Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo per la vetrificazione del volume minimo di ovociti di gatto immaturi con supporti fatti in laboratorio su supporti commerciali. Copre ogni passo dall'isolamento degli ovociti dalle gonadi ex vivo alla vetrificazione e al riscaldamento.
Abstract
Nei programmi di conservazione degli animali selvatici, la gamete banking è fondamentale per salvaguardare le risorse genetiche di individui di valore e specie rare e per promuovere la conservazione della biodiversità. Nei felini, la maggior parte delle specie sono minacciate di estinzione, e le razze domestiche sono utilizzate come modello per aumentare l'efficienza dei protocolli per il germoplasma bancario. Tra le tecniche di crioconservazione degli ovociti, la vetrificazione è sempre più popolare nella riproduzione assistita umana e veterinaria. La vetrificazione criotopica, che è stata inizialmente sviluppata per gli ovociti umani e gli embrioni, ha dimostrato di essere adatta per gli ovociti di gatto. Questo metodo offre diversi vantaggi, come la fattibilità delle condizioni di campo e la velocità della procedura, che può essere utile quando è necessario elaborare più campioni. Tuttavia, l'efficienza dipende fortemente dalle competenze dell'operatore e sono necessarie una standardizzazione intra-laboratorio e interlaboratorio, nonché la formazione del personale. Questo protocollo descrive la vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi su un supporto commerciale in un protocollo passo dopo passo, favorevole al campo, dalla raccolta degli ovociti al riscaldamento. Seguendo il protocollo, la conservazione dell'integrità e della vitalità degli ovociti al riscaldamento (fino al 90%) ci si può aspettare, anche se c'è ancora spazio per migliorare la maturazione post-riscaldamento e i risultati dello sviluppo embrionale.
Introduction
La crioconservazione è diventata un passo fondamentale delle tecniche di riproduzione assistita (ART). Nell'uomo, permette la conservazione della fertilità o il rinvio della genitorialità per motivi medici o personali. Negli animali, è necessario superare la distanza e il tempo negli accoppiamenti pianificati, in particolare negli animali da allevamento e negli animali domestici, o per preservare il materiale genetico di soggetti di valore in programmi di conservazione, in particolare nelle specie selvatiche a rischio di estinzione. La crioconservazione del gamet è la scelta migliore quando gli individui da allevare non sono ancora stati scelti o per evitare problemi etici associati al congelamento degli embrioni, soprattutto nella medicina umana1. Gli spermatozoi sono relativamente facili da preservare e dare risultati soddisfacenti dopo lo scongelamento, ma gli ovociti, a causa delle loro caratteristiche strutturali, potrebbero essere più complessi da conservare. Infatti, il basso rapporto superficie/volume, così come la presenza della zona pellucida che circonda l'ooplasma, limita il movimento dei crioprotettori e dell'acqua attraverso la cella2. Inoltre, negli animali domestici compresi i felidi, sono caratterizzati da un citoplasma ricco di lipidi, che si pensa li renda più sensibili alla crioconservazione3.
La maggior parte dei felidi sono minacciati, e il gatto domestico è usato come modello per sviluppare protocolli per la conservazione del germoplasma grazie alla disponibilità di gonadi da ovariectomia di routine. Negli animali selvatici, le gonadi possono essere ottenute dopo interventi chirurgici elettivi o (più frequentemente) post-mortem, e immaturi (vescicole germinale) gameti possono essere recuperati. La stimolazione ormonale mirata a ottenere ovociti maturi (metafase II) non è così comune come negli ART umani a causa delle questioni etiche e della risposta specifica delle specie e dell'individuo ai trattamenti4.
Pertanto, lo sviluppo di strategie di crioconservazione si è concentrato su gameti immaturi, che di solito possono essere recuperati dopo la morte inaspettata o improvvisa di individui rari. Da un punto di vista biologico, ci sono alcune differenze nella crioconservazione di gameti immaturi o maturi, ognuno con i suoi vantaggi. In primo luogo, il DNA è più protetto negli ovociti immaturi, la cui vescicolo germinale contiene cromosomi circondati da una membrana nucleare, mentre il mandrino meiotico degli ovociti metafase II potrebbe essere più vulnerabile alle criolesioni5. In secondo luogo, i danni da citoscheletro indotti dal freddo potrebbero influenzare la rotazione del mandrino, l'estrusione polare del corpo, la migrazione pronucleare e la citocinesi, che potrebbero avere impatti diversi a seconda della fase di sviluppo degli ovociti, influenzando la progressione della meiosi o gli eventi post-fecondazione. Infine, e forse la cosa più importante, mentre gli ovociti maturi sono pronti per essere fecondati, i gameti immaturi si basano sul supporto delle cellule cumuli che circondano per passare attraverso la maturazione nucleare e citoplastica6, e questo è il motivo per cui tutti i complessi cumulo-oocyte (COC) sono crioconservati. Tuttavia, la perdita di cellule cumuli e/o la perdita di connessione funzionale tra il gamete e le cellule somatiche circostanti sono probabilmente l'effetto più dannoso della crioconservazione dei COC immaturi.
Tra le tecniche di crioconservazione, la vetrificazione è una che può essere applicata più facilmente in condizioni di campo. Rispetto al congelamento lento (o a velocità controllata), la vetrificazione è più veloce e non richiede attrezzature specifiche, come un congelatore programmabile. Al fine di soddisfare i tre principi fondamentali della vetrificazione (cioè un'elevata viscosità, collegata ad alta concentrazione crioprotettrice, piccoli volumi e diminuzione ultra-rapida della temperatura), sono stati sviluppati e utilizzati in particolare diversi supporti e supporti nei gatti sia per gli ovociti immaturi che per quelli maturi. A partire da semplici cannucce7, sono stati poi sviluppati dispositivi per raggiungere l'obiettivo "Volume minimo". Cryoloop8, cannucce tirate aperte (OPS)9, grondaie di plastica (paglia modificata)10 e criotubi11 sono stati utilizzati, fino a quando un dispositivo più efficiente (cioè, Cryotop) è stato impiegato11, migliorando la sopravvivenza e meiosis ripresa. Cryotop (Figura supplementare 1) è un supporto disponibile in commercio che è diventato il sistema aperto elettivo per la vetrificazione. Sviluppato per la vetrificazione di ovociti ed embrioni umani, è costituito da una piccola striscia di pellicola attaccata a un supporto di plastica dura, protetta da un tappo di plastica durante lo stoccaggio12. Grazie alla sua usabilità e all'estrema riduzione del volume di vetrificazione (appena 0,1 l), che porta anche a tassi di raffreddamento e riscaldamento estremamente rapidi, questo supporto di vetrificazione è stato sempre più applicato in diverse specie, tra cui il gatto domestico, in cui è stato utilizzato con una varietà di media13,14,15,1616,17.
Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere un protocollo di raccolta-vitrificazione-riscaldamento, con piccole modifiche da quello originariamente sviluppato per gli ovociti umani, che impiega supporti multimediali e commerciali fatti in laboratorio per la vitrificazione del volume minimo e può essere facilmente applicato in condizioni di campo per la crioconservazione dei COC felini immaturini.
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Protocol
Le procedure descritte non sono state sottoposte all'approvazione etica in quanto le ovaie dei gatti sono state raccolte nelle cliniche veterinarie come sottoprodotti dall'ovariectomia di routine richiesta dal proprietario o dall'ovario.
1. Collezione Oocyte
- Prima di iniziare gli esperimenti, preparare le soluzioni per la raccolta di ovaie e ovociti. Preparare la soluzione di raccolta delle ovaie con salina tampina tamponata da fosfato (PBS) con una miscela di antibiotici e antimicotici (100 IU/mL di penicillina G sodio, 0,1 mg/mL di streptomicina solfato, 0,25 g/mL di anforterica B). Preparare la soluzione di raccolta degli ovociti (ad esempio, PBS/PVA) con PBS con 100 IU/mL di penicillina G sodio, 0,1 mg/mL di streptomicina solfato e 0,1% (w/v) di alcol polivinile (PVA).
- Conservare le soluzioni per la raccolta di ovaie e ovociti a 4 gradi centigradi fino all'uso.
- Il giorno dell'spaying delle regine, poche ore prima dell'elaborazione dei campioni, prendere parte di soluzioni di raccolta di ovaie e ovociti e lasciarli riscaldare a temperatura ambiente (RT; 25 x 2 gradi centigradi).
- Quando i campioni arrivano in laboratorio, isolare le ovaie dal tessuto connettivo circostante e dall'ovidotto e lavarle in un mezzo di raccolta delle ovaie fresche in un piatto Petri.
- Riempire un piatto Petri da 35 mm per ogni regina con circa 3 mL di RT PBS/PVA, e un altro piatto per raccogliere gli ovociti.
- Mettere un paio di ovaie in un piatto Petri e tritare la corteccia con un bisturi chirurgico. Assicurarsi che tutti i follicoli siano stati rotti con l'aiuto di uno stereomicroscopio (ingrandimento 8x).
- Raccogliere i COC con una pipetta e spostarli in PBS/PVA freschi nel piatto Petri assegnato. Selezionare COC di buone qualità, con un citoplasma omogeneo e scuro e circondato da diversi strati compatti di cellule cumuli (grado I18).
2. Vetrificazione
- Preparare l'equilibratità dei media di vetrificazione e la vetrificazione.
- Preparare la soluzione di equilibratura (ES) con il 7,5% (v/v) di glicole etilene (EG) e il 7,5% (v/v) didicilblossido di metilofossido (DMSO) nel mezzo 199, con il 20% di siero bovino fetale (FBS).
- Preparare la soluzione di vitrificazione (VS) con 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO e 0,5 M di saccarosio in media 199, con 20% FBS (modificato da 19).
- Lasciare che ES e VS si riscaldino a RT prima dell'uso.
NOTA: I crioprotettivi (ad esempio, EG, DMSO) sono noti per essere citotossici. Una strategia per contrastare la loro tossicità è quella di ridurre la temperatura a cui le cellule sono esposte a loro20, e gli ovociti sono di solito esposti a criobenti a RT. Pertanto, l'intera procedura, dalla raccolta degli ovociti alla vitrificazione, viene eseguita a RT in questo protocollo per evitare fluttuazioni di temperatura.
- Preparare il piatto di vitrificazione (cioè un piatto speciale composto da sei pozzi conici divisi in due file, note come "Piastra di ripro"). Preparare una riga (tre pozze) per ogni supporto di vitrificazione.
- Aggiungere 20 l di ES sul fondo del primo pozzo.
- Aggiungere 300 L di VS nella parte inferiore del secondo (cioè 1VS) e del terzo (cioè 2VS) pozzi.
- COC equilibrate in ES.
- Con una pipetta a piccolo foro (ad esempio, una pipetta Pasteur tirata su un becco Bunsen per renderla più sottile – il diametro dovrebbe essere di almeno 200 m), trasferire uno (o più) COC sul fondo del primo pozzo.
NOTA: Scegliere la dimensione della pipetta in base al numero di strati di cellule cumuli che circondano gli ovociti, in modo da ridurre le dimensioni COC, con l'obiettivo di ridurre il più possibile il volume dei supporti che vengono trasferiti con COC in ogni passo. Con l'attuale protocollo, gli operatori addestrati possono vinificare con successo fino a otto COC felini per ogni supporto di vitrificazione. - Aggiungere lentamente 20 l di ES sul bordo della goccia. Attendere 3 minuti.
- Aggiungere lentamente altri 20 luna di ES sul bordo della goccia. Attendere 3 minuti.
- Aggiungere lentamente 240 l of ES sul bordo della goccia. Attendere 9 minuti.
- Durante l'attesa, preparare una scatola con azoto liquido (LN2),etichettare un supporto di vetrificazione con il codice di identificazione dell'esperimento/gatto e lasciarlo aperto. Metteteli entrambi vicino allo stereomicroscopio, in modo che possano essere facilmente raggiungibili mentre lavorano.
Attenzione! Indossare dispositivi di protezione personale durante la movimentazione LN2. - In alternativa, se è necessario vacilare più COC, iniziare la prima fase di equilibratizzazione (vedere il passaggio 2.3.1 - 2.3.2) per un altro gruppo di COC (che verrà caricato su un nuovo supporto per la vetrificazione).
- Con una pipetta a piccolo foro (ad esempio, una pipetta Pasteur tirata su un becco Bunsen per renderla più sottile – il diametro dovrebbe essere di almeno 200 m), trasferire uno (o più) COC sul fondo del primo pozzo.
- Vendicare i COC in VS in meno di 90 secondi.
- Utilizzando la stessa pipetta a piccoli fori, riempirla con 1VS, prendere i COC dal fondo del primo pozzo (ES) e spostarli sulla superficie del secondo pozzo (1VS).
- Lavare la pipetta con 1VS.
- Prendere i COC e spostarli in un'altra area (in basso) del pozzo; mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta.
- Riempire la pipetta con 1VS in un'altra area del pozzo, prendere i COC, spostarli e mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta.
- Ripetere il passaggio 2.4.4.
- Lavare la pipetta con 2VS.
- Prendi i COC e spostuquesti sul fondo del terzo pozzo (2VS); mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta.
- Riempire la pipetta con 2VS in un'altra area del pozzo, prendere i COC, spostarli e mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta.
- Ripetere il passaggio 2.4.8.
- Riempire la pipetta con 2VS in un'altra area del pozzo, prendere i COC e caricarli sulla striscia del supporto di vitrificazione, il più vicino possibile alla punta. Aspirare mezzo in eccesso per ridurre il più possibile il volume di VS.
- Immergere immediatamente il supporto di vitrificazione in LN2,spostandolo. Chiuderlo con l'aiuto di alcuni morsetti, assicurandosi che rimanga sempre immerso in LN2.
NOTA: Mantenere il giusto tempismo è fondamentale a causa della crioprotectant cell-toxicity. A causa della loro elevata concentrazione nei mezzi di vitrificazione, l'esposizione cellulare deve essere controllata, anche con un'esecuzione impeccabile della tecnica21. Se i campioni sono abbondanti, prendere in considerazione dividendi li per elaborarli più rapidamente e ridurre al minimo la quantità di tempo dalla raccolta di ovociti alla vitrificazione.
- Conservare i supporti di vitrificazione caricati in un calice e tenerli in un serbatoio LN2 di stoccaggio fino al riscaldamento.
NOTA: Tutti i passaggi precedenti del protocollo possono essere applicati anche in condizioni di campo se LN2 è disponibile. Sarà necessario un corriere asciutto per trasportare i campioni al laboratorio in modo sicuro e poi procedere con le seguenti fasi.
3. Riscaldamento
- Preparare i mezzi di comunicazione di riscaldamento.
- Preparare la soluzione di scongelamento (TS) con 1 M di saccarosio in media 199, con 20% FBS.
- Preparare la soluzione di diluizione (DS) con 0,5 M di saccarosio in media 199, con 20% FBS.
- Preparare la soluzione di lavaggio (WS) con Medium 199 con 20% FBS.
- Prima dell'uso, riscaldare TS a 38 gradi centigradi e DS e WS a RT.
- Se necessario, preparare il mezzo di coltura per il successivo utilizzo di COC riscaldati (ad esempio, maturazione in vitro, IVM).
- Posizionare la fase di riscaldamento vicino allo stereoscopio e accenderla (38 gradi centigradi). Mettere il coperchio di un piatto Petri per riscaldare.
- Quando tutto è pronto, trasferire i supporti di vitrificazione che devono essere riscaldati dal serbatoio di stoccaggio a una scatola con LN2e mettere la scatola vicino allo stereomicroscopio.
- Preparare il "Repro plate". Preparare una riga per ogni supporto di vitrificazione che deve essere riscaldato.
- Aggiungere 300 l di DS sul fondo del primo pozzo.
- Aggiungere 300 l di WS sul fondo del secondo (cioè 1WS) e il terzo (cioè 2WS) pozzetti.
- Fare una goccia di TS (100 gradi centigradi) sul coperchio del piatto Petri.
- Con i morsetti, aprire un supporto di vitrificazione in LN2.
- Mettere la goccia TS sotto lo stereomicroscopio e con un movimento veloce prendere il supporto di vitrificazione dal LN2 e immergere la sua striscia nella goccia, spostandolo fino a quando tutti i COC si staccano. Rimuovere il supporto dal drop non appena è vuoto, ma lasciare i COC in TS per 1 minuto in totale (dall'immersione fino al passaggio successivo).
- Prendere una pipetta simile a quella utilizzata per la vitrificazione e riempirla con DS. Prendere i COC dalla goccia (TS) e spostarli nella parte inferiore del primo pozzo (DS). Attendere 3 minuti.
- Lavare la pipetta con 1WS. Prendere i COC e spostarli sul fondo del secondo pozzo (1WS). Attendere 5 minuti.
- Lavare la pipetta con 2WS. Prendere i COC e spostarli sulla superficie del terzo pozzo (2WS). Attendere che tocchino la parte inferiore del pozzo.
- Ripetere il passaggio 3.11 utilizzando un'altra area del pozzo.
- Lavare la pipetta con il mezzo di coltura e spostare gli ovociti nel piatto di coltura per il seguente utilizzo (ad esempio, IVM).
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Representative Results
Dopo la vitrificazione e il riscaldamento degli ovociti di gatto secondo il protocollo attuale (Figura 1 e Figura supplementare 1), la stragrande maggioranza dei gameti sopravvive. Dopo la vitrificazione, tra le altre tecniche, la vitalità può essere valutata al microscopio ottico come integrità morfologica22 o con l'uso di macchie vitali. Uno di questi ultimi è fluoresceina diacetate/propidio iodide (FDA/PI), che consente l'identificazione di viverla (fluorescenza verde brillante) e cellule morte (fluorescenza rossa). La figura 2 mostra un quadro rappresentativo dei COC di gatto riscaldato in vitrificati macchiati con FDA/PI subito dopo il riscaldamento. I dati degli esperimenti che mostrano la percentuale di sopravvivenza dopo la vitrificazione sono riportati nella tabella 1, che illustra i dati post-riscaldamento degli ovociti destinati alla maturazione in vitro17 o alla produzione di embrioni in vitro16. Nel complesso, nei due esperimenti usati come esempi qui16,17, 395 su 435 ovociti sono sopravvissuti, segnando una redditività complessiva 90.8% post-riscaldamento.
Tuttavia, alcuni cambiamenti morfologici possono essere notati dopo il riscaldamento (Figura 3). Nei gameti vetrificati a seguito di questo protocollo, le anomalie morfologiche più frequenti sono cambiamenti nella forma e nella granulazione dell'ooplasmismo, perdita parziale (o, raramente totale) delle cellule cumuli e (raramente) fratture da zona pellucida. D'altra parte, come riportato nei nostri precedenti lavori sulla vetrificazione del volume minimo con lo stesso supporto, questi coC vetrificati possono maturare17 e svilupparsi in embrioni in vitro16, anche se a tassi inferiori rispetto ai COC freschi. Inoltre, di solito non presentano zona pellucida indurimento (che è un'altra conseguenza ben nota di crioconservazione), dal momento che la fecondazione in vitro (IVF) ha successo16.
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo di riscaldamento della vetrificazione degli ovociti.
Si prega di fare riferimento al testo del manoscritto per indicazioni complete. CoCs: complessi cumulo-ovociti; ES-equilibration solution; Soluzione di vitrificazione VS; TS: soluzione di scongelamento; Soluzione di diluizione DS; Soluzione di lavaggio WS- ; LN2Azoto liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Vitalità degli ovociti vitrificati per gatti dopo il riscaldamento.
Complessi cumulitivi-ovociti vitrificati macchiati con fluoresceina diaceta/propidium iodide (FDA/PI) mostrano fluorescenza verde quando viable (A) o fluorescenza rossa o debole quando morta (B). Lunghezze d'onda di eccitazione/emissione: 495 nm/517 nm per FDA; 538 nm/617 nm per PI. Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Micrografie leggere di ovociti di gatto fresco e vetrificato.
(A) Complessi freschi cumulo-oociti dopo la raccolta, prima della vitrificazione. (B) Complessi cumuli-ovociti vetrificati dopo il riscaldamento, mostrando alcune lesioni indotte dalla vitrificazione (cambiamenti nella forma e nella perdita di cellule cumuli, freccia nera). Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| rsperimento | Gruppo | Ovociti riscaldati (n) | Ovociti vitali (n) | Vitalità (%) | Viabilità (media % : SD) |
| 1† | 1 | 13 | 12 | 92.31 | 91,54 x 3,66 |
| 2 | 47 | 44 | 93.62 | ||
| 3 | 52 | 45 | 86.54 | ||
| 4 | 26 | 24 | 92.31 | ||
| 5 | 41 | 40 | 97.56 | ||
| 6 | 21 | 19 | 90.48 | ||
| 7 | 50 | 44 | 88.00 | ||
| 2‡ | 1 | 17 | 17 | 100.00 | 91,51 - 9,16 |
| 2 | 17 | 17 | 100.00 | ||
| 3 | 9 | 8 | 88.89 | ||
| 4 | 21 | 21 | 100.00 | ||
| 5 | 30 | 23 | 76.67 | ||
| 6 | 26 | 23 | 88.46 | ||
| 7 | 17 | 13 | 76.47 | ||
| 8 | 10 | 10 | 100.00 | ||
| 9 | 15 | 14 | 93.33 | ||
| 10 | 23 | 21 | 91.30 |
Tabella 1: Risultati rappresentativi della redditività negli ovociti vitrificati per gatti. Dati da Colombo et al. 201916 e ‡ Colombo et al. 202017.
Figura supplementare 1: Immagine rappresentativa dei supporti utilizzati per la vitrificazione degli ovociti. Il supporto commerciale misura 13 cm ed è facile da maneggiare e conservare. Gli ovociti devono essere caricati sulla sottile striscia di plastica nella parte superiore del dispositivo, il più vicino possibile al segno nero vicino alla punta. Diritto d'autore: Kitazato Corporation. Clicca qui per scaricare questa figura.
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Discussion
La crioconservazione degli ovociti è una tecnica cruciale di conservazione del germoplasma, specialmente nei taxa dove molte specie sono in pericolo, come la famiglia Felidae. In questo manoscritto è stato presentato un protocollo semplice e rispettoso del campo per la vetrificazione degli ovociti di gatto immaturi. I supporti di laboratorio, i supporti per la vitrificazione del volume minimo e il personale addestrato sono i fattori chiave per il successo di questo metodo, che consente di ottenere ovociti vitali in modo coerente e ripetuto, come dimostrano i risultati rappresentativi riportati.
A partire dalla preparazione dei media, il protocollo deve essere seguito con precisione per garantire i migliori risultati, ma le competenze dell'operatore sono il problema principale. I supporti devono essere preparati lo stesso giorno della procedura di vetrificazione o, se ciò non è possibile, devono essere preparati il giorno prima e conservati a 4 gradi centigradi. In ogni caso, prima dell'elaborazione del campione, è necessario lasciare abbastanza tempo per consentire alle soluzioni di riscaldarsi alla raccolta di RT. Oocyte e la selezione coCs sono procedure rapide e semplici che vengono eseguite regolarmente da ogni laboratorio ARTs. Tuttavia, la crioconservazione è la procedura più delicata. Mentre la procedura di riscaldamento non è così critica, se il protocollo e i tempi sono seguiti, vitrificazione potrebbe essere più complessa. Dopo l'equilibratificazione, in cui occorre prestare attenzione proprio nel rispetto dei tempi, la fase più impegnativa sarà probabilmente la fase di vetrificazione (cfr. 2.4. del presente protocollo). Infatti, i trasferimenti di ovociti e i lavaggi delle pipette devono essere tempestivi e, tutti insieme, eseguiti in meno di 90 secondi. Per i principianti, si consiglia di cronometrare la procedura con un cronometro durante l'allenamento, mentre anche per gli individui addestrati potrebbe essere utile avere un timer che emette un segnale acustico dopo 60 secondi come avviso che il tempo sta per scadere. Inoltre, ciò consentirebbe una maggiore standardizzazione, dal momento che gli operatori che vetrino gruppi di 6-8 COC dovrebbero essere vicini al trasferimento degli ovociti dal secondo al terzo pozzo della piastra Repro (vedi fase 2.4.7 del protocollo attuale) quando l'allarme si spegne. Si spera che, con l'aiuto di questo articolo, si potrebbe ottenere una maggiore standardizzazione tra gli individui e tra i laboratori.
I principali limiti del protocollo rimangono le caratteristiche intrinseche delle procedure di crioconservazione stesse. Come notato in precedenza, la vetrificazione espone gli ovociti a condizioni non fisiologiche e potenzialmente dannose, anche se viene eseguita in modo impeccabile. L'incubazione con crioprotettori e la diminuzione della temperatura sono gli eventi più critici20 e devono essere tenuti sotto stretto controllo. Tra i criolesionivi più comuni, alcuni sono facilmente osservabili al microscopio ottico (ad esempio, perdita di cellule cumuli, alterazione della forma cellulare e delle dimensioni), mentre altri non sono visibili e spesso colpiscono le strutture subcellulari (ad esempio, zona pellucida indurimento, stress ossidativo, danni al citoscheletro, mandrino meiotico e alterazioni del DNA)23,24. Anche se per lo più vitali, coC vetrificati seguendo questo protocollo spesso presentano alcune evidenti anomalie morfologiche dopo il riscaldamento. Tuttavia, non vi è alcuna correlazione tra morfologia e vitalità, che potrebbe anche essere ostacolata a causa dei danni subcellulari3,25, ma le alterazioni morfologiche sono probabilmente una conseguenza di criomuti e in parte una ragione per gli esiti in vitro dello sviluppo di ovociti vetrificati, che sono piuttosto poveri se confrontati con quello degli ovociti freschi. L'attenta preparazione dei mezzi di vitrificazione e l'osservazione precisa dei tempi del protocollo contribuiscono a ottenere una buona vitalità post-riscaldamento e integrità morfologica, ma sono necessari miglioramenti nell'ulteriore maturazione in vitro degli ovociti e dello sviluppo embrionale, poiché la vitalità spesso diminuisce durante la seguente cultura16.
Le lesioni indotte dal freddo si verificano purtroppo con ogni metodo di crioconservazione24. Il supporto di vitrificazione del volume minimo utilizzato in questo protocollo è stato sviluppato per ridurre il più possibile il volume di vetrificazione, con conseguente migliore tasso di raffreddamento e riscaldamento rispetto ad altri dispositivi di crioconservazione (-23.000 c/minuto e 42.000 gradi centigradi/minuto rispettivamente, secondo le specifiche del produttore). Di conseguenza, nella medicina umana, dove sono disponibili studi clinici che valutano sia in vitro (cioè la fecondazione e lo sviluppo degli embrioni) che i parametri in vivo (cioè i tassi di gravidanza e le nascite vive), la vitrificazione del volume minimo è la scelta più comune per la crioconservazione degli ovociti a causa dei suoi risultati incomparabili in termini di sopravvivenza post-riscaldamento e, infine, nascite vive12 da ovociti umani maturi vetrificati. Inoltre, rispetto ad altri dispositivi di vitrificazione, quello utilizzato in questo protocollo è più facile da usare e più sicuro da memorizzare12, poiché è comodo da maneggiare ed è protetto da un tappo durante lo stoccaggio. Ad esempio, il Cryoloop è anche un supporto efficiente per raggiungere l'obiettivo minimo del volume, ma la sua struttura (un loop che supporta una pellicola di soluzione su cui vengono caricati gli ovociti) è fragile e soggetta al riscaldamento accidentale12. Possono essere utilizzate anche cannucce (volume di 0,25 mL) o cannucce estratte aperte (OPS), ma non consentono una riduzione significativa del volume di vitrificazione e sono anche difficili da riempire e vuote, poiché alcuni ovociti potrebbero andare persi26. Molti altri supporti sono stati sviluppati2, ma ognuno di essi ha i suoi inconvenienti. Invece, rispetto al congelamento lento, che in precedenza era la tecnica di crioconservazione più utilizzata, i principali vantaggi della vetrificazione minima del volume sui supporti commerciali sono la sua fattibilità e velocità. Come accennato in precedenza, la vitrificazione non richiede l'esecuzione di un congelatore programmabile, e mentre il congelamento lento degli ovociti richiede circa un'ora e mezza per essere concluso25, la vitrificazione può essere realizzata in circa 17 minuti a seguito del presente protocollo.
In conclusione, le competenze del personale e la standardizzazione degli interoperatori potrebbero essere i requisiti più impegnativi quando si avvia una banca vetrificata degli ovociti, ma saranno raggiunti con la formazione del personale. Questo protocollo di vitrificazione del volume minimo per gli ovociti immaturi dei gatti fornisce risultati coerenti e ripetibili se eseguito da operatori esperti. Tuttavia, vi sono ancora possibilità di miglioramento dei tassi di sviluppo degli ovociti, anche se la redditività e l'integrità post-riscaldamento sono soddisfacenti. Con un'ulteriore ottimizzazione, il presente protocollo potrebbe essere applicato anche in condizioni di campo per i felidi selvatici, per i quali i dati pubblicati sulla crioconservazione degli ovociti sono ancora scarsi27. L'ampliamento dell'applicazione di questo metodo non solo aumenterebbe la possibilità di migliorare i protocolli di crioconservazione, ma consentirebbe anche di istituire biobanche vetrificate di ovociti per la fertilità e la conservazione della biodiversità nei felidi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato in parte sostenuto da EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 e dall'Università della Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Ringraziamo anche la Dott.ssa MariaGiorgia Morselli per il suo contributo agli esperimenti descritti e all'acquisizione di immagini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
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