Summary
Detta manuskript beskriver ett protokoll för minsta volym förglasning av omogna katt oocyter med laboratorietillgjorda medier på kommersiella stöd. Det täcker varje steg från oocyte isolering från ex vivo gonads till förglasning och uppvärmning.
Abstract
I vilda djur bevarande program, gamete banking är avgörande för att skydda genetiska resurser för värdefulla individer och sällsynta arter och för att främja bevarandet av biologisk mångfald. I felids, de flesta arter hotas av utrotning, och inhemska raser används som en modell för att öka effektiviteten i protokoll för germplasm bank. Bland oocyte cryopreservation tekniker, förglasning är mer och mer populärt i mänskliga och veterinära assisterad reproduktion. Cryotop förglasning, som först utvecklades för mänskliga äggceller och embryon, har visat sig vara väl lämpad för katt äggceller. Denna metod erbjuder flera fördelar, såsom genomförbarheten i fältförhållanden och hastigheten på förfarandet, vilket kan vara till hjälp när flera prover behöver bearbetas. Effektiviteten är dock starkt beroende av operatörens kompetens, och intra- och inter-laboratory standardisering behövs, samt personalutbildning. Detta protokoll beskriver minsta volym förglasning av omogna felint äggceller på ett kommersiellt stöd i ett steg för steg fält-vänlig protokoll, från äggcell samling till uppvärmning. Efter protokollet, bevarande av äggcell integritet och lönsamhet vid uppvärmningen (så hög som 90%) kan förväntas, även om det fortfarande finns utrymme för förbättringar i mognads- och embryonala utvecklingsresultat efter uppvärmningen.
Introduction
Kryobevarande har blivit ett viktigt steg i assisterad reproduktionsteknik (ARTs). Hos människor, Det tillåter bevarande av fertilitet eller uppskjutande av föräldraskap för medicinska eller personliga skäl. Hos djur är det nödvändigt att övervinna avstånd och tid i planerade parningar, särskilt hos husdjur och husdjur, eller att bevara genetiskt material av värdefulla ämnen i bevarandeprogram, särskilt i vilda utrotningshotade arter. Gamete cryopreservation är det bästa valet när de individer som ska födas upp inte har valts ännu eller för att undvika etiska frågor i samband med embryo frysning, särskilt i humanmedicin1. Spermatozoa är relativt lätt att bevara och ge tillfredsställande resultat efter upptining, men äggceller, på grund av deras strukturella egenskaper, kan vara mer komplicerat att lagra. Faktum är att den låga ytan / volym förhållandet, liksom förekomsten av zona pellucida kring ooplasma, begränsar förflyttning av cryoprotectants och vatten över cellen2. Dessutom, hos husdjur inklusive kattdjur, de kännetecknas av en lipid-rik cytoplasma, som tros göra dem mer känsliga för kryokonservering3.
De flesta felids hotas, och den inhemska katten används som en modell för att utveckla protokoll för germplasm bevarande tack vare tillgången på gonads från rutinmässiga ovariectomy. Hos vilda djur kan könsceller erhållas efter valbara operationer eller (oftare) obduktion,och omogna (germinal vesicle) könsceller kan hämtas. Hormonell stimulering som syftar till att erhålla mogna (metafas II) äggceller är inte lika vanligt som i mänskliga ARTs på grund av de etiska frågorna och art- och individspecifika svar på behandlingar4.
Därför har utvecklingen av cryopreservation strategier fokuserat på omogna könsceller, som vanligtvis kan hämtas efter den oväntade eller plötsliga död sällsynta individer. Ur biologisk synvinkel finns det vissa skillnader i kryokonservering av omogna eller mogna könsceller, var och en har sina fördelar. För det första är DNA mer skyddat i omogna äggceller, vars germinal vesikel innehåller kromosomer omgivna av ett kärnmembran, medan den meiotiska spindeln av metafas II-äggceller kan vara mer sårbara för kryoinjuries5. För det andra kan kallinducerad cytoskelettetor skador påverka spindelrotation, polar kroppsextrudering, pronuclear migration och cytokinesi, som kan ha olika effekter beroende på äggcell utvecklingsfas, påverkar meios progression eller post-befruktning händelser. Slutligen, och kanske viktigast av allt, medan mogna äggceller är redo att befruktas, är omogna könsceller beroende av stöd från de omgivande cumuluscellerna för att gå igenom nukleär och cytoplasmatisk mognad6, och detta är anledningen till att hela cumulus-okulorkomplex (COCs) kryopreserveras. Förlusten av cumulusceller och/eller förlusten av funktionell anslutning mellan gameten och de omgivande somatiska cellerna är dock förmodligen den mest skadliga effekten av kryobevarande av omogna COC.
Bland kryobevarande tekniker är förglasning en som lättare kan appliceras i fältförhållanden. Jämfört med långsam (eller kontrollerad hastighet) frysning, förglasning är snabbare och kräver inte särskild utrustning, såsom en programmerbar frys. För att uppfylla de tre grundläggande principerna för förglasning (dvs. hög viskositet, kopplad till hög kryoprotectant koncentration, små volymer och ultra-snabb temperaturminskning), flera medier och stöd särskilt har utvecklats och använts i katter för både omogna och mogna äggceller. Från och med enkla sugrör7,enheter utvecklades sedan för att nå "Minsta volym" mål. Cryoloop8, öppna dragna sugrör (OPS)9, plast rännor (modifierad halm)10 och cryotubes11 har använts, tills en effektivare enhet (dvs Cryotop) användes11, förbättra överlevnad och meiosis återupptagande. Cryotop (Supplemental Figur 1) är ett kommersiellt tillgängligt stöd som har blivit det valbara öppna systemet för förglasning. Utvecklad för förglasning av mänskliga äggceller och embryon, består den av en liten filmremsa fäst vid en hård plasthållare, skyddad av ett plaströr lock under lagring12. Tack vare dess användbarhet och den extrema minskningen av förglasningsvolymen (så lite som 0,1 μL), vilket också leder till extremt snabb kylning och uppvärmning, har detta stöd för förglasning alltmer tillämpats på flera arter, inklusive den inhemska katten, där den har använts med en mängd olika medier13,,14,15,,16,17.
Syftet med detta manuskript är att beskriva en samling-förglasning-uppvärmning protokoll, med mindre ändringar från den som ursprungligen utvecklades för mänskliga äggceller, som använder laboratorietillverkade medier och kommersiella stöd för minsta volym förglasning och kan enkelt tillämpas i fältförhållanden för kryoreservation av omogna katt-COCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De förfaranden som härmed avbildas inte genomgå etiskt godkännande eftersom katt äggstockar samlades in på veterinärkliniker som biprodukter från ägare begärda rutin ovariectomy eller ovariohysterectomy.
1. Oocyte samling
- Innan du påbörjar experimenten, förbered lösningar för äggstock och äggcellssamling. Förbered äggstocksuppsamlingslösning med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med en blandning av antibiotika och antimykotika (100 IE/ml penicillin G natrium, 0,1 mg/ml streptomycinsulfat, 0,25 μg/ml amphotericin B). Förbered äggcellsuppsamlingslösning (dvs. PBS/PVA) med PBS med 100 IE/ml penicillin G natrium, 0,1 mg/ml streptomycinsulfat och 0,1 % (w/v) polyvinylalkohol (PVA).
- Förvara lösningar för äggstocks- och äggcellsuppsamling vid 4 °C tills den används.
- På dagen för drottningarnas spaying, några timmar före bearbetningen av proverna, ta del av äggstocks- och äggcellsuppsamlingslösningar och låt dem värmas upp i rumstemperatur (RT; 25 ± 2 °C).
- När prover anländer till labbet, isolera äggstockarna från den omgivande bindväv och från äggledaren och tvätta dem i färsk äggstock samling medium i en petriskål.
- Fyll en 35 mm petriskål för varje drottning med ca 3 ml RT PBS/PVA, och ytterligare en maträtt för att samla in äggcellerna.
- Placera ett par äggstockar i en petriskål och färs cortex med en kirurgisk skalpell. Se till att alla folliklar har brutits med hjälp av ett stereomikroskop (förstoring 8x).
- Samla coc med en pipett och flytta dem i färsk PBS / PVA i den tilldelade petriskålen. Välj goda egenskaper COCs, med en homogen, mörk cytoplasma och omgiven av flera kompakta lager av cumulus celler (klass I18).
2. Förglasning
- Förbered jämvikt och förglasning media.
- Bered ekvilibrationslösning (ES) med 7,5 % (v/v) etylenglykol (EG) och 7,5 % (v/v) dimetylsulfaoxid (DMSO) på Medium 199, med 20 % fetalt bovinserum (FBS).
- Förbered förglasningslösning (VS) med 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO och 0,5 M sackaros på Medium 199, med 20% FBS (ändrad från 19).
- Låt ES och VS värmas upp på RT före användning.
OBS: Kryoprotectants (t.ex. EG, DMSO) är kända för att vara cytotoxiska. En strategi för att motverka deras toxicitet är att minska temperaturen vid vilken cellerna utsätts för dem20, och äggceller är oftast utsätts för kryoprotectants på RT. Således utförs hela förfarandet, från äggcellssamling till förglasning, vid RT i detta protokoll för att undvika temperaturfluktuationer.
- Förbered förglasningsskålen (dvs. en speciell maträtt bestående av sex koniska brunnar uppdelade i två rader, känd som "Repro plate"). Förbered en rad (tre brunnar) för varje förglasningsstöd.
- Tillsätt 20 μl ES på botten av den första brunnen.
- Tillsätt 300 μl VS på undersidan av den andra (dvs. 1VS) och tredje (dvs. 2VS) brunnar.
- Jämviktsk cocs i ES.
- Med en liten rörpipa (t.ex. en Pasteur pipett drog på en Bunsen näbb för att göra den tunnare – diametern bör vara minst 200 μm), överför en (eller flera) COC(s) på undersidan av den första brunnen.
OBS: Välj storleken på pipetten beroende på antalet lager av cumulus celler som omger äggceller, så att COCs dimensioner, som syftar till att minska så mycket som möjligt volymen av media som överförs med COCs i varje steg. Med det nuvarande protokollet kan utbildade operatörer förglasa upp till åtta felint COCs per varje förglasning stöd. - Tillsätt långsamt 20 μl ES på gränsen till avfallet. Vänta i 3 minuter.
- Tillsätt långsamt andra 20 μl ES på gränsen till avfallet. Vänta i 3 minuter.
- Tillsätt långsamt 240 μL ES på gränsen till droppen. Vänta i 9 minuter.
- Medan du väntar, förbereda en låda med flytande kväve (LN2),etikett en förglasning stöd med experiment / katt identifieringskod och lämna den öppen. Placera båda i närheten av stereomikroskopet, så att de lätt kan nås under arbetet.
Försiktighet! Använd personlig skyddsutrustning vid hantering av LN2. - Alternativt, om flera cocs måste förglasas, börja det första jämviktssteget (se steg 2.3.1 - 2.3.2) för en annan grupp av COC (som kommer att lastas på ett nytt stöd för förglasning).
- Med en liten rörpipa (t.ex. en Pasteur pipett drog på en Bunsen näbb för att göra den tunnare – diametern bör vara minst 200 μm), överför en (eller flera) COC(s) på undersidan av den första brunnen.
- Vitrify COCs i VS på mindre än 90 sekunder.
- Med samma småbortrör, fyll den med 1VS, ta COCs från botten av den första brunnen (ES) och flytta dem till ytan av den andra brunnen (1VS).
- Tvätta pipetten med 1VS.
- Ta COCs och flytta dem i ett annat område (på botten) av brunnen; blanda mediet som omger dem med pipetten.
- Fyll pipetten med 1VS i ett annat område av brunnen, ta COCs, flytta dem och blanda mediet som omger dem med pipetten.
- Upprepa steg 2.4.4.
- Tvätta pipetten med 2VS.
- Ta COCs och flytta dem på botten av den tredje brunnen (2VS); blanda mediet som omger dem med pipetten.
- Fyll pipetten med 2VS i ett annat område av brunnen, ta COCs, flytta dem och blanda mediet som omger dem med pipetten.
- Upprepa steg 2.4.8.
- Fyll pipetten med 2VS i ett annat område av brunnen, ta COCs och ladda dem på remsan av förglasningsstödet, så nära spetsen som möjligt. Sug överflödigt medium för att minska volymen av VS så mycket som möjligt.
- Omedelbart störta förglasning stöd i LN2, flytta den. Stäng den med hjälp av några klämmor och se till att den alltid förblir nedsänkt i LN2.
OBS: Att hålla rätt timing är avgörande på grund av cryoprotectant cell-toxicitet. På grund av deras höga koncentration i förglasning media, cellexponering måste kontrolleras, även genom felfri utförande av tekniken21. Om proverna är rikliga, överväga att dela dem för att bearbeta dem snabbare och minimera tiden från äggcell samling till förglasning.
- Förvara de laddade förglasningsstöden i en bägare och förvara dem i en LN2-tank tills den värms upp.
Alla föregående steg i protokollet kan också tillämpas under fältförhållanden om LN2 är tillgängligt. En torr avsändare kommer att vara nödvändigt att transportera proverna till labbet på ett säkert sätt och sedan fortsätta där med följande faser.
3. Uppvärmning
- Förbered uppvärmningsmedia.
- Förbered upptiningslösning (TS) med 1 M sackaros på Medium 199, med 20% FBS.
- Bered utspädningslösning (DS) med 0,5 M sackaros på Medium 199, med 20% FBS.
- Förbered tvättlösning (WS) med Medium 199 med 20% FBS.
- Värm upp TS till 38 °C och DS och WS vid RT före användning.
- Vid behov bered odlingsmediet för efterföljande användning av uppvärmda COC (t.ex. in vitro-mognad, IVM).
- Placera värmefasen nära stereomikroskopet och slå på det (38 °C). Sätt locket på en petriskål för att värma upp.
- När allt är klart, överför förglasningsstöden som måste värmas från lagringstanken till en låda med LN2och placera lådan nära stereomikroskopet.
- Förbered "Repro plattan". Förbered en rad för varje förglasning stöd som måste värmas.
- Tillsätt 300 μl DS på botten av den första brunnen.
- Tillsätt 300 μl WS på botten av den andra (dvs. 1WS) och tredje (dvs. 2WS) brunnar.
- Gör en droppe TS (100 μL) på locket på petriskålen.
- Med klämmor öppnar du ett förglasningsstöd i LN2.
- Placera TS-droppen under stereomikroskopet och ta förglasningsstödet från LN2 med en snabb rörelse och sänk ned remsan i droppen och flytta den tills alla COC lossnar. Ta bort stödet från droppen så snart det är tomt, men lämna COC i TS i totalt 1 minut (från nedsänkning till följande steg).
- Ta en pipett som liknar den som används för förglasning och fyll den med DS. Ta COCs från släpp (TS) och flytta dem till botten av den första brunnen (DS). Vänta i 3 minuter.
- Tvätta pipetten med 1WS. Ta COCs och flytta dem på botten av den andra brunnen (1WS). Vänta i 5 minuter.
- Tvätta pipetten med 2WS. Ta COCs och flytta dem på ytan av den tredje brunnen (2WS). Vänta tills de rör vid botten av brunnen.
- Upprepa steg 3.11 med ett annat område av brunnen.
- Tvätta pipetten med odlingsmedium och flytta äggcellerna till odlingsskålen för följande användning (t.ex. IVM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter katt äggcell förglasning och uppvärmning enligt det nuvarande protokollet (Figur 1 och Supplemental Figur 1), de allra flesta könsceller överleva. Efter förglasning, bland andra tekniker, kan lönsamheten utvärderas vid det optiska mikroskopet som morfolog integritet22 eller med användning av vitala fläckar. En av de senare är fluorescein diacetate/propidium jodid (FDA / PI), vilket gör det möjligt att identifiera livskraftiga (ljusgrön fluorescens) och döda celler (röd fluorescens). Figur 2 visar en representativ bild av förglasade-uppvärmd katt COCs färgas med FDA / PI direkt efter uppvärmningen. Data från experimenten som visar den procentuella överlevnadsprocenten efter förglasning rapporteras i tabell 1,som visar data efter uppvärmningen av äggceller avsedda för in vitro-mognad17 eller in vitro-embryoproduktion16. På det hela taget, i de två experiment som används som exempel här16,17, 395 av 435 äggceller överlevde, scoring en total 90,8% efter uppvärmningen lönsamhet.
Vissa morfologiska förändringar kan dock märkas efter uppvärmningen (figur 3). I könsceller förglasade-värms efter detta protokoll, de vanligaste morfologiska avvikelser är förändringar i ooplasm form och granulering, partiell (eller, sällan, totala) förlust av cumulus celler och (sällan) zona pellucida frakturer. Å andra sidan, som rapporterats i våra tidigare arbeten om minsta volym förglasning med samma stöd, kan dessa förglasade COCs mogna17 och utvecklas till embryon in vitro16, även om det är lägre än färska COCs. Dessutom presenterar de vanligtvis inte zona pellucida härdning (vilket är en annan välkänd konsekvens av kryobevarande), eftersom provrörsbefruktning (IVF) är framgångsrik16.
Figur 1: Schematisk skildring av protokollet om förglasning av äggceller.
Se manuskripttexten för fullständiga indikationer. COCs = cumulus-oocyte komplex; ES=equilibration lösning; VS= förglasning lösning; TS=upptiningslösning; DS=utspädningslösning; WS=tvättlösning; LN2=flytande kväve. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Livskraften hos förglasade kattoocyter efter uppvärmningen.
Förglasade cumulus-oocyter komplex färgas med fluorescein diacetate/propidium jodid (FDA / PI) visar grön fluorescens när livskraftig(A) eller röd eller svag fluorescens när död (B). Excitation/emissions våglängder: 495 nm/517 nm för FDA; 538 nm/617 nm för PI. Skala bar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Lätta mikrografer av färska och förglasade kattoocyter.
(A) Färska cumulus-oocyte komplex efter insamling, före förglasning. (B)Förglasade cumulus-oocyte komplex efter uppvärmningen, visar några förglasning-inducerad skador (förändringar i form och förlust av cumulus celler, svart pil). Skala bar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Experiment | Grupp | Uppvärmda äggceller (n) | Livsdugliga äggceller (n) | Lönsamhet (%) | Lönsamhet (medelvärde % ± SD) |
| 1† | 1 | 13 | 12 | 92.31 | 91,54 ± 3,66 |
| 2 | 47 | 44 | 93.62 | ||
| 3 | 52 | 45 | 86.54 | ||
| 4 | 26 | 24 | 92.31 | ||
| 5 | 41 | 40 | 97.56 | ||
| 6 | 21 | 19 | 90.48 | ||
| 7 | 50 | 44 | 88.00 | ||
| 2‡ | 1 | 17 | 17 | 100.00 | 91,51 ± 9,16 |
| 2 | 17 | 17 | 100.00 | ||
| 3 | 9 | 8 | 88.89 | ||
| 4 | 21 | 21 | 100.00 | ||
| 5 | 30 | 23 | 76.67 | ||
| 6 | 26 | 23 | 88.46 | ||
| 7 | 17 | 13 | 76.47 | ||
| 8 | 10 | 10 | 100.00 | ||
| 9 | 15 | 14 | 93.33 | ||
| 10 | 23 | 21 | 91.30 |
Tabell 1: Representativa resultat av lönsamheten i kattförglasade oocyter. Data från †Colombo et al. 201916 och ‡ Colombo et al. 202017.
Kompletterande figur 1: Representativ bild av de stöd som används för äggcell förglasning. Det kommersiella stödet mäter 13 cm och är lätt att hantera och förvara. Äggceller måste lastas på den tunna plastremsan på toppen av enheten, så nära som möjligt till den svarta markeringen nära spetsen. Upphovsrätt: Kitazato Corporation. Klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oocyte cryopreservation är en avgörande bakterieplasm bevarande teknik, särskilt i taxa där många arter är utrotningshotade, såsom Felidae familj. I detta manuskript presenterades ett enkelt och fältvänligt protokoll för förglasning av omogna kattoocyter. Laboratorietillhandagivna medier, minsta volymförglaseringsstöd och utbildad personal är de viktigaste faktorerna för att denna metod ska lyckas, vilket gör det möjligt att erhålla livskraftiga äggceller konsekvent och upprepade gånger, vilket framgår av de representativa resultat som rapporteras härmed.
Från och med medieberedningen bör protokollet följas korrekt för att säkerställa bästa resultat, men operatörens kompetens är den viktigaste frågan. Media bör beredas samma dag som förglasningsförfarandet, eller, om detta inte är möjligt, bör de beredas dagen före och förvaras vid 4 °C. I vilket fall som helst, före provbearbetning, bör tillräckligt med tid lämnas för att lösningarna ska kunna värmas upp till RT. Oocyte insamling och COCs urval är snabba och enkla förfaranden som rutinmässigt utförs av varje ARTs laboratorium. Cryopreservation är dock det känsligaste förfarandet. Även om uppvärmningen förfarandet inte är så kritisk, om protokollet och tidpunkterna följs, kan förglasning vara mer komplex. Efter jämvikt, där man måste vara försiktig med att respektera tidpunkter, är den mest utmanande fasen sannolikt förglasningssteget (se 2.4. i detta protokoll). Faktum är att äggcellsöverföringar och pipetttvättar måste vara vältänd och, alla tillsammans, utförs på mindre än 90 sekunder. För nybörjare är det lämpligt att tajpa proceduren med ett stoppur under träning, medan det även för utbildade individer kan vara bra att ha en timer pipande efter 60 sekunder som en varning om att tiden är igång. Dessutom skulle detta möjliggöra en högre standardisering, eftersom operatörerna vitrifying grupper av 6-8 COCs bör vara nära överföringen av äggceller från den andra till den tredje brunnen i Repro plattan (se steg 2.4.7 i detta protokoll) när larmet går. Förhoppningsvis, med hjälp av denna artikel, en högre standardisering mellan individer och mellan laboratorier skulle kunna uppnås.
De stora begränsningarna i protokollet förblir de inneboende egenskaperna hos cryopreservation förfaranden själva. Som tidigare nämnts, förglasning utsätter äggceller för icke-fysiologiska och potentiellt skadliga förhållanden, även om det utförs felfritt. Inkubationen med kryoprotectants och minskningen av temperaturen är de mest kritiska händelserna20 och de måste hållas under strikt kontroll. Bland de vanligaste kryoinjuries, vissa är lätt observerbara på det optiska mikroskopet (t.ex. cumulus cellförlust, förändring av cellulär form och storlek), medan andra inte är synliga och ofta påverkar subcellulära strukturer (t.ex. zona pellucida härdning, oxidativ stress, cytoskeleton skador, meiotic spindel och DNA-förändringar)23,24. Även om mestadels livskraftiga, COCs förglasade efter detta protokoll presenterar ofta några uppenbara morfologiska anomalier efter uppvärmningen. Det finns dock inget samband mellan morfologi och lönsamhet, som också kan hämmas på grund av subcellulära skador3,,25, men morfologiska förändringar är sannolikt en följd av kryoinjuries och delvis en orsak till in vitro utvecklingsresultat av förglasade äggceller, som är ganska dåliga jämfört med färska äggceller. Noggranna förberedelser av förglasningsmedier och den exakta observationen av protokolltidsinställningen bidrar till att uppnå god lönsamhet och morfologiska integritet efter uppvärmningen, men det behövs fortfarande förbättringar av ytterligare in vitro-mognad av äggceller och embryoutveckling, eftersom lönsamheten ofta minskar under följande kultur16.
Kallinducerade skador uppstår tyvärr med varje kryobevarandesmetod24. Det minsta volymförglaseringsstöd som används i detta protokoll har utvecklats för att minska förglasningsvolymen så mycket som möjligt, vilket resulterar i bättre kyl- och uppvärmningshastigheter jämfört med andra kryobevarandeanordningar (-23 000 °C/minut respektive 42 000 °C/minut, enligt tillverkarens specifikationer). Som en följd av detta är minimivolymförglasing i kliniska studier som bedömer både in vitro (dvs. befruktning och embryoutveckling) och in vivo-parametrar (dvs. graviditetsfrekvens och levande födda barn) tillgängliga, minsta volymförglasande det vanligaste valet för äggcells cryopreservation på grund av dess ojämförliga resultat när det gäller överlevnad efter uppvärmningen och slutligen levande födda12 från förglasade mogna humanocyter. Dessutom, jämfört med andra förglasning enheter, den som används i detta protokoll är lättare att använda och säkrare att lagra12, eftersom det är bekvämt att hantera och skyddas av ett lock under lagring. Till exempel är Cryoloop också ett effektivt stöd för att nå minimal volym målet, men dess struktur (en slinga som stöder en film av lösning där äggcellerna laddas) är bräcklig och benägna att oavsiktlig uppvärmning12. Sugrör (0,25 ml volym) eller öppna dragna sugrör (OPS) kan också användas, men de tillåter inte en betydande minskning av förglasningsvolymen och är också utmanande att fylla och tömma, eftersom vissa äggceller kan gå förlorade26. Många andra stöd har utvecklats2, men var och en av dem har sina nackdelar. I stället, jämfört med långsam frysning, som tidigare var den mest använda cryopreservation teknik, de främsta fördelarna med minsta volym förglasning på kommersiella stöd är dess genomförbarhet och hastighet. Som tidigare nämnts, förglasning kräver inte en programmerbar frys som skall utföras, och medan långsam frysning av äggceller tar ungefär en timme och hälften för attingås 25, förglasning kan åstadkommas i ca 17 minuter efter det nuvarande protokollet.
Sammanfattningsvis kan personalkompetens och inter-operatör standardisering vara de mest utmanande kraven när man startar en förglasad äggcellsbank, men de kommer att uppnås med personalutbildning. Denna minsta volym förglasning protokoll för katt omogna äggceller ger konsekventa och repeterbara resultat när de utförs av erfarna operatörer. Det finns dock fortfarande möjligheter till förbättring av äggcellsutvecklingstakten, även om lönsamheten och integriteten efter uppvärmningen är tillfredsställande. Med ytterligare optimering, det nuvarande protokollet kan också tillämpas i fältförhållanden för vilda felids, för vilka publicerade uppgifter om äggcell cryopreservation är fortfarande knappa27. En utvidgning av tillämpningen av denna metod skulle inte bara öka möjligheten att förbättra protokollen för kryokonservering, utan skulle också göra det möjligt att inrätta förglasade biobanker för förtätning av fertilitet och biologisk mångfald i felids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 och av Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Vi vill också tacka Dr MariaGiorgia Morselli för hennes bidrag till de experiment som härmed skildras och till bildförvärv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
