Summary
Dit manuscript beschrijft een protocol voor de minimale volume vitrification van onrijpe katoocyten met laboratorium-gemaakte media op commerciële steunen. Het dekt elke stap van eicelisolatie van ex vivo gonaden tot vitrificatie en opwarming.
Abstract
In de instandhoudingsprogramma's van wilde dieren is gamete banking cruciaal om genetische hulpbronnen van waardevolle individuen en zeldzame soorten te beschermen en het behoud van de biodiversiteit te bevorderen. In felids, de meeste soorten worden bedreigd met uitsterven, en binnenlandse rassen worden gebruikt als een model om de efficiëntie van protocollen voor kiemplasma bankieren te verhogen. Onder oocyte cryopreservatie technieken, vitrification is meer en meer populair in de menselijke en veterinaire ondersteunde voortplanting. Cryotop vitrification, dat in eerste instantie werd ontwikkeld voor menselijke eicellen en embryo's, heeft aangetoond zeer geschikt te zijn voor kattenoraad. Deze methode biedt verschillende voordelen, zoals de haalbaarheid in het veld omstandigheden en de snelheid van de procedure, die nuttig kunnen zijn wanneer meerdere monsters moeten worden verwerkt. De efficiëntie is echter sterk afhankelijk van de vaardigheden van de operator en intra- en interlaboratoriumstandaardisatie zijn nodig, evenals personeelstraining. Dit protocol beschrijft minimale volume vitrificatie van onrijpe katachtige eicellen op een commerciële ondersteuning in een stap voor stap veld-vriendelijk protocol, van eicel collectie tot opwarming. Volgens het protocol, behoud van eicelintegriteit en levensvatbaarheid bij opwarming (tot 90%) kan worden verwacht, hoewel er nog ruimte is voor verbetering in de post-opwarming van de rijping en de embryonale ontwikkelingsresultaten.
Introduction
Cryopreservatie is uitgegroeid tot een belangrijke stap van geassisteerde reproductietechnieken (ART's). Bij mensen, het maakt het behoud van de vruchtbaarheid of uitstel van het ouderschap om medische of persoonlijke redenen. Bij dieren is het noodzakelijk om afstand en tijd in geplande paringen te overwinnen, vooral bij boerderijdieren en huisdieren, of om genetisch materiaal van waardevolle onderwerpen in instandhoudingsprogramma's te behouden, met name bij bedreigde diersoorten. Gamete cryopreservatie is de beste keuze wanneer de te fokken personen nog niet zijn gekozen of om ethische problemen in verband met het invriezen van embryo's te voorkomen, vooral in de menselijke geneeskunde1. Spermatozoa zijn relatief eenvoudig te bewaren en geven bevredigende resultaten na ontdooien, maar eicellen, vanwege hun structurele kenmerken, misschien complexer op te slaan. Inderdaad, de lage oppervlakte /volume verhouding, evenals de aanwezigheid van de zona pellucida rond de ooplasma, beperkt de beweging van cryoprotectiva en water over de cel2. Bovendien worden ze bij huisdieren, waaronder feliden, gekenmerkt door een lipiderijk cytoplasma, waarvan wordt gedacht dat ze gevoeliger zijn voor cryopreservatie3.
De meeste feliden worden bedreigd, en de binnenlandse kat wordt gebruikt als een model om protocollen te ontwikkelen voor het behoud van kiemplasma dankzij de beschikbaarheid van gonaden van routine ovariectomie. Bij wilde dieren kunnen geslachtsklieren worden verkregen na electieve operaties of (vaker) postmortem,en onrijpe (kiemvellen) kunnen worden opgehaald. Hormonale stimulatie gericht op het verkrijgen van volwassen (metafase II) eicellen is niet zo gebruikelijk als in de menselijke ARTs vanwege de ethische kwesties en de soort- en individueel-specifieke reactie op behandelingen4.
Daarom is de ontwikkeling van cryopreservatie strategieën is gericht op onvolwassen gameten, die meestal kan worden opgehaald na de onverwachte of plotselinge dood van zeldzame individuen. Vanuit biologisch oogpunt zijn er enkele verschillen in de cryopreservatie van onrijpe of volwassen gameten, elk met zijn voordelen. Ten eerste is DNA beter beschermd in onrijpe eicellen, waarvan de kiemvezel chromosomen bevat die zijn omgeven door een nucleair membraan, terwijl de meiotische as van metafase II-eicellen kwetsbaarder zou kunnen zijn voor cryoinjuries5. Ten tweede kunnen koud-geïnduceerde cytoskeletschade de rotatie van de as, de extrusie van het polaire lichaam, de pronucleaire migratie en cytokinese beïnvloeden, wat verschillende effecten kan hebben volgens de ontwikkelingsfase van oocyten, die meioseprogressie of post-fersiegebeurtenissen beïnvloedt. Tot slot, en misschien wel het belangrijkste, terwijl volwassen eicellen klaar zijn om bevrucht te worden, vertrouwen onrijpe gameten op de steun van de omliggende cumuluscellen om door nucleaire en cytoplasmamische rijping te gaan6, en dit is de reden waarom hele cumulus-eicellencomplexen (COC's) worden gehuild. Echter, het verlies van cumulus cellen en / of het verlies van functionele verbinding tussen de gamete en de omliggende somatische cellen zijn waarschijnlijk het meest nadelige effect van cryopreservatie van onrijpe COCs.
Onder cryopreservatie technieken, vitrification is er een die gemakkelijker kan worden toegepast in het veld voorwaarden. In vergelijking met langzame (of gecontroleerde snelheid) bevriezing, vitrification is sneller en vereist geen specifieke apparatuur, zoals een programmeerbare vriezer. Om te voldoen aan de drie fundamentele principes van vitrificatie (d.w.z. hoge viscositeit, verbonden met hoge cryoprotectantconcentratie, kleine volumes en ultrasnelle temperatuurdaling), zijn verschillende media en steunen speciaal ontwikkeld en gebruikt bij katten voor zowel onrijpe als volwassen eicellen. Beginnend met eenvoudige rietjes7,werden de apparaten toen ontwikkeld om het doel "Minimum volume" te bereiken. Cryoloop8, open pulled straws (OPS)9, plastic goten (gemodificeerd stro)10 en cryotubes11 zijn gebruikt, totdat een efficiënter apparaat (dat wil zeggen, Cryotop) werd gebruikt11, verbetering van de overleving en meiose hervatting. Cryotop (Supplemental Figuur 1) is een commercieel beschikbare ondersteuning die is uitgegroeid tot de keuze open systeem voor vitrification. Ontwikkeld voor de vitrificatie van menselijke eicellen en embryo's, het bestaat uit een kleine film strip bevestigd aan een harde plastic houder, beschermd door een plastic buis dop tijdens opslag12. Dankzij de bruikbaarheid en de extreme vermindering van het vitrificatievolume (zo weinig als 0,1 μL), wat ook leidt tot extreem snelle koel- en opwarmingspercentages, is deze vitrificatiesteun steeds vaker toegepast in verschillende soorten, waaronder de huiskat, waarbij deze is gebruikt met een verscheidenheid aan media13,14,15,16,17.
Het doel van dit manuscript is om een collectie-vitrification-warming protocol te beschrijven, met kleine wijzigingen van de oorspronkelijk ontwikkeld voor menselijke eicellen, die laboratorium-en-klare media en commerciële ondersteuning voor een minimum volume vitrification gebruikt en kan gemakkelijk worden toegepast in het veld omstandigheden voor de cryopreservatie van onrijpe katachtige COC's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De afgebeelde procedures hebben geen ethische goedkeuring ondergaan, aangezien kattenstokken bij veterinaire klinieken werden verzameld als bijproducten van door de eigenaar gevraagde routineovariectomie of ovariohysterectomie.
1. Oocytencollectie
- Bereid voor aanvang van de experimenten oplossingen voor eierstok- en eicelcollectie. Bereid eierstokverzameloplossing met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een mengsel van antibiotica en antimycotica (100 IU/mL penicilline G natrium, 0,1 mg/mL streptomycinesulfaat, 0,25 μg/mL amphotericine B). Bereid oocytenopvangoplossing (d.w.z. PBS/PVA) met PBS met 100 IU/mL penicilline G natrium, 0,1 mg/mL streptomycinesulfaat en 0,1% (w/v) polyvinylalcohol (PVA).
- Bewaar oplossingen voor eierstok- en eicelverzameling bij 4 °C tot gebruik.
- Neem op de dag van het kuurwerk van koninginnen, enkele uren voor de verwerking van de monsters, een deel van eierstok- en eicelleninzamelingsoplossingen en laat ze opwarmen bij kamertemperatuur (RT; 25 ± 2 °C).
- Wanneer monsters aankomen in het lab, isoleren van de eierstokken uit de omliggende bindweefsel en van de eicel en was ze in verse eierstok collectie medium in een petrischaal.
- Vul een 35 mm petrischaal voor elke koningin met ongeveer 3 mL RT PBS/PVA, en nog een schotel om de eicellen te verzamelen.
- Plaats een paar eierstokken in een petrischaaltje en maak gehakt van de cortex met een chirurgische scalpel. Zorg ervoor dat alle follikels zijn gebroken met behulp van een stereomicroscoop (vergroting 8x).
- Verzamel COC's met een pipet en verplaats ze in verse PBS/PVA in de toegewezen petrischaal. Selecteer goede eigenschappen COC's, met een homogeen, donker cytoplasma en omgeven door verschillende compacte lagen cumuluscellen (graad I18).
2. Verglaringing
- Bereid evenwichts- en verglaasingsmedia voor.
- Bereid evenwichtsoplossing (ES) voor met 7,5% ethyleenglycol (EG) en 7,5% (v/v) dimethylsulphoxide (DMSO) in Medium 199, met 20% foetaal runderserum (FBS).
- Bereid vitrification solution (VS) voor met 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO en 0,5 M sacharose in Medium 199, met 20% FBS (gewijzigd vanaf 19).
- Laat ES en VS opwarmen bij RT voor gebruik.
OPMERKING: Cryoprotectants (bijvoorbeeld EG, DMSO) staan bekend als cytotoxisch. Een strategie om hun toxiciteit tegen te gaan is het verminderen van de temperatuur waarbij de cellen worden blootgesteld aan hen20, en eicellen worden meestal blootgesteld aan cryoprotectiva op RT. Zo wordt de hele procedure, van eicelinzameling tot vitrificatie, uitgevoerd bij RT in dit protocol om temperatuurschommelingen te voorkomen.
- Bereid de vitrification schotel (dat wil zeggen, een speciaal gerecht bestaande uit zes kegelvormige putten verdeeld in twee rijen, bekend als "Repro plate"). Bereid een rij (drie putten) voor elke vitrification ondersteuning.
- Voeg 20 μL ES toe aan de onderkant van de eerste put.
- Voeg 300 μL VS toe aan de onderkant van de tweede (d.w.z. 1VS) en derde (d.w.z. 2VS) putten.
- Equilibrate COC's in ES.
- Met een kleine boring pipet (bijvoorbeeld, een Pasteur pipet getrokken op een Bunsen snavel om het dunner te maken - diameter moet ten minste 200 μm), breng een (of meer) COC(s) op de bodem van de eerste put.
OPMERKING: Kies de grootte van de pipet op basis van het aantal lagen cumuluscellen rond de eicellen, dus naar coc-afmetingen, met als doel om het volume van de media die in elke stap wordt overgedragen met COC's, zoveel mogelijk te verminderen. Met het huidige protocol kunnen getrainde operators met succes tot acht katachtige COC's per vitrification-ondersteuning met succes verglaasen. - Voeg langzaam 20 μL ES toe aan de rand van de druppel. Wacht 3 minuten.
- Voeg langzaam andere 20 μL ES toe aan de rand van de druppel. Wacht 3 minuten.
- Voeg langzaam 240 μL ES toe aan de rand van de druppel. Wacht 9 minuten.
- Tijdens het wachten, bereid een doos met vloeibare stikstof (LN2), label een vitrification ondersteuning met het experiment / kat identificatiecode en laat het open. Zet ze allebei in de buurt van de stereomicroscoop, zodat ze gemakkelijk bereikbaar zijn tijdens het werken.
Voorzichtigheid! Draag persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van LN2. - Als er meerdere COC's moeten worden verglaasd, begint u ook aan de eerste evenwichtsstap (zie stap 2.3.1 - 2.3.2) voor een andere groep COC's (die op een nieuwe vitrificatieondersteuning zal worden geladen).
- Met een kleine boring pipet (bijvoorbeeld, een Pasteur pipet getrokken op een Bunsen snavel om het dunner te maken - diameter moet ten minste 200 μm), breng een (of meer) COC(s) op de bodem van de eerste put.
- Vitrify COC's in VS in minder dan 90 seconden.
- Met behulp van dezelfde kleine boring pipet, vul het met 1VS, neem de COCs van de bodem van de eerste put (ES) en verplaats ze naar het oppervlak van de tweede put (1VS).
- Was de pipet met 1VS.
- Neem de COC's en verplaats ze in een ander gebied (op de bodem) van de put; meng het medium eromheen met de pipet.
- Vul de pipet met 1VS in een ander gebied van de put, neem de COC's, verplaats ze en meng het medium eromheen met de pipet.
- Herhaal stap 2.4.4.
- Was de pipet met 2VS.
- Neem de COC's en verplaats ze op de bodem van de derde put (2VS); meng het medium eromheen met de pipet.
- Vul de pipet met 2VS in een ander gebied van de put, neem de COC's, verplaats ze en meng het medium eromheen met de pipet.
- Herhaal stap 2.4.8.
- Vul de pipet met 2VS in een ander gebied van de put, neem de COC's en laad ze op de strook van de vitrification-ondersteuning, zo dicht mogelijk bij de punt. Aanzuigen overtollig medium om het volume van VS zo veel mogelijk te verminderen.
- Onmiddellijk duik de vitrification steun in LN2, verplaatsen. Sluit het met behulp van een aantal klemmen, zorg ervoor dat het altijd blijft ondergedompeld in LN2.
OPMERKING: Het behouden van de juiste timing is cruciaal vanwege cryoprotectant celtoxiciteit. Vanwege hun hoge concentratie in vitrification media, cel blootstelling moet worden gecontroleerd, ook door vlekkeloze uitvoering van de techniek21. Als monsters overvloedig zijn, overwegen ze te verdelen om ze sneller te verwerken en de hoeveelheid tijd van oocyte verzameling tot vitrificatie te minimaliseren.
- Bewaar de geladen vitrificatiesteunen in een beker en bewaar ze in een opslag LN2 tank tot de opwarming.
OPMERKING: Alle voorgaande stappen van het protocol kunnen ook worden toegepast in veldomstandigheden als LN2 beschikbaar is. Een droge verlader zal nodig zijn om de monsters veilig naar het lab te vervoeren en vervolgens daar heen te gaan met de volgende fasen.
3. Opwarming
- Bereid opwarmende media voor.
- Bereid ontdooioplossing (TS) voor met 1 M sucrose in Medium 199, met 20% FBS.
- Bereid verdunningsoplossing (DS) met 0,5 M sacharose in Medium 199, met 20% FBS.
- Bereid wasoplossing (WS) voor met Medium 199 met 20% FBS.
- Verwarm ts voor gebruik op tot 38 °C en DS en WS bij RT.
- Bereid indien nodig het kweekmedium voor op het latere gebruik van opgewarmde COC's (bijvoorbeeld in vitro rijping, IVM).
- Plaats het verwarmingsstadium dicht bij de stereomicroscoop en zet deze aan (38 °C). Doe het deksel van een petrischaaltje om op te warmen.
- Wanneer alles klaar is, breng je de vitrificatiesteunen die van de opslagtank moeten worden opgewarmd naar een doos met LN2,over en zet je de doos in de buurt van de stereomicroscoop.
- Bereid de "Repro plate" voor. Bereid een rij voor voor elke vitrificatie ondersteuning die moet worden opgewarmd.
- Voeg 300 μL DS toe aan de onderkant van de eerste put.
- Voeg 300 μL WS toe aan de onderkant van de tweede (d.w.z., 1WS) en derde (d.w.z., 2WS) putten.
- Maak een druppel TS (100 μL) op het deksel van de petrischaal.
- Open met klemmen één vitrificatiesteun in de LN2.
- Zet de TS-druppel onder de stereomicroscoop en neem met één snelle beweging de vitrificatieondersteuning van de LN2 en dompel de strip onder in de druppel, en verplaats deze totdat alle COC's loskomen. Verwijder de steun uit de druppel zodra deze leeg is, maar laat de COC's in totaal 1 minuut in TS staan (van onderdompeling tot de volgende stap).
- Neem een pipet vergelijkbaar met die gebruikt voor vitrification en vul het met DS. Neem de COC's uit de drop (TS) en verplaats ze naar de bodem van de eerste put (DS). Wacht 3 minuten.
- Was de pipet met 1WS. Neem de COC's en verplaats ze op de bodem van de tweede put (1WS). Wacht 5 minuten.
- Was de pipet met 2WS. Neem de COC's en verplaats ze op het oppervlak van de derde put (2WS). Wacht tot ze de bodem van de put aanraken.
- Herhaal stap 3.11 met behulp van een ander gebied van de put.
- Was de pipet met cultuurmedium en verplaats de eicellen naar de kweekschaal voor het volgende gebruik (bijvoorbeeld IVM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na cat oocyte vitrification en opwarming volgens het huidige protocol (Figuur 1 en Supplemental Figuur 1), de overgrote meerderheid van de gameten overleven. Na vitrificatie, onder andere technieken, kan de levensvatbaarheid worden geëvalueerd op de optische microscoop als morfologische integriteit22 of met het gebruik van vitale vlekken. Een van de laatste is fluoresceïne diacetaat / propidium jodide (FDA / PI), die het mogelijk maakt de identificatie van levensvatbare (felgroene fluorescentie) en dode cellen (rode fluorescentie). Figuur 2 toont een representatief beeld van verglaasde verwarmde kat COC's bevlekt met FDA / PI direct na de opwarming. Gegevens uit de experimenten die het overlevingspercentage na vitrificatie laten zien, worden vermeld in tabel 1, waarin postopwarmende gegevens van eicellen die bestemd zijn voor in vitro rijping17 of in vitro embryoproductie16weergeeft . Over het geheel genomen, in de twee experimenten gebruikt als voorbeelden hier16,17, 395 van de 435 eicellen overleefd, scoren een totale 90,8% post-warming levensvatbaarheid.
Sommige morfologische veranderingen kunnen echter worden opgemerkt na de opwarming(figuur 3). In gameten die volgens dit protocol zijn opgewarmd, zijn de meest voorkomende morfologische afwijkingen veranderingen in ooplasmavorm en granulatie, gedeeltelijk (of, zelden, totaal) verlies van cumuluscellen en (zelden) zona pellucida fracturen. Aan de andere kant, zoals gemeld in onze vorige werken over minimale volume vitrification met dezelfde steun, deze verglaasde COC's kunnen rijpen17 en ontwikkelen zich tot embryo's in vitro16, zelfs als tegen lagere tarieven dan verse COCs. Bovendien presenteren ze meestal geen zona pellucida verharding (wat een ander bekend gevolg is van cryopreservatie), omdat in vitro fertilisatie (IVF) succesvol is16.
Figuur 1: Schematische weergave van oocyte vitrification-warming protocol.
Raadpleeg de manuscripttekst voor volledige indicaties. COC's= cumulus-eicellencomplexen; ES=evenwichtsoplossing; VS=vitrificatieoplossing; TS=ontdooioplossing; DS=verdunningsoplossing; WS=wasoplossing; LN2=vloeibare stikstof. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Levensvatbaarheid van verglaasde kattenocyten na opwarming.
Verglaasde cumulus-oocytencomplexen bevlekt met fluoresceïnediacetaat/propidium jodide (FDA/PI) vertonen groene fluorescentie wanneer ze levensvatbaar zijn(A)of rode of zwakke fluorescentie wanneer ze dood zijn(B). Opwinding/emissiegolflengten: 495 nm/517 nm voor DE FDA; 538 nm/617 nm voor PI. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Lichte micrografen van verse en verglaasde kattenocyten.
aA) Verse cumulus-oocytencomplexen na inzameling, vóór vitrificatie. (B) Geglazuurde cumulus-oocytencomplexen na opwarming, met enkele vitrification-geïnduceerde verwondingen (veranderingen in vorm en verlies van cumuluscellen, zwarte pijl). Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Experiment | Groep | Opgewarmde eicellen (n) | Levensvatbare eicellen (n) | Levensvatbaarheid (%) | Levensvatbaarheid (gemiddelde ± SD) |
| 1† | 1 | 13 | 12 | 92.31 | 91,54 ± 3,66 |
| 2 | 47 | 44 | 93.62 | ||
| 3 | 52 | 45 | 86.54 | ||
| 4 | 26 | 24 | 92.31 | ||
| 5 | 41 | 40 | 97.56 | ||
| 6 | 21 | 19 | 90.48 | ||
| 7 | 50 | 44 | 88.00 | ||
| 2‡ | 1 | 17 | 17 | 100.00 | 91,51 ± 9,16 |
| 2 | 17 | 17 | 100.00 | ||
| 3 | 9 | 8 | 88.89 | ||
| 4 | 21 | 21 | 100.00 | ||
| 5 | 30 | 23 | 76.67 | ||
| 6 | 26 | 23 | 88.46 | ||
| 7 | 17 | 13 | 76.47 | ||
| 8 | 10 | 10 | 100.00 | ||
| 9 | 15 | 14 | 93.33 | ||
| 10 | 23 | 21 | 91.30 |
Tabel 1: Representatieve resultaten van de levensvatbaarheid bij kattenglarverwarmde eicellen. Gegevens van †Colombo et al. 201916 en ∙ Colombo et al. 202017.
Aanvullende figuur 1: Representatief beeld van de steunen die worden gebruikt voor eiglasverglading. De commerciële ondersteuning meet 13 cm en is gemakkelijk te hanteren en op te slaan. Oocyten moeten worden geladen op de dunne plastic strip aan de bovenkant van het apparaat, zo dicht mogelijk bij de zwarte vlek in de buurt van de tip. Auteursrecht: Kitazato Corporation. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oocyte cryopreservatie is een cruciale kiemplasma behoud techniek, vooral in taxa waar veel soorten worden bedreigd, zoals Felidae familie. In dit manuscript werd een eenvoudig en veldvriendelijk protocol voor de vitrificatie van onrijpe katoocyten gepresenteerd. Laboratoriummedia, ondersteuning van het minimale volume vitrification en opgeleid personeel zijn de belangrijkste factoren voor het succes van deze methode, die het mogelijk maakt om consequent en herhaaldelijk levensvatbare eicellen te verkrijgen, zoals blijkt uit de representatieve resultaten die hierbij worden gerapporteerd.
Beginnend met de voorbereiding van de media, moet het protocol nauwkeurig worden gevolgd om de beste resultaten te garanderen, maar de vaardigheden van de operator zijn het belangrijkste probleem. Media moeten op dezelfde dag van de vitrificatieprocedure worden voorbereid, of, indien dat niet mogelijk is, moeten ze de dag ervoor worden voorbereid en bij 4 °C worden opgeslagen. In ieder geval moet er vóór de monsterverwerking voldoende tijd overblijven om de oplossingen op te warmen voor RT. Oocyte verzameling en COC's selectie zijn snelle en eenvoudige procedures die routinematig worden uitgevoerd door elk ARTs laboratorium. Cryopreservatie is echter de meest delicate procedure. Hoewel de opwarmingsprocedure niet zo kritiek is, als het protocol en de timings worden gevolgd, kan vitrificatie complexer zijn. Na evenwicht, waarbij alleen moet worden gezorgd voor tijdstippen, is de meest uitdagende fase waarschijnlijk de vitrificatiestap (zie 2.4. van het huidige protocol). Inderdaad, eicel transfers en pipet wassen moeten goed worden getimed en, allemaal samen, uitgevoerd in minder dan 90 seconden. Voor beginners is het raadzaam om de procedure te timen met een stopwatch tijdens de training, terwijl het ook voor getrainde personen nuttig kan zijn om een timer te laten piepen na 60 seconden als een waarschuwing dat de tijd oploopt. Bovendien zou dit een hogere standaardisatie mogelijk maken, aangezien exploitanten die groepen van 6-8 COC's versterken, dicht bij de overdracht van de eicellen van de tweede naar de derde put van de Repro-plaat (zie stap 2.4.7 van het huidige protocol) moeten zijn wanneer het alarm afgaat. Hopelijk, met behulp van dit artikel, een hogere standaardisatie tussen individuen en tussen laboratoria zou kunnen worden bereikt.
De belangrijkste beperkingen van het protocol blijven de intrinsieke kenmerken van cryopreservatieprocedures zelf. Zoals eerder opgemerkt, stelt vitrificatie eicellen bloot aan niet-fysiologische en potentieel schadelijke aandoeningen, zelfs als het feilloos wordt uitgevoerd. De incubatie met cryoprotectiva en de daling van de temperatuur zijn de meest kritieke gebeurtenissen20 en ze moeten onder strikte controle worden gehouden. Onder de meest voorkomende cryoinjuries, sommige zijn gemakkelijk waarneembaar op de optische microscoop (bijvoorbeeld cumulus celverlies, wijziging van cellulaire vorm en grootte), terwijl anderen niet zichtbaar zijn en vaak van invloed op subcellulaire structuren (bijvoorbeeld, zona pellucida verharding, oxidatieve stress, cytoskelet schade, meiotische spindel en DNA veranderingen)23,24. Hoewel meestal levensvatbaar, COC's verglaasd volgens dit protocol vaak presenteren een aantal duidelijke morfologische anomalieën na de opwarming. Er is echter geen correlatie tussen morfologie en levensvatbaarheid, die ook kunnen worden belemmerd als gevolg van subcellulaire schade3,25, maar morfologische veranderingen zijn waarschijnlijk een gevolg van cryoïstiek en gedeeltelijk een reden voor de in vitro ontwikkelingsresultaten van verglaasde eicellen, die vrij slecht zijn in vergelijking met die van verse eicellen. De zorgvuldige voorbereiding van vitrification media en de nauwkeurige observatie van de protocoltiming dragen bij tot een goede post-warming levensvatbaarheid en morfologische integriteit, maar verbeteringen in verdere in vitro rijping van eicellen en embryoontwikkeling zijn nog steeds nodig, omdat de levensvatbaarheid vaak afneemt tijdens de volgende cultuur16.
Koud geïnduceerde verwondingen komen helaas voor bij elke cryopreservatiemethode24. De minimale ondersteuning voor het verven van het volume die in dit protocol wordt gebruikt, is ontwikkeld om het vitrificatievolume zoveel mogelijk te verminderen, wat resulteert in betere koel- en opwarmingspercentages in vergelijking met andere cryopreservatie-apparaten (-23.000 °C/minute en 42.000 °C/minute respectievelijk, volgens de specificaties van de fabrikant). Als gevolg hiervan, in de menselijke geneeskunde, waar klinische studies die zowel in vitro (d.w.z. bevruchting en embryoontwikkeling) als in vivo parameters (d.w.z. zwangerschapscijfers en levend geboren zijn) beschikbaar zijn, is de minimale vorm vitrificatie de meest voorkomende keuze voor eicellen cryopreservatie vanwege de onvergelijkbare resultaten in termen van overleving na de opwarming en, ten slotte, levende geboorten12 van verglaasde volwassen menselijke oocyten. Bovendien, in vergelijking met andere vitrification apparaten, de ene gebruikt in dit protocol is gemakkelijker te gebruiken en veiliger op te slaan12, omdat het comfortabel is om te hanteren en wordt beschermd door een dop tijdens de opslag. Bijvoorbeeld, de Cryoloop is ook een efficiënte ondersteuning om het minimale volume doel te bereiken, maar de structuur (een lus ter ondersteuning van een film van oplossing waarop de eicellen worden geladen) is kwetsbaar en gevoelig voor toevallige opwarming12. Rietjes (0,25 mL volume) of open pulled straws (OPS) kunnen ook worden gebruikt, maar ze staan geen significante vermindering van het vitrification volume toe en zijn ook uitdagend om te vullen en leeg te maken, omdat sommige eicellen verloren kunnen gaan26. Veel andere steunen zijn ontwikkeld2,maar elk van hen heeft zijn nadelen. In plaats daarvan, in vergelijking met langzame bevriezing, die voorheen was de meest gebruikte cryopreservatie techniek, de belangrijkste voordelen van minimale volume vitrification op commerciële ondersteunt zijn de haalbaarheid en snelheid. Zoals eerder vermeld, vitrification vereist niet een programmeerbare vriezer worden uitgevoerd, en terwijl langzame bevriezing van eicellen duurt ongeveer een uur en de helft te worden geconcludeerd25, vitrification kan worden bereikt in ongeveer 17 minuten na het huidige protocol.
Tot slot zijn de vaardigheden van het personeel en de standaardisatie tussen de operatoren misschien wel de meest uitdagende vereisten bij het starten van een verglaasde eicelbank, maar deze zullen worden bereikt met personeelstraining. Dit minimale volume vitrification protocol voor kat onrijpe eicellen geeft consistente en herhaalbare resultaten wanneer uitgevoerd door ervaren operators. Er zijn echter nog steeds kansen op verbetering van de eicelontwikkelingspercentages, zelfs als de levensvatbaarheid en integriteit na de opwarming bevredigend zijn. Met verdere optimalisatie, het huidige protocol kan ook worden toegepast in het veld omstandigheden voor wilde felids, waarvoor gepubliceerde gegevens over eicel cryopreservatie is nog steeds schaars27. De uitbreiding van de toepassing van deze methode zou niet alleen de mogelijkheid vergroten om cryopreservatieprotocollen te verbeteren, maar zou ook de oprichting van verglaasde eicelbiobanken voor vruchtbaarheid en behoud van biodiversiteit in feliden mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 en door Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). We willen ook dr. MariaGiorgia Morselli bedanken voor haar bijdrage aan de experimenten die hierbij worden afgebeeld en aan de beeldaanwinst.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
