر بالنسبة لهيئة التنمية الحرجية؛ 538 نانومتر/617 نانومتر لPI. شريط مقياس: 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ميكروجرافات خفيفة من بويضات القطط الطازجة والزهية.
(أ)مجمعات تجمّع البويضات الطازجة بعد جمعها، قبل التزجيج. (ب) Vitrified cumulus-oocyte المجمعات بعد الاحترار، وتبين بعض الإصابات الناجمة عن vitrification (التغيرات في الشكل وفقدان خلايا الركام، السهم الأسود). شريط مقياس: 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| التجربه | مجموعه | بويضات دافئة (n) | بويضات قابلة للحياة (n) | القدرة على البقاء (في المائة) | قابلية البقاء (متوسط % ± SD) |
| 1† | 1 | 13 | 12 | 92.31 | 91.54 ± 3.66 |
| 2 | 47 | 44 | 93.62 | ||
| 3 | 52 | 45 | 86.54 | ||
| 4 | 26 | 24 | 92.31 | ||
| 5 | 41 | 40 | 97.56 | ||
| 6 | 21 | 19 | 90.48 | ||
| 7 | 50 | 44 | 88.00 | ||
| 2‡ | 1 | 17 | 17 | 100.00 | 91.51 ± 9.16 |
| 2 | 17 | 17 | 100.00 | ||
| 3 | 9 | 8 | 88.89 | ||
| 4 | 21 | 21 | 100.00 | ||
| 5 | 30 | 23 | 76.67 | ||
| 6 | 26 | 23 | 88.46 | ||
| 7 | 17 | 13 | 76.47 | ||
| 8 | 10 | 10 | 100.00 | ||
| 9 | 15 | 14 | 93.33 | ||
| 10 | 23 | 21 | 91.30 |
الجدول 1: النتائج التمثيلية لصلاحية البقاء في البويضات ذات البويضات ذات البويضات ذات البويضات ذات البويضات ذات الحساسية. بيانات من † كولومبو وآخرون 201916 و ‡ كولومبو وآخرون 202017.
الشكل التكميلي 1: صورة تمثيلية للدعامات المستخدمة في عملية البويضات. ومقياس الدعم التجاري 13 سم، وهو سهل التعامل معه وتخزينه. يجب تحميل البويضات على الشريط البلاستيكي الرقيق في الجزء العلوي من الجهاز، في أقرب وقت ممكن من العلامة السوداء بالقرب من الطرف. حقوق الطبع والنشر: شركة كيتازاتو. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحفظ بالتبريد البويضات هو تقنية حفظ الجراثيم الحاسمة، وخاصة في التاشيا حيث العديد من الأنواع المهددة بالانقراض، مثل عائلة فيليداي. في هذه المخطوطة، تم تقديم بروتوكول بسيط وصديق للحقل لتكطيب البويضات غير الناضجة من القطط. وسائل الإعلام المختبرية الصنع، والحد الأدنى من دعم الtrification حجم والموظفين المدربين هي العوامل الرئيسية لنجاح هذه الطريقة، والتي تسمح بالحصول على البويضات قابلة للحياة بشكل ثابت ومرات متكررة، كما هو مبين في النتائج التمثيلية التي تم الإبلاغ عنها بموجب هذا.
بدءا من إعداد وسائل الإعلام، ينبغي اتباع البروتوكول بدقة لضمان أفضل النتائج، ولكن مهارات المشغل هي القضية الرئيسية. وينبغي إعداد وسائل الإعلام في نفس اليوم من إجراء التزجيج، أو، إذا لم يكن ذلك ممكنا، ينبغي إعدادها في اليوم السابق وتخزينها عند 4 درجات مئوية. في أي حال، قبل معالجة العينة، ينبغي ترك ما يكفي من الوقت للسماح للحلول للاحماء لجمع RT. Oocyte واختيار COCs هي إجراءات سريعة وبسيطة التي يتم تنفيذها بشكل روتيني من قبل كل مختبر ARTs. ومع ذلك، الحفظ بالتبريد هو الإجراء الأكثر حساسية. في حين أن إجراء الاحترار ليس حاسما جدا، إذا تم اتباع البروتوكول والتوقيت، قد يكون التزجيج أكثر تعقيدا. وبعد التوازن، الذي يجب الحرص فيه على احترام التوقيتات فقط، من المرجح أن تكون المرحلة الأكثر تحديا هي خطوة التزجيج (انظر 2-4 من هذا البروتوكول). في الواقع، يجب أن تكون عمليات نقل البويضة وغسلات الماصات في الوقت المناسب، وكلها مجتمعة، تؤدي في أقل من 90 ثانية. للمبتدئين، فمن المستحسن أن الوقت الإجراء مع ساعة توقيت أثناء التدريب، في حين أيضا للأفراد المدربين قد يكون من المفيد أن يكون جهاز توقيت صفير بعد 60 ثانية كلتنبيه أن الوقت قيد التشغيل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا من شأنه أن يسمح بتوحيد أعلى، حيث أن المشغلين الذين يتصدون لمجموعات من 6-8 COCs ينبغي أن يكونوا قريبين من نقل البويضات من البئر الثاني إلى البئر الثالث من لوحة Repro (انظر الخطوة 2-4.7 من البروتوكول الحالي) عندما ينطلق الإنذار. نأمل، بمساعدة هذه المادة، يمكن تحقيق أعلى توحيد بين الأفراد وبين المختبرات.
ولا تزال القيود الرئيسية للبروتوكول هي السمات الجوهرية لإجراءات الحفظ بالتبريد نفسها. كما لوحظ سابقا، التخريب يعرض البويضات لظروف غير فسيولوجية وضارة محتملة، حتى لو تم تنفيذها لا تشوبه شائبة. الحضانة مع المواد المبردة وانخفاض درجة الحرارة هي الأحداث الأكثر أهمية20 وأنها تحتاج إلى أن تبقى تحت رقابة صارمة. من بين النظافة المبردة الأكثر شيوعًا ، يمكن ملاحظتها بسهولة في المجهر البصري (على سبيل المثال ، فقدان الخلايا الركامية ، تغيير الشكل والحجم الخلويين) ، في حين أن البعض الآخر غير مرئي وغالبًا ما يؤثر على الهياكل دون الخلوية (على سبيل المثال ، تصلب zona pellucida ، الإجهاد التأكسي ، أضرار الهيكل الخلوي ، المغزل الميوتيك وتعديلات الحمض النووي)23،24. على الرغم من أن معظمها قابلة للحياة، COCs vitrified بعد هذا البروتوكول غالبا ما تقدم بعض الشذوذات المورفولوجية واضحة بعد الاحترار. ومع ذلك، لا يوجد أي ارتباط بين المورفولوجيا وقابلية البقاء، والتي قد تكون أيضا إعاقة بسبب الأضرار دون الخلوية3،25، ولكن من المرجح أن تكون التعديلات المورفولوجية نتيجة للتبريد وجزئيا سبب لنتائج النمو في المختبر من البويضات vitrified ، والتي هي سيئة جدا إذا ما قورنت مع تلك البويضات الطازجة. إن الإعداد الدقيق للوسائط التزجيج والملاحظة الدقيقة لتوقيت البروتوكول يساهمان في الحصول على قابلية جيدة للمعالجة بعد الاحترار والسلامة المورفولوجية ، ولكن لا تزال هناك حاجة إلى إدخال تحسينات على المزيد من النضج في المختبر من البويضات وتطوير الأجنة ، حيث أن القدرة على البقاء غالبا ما تنخفض خلال الثقافة التالية16.
الإصابات الناجمة عن البرد تحدث للأسف مع كل طريقة الحفظ بالتبريد24. وقد تم تطوير الحد الأدنى لدعم التزجيج الحجمي المستخدم في هذا البروتوكول لتقليل حجم التزجيج قدر الإمكان، مما يؤدي إلى معدلات تبريد والاحترار أفضل مقارنة بأجهزة حفظ التبريد الأخرى (-23000 درجة مئوية/دقيقة و42000 درجة مئوية/دقيقة على التوالي، وفقا لمواصفات الشركة المصنعة). ونتيجة لذلك، في الطب البشري، حيث الدراسات السريرية تقييم كل من في المختبر (أي، الإخصاب ونمو الجنين) وفي المعلمات في الجسم الحي (أي معدلات الحمل والولادات الحية) متوفرة، الحد الأدنى من حجم التبخيل هو الخيار الأكثر شيوعا لبويضات حفظ التبريد بسبب نتائجها لا تضاهى من حيث البقاء على قيد الحياة بعد الاحترار، وأخيرا، الولادات الحية12 من البويضات البشرية الناضجة vitrified. وبالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع أجهزة التزجيج الأخرى، واحد المستخدمة في هذا البروتوكول هو أسهل للاستخدام وأكثر أمانا لتخزين12، لأنه هو مريح للتعامل ومحمية بغطاء أثناء التخزين. على سبيل المثال ، Cryoloop هو أيضا دعم فعال من أجل الوصول إلى الحد الأدنى من حجم الهدف ، ولكن هيكلها (حلقة دعم فيلم من الحل الذي يتم تحميل البويضات) هشة وعرضة للاحترار عرضي12. يمكن أيضا أن تستخدم القش (0.25 مل حجم) أو فتح قش سحبت (مكتب خدمات المشاريع) ، لكنها لا تسمح بانخفاض كبير في حجم الtrification ، كما أنها تشكل تحديا لملء وفارغة ، وبعض البويضات قد تضيع26. وقد تم تطوير العديد من الدعامات الأخرى2، ولكن كل منها له عيوبه. بدلا من ذلك ، بالمقارنة مع تجميد بطيء ، والتي كانت في السابق تقنية الحفظ بالتبريد الأكثر استخداما ، والمزايا الرئيسية للحد الأدنى من حجم التبزج على الدعامات التجارية هي جدواها وسرعتها. كما ذكر سابقا، vitrification لا يتطلب الفريزر للبرمجة التي يتعين القيام بها، وبينما تجميد بطيء من البويضات يستغرق حوالي ساعة ونصف إلى أن يتم الانتهاء25،يمكن إنجاز vitrification في حوالي 17 دقيقة بعد هذا البروتوكول.
وفي الختام، قد تكون مهارات الموظفين وتوحيد المقاييس بين المشغلين أكثر المتطلبات تحديا عند بدء تشغيل بنك بويضات مُزَمَّن، ولكن سيتم تحقيقها بتدريب الموظفين. هذا الحد الأدنى من حجم بروتوكول التنفيس عن البويضات غير ناضجة القط يعطي نتائج متسقة وقابلة للتكرار عندما يؤديها من قبل مشغلي ذوي الخبرة. ومع ذلك، لا تزال هناك فرص لتحسين معدلات نمو البويضة، حتى لو كانت قابلية البقاء في مرحلة ما بعد الاحترار والسلامة مرضية. مع مزيد من التحسين، يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول في ظروف ميدانية ل felids البرية، والتي البيانات المنشورة بشأن بويضات cryopreservation لا تزال نادرة27. وتوسيع نطاق تطبيق هذه الطريقة لن يؤدي فقط إلى زيادة إمكانية تحسين بروتوكولات حفظ التبريد، بل سيسمح أيضا بإنشاء بنوك حيوية بويضية vitrified للخصوبة وحفظ التنوع البيولوجي في felids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل جزئيًا من قبل EVSSAR (الجمعية البيطرية الأوروبية لتكاثر الحيوانات الصغيرة) منحة 2016 ومن جامعة degli Studi di Milano، Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). ونود أيضا أن نشكر الدكتورة ماريا جيوجيرجيا مورسيلي على مساهمتها في التجارب التي تم تصويرها في هذا واقتناء الصور.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
