Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61523
Automatic Translation
1, 1
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור אמצעי האחסון המינימלי של ויטריפיקציה של חתולים בלתי בוגרים עם מדיה מתוצרת מעבדה על תמיכות מסחריות. הוא מכסה כל צעד מ oocyte בידוד מ vivo גונדות לשעבר כדי ויטריפיקציה והתחממות.

Abstract

בתוכניות השימור של חיות הבר, הבנקאות המגיים חיונית לשמירה על משאבים גנטיים של אנשים יקרי ערך ומינים נדירים ולקדם שימור ביולוגי. ב-felids, רוב המינים מאוימים בפני הכחדה, וגזעים ביתיים משמשים כמודל כדי להגביר את היעילות של פרוטוקולים עבור בנקאות germplasm. בין טכניקות הקפאת הקריוציט, ויטריפיקציה הוא יותר ויותר פופולרי ב אדם וטרינרי בסיוע רבייה. קריוטופ ויטריפיקציה, אשר פותחה לראשונה עבור האדם oocytes ועוברים, הוכיחה להיות מתאים היטב עבור החתול oocytes. שיטה זו מציעה מספר יתרונות, כגון הכדאיות בתנאי שדה ומהירות ההליך, שיכולה להועיל כאשר יש צורך לעבד מספר דגימות. עם זאת, היעילות תלויה מאוד בכישורי המפעיל, ובקביעת הסדר הפנים-מעבדה, ובהתאם לצורך בהכשרה לאנשי צוות. פרוטוקול זה מתאר כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים בתמיכה מסחרית בפרוטוקול צעד אחר צעד ידידותי לשדה, מאוסף oocyte להתחממות. בעקבות הפרוטוקול, שימור שלמות oocyte ויכולת הכדאיות בהתחממות (גבוה ככל 90%) ניתן לצפות, למרות שעדיין יש מקום לשיפור התבגרות שלאחר ההתחממות ותוצאות פיתוח עובריים.

Introduction

הקפאה הקריוגנית הפכה לשלב מפתח של טכניקות שעתוק בסיוע (אומנויות). בבני אדם, היא מאפשרת שימור פוריות או דחייה של ההורות מסיבות רפואיות או אישיות. בבעלי חיים, יש צורך להתגבר על מרחק וזמן במקצועות מתוכננים, בעיקר בבעלי חיים חקלאיים ובחיות מחמד, או לשמר חומר גנטי של נושאים יקרי ערך בתוכניות שימור, במיוחד במינים פראיים בסכנת הכחדה. שמירת המשחק היא הבחירה הטובה ביותר כאשר אנשים להיות מתרבה לא נבחרו עדיין או על מנת למנוע בעיות אתיות הקשורות לקיפאון העובר, במיוחד ברפואה האנושית1. הזרע קל יחסית לשמר ולתת תוצאות משביע רצון לאחר הפשרה, אבל oocytes, בשל התכונות הקונסטרוקטיביות שלהם, יכול להיות מורכב יותר לאחסן. ואכן, היחס הנמוך של פני השטח/נפח, כמו גם הנוכחות של הסונה pellucida סביב האופלמה, מגביל את התנועה של הcryoprotectants והמים על פני התא2. יתר על כן, בעלי חיים ביתיים כולל felids, הם מאופיינים על ידי ציטופלסמה עשיר ליפיד, אשר נחשב להפוך אותם רגישים יותר לקריוגנית3.

רוב הפלאידים מאוימים, והחתול המקומי משמש כמודל לפיתוח פרוטוקולים לשימור גארפלמטר בזכות הזמינות של הגונדות מניתוח שגרתי. בחיות בר, הגונדות ניתן להשיג לאחר ניתוחים בחירה או (לעתים קרובות יותר) לאחר המוות, ולא בוגר (בתוספת vesicle לפוחית) מגיים ניתן לאחזר. גירוי הורמונלי שנועד לקבל בוגרת (מטאמשלב II) oocytes אינו נפוץ כמו באמנויות האדם בגלל הסוגיות המוסריות ואת התגובה הספציפית מיני לטיפולים4.

לכן, ההתפתחות של אסטרטגיות הקריואופרסטית התמקדה gametes בוגרים, אשר בדרך כלל ניתן לאחזר לאחר מוות בלתי צפוי או פתאומי של אנשים נדירים. מבחינה ביולוגית של השקפה, ישנם כמה הבדלים הקריוגנית של משחטים בוגרים או מבוגרים, כל אחד בעל יתרונותיה. ראשית, ה-DNA הוא מוגן יותר oocytes בוגר, אשר שלפוחית נבטי מכיל כרומוזומים מוקפת קרום גרעיני, בעוד הציר meiotic של השנייה oocytes יכול להיות פגיע יותר לקריופציעות5. שנית, נזק הנגרמת על ידי הצטננות השלד עשוי להשפיע על סיבוב ציר, הגוף שחול הקוטב, הגירה ברורה ו ציטוקינזה, אשר יכול להיות השפעות שונות על פי השלב ההתפתחותי oocyte, השפעה על התקדמות מיוזה או לאחר הפריה אירועים. בסופו של דבר, ואולי החשוב ביותר, בעוד oocytes בוגרת מוכנים להיות מופרית, בוגרים גמטות להסתמך על התמיכה של תאי קומולוס המקיפים לעבור התבגרות גרעינית cytoplasmic6, וזו הסיבה מדוע תלולית השלם מתחמי oocyte (cocs) הם cryopreserved. עם זאת, אובדן של תאים קומולוס ו/או אובדן של חיבור פונקציונלי בין תא רבייה והתאים הסומטיים שמסביב הם כנראה ההשפעה הפוגעת ביותר של הקריוגנית של cocs בלתי מפותחים.

בין טכניקות הקפאת שיריון, ויטריפיקציה הוא אחד כי ניתן להחיל בקלות רבה יותר בתנאי שדה. לעומת איטי (או שיעור מבוקר) קופא, ויטריפיקציה הוא מהיר יותר אינו דורש ציוד ספציפי, כגון מקפיא לתכנות. על מנת לספק את שלושת העקרונות הבסיסיים של ויטריפיקציה (כלומר, צמיגות גבוהה, מחובר לריכוז כימיות גבוה, כרכים קטנים וירידה בטמפרטורה מהירה), מספר מדיה ותמיכה במיוחד פותחו ובשימוש אצל חתולים עבור האוזציטים הן בוגרות והן בוגרת. החל עם קשיות פשוטה7, התקנים פותחו אז כדי להגיע "נפח מינימלי" המטרה. קריולופ8, פתח משכו קשיות (OPS)9, מרזבים פלסטיק (שונה קש)10 ו קריוצינוריות11 כבר בשימוש, עד מכשיר יעיל יותר (כלומר, קריוטופ) היה מועסק11, שיפור הישרדות ו היוסיס חידוש. קריוטופ (משלים איור 1) היא תמיכה מסחרית הפכה להיות מערכת פתוחה בחירה עבור ויטריפיקציה. פותח עבור הויטריפיקציה של האדם האוציטים ועוברים, הוא מורכב רצועת סרט קטן המצורפת בעל פלסטיק קשיח, מוגן על ידי כובע צינור פלסטיק במהלך אחסון12. בזכות השימושיות שלה ועל הפחתת הקיצונית ויטריפיקציה volume (מעט כמו 0.1 μl), אשר גם מוביל לשיעורי קירור מהירה ביותר ומחמם, זו תמיכה ויטריפיקציה הוחל יותר ויותר במינים מספר, כולל החתול המקומי, שבו הוא שימש עם מגוון רחב של מדיה13,14,15,16,17.

מטרת כתב היד הזה היא לתאר את הפרוטוקול אוסף-ויטריפיקציה-התחממות, עם שינויים קלים מן האחד שפותחה במקור עבור הנגיף האנושי, אשר מעסיקה מעבדות מתוצרת מסחרית ותמיכה מסחריים עבור אמצעי אחסון מינימלי ויטריפיקציה והוא יכול להיות בקלות להחיל בתנאי שדה עבור קריוגנית של חתולים בלתי מפותחים COCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים מתוארים בזאת לא עברו אישור מוסרי מאז שחלות החתול נאספו במרפאות וטרינרי כמו תוצרי לוואי של הבעלים-כריתת שגרתית המבוקש או ovarioכריתת רחם.

1. אוסף אוקינטה

  1. לפני תחילת הניסויים, להכין פתרונות עבור שחלות ואוסף oocyte. הכנת הפתרון של אוסף שחלות עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) עם תערובת של אנטיביוטיקה ו antimycotics (100 IU/mL של פניצילין G נתרן, 0.1 mg/mL של סטרפטומיצין סולפט, 0.25 μg/mL של אמפוריטיצין B). הכינו פתרון אוסף oocyte (כלומר, PBS/PVA) עם PBS עם 100 IU/mL של פניצילין G נתרן, 0.1 mg/mL של סטרפטומיצין סולפט ו 0.1% (w/v) פוליוויניל אלכוהול (PVA).
  2. לאחסן פתרונות עבור השחלה ואוסף oocyte ב 4 ° צ' עד השימוש.
  3. ביום העיקור של מלכות, כמה שעות לפני עיבוד הדגימות, לקחת חלק מפתרונות איסוף שחלות והשחלה ולתת להם להתחמם בטמפרטורת החדר (RT; 25 ± 2 ° c).
  4. כאשר מגיעים דגימות למעבדה, מבודדים את השחלות מרקמת החיבור שמסביב ומצינור ההטלה ורוחצים אותם בתוך מדיום של אוסף שחלות טריות בצלחת פטרי.
  5. מילוי 1 35 mm צלחת פטרי עבור כל מלכה עם כ 3 מ ל RT PBS/PVA, ועוד מנה אחת כדי לאסוף את oocytes.
  6. מניחים זוג שחלות בצלחת פטרי ומכלים את קליפת המוח עם אזמל כירורגי. ודא שכל הזקיקים שבורים בעזרת stereomicroscope (הגדלה 8x).
  7. לאסוף את COCs עם פיפטה ולהעביר אותם PBS חדש/PVA בצלחת פטרי שהוקצתה. בחר תכונות טובות COCs, עם הומוגנית, ציטופלסמה כהה מוקף מספר שכבות קומפקטיות של תאים קומולוס (כיתה I18).

2. ויטריפיקציה

  1. הכן את התקשורת הויטריפיקציה והתקשורתית.
    1. הכנת פתרון equilibration (ES) עם 7.5% (v/v) אתילן גליקול (EG) ו 7.5% (v/v) (DMSO) ב בינונית 199, עם 20% סרום בקר עוברי (FBS).
    2. להכין פתרון ויטריפיקציה (VS) עם 15% (v/v) לדוגמה, 15% (v/v) DMSO ו 0.5 M סוכות ב בינונית 199, עם 20% FBS (שונה מ 19).
    3. תן ES ו VS לחמם ב-RT לפני השימוש.
      הערה: Cryoprotectants (g., למשל, DMSO) ידועים כרעילים ציטוטוקסיים. אסטרטגיה לקונטרה רעילות שלהם היא להפחית את הטמפרטורה שבה התאים חשופים להם20, ו oocytes חשופים בדרך כלל לcryoprotectants ב RT. כך, את כל ההליך, מן האוסף oocyte כדי ויטריפיקציה, מבוצע ב-RT בפרוטוקול זה כדי למנוע תנודות בטמפרטורה.
  2. הכן את המנה הויטריפיקציה (כלומר, מנה מיוחדת המורכבת משש בארות חרותיים מחולקות בשתי שורות, הידועות בשם "Repro פלייט"). הכן שורה אחת (שלוש בארות) עבור כל תמיכה ויטריפיקציה.
    1. הוסף 20 μL של ES בתחתית הבאר הראשונה.
    2. הוסף 300 μL של VS בתחתית השני (כלומר, 1VS) והשלישי (כלומר, 2VS) בארות.
  3. משקל השפה הבין-מדעי ב-ES.
    1. עם פיפטה קטן ומשעמם (למשל, פיפטה פסטר ששלף על מקור בונזן לעשות את זה דק יותר-קוטר צריך להיות לפחות 200 μm), להעביר אחד (או יותר) COC (s) בתחתית הבאר הראשונה.
      הערה: בחר את גודל הפיפטה לפי מספר השכבות של תאי קומולוס המקיפים את האוציטים, כך שבממדים של COCs, במטרה להקטין ככל האפשר את נפח המדיה המועבר עם COCs בכל שלב. עם הפרוטוקול הנוכחי, מפעילים מאומנים יכולים לסייע בהצלחה של עד שמונה חתולים בעלי מדעי החתול לכל תמיכה ויטריפיקציה.
    2. הוסף באיטיות 20 μL של ES בגבול המסירה. . חכו 3 דקות
    3. הוסף לאט את 20 μL של ES בגבול המסירה. . חכו 3 דקות
    4. הוסף באיטיות 240 μL של ES בגבול המסירה. . חכה 9 דקות
    5. בזמן ההמתנה, הכן קופסה עם חנקן נוזלי (LN2), סמן תמיכה ויטריפיקציה עם קוד זיהוי הניסוי/חתול והשאר אותו פתוח. שים את שניהם ליד stereomicroscope, כך שהם יכולים להיות נגישים בקלות בעת העבודה.
      זהירות! לבשו ציוד הגנה אישי בעת טיפול LN2.
    6. לחילופין, אם יש מספר מקרי החלקה של COCs, התחל בצעד האמצעי הראשון (ראה step 2.3.1-2.3.2) עבור קבוצה אחרת של COCs (שתיטען על תמיכה ויטריפיקציה חדשה).
  4. Vitrify COCs ב VS בתוך פחות מ 90 שניות.
    1. באמצעות אותו מנשא קטן, למלא אותו עם 1VS, לקחת את COCs מהחלק התחתון של הטוב הראשון (ES) ולהעביר אותם אל פני השטח של הבאר השנייה (1VS).
    2. רחץ את הפיפטה באמצעות 1VS.
    3. קח את מחשבי ה-COCs והעבר אותם לאזור אחר (בתחתית) של הבאר; ערבב את המדיום המקיף אותם עם הפיפטה.
    4. למלא את הפיפטה עם 1VS באזור אחר של הבאר, לקחת את COCs, להזיז אותם ולערבב את המדיום המקיפים אותם עם הפיפטה.
    5. חזור על שלב ה2.4.4.
    6. שטוף את הפיפטה עם 2VS.
    7. קח את מחשבי ה-COCs והזז אותם בתחתית הבאר השלישית (2VS); ערבב את המדיום המקיף אותם עם הפיפטה.
    8. למלא את הפיפטה עם 2VS באזור אחר של הבאר, לקחת את COCs, להזיז אותם ולערבב את המדיום המקיפים אותם עם הפיפטה.
    9. חזור על שלב ה2.4.8.
    10. למלא את הפיפטה עם 2VS באזור אחר של הבאר, לקחת את COCs ולטעון אותם על רצועת התמיכה ויטריפיקציה, קרוב ככל האפשר לקצה. מפחית מדיום עודף כדי להפחית את עוצמת הקול של VS ככל האפשר.
    11. לצלול מיד את התמיכה הויטריפיקציה. ב-LN2, הזזת המקום סגור אותו בעזרת מלחציים מסוימים, וודא שהוא תמיד נשאר שקוע ב-LN2.
      הערה: שמירה על התזמון הנכון היא חיונית עקב רעילות כימיות cell. בגלל הריכוז הגבוה שלהם בתקשורת ויטריפיקציה, צריך לשלוט בחשיפה לתאים, גם על ידי ביצוע מושלם של הטכניקה21. אם הדגימות שופע, שקול לחלק אותם כדי לעבד אותם במהירות רבה יותר ולמזער את כמות הזמן מאוסף oocyte כדי ויטריפיקציה.
  5. אחסן את התמיכה ויטריפיקציה טעון בגביע ולשמור אותם באחסון LN2 טנק עד התחממות.
    הערה: ניתן להחיל את כל השלבים הקודמים של הפרוטוקול גם בתנאי שדה אם LN2 זמין. מוביל יבש יהיה צורך להעביר את הדגימות למעבדה בביטחה ולאחר מכן להמשיך שם עם השלבים הבאים.

3. התחממות

  1. . הכן מדיה מחממת
    1. הכינו את התמיסה (TS) עם סוכרוז 1 מ 199 בינונית, עם 20% FBS.
    2. הכנת תמיסת דילול (DS) עם 0.5 מ ' סוכות ב בינונית 199, עם 20% FBS.
    3. הכנת פתרון כביסה (WS) עם בינוני 199 עם 20% FBS.
    4. לפני השימוש, לחמם את TS עד 38 ° צ' ו DS ו-WS ב RT.
  2. במידת הצורך, הכינו את מדיום התרבות לשימוש הבאים של מחשבי ה-COCs התחממו (לדוגמה, התבגרות מחוץ לגוף, IVM).
  3. הציבו את שלב החימום קרוב לstereomicroscope והפעל אותו (38 ° c). שים את המכסה של צלחת פטרי כדי לחמם.
  4. כאשר הכל מוכן, להעביר את התמיכה ויטריפיקציה אשר צריך להתחמם ממיכל האחסון לקופסה עם LN2, ולשים את התיבה ליד stereomicroscope.
  5. הכינו את "הצלחת Repro". הכן שורה עבור כל אחת מהתמיכה הויטריפיקציה שיש לחמם.
    1. הוסף 300 μL של DS בתחתית הבאר הראשונה.
    2. הוסף 300 μL של WS בתחתית השניה (כלומר, 1WS) ושלישית (כלומר, 2WS) ובארות.
  6. לבצע ירידה של TS (100 μL) על המכסה של צלחת פטרי.
  7. עם מלחציים, פתח תמיכה. ויטריפיקציה אחת ב-LN2
  8. שים את הירידה TS מתחת stereomicroscope עם תנועה מהירה אחת לקחת את התמיכה הויטריפיקציה מתוך LN2 ולטבול את הרצועה שלו בירידה, הזזת אותו עד כולם לנתק את כל cocs. הסר את התמיכה מהשחרור ברגע שהוא ריק, אך השאר את ה-COCs ב-TS במשך דקה אחת בסך הכל (מטבילה עד השלב הבא).
  9. קחו פיפטה דומה לזה ששימש לויטריפיקציה ומלאו אותו ב-DS. קח את ה-COCs מהשחרור (TS) והעבר אותם לתחתית הבאר הראשונה (DS). . חכו 3 דקות
  10. שטוף את הפיפטה עם 1WS. קח את ה-COCs והזז אותם בתחתית הבאר השנייה (1WS). . חכה 5 דקות
  11. שטוף את הפיפטה עם 2WS. קח את ה-COCs והזז אותם על פני השטח של הבאר השלישי (2WS). לחכות להם לגעת בתחתית הבאר.
  12. חזור על שלב 3.11 באמצעות אזור אחר של הבאר.
  13. שטוף את הפיפטה עם המדיום התרבותי והזיזו את האוציטים לצלחת התרבות לשימוש הבא (למשל, IVM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות החתול oocyte ויטריפיקציה ומתחמם בהתאם לפרוטוקול הנוכחי (איור 1 ומשלים איור 1), הרוב המכריע של גיים לשרוד. לאחר ויטריפיקציה, בין טכניקות אחרות, יכולת הכדאיות ניתן להעריך במיקרוסקופ אופטי כמו שלמות מורפולוגית22 או עם שימוש של כתמים חיוניים. אחד האחרונים הוא fluorescein diacetate/propidium יודיד (ה-FDA/PI), אשר מאפשר זיהוי של קיימא (פלואורסצנטית ירוק בהיר) ותאים מתים (זריחה אדומה). איור 2 מראה תמונה מייצגת של החתול החמם-מחומם cocs מוכתם עם ה-FDA/PI מיד לאחר ההתחממות. נתונים מתוך הניסויים המראים את אחוזי ההישרדות לאחר ויטריפיקציה מדווחים בטבלה 1, אשר מתארת נתונים שלאחר ההתחממות של האוציטים המיועדים להבשלה בתוך מבחנה17 או בייצור העובר מבחנה16. בכלל, בשני הניסויים המשמשים כדוגמאות כאן16,17, 395 מתוך 435 oocytes שרדו, הבקיע הכולל 90.8% לאחר ההתחממות.

עם זאת, כמה שינויים מורפולוגיים ניתן להבחין לאחר התחממות (איור 3). במשחק המשחק-התחמם בעקבות הפרוטוקול הזה, החריגות מורפולוגיים התכופים ביותר הם שינויים בצורה ובחומצה, חלקי (או, לעתים רחוקות, סה כ) אובדן של תאים קומולוס ו (לעתים נדירות) שברים של הסונה. מצד שני, כפי שדווח בעבודות הקודמות שלנו על מינימום נפח ויטריפיקציה עם תמיכה זהה, האלה COCs מעובד יכול לבנות17 ולהתפתח לעוברים בתוך מבחנה16, גם אם במחירים נמוכים יותר מאשר cocs טרי. בנוסף, הם בדרך כלל לא להציג התקשות הסונה הפרט (שהיא תוצאה ידועה היטב של הקפאה), מאז הפריה חוץ גופית (IVF) הוא מוצלח16.

Figure 1
איור 1: תיאור סכמטי של פרוטוקול ויטריפיקציה-מחמם oocyte.
עיין בטקסט של כתב היד עבור סימנים מלאים. COCs = מתחמי מתחמים-oocyte; ES = פתרון שיווציה; VS = ויטריפיקציה פתרון; TS = מהווה פתרון; DS = תמיסת דילול; WS = פתרון כביסה; . בתוך2= חנקן נוזלי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הכדאיות של החתול האוציטים בחומצה לאחר ההתחממות.
קומולוס מיוניים-מתחמי oocyte ויטראז ' באמצעות פלואורואסעין diacetate/propidium יודיד (FDA/PI) להראות ירוק פלואורסצנטית כאשר בר קיימא (א) או כאשרמתיםפלואורסצנטית אדום או חלש כאשר מת (ב). עירור/פליטות אורכי: 495 nm/517 nm עבור ה-FDA; 538 nm/617 nm עבור PI. סרגל קנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיקרוגרפים מוארים של חתולים טריים ומרצקלים.
(A) טריים קומולוס-oocyteמתחמילאחר איסוף, לפני ויטריפיקציה. (ב) תלולית-מתחמי oocyte לאחר ההתחממות, מראה כמה פציעות ויטריפיקציה המושרה (שינויים בצורה ואובדן של תאים קומולוס, חץ שחור). סרגל קנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ניסוי קבוצה אוציטים מחומם (נ) האוציטים בר קיימא (n) יכולת הכדאיות (%) כדאיות (ממוצע% ± SD)
1 1 13 12 92.31 91.54 ± 3.66
2 47 44 93.62
3 52 45 86.54
4 26 24 92.31
מיכל 5 41 40 97.56
6 21 19 90.48
7 50 44 88.00
2 1 17 17 100.00 91.51 ± 9.16
2 17 17 100.00
3 9 8 88.89
4 21 21 100.00
מיכל 5 30 23 76.67
6 26 23 88.46
7 17 13 76.47
8 10 10 100.00
9 15 14 93.33
10 23 21 91.30

טבלה 1: תוצאות מייצגות של יכולת הכדאיות בתוך החתול-מחומם. נתונים מתוך † קולומבו ואח ' 201916 ו‡ קולומבו ואח ' 202017.

משלים איור 1: תמונת הנציג של התמיכות המשמשות oocyte ויטריפיקציה. התמיכה המסחרית מודדת 13 ס מ והיא קלה לטיפול ולאחסון. אוציטים יש לטעון על רצועת פלסטיק דק בחלק העליון של המכשיר, קרוב ככל האפשר לסמן שחור ליד הקצה. זכויות יוצרים: חברת Kitazato. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקפאה הקריוגנית היא טכניקת שימור מכרעת, במיוחד בתחום המינים בהם מינים רבים בסכנת הכחדה, כגון משפחת פליקס. בכתב יד זה, פרוטוקול פשוט וידידותי לשדה לויטריפיקציה של החתול הילדותי אוציטים הוצג. מדיה מתוצרת מעבדה, אמצעי אחסון מינימלי ויטריפיקציה תומך ועובדים מיומנים הם גורמי מפתח להצלחת שיטה זו, אשר מאפשר קבלת האוציטים קיימא בעקביות ושוב, כפי שמוצג על ידי תוצאות הנציגים דיווחו בזאת.

החל בהכנה תקשורתית, יש לעקוב אחר הפרוטוקול באופן מדויק כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר, אך מיומנויות המפעיל הן הסוגיה העיקרית. מדיה צריכה להיות מוכנה באותו יום של הליך ויטריפיקציה, או, אם זה לא אפשרי, הם צריכים להיות מוכנים יום לפני ומאוחסן ב 4 ° c. בכל מקרה, לפני עיבוד לדוגמא, יש להשאיר מספיק זמן כדי לאפשר לפתרונות להתחמם עד RT. אוסף Oocyte ובחירת COCs הם הליכים מהירים ופשוטים המבוצעים באופן שגרתי על ידי כל מעבדה באמנויות. עם זאת, הקפאת ההזמנה היא ההליך העדין ביותר. בעוד שהליך ההתחממות אינו קריטי כל כך, אם מעקב אחר הפרוטוקול והתזמונים, ויטריפיקציה עשוי להיות מורכב יותר. לאחר שיווי משקל, שבו יש לקחת את הטיפול רק כיבוד תזמונים, השלב המאתגר ביותר הוא עשוי להיות צעד ויטריפיקציה (לראות 2.4. של הפרוטוקול הנוכחי). אכן, העברות oocyte ושופות מצנפות צריכות להיות מתוזמן וכולם יחד, בוצעו בפחות מ-90 שניות. למתחילים, מומלץ לזמן את ההליך עם סטופר בזמן האימון, גם עבור אנשים מיומנים זה עשוי להיות שימושי יש טיימר צפצוף אחרי 60 שניות כהתראה כי הזמן הוא רץ. בנוסף, זה יאפשר סטנדרטיזציה גבוהה יותר, מאז המפעילים קבוצות של 6-8 COCs צריך להיות קרוב להעברת של oocytes מן השני אל הבאר השלישית של הצלחת Repro (ראה שלב 2.4.7 של הפרוטוקול הנוכחי) כאשר האזעקה מופעלת. בתקווה, בעזרת מאמר זה, ניתן להשיג סטנדרטיזציה גבוהה יותר בין אנשים ובין מעבדות.

המגבלות המרכזיות של הפרוטוקול נשארות התכונות הפנימיות של הליכי הקפאת השיריון עצמם. כפי שצוין קודם לכן, ויטריפיקציה חושף אוסטציטים לתנאים שאינם פיזיולוגיים ועלולים להזיק, גם אם הוא מבוצע ללא רבב. הדגירה עם cryoprotectants ואת הירידה של הטמפרטורה הם האירועים הקריטיים ביותר20 והם צריכים להישמר תחת שליטה קפדנית. בין פציעות ההקפאה הנפוצות ביותר, חלקם בקלות לראות את המיקרוסקופ האופטי (g., הפסד תא תלולית, שינוי של הצורה התאית וגודל), בעוד אחרים אינם גלויים ולעיתים קרובות משפיעים על מבנים subcellular (למשל, סונה pelלוצידה התקשות,23,24לחץ חמצוני, נזק השלד הציטוטי, הציר למרות הקיימא ביותר, COCs לאחר פרוטוקול זה לעתים קרובות להציג כמה סטיות מורפולוגיות ברור לאחר התחממות. עם זאת, אין מתאם בין מורפולוגיה לבין הכדאיות, אשר עשוי להיות גם השלכה בשל נזקים subcellular3,25, אבל שינויים מורפולוגיים סביר להניח תוצאה של קריופציעות ובאופן חלקי סיבה התפתחותית בלתי מתורבת התוצאות התפתחותיות של oocytes, אשר הם עניים למדי אם לעומת זה של oocytes טריים. ההכנה הזהירה של אמצעי התקשורת הויטריפיקציה וההתבוננות המדויקת בעיתוי הפרוטוקול תורמים להשגת הכדאיות הטובה שלאחר ההתחממות והשלמות המורפולוגית, אך שיפורים נוספים בההבשלה בתחום החוץ של האוציטים והתפתחות העובר עדיין נחוצים, שכן הכדאיות יורדת לעתים קרובות במהלך התרבות שלהלן16.

פציעות בהשפעת קר למרבה הצער להתרחש עם כל שיטה הקריוגנית24. הויטריפיקציה אמצעי האחסון המינימלי המשמש בפרוטוקול זה פותחה כדי להקטין את אמצעי האחסון הויטריפיקציה ככל האפשר, וכתוצאה מכך שיעורי צינון והתחממות טובים יותר בהשוואה להתקני הקפאה אחרים (-23,000 ° c/דקה ו-42,000 ° c/דקה בהתאמה, לפי מפרטי היצרן). כתוצאה מכך, ברפואה אנושית, כאשר מחקריםקליניים מעריכים הן בתחום החוץ (כלומר, הפריה והתפתחות העובר) ובפרמטרים vivo (כלומר, שיעורי היריון ולידות חי) זמינים, אמצעי האחסון המינימלי ויטריפיקציה היא הבחירה השכיחה ביותר עבור הקפאה הקריוגנית בשל התוצאות שאין דומה לו במונחים של הישרדות לאחר ההתחממות, ו בנוסף, לעומת התקנים ויטריפיקציה אחרים, האחד המשמש בפרוטוקול זה קל יותר לשימוש ובטוח יותר לאחסן12, מאז הוא נוח לטפל והוא מוגן על ידי כובע במהלך האחסון. למשל, הקריולופ היא גם תמיכה יעילה כדי להגיע למטרה נפח מינימלי, אבל המבנה שלה (לולאה התומכת בסרט של פתרון שבו oocytes הם טעונים) הוא שברירי ונוטה התחממות בשוגג12. קשיות (0.25 mL) או לפתוח קשים (OPS) יכול לשמש גם, אבל הם לא מאפשרים ירידה משמעותית באמצעי האחסון ויטריפיקציה וגם מאתגרת למלא וריק, כמו oocytes כמה עלול לאבד26. תמיכה רבים אחרים פותחו2, אבל כל אחד מהם יש חסרונות שלה. במקום זאת, בהשוואה לקיפאון איטי, שבעבר הייתה השיטה הקריוגנית ביותר בשימוש, היתרונות העיקריים של אמצעי האחסון המינימלי הויטריפיקציה על התמיכה המסחרית הם הכדאיות והמהירות שלה. כפי שהוזכר קודם לכן, ויטריפיקציה אינו דורש מקפיא לתכנות להתבצע, ובעוד הקפאה איטית של oocytes לוקח בערך שעה וחצי להיות סיכם25, ויטריפיקציה יכול להתבצע בערך 17 דקות לאחר הפרוטוקול הנוכחי.

לסיכום, כישורי הצוות והתקינה הבין-מרכזיה עשויים להיות הדרישות המאתגרים ביותר כאשר מתחילים בנק מיוכן מבוקר, אך הם יקבלו הכשרה של כוח אדם. זה כמות ויטריפיקציה פרוטוקול מינימלי עבור החתול בוגר oocytes נותן תוצאות עקביות ולשחזור כאשר מבוצעת על ידי אופרטורים מנוסים. עם זאת, יש עדיין סיכוי לשיפור בשיעורים התפתחותיים oocyte, גם אם הכדאיות לאחר התחממות ויושרה משביע רצון. עם אופטימיזציה נוספת, הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם גם בתנאי שדה עבור felids פראי, אשר פורסם נתונים בנוגע הקריוגנית oocyte עדיין נדיר27. הרחבת היישום של שיטה זו לא רק תגדיל את האפשרות לשפר את הפרוטוקולים הקריוגנית, אלא גם לאפשר הקמה של ביוקלים בידוניים לפוריות ולשימור ביולוגי בפלאידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו היתה נתמכת באופן חלקי על ידי EVSSAR (האגודה האירופית וטרינרית עבור רבייה בעלי חיים קטנים) גרנט 2016 ועל ידי אוניברסיטת הווסטאה degli Studi די מילאנו, פסנתר די Sostegno אלה Ricerca 2019 (לינאה 2 Azione A). כמו כן, אנו רוצים להודות לד ר מרידעגיה מורסלי על תרומתו לניסויים המתוארים בזאת ולרכישת תמונה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2942 /
Automatic pipettes & tips / / Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL
Surgical scalpels / / Size 10 is usually ok
Bunsen beak / / /
Clamps / / Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen
Cryotop Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) 01.CR Distributors and catalog number may change in different countries
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 /
Ethylene glycol (EG) Sigma-Aldrich E9129 /
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 /
Glass Pasteur pipettes / / Advised lenght 230 mm (100+130)
Gobelets / / According to the canisters of the storage tank
Heating stage / / All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC
Liquid nitrogen / / /
Medium 199 Sigma-Aldrich M4530 /
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 /
Penicillin G sodium Sigma-Aldrich P3032 /
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136 /
Repro plate Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) 01.K-2 Distributors and catalog number may change in different countries
Stereomicroscope / / As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok
Storage tank / / Any regularly filled tank is ok
Streptomycin sulphate Sigma-Aldrich S9137 /
Styrofoam/nitrogen resistant box / / All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack"
Sucrose Sigma-Aldrich S1888 /
Timers / / All timers which can be set on times until 9 minutes are ok

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
  2. Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
  3. Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
  4. Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
  5. Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
  6. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  7. Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
  8. Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
  9. Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
  10. Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
  11. Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
  12. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
  13. Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
  14. Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
  15. Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
  16. Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
  17. Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
  18. Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
  19. Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
  20. Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
  21. Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
  22. Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
  23. Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
  24. Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
  25. Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
  26. Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
  27. Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 160 חתול בנקאות שימור הקפאה קומולוס-מתחם oocyte Felid נקבה הקפאה מגיים נבטי ושלפוחית גרמפלאם מהיר
כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colombo, M., Luvoni, G. C. Minimum… More

Colombo, M., Luvoni, G. C. Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes. J. Vis. Exp. (160), e61523, doi:10.3791/61523 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter