Summary
Bu el yazması, olgunlaşmamış kedi yumurtalarının ticari destekler de laboratuvar yapımı ortamla minimum hacimli vitrifikasyonuna ilişkin bir protokolü açıklamaktadır. Oosit izolasyonundan ex vivo gonadlardan vitrifikasyon ve ısınmaya kadar her adımı kapsar.
Abstract
Vahşi hayvanların koruma programlarında, gamet bankacılığı değerli bireylerin ve nadir türlerin genetik kaynaklarını korumak ve biyolojik çeşitliliğin korunmasını teşvik etmek için çok önemlidir. Felids, çoğu tür yok olma tehlikesiyle karşı karşıya, ve yerli ırklar germplasm bankacılık için protokollerin verimliliğini artırmak için bir model olarak kullanılır. Oosit kriyoprezervasyon teknikleri arasında, vitrifikasyon insan ve veteriner destekli üreme daha popüler. İlk olarak insan yumurtaları ve embriyolar için geliştirilen cryotop vitrifikasyon, kedi yumurtaları için çok uygun olduğunu göstermiştir. Bu yöntem, alan koşullarındafizibilite ve yordamın hızı gibi çeşitli avantajlar sunar ve bu da birkaç numunenin işlenmesi gerektiğinde yararlı olabilir. Ancak, verimlilik güçlü operatörün becerilerine bağlıdır ve intra-ve laboratuvarlar arası standardizasyon yanı sıra personel eğitimi gereklidir. Bu protokol, yumurta koleksiyonundan ısınmaya kadar, adım adım alan dostu protokolile ticari destek te olgunlaşmamış kedi yumurtalarının minimum hacimli vitrifikasyonu dur. Protokolün ardından, yumurta bütünlüğünün ve ısınmada canlılığın korunması (%90'a kadar) ısınma sonrası olgunlaşma ve embriyonik gelişim sonuçlarında iyileşme için hala yer olmasına rağmen, beklenebilir.
Introduction
Kriyopreservation destekli üreme teknikleri (ARTs) önemli bir adım haline gelmiştir. İnsanlarda, bu tıbbi veya kişisel nedenlerle doğurganlık korunması veya ebeveynlik ertelenmesi sağlar. Hayvanlarda, özellikle çiftlik hayvanları ve evcil hayvanlarda, planlanan çiftliklerde mesafe ve zamanın üstesinden gelmek ya da özellikle nesli tükenmekte olan vahşi türler olmak üzere koruma programlarındaki değerli deneklerin genetik materyallerini korumak gereklidir. Gamet kriyoppreservation bireylerin henüz seçilmiş değil ya da amacıyla embriyo dondurma ile ilgili etik sorunları önlemek için, özellikle insan tıbbı1en iyi seçimdir. Spermatozoakorumak ve erime sonra tatmin edici sonuçlar vermek nispeten kolaydır, ancak yumurta, yapısal özellikleri nedeniyle, saklamak için daha karmaşık olabilir. Nitekim, düşük yüzey / hacim oranı, hem de ooplazma çevreleyen zona pellucida varlığı,hücre2 boyunca kriyoprotektif ve su hareketini sınırlar . Ayrıca, felidler de dahil olmak üzere evcil hayvanlarda, onlar kriyopreservation3onları daha duyarlı hale getirmek için düşünülen bir lipid açısından zengin sitoplazma ile karakterizedir.
En felids tehdit altındadır, ve evcil kedi rutin ovariektomi gelen gonadların durumu sayesinde germplasm korunması için protokoller geliştirmek için bir model olarak kullanılır. Vahşi hayvanlarda, gonadlar elektif ameliyatlardan sonra veya (daha sık) post-mortemsonra elde edilebilir, ve olgunlaşmamış (germinal vezikül) gametler alınabilir. Hormonal stimülasyon olgun elde etmek için amaçlayan (metafaz II) oositler etik sorunlar ve tür nedeniyle insan ARTs olarak yaygındeğildir-ve tedavilere bireysel-özel yanıt 4 .
Bu nedenle, kriyoprezervasyon stratejilerinin geliştirilmesi genellikle nadir bireylerin beklenmedik veya ani ölümünden sonra alınabilir olgunlaşmamış gametler, odaklanmıştır. Biyolojik bir bakış açısıyla, her birinin avantajları olan olgunlaşmamış veya olgun gametlerin kriyopreservation bazı farklılıklar vardır. İlk olarak, DNA daha olgunlaşmamış oositler korunur, olan germinal vezikül bir nükleer membran ile çevrili kromozomlar içerir, metafaz II oositlerin meiotik mil kriyoyaralanmalara karşı daha savunmasız olabilirise 5. İkinci olarak, soğuk kaynaklı sitoiskelet hasarları iğ rotasyonunu, kutup cisim ekstrüzyonu, pronükleer göç ve sitokinezi etkileyebilir, bu da oosit gelişim evresine göre farklı etkilere yol açabilir, mayoz progresyonu veya döllenme sonrası olayları etkileyebilir. Son olarak, ve belki de en önemlisi, olgun yumurtadöllenmeye hazır iken, olgunlaşmamış gametler nükleer ve sitoplazmikolgunlaşma6 geçmesi için çevreleyen kümülüs hücrelerinin desteğine güveniyor , ve bu nedenle tüm kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) cryopreserved vardır. Ancak, kümülüs hücrelerinin kaybı ve/veya gamet ve çevresindeki somatik hücreler arasındaki fonksiyonel bağlantının kaybı muhtemelen olgunlaşmamış COC'lerin kriyopreservation en zararlı etkisidir.
Kriyopreservation teknikleri arasında vitrifikasyon alan koşullarında daha kolay uygulanabilen bir tekniktir. Yavaş (veya kontrollü hız) dondurma ile karşılaştırıldığında, vitrifikasyon daha hızlıdır ve programlanabilir bir dondurucu gibi belirli ekipmanlar gerektirmez. Vitrifikasyonun üç temel prensibini (yani yüksek viskozite, yüksek kriyoprotektif konsantrasyon, küçük hacimler ve ultra hızlı sıcaklık düşüşüne bağlı) karşılamak için, özellikle olgunlaşmamış ve olgun yumurtalar için kedilerde çeşitli ortam ve destekler geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Basit pipetler7ile başlayarak, cihazlar daha sonra "Minimum hacim" hedefine ulaşmak için geliştirilmiştir. Cryoloop8, açık çekti pipetler (OPS)9, plastik oluklar (modifiye saman)10 ve kriyotüpler11 kullanılmıştır, kadar daha verimli bir cihaz (yani, Cryotop) istihdam edildi11, hayatta kalma ve kızamık devamı iyileştirilmesi. Cryotop (Ek Şekil 1) vitrifikasyon için seçmeli açık sistem haline gelmiştir ticari olarak kullanılabilir bir destektir. İnsan yumurtaları ve embriyoların vitrifikasyon için geliştirilen, bu depolama sırasında plastik bir tüp kapağı ile korunan sert bir plastik tutucu bağlı küçük bir film şerit oluşur12. Kullanılabilirliği ve vitrifikasyon hacmindeki aşırı azalma (0,1 μL gibi az), aynı zamanda son derece hızlı soğutma ve ısınma oranlarıyol açar, bu vitrifikasyon desteği giderek çeşitli medya13,,14,15,16,17ile kullanılmıştır yerli kedi de dahil olmak üzere çeşitli türler, uygulanmıştır .
Bu makalenin amacı, insan yumurtaları için başlangıçta geliştirilen, minimum hacimli vitrifikasyon için laboratuvar yapımı medya ve ticari destekler kullanan ve olgunlaşmamış kedi COC'larının kriyopreservation için saha koşullarında kolayca uygulanabilen küçük değişikliklerle bir koleksiyon-vitrifikasyon-ısınma protokolünü tanımlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu vesileyle yapılan işlemler, kedi yumurtalıkları veteriner kliniklerinde sahibinin istediği rutin ovariektomi veya ovariohysterektomiden elde edilen ürünler olarak toplandığı için etik onaya tabi tutulmadı.
1. Yumurta toplama
- Deneylere başlamadan önce, yumurtalık ve yumurta toplama için çözümler hazırlayın. Antibiyotik ve antimikotikkarışımı (100 IU/mL penisilin G sodyum, 0.1 mg/mL streptomisin sülfat, 0.25 μg/mL amphotericin B) karışımı ile fosfat tamponlu salin (PBS) ile yumurtalık toplama çözeltisi hazırlayın. 100 IU/mL penisilin G sodyum, 0.1 mg/mL streptomisin sülfat ve %0.1 (w/v) polivinil alkol (PVA) ile PBS ile oosit toplama çözeltisi (yani PBS/PVA) hazırlayın.
- Yumurtalık ve yumurta toplama için çözümleri kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
- Vezirlerin ödeme gününde, numuneleri işlemeden birkaç saat önce, yumurtalık ve yumurta toplama solüsyonlarının bir parçası olun ve oda sıcaklığında (RT; 25 ± 2 °C) ısınmalarına izin verin.
- Örnekler laboratuvara geldiğinde, yumurtalıkları çevredeki bağ dokusundan ve oviduct'ten izole edin ve petri kabında taze yumurtalık toplama ortamında yıkayın.
- Her kraliçe için yaklaşık 3 mL RT PBS/PVA ile bir adet 35 mm Petri kabı doldurun ve yumurtaları toplamak için bir çanak daha doldurun.
- Bir Petri kabına bir çift yumurtalık yerleştirin ve bir cerrahi neşter ile korteks kıyma. Tüm foliküllerin stereomikroskop (büyütme 8x) yardımıyla kırıldığından emin olun.
- Bir pipet ile COCs toplamak ve ayrılan Petri çanak taze PBS / PVA onları taşımak. Homojen, koyu sitoplazmalı ve birkaç kompakt küulus hücresi katmanı ile çevrili iyi nitelikler ekolleri seçin (Grade I18).
2. Vitrifikasyon
- Denge ve vitrifikasyon ortamını hazırlayın.
- Orta 199 yılında %7,5 (v/v) etilen glikol (EG) ve %7,5 (v/v) dimethylsulphoxide (DMSO) ile %20 fetal sığır serumu (FBS) ile denge çözeltisi (ES) hazırlayın.
- %15 (v/v) EG, %15 (v/v) DMSO ve Orta 199'da 0,5 M sakaroz ile %20 FBS (19'danmodifiye) ile vitrifikasyon solüsyonu (VS) hazırlayın.
- Es ve VS'nin kullanmadan önce RT'de ısınmasına izin verin.
NOT: Kriyoprotekterlerin (örneğin, EG, DMSO) sitotoksik olduğu bilinmektedir. Onların toksisite karşı bir strateji hangi hücrelerin onlara maruz olduğu sıcaklığı azaltmaktır20, ve yumurtalar genellikle RT kriyoprotektörler maruz kıtatüran. Böylece, sıcaklık dalgalanmalarını önlemek için bu protokolde yumurta toplamadan vitrifikasyona kadar tüm prosedür RT'de gerçekleştirilir.
- Vitrifikasyon kabını (örneğin, "Repro plakası" olarak bilinen iki sıraya bölünmüş altı konik kuyudan oluşan özel bir yemek) hazırlayın. Her vitrifikasyon desteği için bir satır (üç kuyu) hazırlayın.
- İlk kuyunun altına 20°L ES ekleyin.
- İkinci (yani, 1VS) ve üçüncü (yani, 2VS) kuyuların altına 300 μL VS ekleyin.
- ES'deki COC'ları dengeleyin.
- Küçük delikli bir pipetle (örn. bir Pasteur pipeti daha ince yapmak için Bunsen gagasına çekilir – çapı en az 200 μm olmalıdır), ilk kuyunun alt kısmında bir (veya daha fazla) COC(lar) aktarın.
NOT: Pipetin boyutunu, her adımda COC'lerle aktarılan ortam hacmini mümkün olduğunca azaltmayı amaçlayan, oositleri çevreleyen kümülüs hücrelerinin katman sayısına göre seçin. Mevcut protokol ile, eğitimli operatörler her vitrifikasyon desteği başına en fazla sekiz kedi COC'u başarıyla vitrifiye edebilirler. - Yavaşça damla sınırında ES 20 μL ekleyin. 3 dakika bekleyin.
- Yavaşça damla sınırında ES diğer 20 μL ekleyin. 3 dakika bekleyin.
- Yavaşça damla sınırında ES 240 μL ekleyin. 9 dakika bekleyin.
- Beklerken, sıvı nitrojen (LN2)içeren bir kutu hazırlayın, deney/kedi tanımlama koduyla vitrifikasyon desteği etiketleyin ve açık bırakın. Her ikisini de stereomikroskobun yakınına koyun, böylece çalışırken kolayca ulaşılabilir ler.
Dikkat! LN2'yikullanırken kişisel koruyucu ekipman takın. - Alternatif olarak, birkaç COVitrifiye olması gerekiyorsa, başka bir COC grubu için (yeni bir vitrifikasyon desteğine yüklenecek olan adım 2.3.1 - 2.3.2'ye bakınız) ilk dengeleme adımına başlayabilirsiniz.
- Küçük delikli bir pipetle (örn. bir Pasteur pipeti daha ince yapmak için Bunsen gagasına çekilir – çapı en az 200 μm olmalıdır), ilk kuyunun alt kısmında bir (veya daha fazla) COC(lar) aktarın.
- 90 saniyeden daha kısa bir sürede VS'deki COC'ları vitrifiy.
- Aynı küçük delikli pipeti kullanarak, 1VS ile doldurun, ilk kuyunun (ES) altındaki COC'ları alın ve ikinci kuyunun (1VS) yüzeyine taşıyın.
- Pipeti 1VS ile yıkayın.
- COCs alın ve başka bir alanda (alt) kuyunun taşıyın; pipet ile çevreleyen orta karıştırın.
- Pipeti kuyunun başka bir alanında 1VS ile doldurun, COC'leri alın, taşıyın ve çevredeki ortamı pipetle karıştırın.
- Adımı tekrarlayın 2.4.4.
- Pipeti 2VS ile yıkayın.
- COC'ları alın ve üçüncü kuyunun (2VS) altına taşıyın; pipet ile çevreleyen orta karıştırın.
- Pipeti kuyunun başka bir alanında 2VS ile doldurun, COC'leri alın, taşıyın ve çevredeki ortamı pipetle karıştırın.
- Adımı tekrarlayın 2.4.8.
- Pipeti kuyunun başka bir alanında 2VS ile doldurun, COC'ları alın ve vitrifikasyon desteğinin şeridine mümkün olduğunca ucuna yakın yükleyin. VS hacmini mümkün olduğunca azaltmak için aşırı ortamı aspire edin.
- Hemen LN2vitrifikasyon desteği dalma , hareket ettirin. Bazı kelepçeler yardımıyla kapatın, her zaman LN2'yedaldırılmış olarak kaldığından emin olun.
NOT: Kriyoprotektif hücre toksisitesi nedeniyle doğru zamanlamayı tutmak çok önemlidir. Vitrifikasyon ortamlarında yüksek konsantrasyon nedeniyle, hücre maruziyeti kontrol edilmelidir, ayrıca tekniğin kusursuz yürütülmesi ile21. Numuneler bolise, bunları daha hızlı işlemek için bölmeyi düşünün ve yumurta koleksiyonundan vitrifikasyona kadar olan süreyi en aza indirin.
- Yüklü vitrifikasyon desteklerini bir kadehte saklayın ve ısınmaya kadar bir depolama LN2 tankında saklayın.
NOT: LN2 varsa, protokolün önceki tüm adımları alan koşullarında da uygulanabilir. Numuneleri güvenli bir şekilde laboratuvara taşımak ve aşağıdaki aşamalarla devam etmek için kuru bir gönderic gerekli olacaktır.
3. Isınma
- Isınma ortamı hazırlayın.
- Orta 199 yılında 1 M sakaroz ile %20 FBS ile eritme çözeltisi (TS) hazırlayın.
- Orta 199 yılında 0,5 M sakaroz ile seyreltme çözeltisi (DS) hazırlayın, % 20 FBS ile.
- %20 FBS ile Orta 199 ile yıkama çözeltisi (WS) hazırlayın.
- Kullanmadan önce TS'yi 38 °C'ye, DS ve WS'yi RT'de ısıtın.
- Gerekirse, ısıtılmış COC'ların sonraki kullanımına (örn. in vitro maturasyon, IVM) kültür ortamı nı hazırlayın.
- Isıtma aşamasını stereomikroskoba yakın yerleştirin ve açın (38 °C). Isınmak için petri kabının kapağını koyun.
- Her şey hazır olduğunda, depolama tankından ısıtılması gereken vitrifikasyon desteklerini LN2içeren bir kutuya aktarın ve kutuyu stereomikroskobun yakınına koyun.
- "Repro plakasını" hazırlayın. Isınması gereken her vitrifikasyon desteği için bir satır hazırlayın.
- İlk kuyunun altına 300 μL DS ekleyin.
- İkinci kuyunun altına (yani 1WS) ve üçüncü (2WS) kuyuların altına 300 μL WS ekleyin.
- Petri kabının kapağına bir damla TS (100 μL) yapın.
- Kelepçeler ile LN2'debir vitrifikasyon desteği açın.
- Stereomikroskop altında TS damla koyun ve hızlı bir hareketle LN2 vitrifikasyon desteği almak ve damla onun şerit batırın, tüm COCs kopmak kadar hareket. Boşalır boş almaz desteği damladan çıkarın, ancak CoC'leri toplamda 1 dakika ts olarak bırakın (aşağıdaki adıma kadar daldırmadan).
- Vitrifikasyon için kullanılan benzer bir pipet alın ve DS ile doldurun. Damla (TS) den COCs alın ve ilk kuyu (DS) altına taşıyın. 3 dakika bekleyin.
- Pipeti 1WS ile yıkayın. COC'ları alın ve ikinci kuyunun (1WS) altına taşıyın. 5 dakika bekleyin.
- Pipeti 2WS ile yıkayın. COC'leri alın ve üçüncü kuyunun (2WS) yüzeyinde taşıyın. Kuyunun dibine dokunmalarını bekle.
- Kuyunun başka bir alanını kullanarak adım 3.11'i tekrarlayın.
- Pipetleri kültür ortamıyla yıkayın ve yumurtaları aşağıdaki kullanım için kültür yemeğine taşıyın (örn. IVM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mevcut protokole göre kedi yumurtası vitrifikasyonve ısınmasını takiben(Şekil 1 ve Ek Şekil 1),gametlerin büyük çoğunluğu hayatta kalır. Vitrifikasyon sonrası, diğer tekniklerin yanı sıra, canlılık optik mikroskopta morfolojik bütünlük22 veya hayati lekelerin kullanımı ile değerlendirilebilir. İkincisi floresan diasetat / propidium iyodür (FDA / PI), hangi canlı (parlak yeşil floresan) ve ölü hücrelerin (kırmızı floresan) belirlenmesini sağlar. Şekil 2, ısınmadan hemen sonra FDA/PI ile boyanmış vitrifiye ısıtılmış kedi COC'larının temsili bir resmini gösterir. Vitrifikasyon sonrası sağkalım yüzdesini gösteren deneylerden elde edilen veriler Tablo 1'derapor edilmiştir , in vitro matürasyon için tasarlanan yumurtaların ısınma sonrası verilerini gösteren17 veya in vitro embriyo üretimi16. Genel olarak, burada örnek olarak kullanılan iki deneyde 435 oositin16,17, 395'i hayatta kaldı ve %90.8'lik Bir ısınma sonrası canlılık elde etti.
Ancak, ısınma dan sonra bazı morfolojik değişiklikler fark edilebilir (Şekil 3). Bu protokole göre vitrifiye-ısınmış gametlerde en sık görülen morfolojik anormallikler ooplazm şekli ve granülasyon değişiklikleri, kümülüs hücrelerinin kısmi (veya nadiren toplam) kaybı ve (nadiren) zona pellucida kırıklarıdır. Öte yandan, aynı destek ile minimum hacim vitrifikasyon önceki çalışmalarda bildirildiği gibi, bu vitrifiye COCs olgunolabilir 17 ve embriyolar in vitro16içine geliştirmek , taze COCs daha düşük oranlarda bile. Buna ek olarak, genellikle zona pellucida sertleşme mevcut değil (kriyopreservation başka bir iyi bilinen sonucudur), in vitro fertilizasyon beri (IVF) başarılı16.
Şekil 1: Oosit vitrifikasyon-ısınma protokolünün şematik tasviri.
Tam endikasyonlar için lütfen el yazması metne bakın. COCs= kümülüs-oosit kompleksleri; ES=denge çözeltisi; VS=vitrifikasyon çözeltisi; TS=çözülme çözeltisi; DS=seyreltme çözeltisi; WS=yıkama çözeltisi; LN2=sıvı nitrojen. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Isındıktan sonra vitrifiye kedi yumurtalarının canlılığı.
Floresan diasetat/propidium iyodür (FDA/PI) ile boyanmış vitrifiye kümülüs-oosit kompleksleri, canlı olduğunda(A) veya ölüyken kırmızı veya zayıf floresans(B)yeşil floresan gösterir. Uyarma/emisyon dalga boyları: FDA için 495 nm/517 nm; PI için 538 nm/617 nm. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Taze ve vitrifiye kedi yumurtalarının ışık mikrografları.
(A) Toplanmadan sonra taze kümülüs kompleksleri, vitrifikasyon öncesi. (B) Isındıktan sonra vitrifiye kümülüs-oosit kompleksleri, bazı vitrifikasyon kaynaklı yaralanmalar (şekil değişiklikleri ve kümülüs hücrelerinin kaybı, siyah ok) gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Deney | Grup | Isıtılmış oositler (n) | Canlı oositler (n) | Canlılık (%) | Canlılık (ortalama % ± SD) |
| 1† | 1 | 13 | 12 | 92.31 | 91,54 ± 3,66 |
| 2 | 47 | 44 | 93.62 | ||
| 3 | 52 | 45 | 86.54 | ||
| 4 | 26 | 24 | 92.31 | ||
| 5 | 41 | 40 | 97.56 | ||
| 6 | 21 | 19 | 90.48 | ||
| 7 | 50 | 44 | 88.00 | ||
| 2‡ | 1 | 17 | 17 | 100.00 | 91,51 ± 9,16 |
| 2 | 17 | 17 | 100.00 | ||
| 3 | 9 | 8 | 88.89 | ||
| 4 | 21 | 21 | 100.00 | ||
| 5 | 30 | 23 | 76.67 | ||
| 6 | 26 | 23 | 88.46 | ||
| 7 | 17 | 13 | 76.47 | ||
| 8 | 10 | 10 | 100.00 | ||
| 9 | 15 | 14 | 93.33 | ||
| 10 | 23 | 21 | 91.30 |
Tablo 1: Tüp bebek-ısıtılmış yumurtalarda canlılığın temsili sonuçları. 201916 ve • Colombo ve ark. 202017'den alınan veriler .
Ek Şekil 1: Yumurta vitrifikasyonu için kullanılan desteklerin temsili resmi. Ticari destek 13 cm ölçüleri ve kullanımı ve saksı kolaydır. Yumurtalar, cihazın üst kısmındaki ince plastik şerit üzerine, ucuna yakın siyah izlenmeye mümkün olduğunca yakın olarak yüklenmesi gerekir. Telif Hakkı: Kitazato Corporation. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oosit kriyoprezervasyon felidae ailesi gibi birçok türün nesli tükenmekte olan taksonlarda özellikle önemli bir germplazm koruma tekniğidir. Bu yazıda, olgunlaşmamış kedi yumurtalarının vitrifikasyonu için basit ve alan dostu bir protokol sunulmuştur. Laboratuvar yapımı ortam, minimum hacim vitrifikasyon destekleri ve eğitimli personel, bu yöntemin başarısı için önemli faktörlerdir, bu da temsili sonuçlarda gösterildiği gibi sürekli ve sürekli olarak canlı yumurtaların elde edilmesine olanak sağlar.
Medya hazırlığından başlayarak, en iyi sonuçları elde etmek için protokolün doğru bir şekilde izlenmesi gerekir, ancak en önemli konu operatörün becerileridir. Ortam vitrifikasyon işleminin aynı günü hazırlanmalı veya mümkün değilse bir gün önce hazırlanmalı ve 4 °C'de saklanmalıdır. Her durumda, numune işlemeden önce, çözeltilerin RT. Oosit koleksiyonuna ısınmasını sağlamak için yeterli zaman bırakılmalıdır ve COC seçimi her ART laboratuvarı tarafından rutin olarak gerçekleştirilen hızlı ve basit işlemlerdir. Ancak, kriyopreservation en hassas prosedürdür. Isınma prosedürü çok kritik olmasa da, protokol ve zamanlamaları takip edilirse, vitrifikasyon daha karmaşık olabilir. Sadece zamanlamalara göre dikkat edilmesi gereken dengeden sonra, en zorlu aşama vitrifikasyon adımı olacaktır (bkz. mevcut protokolün 2.4. ). Gerçekten de, yumurta transferleri ve pipet yıkamaiyi zamanlanmış olması gerekir ve, hep birlikte, az 90 saniye içinde gerçekleştirilir. Yeni başlayanlar için, eğitim sırasında bir kronometre ile zaman tavsiye edilir, aynı zamanda eğitimli bireyler için bir zamanlayıcı zaman kadar çalışıyor bir uyarı olarak 60 saniye sonra bip leme için yararlı olabilir. Buna ek olarak, 6-8 COC'luk grupları vitrifiye eden operatörler, alarm çaldığında yumurtaların ikinciden üçüncü kuyuya aktarılmasına yakın olmalıdır (mevcut protokolün 2.4.7. adımına bakınız) daha yüksek bir standardizasyona olanak sağlayacaktır. Umarım, bu makalenin yardımıyla, bireyler arasında ve laboratuvarlar arasında daha yüksek bir standardizasyon elde edilebilir.
Protokolün en önemli sınırlamaları kriyopreservation prosedürlerinin içsel özellikleri olarak kalır. Daha önce de belirtildiği gibi, vitrifikasyon, yumurtaları kusursuz bir şekilde yapılsa bile fizyolojik olmayan ve potansiyel olarak zarar verici durumlara maruz bırakır. Kriyoprotektifler ile kuluçka ve sıcaklık düşüşü en kritik olaylardır 20 ve sıkı kontrol altında tutulması gerekir. En yaygın kriyoyaralanmalar arasında, bazıları optik mikroskopta kolayca gözlemlenebilir (örneğin, kümülüs hücre kaybı, hücresel şekil ve boyut değişikliği), diğerleri görünür değildir ve genellikle hücre altı yapıları etkiler (örneğin, zona pellucida sertleştirme, oksidatif stres, sitoiskelet hasarları, meiotik mil ve DNA değişiklikleri)23,24. Çoğunlukla uygulanabilir olmasına rağmen, bu protokole uygun olarak vitrifiye COC'lar genellikle ısınma dan sonra bazı belirgin morfolojik anomaliler sunarlar. Ancak, morfoloji ve canlılık arasında bir korelasyon yoktur, hangi da subsellüler hasarlar nedeniyle engel olabilir3,25, ama morfolojik değişiklikler kriyoyaralanmaların bir sonucu ve kısmen vitrifiye yumurtaların in vitro gelişimsel sonuçları için bir neden, hangi taze oositler ile karşılaştırıldığında oldukça kötü. Vitrifikasyon ortamının dikkatli hazırlanması ve protokol zamanlamasının kesin gözlemi iyi ısınma sonrası canlılık ve morfolojik bütünlük elde etmek için katkıda, ancak yumurta ve embriyo gelişimi daha fazla in vitro olgunlaşma iyileştirmeler hala gereklidir, canlılık genellikle aşağıdaki kültür sırasında azalır beri16.
Soğuk kaynaklı yaralanmalar ne yazık ki her kriyopreservation yöntemi24ile oluşur. Bu protokolde kullanılan minimum hacimli vitrifikasyon desteği, diğer kriyopreservation cihazlara göre (-23.000 °C/dakika ve 42.000 °C/dakika, üretici spesifikasyonlarına göre) daha iyi soğutma ve ısınma oranları ile sonuçlanan vitrifikasyon hacmini mümkün olduğunca azaltmak için geliştirilmiştir. Sonuç olarak, insan tıbbında, hem in vitro (yani döllenme ve embriyo gelişimi) hem de in vivo parametreleri (yani gebelik oranları ve canlı doğumlar) değerlendirilen klinik çalışmaların mevcut olduğu durumlarda, minimum hacimli vitrifikasyon, ısınma sonrası sağkalım açısından eşsiz sonuçları ve son olarak canlıdoğumlar 12 vitrifiye olgun insan oositi açısından yumurta kriyopreservation için en yaygın seçimdir. Buna ek olarak, diğer vitrifikasyon cihazları ile karşılaştırıldığında, bu protokolde kullanılan bir kullanımı daha kolay ve saklamak için daha güvenli12, bu işlemek için rahat ve depolama sırasında bir kapak tarafından korunmaktadır beri. Örneğin, Cryoloop da minimum hacim hedefine ulaşmak için etkili bir destek, ama yapısı (bir döngü hangi oositler yüklenir çözüm bir film destekleyen) kırılgan ve kazara ısınma eğilimli12. Pipetler (0,25 mL hacim) veya açık çekilmiş pipetler (OPS) de kullanılabilir, ancak vitrifikasyon hacminde önemli bir azalmaya izin vermezler ve bazı yumurtalar26kaybolabileceğinden, doldurmaları ve boşaltmaları da zordur. Diğer birçok destekler 2geliştirilmiştir,ancak her biri kendi dezavantajları vardır. Bunun yerine, daha önce en çok kullanılan kriyopreservation tekniği olan yavaş donma ile karşılaştırıldığında, ticari desteklerde minimum hacimli vitrifikasyonun başlıca avantajları fizibilite ve hızdır. Daha önce de belirtildiği gibi, vitrifikasyon gerçekleştirilecek programlanabilir bir dondurucu gerektirmez, ve yumurtaların yavaş donma25sonuçlanması yaklaşık bir saat ve yarım sürer iken, vitrifikasyon mevcut protokolü takip yaklaşık 17 dakika içinde gerçekleştirilebilir.
Sonuç olarak, personel becerileri ve operatörler arası standardizasyon vitrifiye oosit banka başlatırken en zorlu gereksinimleri olabilir, ancak personel eğitimi ile elde edilecektir. Kedi olgunlaşmamış yumurtalar için bu minimum hacim vitrifikasyon protokolü, deneyimli operatörler tarafından yapıldığında tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar verir. Ancak, ısınma sonrası canlılık ve bütünlük tatmin edici olsa bile, yumurta gelişim oranlarında iyileşme şansı hala vardır. Daha fazla optimizasyon ile, mevcut protokol de yabani felids için alan koşullarında uygulanabilir, hangi oosit kriyoppreservation ile ilgili yayınlanan veri hala kıt27. Bu yöntemin uygulanmasının genişletilmesi sadece kriyopreservation protokolleri geliştirmek için olasılığını artırmak değil, aynı zamanda felids doğurganlık ve biyolojik çeşitliliğin korunması için vitrifiye oosit biyobankaların kurulmasına olanak sağlayacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen EVSSAR (Avrupa Küçük Hayvan Üreme Derneği) Grant 2016 ve Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Dr. MariaGiorgia Morselli'ye burada betimlenen deneylere ve görüntü edinimine olan katkıları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
