Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Minimum Volum Vitrifisering av umodne Feline Oocytes

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61523
Automatic Translation
1, 1
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

Summary

Dette manuskriptet beskriver en protokoll for minimum volum vitrifisering av umodne kattocytter med laboratorie-laget media på kommersielle støtter. Det dekker hvert trinn fra oocyte isolasjon fra ex vivo gonads til vitrifisering og oppvarming.

Abstract

I ville dyrs bevaringsprogrammer er gamete banktjenester avgjørende for å beskytte genetiske ressurser til verdifulle individer og sjeldne arter og for å fremme bevaring av biologisk mangfold. I felids er de fleste arter truet med utryddelse, og innenlandske raser brukes som modell for å øke effektiviteten av protokoller for germplasm banktjenester. Blant oocyte kryopreservation teknikker, vitrifisering er mer og mer populært i menneskelig og veterinær assistert reproduksjon. Kryotop vitrifisering, som først ble utviklet for humane oocytter og embryoer, har vist seg å være godt egnet for kattocytter. Denne metoden gir flere fordeler, for eksempel gjennomførbarheten i feltforhold og hastigheten på prosedyren, noe som kan være nyttig når flere prøver må behandles. Effektiviteten er imidlertid sterkt avhengig av operatørens ferdigheter, og intra- og interlaboratoriestandardisering er nødvendig, samt personellopplæring. Denne protokollen beskriver minimum volum vitrifisering av umodne feline oocytes på en kommersiell støtte i en trinnvis feltvennlig protokoll, fra oocyte samling til oppvarming. Etter protokollen, bevaring av oocyte integritet og levedyktighet ved oppvarming (så høyt som 90%) kan forventes, selv om det fortsatt er rom for forbedring i ettervarmende modning og embryonale utviklingsresultater.

Introduction

Kryopreservation har blitt et viktig skritt for assistert reproduksjonsteknikker (ARTs). Hos mennesker tillater det bevaring av fruktbarhet eller utsettelse av foreldreskap av medisinske eller personlige grunner. Hos dyr er det nødvendig å overvinne avstand og tid i planlagte parring, spesielt hos husdyr og kjæledyr, eller for å bevare genetisk materiale av verdifulle i bevaringsprogrammer, spesielt i ville truede arter. Gamete cryopreservation er det beste valget når individene som skal avles ikke har blitt valgt ennå eller for å unngå etiske problemer forbundet med embryofrysing, spesielt i menneskelig medisin1. Spermatozoa er relativt lett å bevare og gi tilfredsstillende resultater etter tining, men oocytes, på grunn av deres strukturelle egenskaper, kan være mer komplisert å lagre. Faktisk begrenser det lave overflate / volumforholdet, samt tilstedeværelsen av zona pellucida rundt ooplasma, bevegelsen av kryobeskyttende midler og vann over cellen2. Videre, i husdyr inkludert felids, er de preget av en lipidrik cytoplasma, som antas å gjøre dem mer følsomme for kryopreservation3.

De fleste felids er truet, og den innenlandske katten brukes som en modell for å utvikle protokoller for germplasm bevaring takket være tilgjengeligheten av gonader fra rutinemessig ovariectomy. I ville dyr kan gonader oppnås etter elektive operasjoner eller (oftere) post-mortem,og umodne (germinal vesikkel) gametes kan hentes. Hormonell stimulering som tar sikte på å oppnå modne (metafase II) oocytes er ikke så vanlig som i humane ARTs på grunn av de etiske problemene og arten- og individuelle respons på behandlinger4.

Derfor har utviklingen av kryopreservation strategier fokusert på umodne gametes, som vanligvis kan hentes etter uventet eller plutselig død av sjeldne individer. Fra et biologisk synspunkt er det noen forskjeller i kryopreservation av umodne eller modne gametes, hver har sine fordeler. For det første er DNA mer beskyttet i umodne oocytes, hvis germinal vesikkel inneholder kromosomer omgitt av en kjernefysisk membran, mens den meiotiske spindelen av metafase II oocytes kan være mer utsatt for kryoskader5. For det andre kan forkjølelsesinduserte cytoskeletonskader påvirke spindelrotasjon, polar kroppsprofilering, pronukleær migrasjon og cytokinese, som kan ha forskjellige virkninger i henhold til oocyte utviklingsfasen, som påvirker meiose progresjon eller post-befruktning hendelser. Til slutt, og kanskje viktigst, mens modne oocytter er klare til å bli befruktet, er umodne gametes avhengig av støtte fra de omkringliggende cumulus-cellene for å gå gjennom kjernefysisk og cytoplasmatisk modning6, og dette er grunnen til at hele cumulus-oocyte komplekser (COCs) er cryopreserved. Imidlertid er tapet av cumulus celler og / eller tap av funksjonell forbindelse mellom gamete og de omkringliggende somatiske cellene trolig den mest skadelige effekten av kryopreservation av umodne COCer.

Blant kryopreservation teknikker, vitrifisering er en som kan brukes lettere i feltforhold. Sammenlignet med langsom (eller kontrollert hastighet) frysing, er vitrifisering raskere og krever ikke spesifikt utstyr, for eksempel en programmerbar fryser. For å tilfredsstille de tre grunnleggende prinsippene for vitrification (dvs. høy viskositet, koblet til høy kryobeskyttende konsentrasjon, små volumer og ultra-rask temperaturreduksjon), flere medier og støtter spesielt har blitt utviklet og brukt i katter for både umodne og modne oocytes. Fra og med enkle sugerør7ble enheter deretter utviklet for å nå målet "Minimum volum". Cryoloop8, åpne trukket sugerør (OPS)9, plast takrenner (modifisert halm)10 og kryorør11 har blitt brukt, inntil en mer effektiv enhet (dvs. Cryotop) ble ansatt11, forbedre overlevelse og meiose gjenopptakelse. Cryotop (Supplerende figur 1) er en kommersielt tilgjengelig støtte som har blitt det valgfrie åpne systemet for vitrifisering. Utviklet for vitrifisering av menneskelige oocytter og embryoer, består den av en liten filmstripe festet til en hard plastholder, beskyttet av en plastrørhette under lagring12. Takket være brukervennligheten og den ekstreme reduksjonen i vitrifiseringsvolumet (så lite som 0,1 μL), noe som også fører til ekstremt rask kjøling og oppvarming, har denne vitrifiseringsstøtten blitt stadig mer brukt i flere arter, inkludert den innenlandske katten, der den har blitt brukt med en rekke medier13,14,15,16,17.

Formålet med dette manuskriptet er å beskrive en samling-vitrification-oppvarming protokoll, med mindre modifikasjoner fra den som opprinnelig er utviklet for menneskelige oocytes, som benytter laboratorie-laget media og kommersielle støtter for minimum volum vitrifisering og kan lett brukes i feltforhold for kryopation av umodne feline COCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrene herved avbildet ikke gjennomgå etisk godkjenning siden katten eggstokkene ble samlet inn på veterinærklinikker som biprodukter fra eier-forespurt rutinemessig ovariectomy eller ovariohysterektomi.

1. Oocyte samling

  1. Før du starter forsøkene, forberede løsninger for eggstokk og oocyte samling. Forbered eggstokkoppsamlingsløsning med fosfatbufret saltvann (PBS) med en blanding av antibiotika og antimykotika (100 IE/ml penicillin G-natrium, 0,1 mg/ml streptomycinsulfat, 0,25 μg/ml amfotericin B). Forbered oocyteoppsamlingsoppløsning (dvs. PBS/PVA) med PBS med 100 IE/ml penicillin G natrium, 0,1 mg/ml streptomycinsulfat og 0,1 % (w/v) polyvinylalkohol (PVA).
  2. Oppbevar løsninger for eggstokk- og oocytesamling ved 4 °C til bruk.
  3. På dagen for dronningenes spaying, noen timer før du behandler prøvene, ta del av eggstokk- og oocyteinnsamlingsløsninger og la dem varme opp ved romtemperatur (RT; 25 ± 2 °C).
  4. Når prøver kommer til laboratoriet, isolere eggstokkene fra de omkringliggende bindevev og fra oviduct og vaske dem i frisk eggstokk samling medium i en Petri parabolen.
  5. Fyll en 35 mm petriskål for hver dronning med ca. 3 ml RT PBS/PVA, og en tallerken til for å samle oocytene.
  6. Legg et par eggstokker i en petriskål og hakk cortex med en kirurgisk skalpell. Sørg for at alle folliklene er brutt ved hjelp av et stereomikroskop (forstørrelse 8x).
  7. Samle COCs med en pipette og flytte dem i fersk PBS / PVA i tildelt Petri parabolen. Velg gode kvaliteter COCer, med en homogen, mørk cytoplasma og omgitt av flere kompakte lag med cumulus celler (klasse I18).

2. Vitrifisering

  1. Forbered likevekt og vitrifiseringsmedier.
    1. Forbered likevektsløsning (ES) med 7,5 % (v/v) etylenglykol (EG) og 7,5 % (v/v) dimetylsulfoksid (DMSO) i Medium 199, med 20 % fostersvinserum (FBS).
    2. Forbered vitrifiseringsløsning (VS) med 15 % (v/v) F.EKS, 15 % (v/v) DMSO og 0,5 M sukrose i Medium 199, med 20 % FBS (modifisert fra 19).
    3. La ES og VS varme opp ved RT før bruk.
      MERK: Kryobeskyttende midler (f.eks. F.eks. En strategi for å motvirke deres toksisitet er å redusere temperaturen der cellene blir utsatt for dem20, og oocytes er vanligvis utsatt for kryobeskyttende midler ved RT. Dermed utføres hele prosedyren, fra oocyte samling til vitrifisering, ved RT i denne protokollen for å unngå temperatursvingninger.
  2. Forbered vitrifiseringsfatet (dvs. en spesiell tallerken bestående av seks koniske brønner fordelt på to rader, kjent som "Repro plate"). Forbered én rad (tre brønner) for hver vitrifiseringsstøtte.
    1. Tilsett 20 μL ES på bunnen av den første brønnen.
    2. Tilsett 300 μL VS på bunnen av den andre (dvs. 1VS) og tredje (dvs. 2VS) brønner.
  3. Likevekts-COCer i ES.
    1. Med en liten rørsetter (f.eks. en Pasteur pipette trukket på en Bunsen nebb for å gjøre den tynnere – diameteren skal være minst 200 μm), overføre en (eller flere) COC(er) på bunnen av den første brønnen.
      MERK: Velg størrelsen på pipetten i henhold til antall lag med cumulus celler rundt oocytter, så til COCs dimensjoner, med sikte på å redusere så mye som mulig volumet av media som overføres med COCs i hvert trinn. Med den nåværende protokollen kan opplærte operatører vitrify vellykket opptil åtte feline COCer per hver vitrification støtte.
    2. Tilsett sakte 20 μL ES på kanten av dråpen. Vent i 3 minutter.
    3. Tilsett sakte andre 20 μL ES på kanten av dråpen. Vent i 3 minutter.
    4. Tilsett sakte 240 μL ES på kanten av dråpen. Vent i 9 minutter.
    5. Mens du venter, klargjør en boks med flytende nitrogen (LN2), merk en vitrifiseringsstøtte med eksperimentet / katten identifikasjonskode og la den stå åpen. Sett dem begge i nærheten av stereomikroskopet, slik at de lett kan nås mens de arbeider.
      Forsiktighet! Bruk personlig verneutstyr ved håndtering av LN2.
    6. Alternativt, hvis flere COCer må vitrifiseres, begynner du det første likevektstrinnet (se trinn 2.3.1 - 2.3.2) for en annen gruppe COCer (som vil bli lastet inn på en ny vitrification-støtte).
  4. Vitrify COCer i VS på mindre enn 90 sekunder.
    1. Bruk samme pipette med små boring, fyll den med 1VS, ta COC-ene fra bunnen av den første brønnen (ES) og flytt dem til overflaten av den andre brønnen (1VS).
    2. Vask pipetten med 1VS.
    3. Ta COCs og flytte dem i et annet område (på bunnen) av brønnen; blande mediet rundt dem med pipetten.
    4. Fyll pipetten med 1VS i et annet område av brønnen, ta COCs, flytt dem og bland mediet rundt dem med pipetten.
    5. Gjenta trinn 2.4.4.
    6. Vask pipetten med 2VS.
    7. Ta COCs og flytte dem på bunnen av den tredje brønnen (2VS); blande mediet rundt dem med pipetten.
    8. Fyll pipetten med 2VS i et annet område av brønnen, ta COCs, flytt dem og bland mediet rundt dem med pipetten.
    9. Gjenta trinn 2.4.8.
    10. Fyll pipetten med 2VS i et annet område av brønnen, ta COCs og legg dem på stripen av vitrifiseringsstøtten, så nært som mulig til spissen. Aspirere overflødig medium for å redusere volumet av VS så mye som mulig.
    11. Umiddelbart stupe vitrifisering støtte i LN2, flytte den. Lukk den ved hjelp av noen klemmer, og sørg for at den alltid forblir nedsenket i LN2.
      MERK: Å holde riktig timing er avgjørende på grunn av kryobeskyttende celletoksisitet. På grunn av deres høye konsentrasjon i vitrification media, må celleeksponering kontrolleres, også ved feilfri utførelse av teknikken21. Hvis prøvene er rikelig, bør du vurdere å dele dem for å behandle dem raskere og minimere tiden fra oocyte samling til vitrifisering.
  5. Oppbevar de lastede vitrifiseringsstøttene i en beger og oppbevar dem i en LN2-tank til den varmer.
    MERK: Alle tidligere trinn i protokollen kan også brukes under feltforhold hvis LN2 er tilgjengelig. En tørr avsender vil være nødvendig for å transportere prøvene til laboratoriet trygt og deretter fortsette der med følgende faser.

3. Oppvarming

  1. Forbered oppvarmingsmedier.
    1. Forbered tiningsløsning (TS) med 1 M sukrose i Medium 199, med 20 % FBS.
    2. Forbered fortynningsløsning (DS) med 0,5 M sukrose i Medium 199, med 20 % FBS.
    3. Forbered vaskeoppløsning (WS) med Medium 199 med 20 % FBS.
    4. Før bruk, varm opp TS til 38 °C og DS og vrang ved RT.
  2. Om nødvendig, forberede kulturmediet for etterfølgende bruk av oppvarmede COCer (f.eks in vitro modning, IVM).
  3. Plasser varmetrinnet i nærheten av stereomikroskopet og slå den på (38 °C). Sett lokket på en petriskål for å varme opp.
  4. Når alt er klart, overfør vitrifiseringsstøttene som må varmes opp fra oppbevaringstanken til en boks med LN2,og sett boksen i nærheten av stereomikroskopet.
  5. Forbered "Repro plate". Forbered en rad for hver vitrification støtte som må varmes opp.
    1. Tilsett 300 μL DS på bunnen av den første brønnen.
    2. Tilsett 300 μL Vrangen på bunnen av den andre (dvs. 1WS) og tredje (dvs. 2WS) brønner.
  6. Lag en dråpe TS (100 μL) på lokket på petriskålen.
  7. Med klemmer åpner du en vitrifiseringsstøtte i LN2.
  8. Sett TS-dråpen under stereomikroskopet, og med en rask bevegelse tar du vitrifiseringsstøtten fra LN2 og senker stripen i dråpen, og flytter den til alle COCer løsner. Fjern støtten fra dråpen så snart den er tom, men la COCene stå i TS i totalt 1 minutt (fra nedsenking til neste trinn).
  9. Ta en pipette som ligner den som brukes til vitrifisering og fyll den med DS. Ta COCene fra dråpen (TS) og flytt dem til bunnen av den første brønnen (DS). Vent i 3 minutter.
  10. Vask pipetten med 1WS. Ta COCs og flytte dem på bunnen av den andre brønnen (1WS). Vent i 5 minutter.
  11. Vask pipetten med 2WS. Ta COCs og flytte dem på overflaten av den tredje brønnen (2WS). Vent til de berører bunnen av brønnen.
  12. Gjenta trinn 3.11 ved hjelp av et annet område av brønnen.
  13. Vask pipetten med kulturmedium og flytt oocytene til kulturfatet for følgende bruk (f.eks. IVM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter kattocytcyt vitrifisering og oppvarming i henhold til gjeldende protokoll (Figur 1 og Supplerende Figur 1), de aller fleste gametes overleve. Etter vitrifisering, blant andre teknikker, levedyktighet kan evalueres på det optiske mikroskopet som morfologiske integritet22 eller ved bruk av vitale flekker. En av sistnevnte er fluoresceindiacetate / propidium iodide (FDA / PI), som tillater identifisering av levedyktig (lys grønn fluorescens) og døde celler (rød fluorescens). Figur 2 viser et representativt bilde av vitrififiserte katte-COCer farget med FDA/PI rett etter oppvarming. Data fra forsøkene som viser prosentandelen av overlevelse etter vitrifisering er rapportert i tabell 1, som viser post-oppvarming data av oocytes beregnet for in vitro modning17 eller in vitro embryo produksjon16. I det hele tatt, i de to eksperimentene som brukes som eksempler her16,17, 395 av 435 oocytes overlevde, scoret en samlet 90,8% etter oppvarming levedyktighet.

Noen morfologiske endringer kan imidlertid merkes etter oppvarming (figur 3). I gametes vitrified-varmet etter denne protokollen, de hyppigste morfologiske abnormiteter er endringer i ooplasm form og granulering, delvis (eller, sjelden, totalt) tap av cumulus celler og (sjelden) zona pellucida frakturer. På den annen side, som rapportert i våre tidligere arbeider på minimum volum vitrification med samme støtte, kan disse vitrifiserte COCenemodnes 17 og utvikle seg til embryoer in vitro16, selv om til lavere priser enn friske COCer. I tillegg presenterer de vanligvis ikke zona pellucida herding (som er en annen velkjent konsekvens av kryopreservation), siden in vitro befruktning (IVF) er vellykket16.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk skildring av oocyte vitrification-oppvarming protokoll.
Se manuskriptteksten for fullstendige indikasjoner. COCs = cumulus-oocyte komplekser; ES=likevektsløsning; VS =vitrifisering løsning; TS = tining løsning; DS= fortynningsløsning; WS =vaskeløsning; LN2= flytende nitrogen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Levedyktighet av vitrifiserte kattocytter etter oppvarming.
Vitrifiserte cumulus-oocyte komplekser farget med fluorescein diacetate / propidium iodide (FDA / PI) viser grønn fluorescens når levedyktig (A) eller rød eller svak fluorescens når død (B). Eksitasjon/utslippsbølgelengder: 495 nm/517 nm for FDA; 538 nm/617 nm for PI. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Lette mikrografer av friske og vitrifiserte kattocytter.
(A)Ferske cumulus-oocyte komplekser etter innsamling, før vitrification. (B) Vitrififiserte cumulus-oocyte komplekser etter oppvarming, viser noen vitrification-indusert skader (endringer i form og tap av cumulus celler, svart pil). Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Eksperiment Gruppe Varmede oocytes (n) Levedyktige oocytes (n) Levedyktighet (%) Levedyktighet (gjennomsnittlig % ± SD)
1† 1 13 12 92.31 91,54 ± 3,66
2 47 44 93.62
3 52 45 86.54
4 26 24 92.31
5 41 40 97.56
6 21 19 90.48
7 50 44 88.00
2‡ 1 17 17 100.00 91,51 ± 9,16
2 17 17 100.00
3 9 8 88.89
4 21 21 100.00
5 30 23 76.67
6 26 23 88.46
7 17 13 76.47
8 10 10 100.00
9 15 14 93.33
10 23 21 91.30

Tabell 1: Representative resultater av levedyktighet hos katte vitrifiserte oocytes. Data fra †Colombo et al. 201916 og ‡ Colombo et al. 202017.

Tilleggsinfo 1: Representativt bilde av støttene som brukes til oocyte vitrification. Den kommersielle støtten måler 13 cm og er lett å håndtere og lagre. Oocytes må lastes på den tynne plaststripen på toppen av enheten, så nær det svarte merket nær spissen. Opphavsrett: Kitazato Corporation. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oocyte kryopreservation er en avgjørende germplasm bevaring teknikk, spesielt i taxa hvor mange arter er truet, som Felidae familie. I dette manuskriptet ble det presentert en enkel og feltvennlig protokoll for vitrifisering av umodne kattocytter. Laboratoriebaserte medier, minimum volum vitrifisering støtter og opplært personell er de viktigste faktorene for suksessen til denne metoden, noe som gjør det mulig å skaffe levedyktige oocytes konsekvent og gjentatte ganger, som vist av de representative resultatene herved rapportert.

Fra og med medieforberedelse bør protokollen følges nøyaktig for å sikre de beste resultatene, men operatørens ferdigheter er det store problemet. Media bør tilberedes samme dag i vitrifiseringsprosedyren, eller hvis det ikke er mulig, bør de tilberedes dagen før og lagres ved 4 °C. I alle fall, før prøvebehandling, bør nok tid overlates til at løsningene kan varme opp til RT. Oocyte samling og COCs valg er raske og enkle prosedyrer som rutinemessig utføres av hvert ARTs laboratorium. Imidlertid er kryopreservation den mest delikate prosedyren. Selv om oppvarmingsprosedyren ikke er så kritisk, kan vitrifiseringen være mer kompleks hvis protokollen og tidspunktene følges. Etter likevekt, der forsiktighet må tas bare i forhold til timings, er den mest utfordrende fasen sannsynligvis vitrification trinnet (se 2.4. av den nåværende protokollen). Faktisk må oocyte overføringer og pipettevaskinger være godt timet og, alle sammen, utført på mindre enn 90 sekunder. For nybegynnere er det tilrådelig å tid prosedyren med en stoppeklokke mens du trener, mens også for trente personer kan det være nyttig å ha en timer piper etter 60 sekunder som et varsel om at tiden kjører opp. I tillegg vil dette tillate en høyere standardisering, siden operatører vitrifying grupper av 6-8 COCer bør være nær overføring av oocytes fra den andre til den tredje brønnen av Repro plate (se trinn 2.4.7 av den nåværende protokollen) når alarmen går av. Forhåpentligvis, ved hjelp av denne artikkelen, kan en høyere standardisering mellom enkeltpersoner og mellom laboratorier oppnås.

De viktigste begrensningene i protokollen forblir de iboende egenskapene til kryopreservation prosedyrer selv. Som tidligere nevnt, vitrifisering utsetter oocytes for ikke-fysiologiske og potensielt skadelige forhold, selv om det utføres feilfritt. Inkubasjonen med kryobeskyttende midler og temperaturreduksjon er de mest kritiske hendelsene20, og de må holdes under streng kontroll. Blant de vanligste kryoskader, noen er lett observerbare på det optiske mikroskopet (f.eks cumulus celle tap, endring av cellulær form og størrelse), mens andre er ikke synlige og ofte påvirker subcellulære strukturer (f.eks zona pellucida herding, oksidativt stress, cytoleton skader, meiotisk spindel og DNA endringer)23,24. Selv om det meste levedyktig, COCs vitrifisert etter denne protokollen ofte presentere noen tydelige morfologiske anomalier etter oppvarming. Det er imidlertid ingen sammenheng mellom morfologi og levedyktighet, som også kan hindres på grunn av subcellulære skader3,25, men morfologiske endringer er sannsynligvis en konsekvens av kryfoskader og delvis en årsak til in vitro utviklingsutfall av vitrififiserte oocytter, som er ganske dårlige hvis sammenlignet med friske oocytes. Den forsiktige utarbeidelsen av vitrifiseringsmedier og presis observasjon av protokolltim bidrar til å oppnå god etteroppvarmingsevne og morfologiske integritet, men forbedringer i ytterligere in vitro modning av oocytes og embryoutvikling er fortsatt nødvendig, siden levedyktighet ofte reduseres i løpet av følgende kultur16.

Kaldinduserte skader oppstår dessverre med hver kryopreservation metode24. Minimumsvolumvitifiseringsstøtten som brukes i denne protokollen, er utviklet for å redusere vitrifiseringsvolumet så mye som mulig, noe som resulterer i bedre kjøle- og oppvarmingshastigheter sammenlignet med andre kryopreservationsenheter (-23 000 °C/minutt og 42 000 °C/minutt, i henhold til produsentens spesifikasjoner). Som en konsekvens, i human medisin, hvor kliniske studier som vurderer både in vitro (dvs. befruktning og embryoutvikling) og in vivo parametere (dvs. graviditet priser og levende fødsler) er tilgjengelig, minimum volum vitrifisering er det vanligste valget for oocyte kryopreservation på grunn av sine uforlignelige resultater i form av post-oppvarming overlevelse og, til slutt, levende fødsler12 fra vitrifisert modne menneskelige ocytter. I tillegg, sammenlignet med andre vitrification enheter, er den som brukes i denne protokollen enklere å bruke og tryggere å lagre12, siden det er behagelig å håndtere og er beskyttet av en hette under lagring. For eksempel er Cryoloop også en effektiv støtte for å nå det minimale volummålet, men strukturen (en løkke som støtter en film av løsning som oocytes er lastet på) er skjør og utsatt for utilsiktet oppvarming12. Sugerør (0,25 ml volum) eller åpne trukket sugerør (OPS) kan også brukes, men de tillater ikke en betydelig reduksjon i vitrifiseringsvolumet og er også utfordrende å fylle og tømme, da noen oocytes kan gå tapt26. Mange andre støtter har blitt utviklet2, men hver av dem har sine ulemper. I stedet, sammenlignet med langsom frysing, som tidligere var den mest brukte kryopreservation teknikken, de viktigste fordelene med minimum volum vitrifisering på kommersielle støtter er dens gjennomførbarhet og hastighet. Som tidligere nevnt krever vitrifisering ikke en programmerbar fryser som skal utføres, og mens langsom frysing av oocytes tar omtrent en og en halv time å bli avsluttet25, vitrifisering kan oppnås i ca 17 minutter etter dagens protokoll.

Til slutt kan stabsferdigheter og interoperatørstandardisering være de mest utfordrende kravene når man starter en vitrifisert oocyte bank, men de vil bli oppnådd med personellopplæring. Denne minste volum vitrification protokollen for katt umodne oocytes gir konsistente og repeterbare resultater når utført av erfarne operatører. Det er imidlertid fortsatt sjanser for forbedring i oocyte utviklingshastigheter, selv om etter oppvarming levedyktighet og integritet er tilfredsstillende. Med ytterligere optimalisering kan den nåværende protokollen også brukes under feltforhold for ville kattedyr, som publiserte data om oocyte kryopreservation fortsatt er knappe27. Utvide anvendelsen av denne metoden ikke bare ville øke muligheten for å forbedre kryopreservation protokoller, men ville også tillate etablering vitrified oocyte biobanker for fruktbarhet og biologisk mangfold bevaring i felids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 og av Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Vi ønsker også å takke Dr. MariaGiorgia Morselli for hennes bidrag til eksperimentene herved avbildet og til bildeoppkjøp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2942 /
Automatic pipettes & tips / / Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL
Surgical scalpels / / Size 10 is usually ok
Bunsen beak / / /
Clamps / / Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen
Cryotop Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) 01.CR Distributors and catalog number may change in different countries
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 /
Ethylene glycol (EG) Sigma-Aldrich E9129 /
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 /
Glass Pasteur pipettes / / Advised lenght 230 mm (100+130)
Gobelets / / According to the canisters of the storage tank
Heating stage / / All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC
Liquid nitrogen / / /
Medium 199 Sigma-Aldrich M4530 /
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 /
Penicillin G sodium Sigma-Aldrich P3032 /
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136 /
Repro plate Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) 01.K-2 Distributors and catalog number may change in different countries
Stereomicroscope / / As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok
Storage tank / / Any regularly filled tank is ok
Streptomycin sulphate Sigma-Aldrich S9137 /
Styrofoam/nitrogen resistant box / / All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack"
Sucrose Sigma-Aldrich S1888 /
Timers / / All timers which can be set on times until 9 minutes are ok

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
  2. Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
  3. Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
  4. Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
  5. Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
  6. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  7. Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
  8. Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
  9. Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
  10. Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
  11. Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
  12. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
  13. Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
  14. Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
  15. Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
  16. Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
  17. Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
  18. Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
  19. Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
  20. Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
  21. Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
  22. Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
  23. Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
  24. Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
  25. Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
  26. Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
  27. Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 160 Katt Bank Bevaring Kryopreservation Cumulus-oocyte kompleks Felid Kvinne Frysing Gamete Germinal Vesicle Germplasm Rapid
Minimum Volum Vitrifisering av umodne Feline Oocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colombo, M., Luvoni, G. C. Minimum… More

Colombo, M., Luvoni, G. C. Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes. J. Vis. Exp. (160), e61523, doi:10.3791/61523 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter