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Developmental Biology

अपरिपक्व फेलिन ओसाइट्स का न्यूनतम वॉल्यूम विट्रीफिकेशन

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61523
Automatic Translation
1, 1
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

Summary

यह पांडुलिपि वाणिज्यिक समर्थन पर प्रयोगशाला निर्मित मीडिया के साथ अपरिपक्व बिल्ली ओसाइट्स के न्यूनतम मात्रा विट्रीफिकेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। यह पूर्व वीवो गोनाड से vitrification और वार्मिंग के लिए oocyte अलगाव से हर कदम को शामिल किया गया ।

Abstract

जंगली जानवरों के संरक्षण कार्यक्रमों में, गेमे बैंकिंग मूल्यवान व्यक्तियों और दुर्लभ प्रजातियों के आनुवंशिक संसाधनों की रक्षा और जैव विविधता संरक्षण को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण है । फेलिड्स में, अधिकांश प्रजातियों को विलुप्त होने की धमकी दी जाती है, और घरेलू नस्लों का उपयोग जर्मप्लाज्म बैंकिंग के लिए प्रोटोकॉल की दक्षता बढ़ाने के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है। ओसाइट क्रायोप्रिजर्वेशन तकनीकों में, विट्रीफिकेशन मानव और पशु चिकित्सा सहायता प्राप्त प्रजनन में अधिक से अधिक लोकप्रिय है। क्रायोटॉप विट्रीफिकेशन, जो पहले मानव ओसाइट्स और भ्रूण के लिए विकसित किया गया था, ने बिल्ली ओसाइट्स के लिए अच्छी तरह से अनुकूल होने का प्रदर्शन किया है। यह विधि कई फायदे प्रदान करती है, जैसे कि क्षेत्र की स्थिति में व्यवहार्यता और प्रक्रिया की गति, जो कई नमूनों को संसाधित करने की आवश्यकता होने पर सहायक हो सकती है। हालांकि, दक्षता दृढ़ता से ऑपरेटर के कौशल पर निर्भर है, और अंतर और अंतर प्रयोगशाला मानकीकरण की जरूरत है, साथ ही कार्मिक प्रशिक्षण । यह प्रोटोकॉल ओसाइट संग्रह से वार्मिंग तक, कदम क्षेत्र के अनुकूल प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम में एक वाणिज्यिक समर्थन पर अपरिपक्व बिल्ली के समान ओसाइट्स के न्यूनतम मात्रा विट्रीफिकेशन का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल के बाद, वार्मिंग में ओसाइट अखंडता और व्यवहार्यता का संरक्षण (90% जितना अधिक) उम्मीद की जा सकती है, हालांकि अभी भी वार्मिंग के बाद परिपक्वता और भ्रूणीय विकास परिणामों में सुधार की गुंजाइश है।

Introduction

क्रायोप्रिजर्वेशन असिस्टेड प्रजनन तकनीकों (एआरटी) का एक महत्वपूर्ण कदम बन गया है। मनुष्यों में, यह चिकित्सा या व्यक्तिगत कारणों के लिए प्रजनन क्षमता या पितृत्व के स्थगन के संरक्षण की अनुमति देता है । जानवरों में, विशेष रूप से खेत जानवरों और पालतू जानवरों में, या विशेष रूप से जंगली लुप्तप्राय प्रजातियों में, नियोजित संभोग में दूरी और समय को दूर करना आवश्यक है। जब पैदा होने वाले व्यक्तियों को अभी तक नहीं चुना गया है या भ्रूण ठंड से जुड़े नैतिक मुद्दों से बचने के लिए, विशेष रूप से मानव चिकित्सा1में, गेमटे क्रायोप्रिजर्वेशन सबसे अच्छा विकल्प है। शुक्राणुओं को संरक्षित करना और विगलन के बाद संतोषजनक परिणाम देना अपेक्षाकृत आसान है, लेकिन उनकी संरचनात्मक विशेषताओं के कारण ओसाइट्स, स्टोर करने के लिए अधिक जटिल हो सकते हैं। दरअसल, कम सतह/मात्रा अनुपात, साथ ही ऊप्लाज्मा के आसपास जोना पेलुसिडा की उपस्थिति, कोशिका2में क्रायोप्रोटेक्टेंट और पानी के आंदोलन को सीमित करती है । इसके अलावा, फेलिड सहित घरेलू जानवरों में, उन्हें लिपिड-समृद्ध साइटोप्लाज्म की विशेषता है, जिसे उन्हें क्रायोप्रिजर्वेशन 3 के प्रति अधिक संवेदनशील बनाने के लिए सोचाजाताहै।

अधिकांश फेलिड्स को धमकी दी जाती है, और घरेलू बिल्ली का उपयोग नियमित ओवेरेक्टॉमी से गोनाड की उपलब्धता के लिए जर्मप्लाज्म संरक्षण के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है। जंगली जानवरों में, गोनाड को वैकल्पिक सर्जरी या (अधिक बार) पोस्टमार्टमके बाद प्राप्त किया जा सकता है, और अपरिपक्व (अंकुरित वेसिकल) गेमेस को वापस लाया जा सकता है। हार्मोनल उत्तेजना परिपक्व (मेटाफेज द्वितीय) oocytes प्राप्त करने के उद्देश्य से मानव ARTs में के रूप में के रूप में आम नहीं है क्योंकि नैतिक मुद्दों और प्रजातियों के-और उपचार के लिए व्यक्तिगत विशिष्ट प्रतिक्रिया4।

इसलिए, क्रायोप्रिजर्वेशन रणनीतियों के विकास ने अपरिपक्व गेम्स पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसे आमतौर पर दुर्लभ व्यक्तियों की अप्रत्याशित या अचानक मृत्यु के बाद वापस लाया जा सकता है। जैविक दृष्टिकोण से, अपरिपक्व या परिपक्व गेम के क्रायोप्रिजर्वेशन में कुछ अंतर हैं, प्रत्येक के फायदे हैं। सबसे पहले, डीएनए अपरिपक्व ओसाइट्स में अधिक संरक्षित है, जिसके अंकुरित वेसिकल में परमाणु झिल्ली से घिरे गुणसूत्र होते हैं, जबकि मेटाफेज II ओसाइट्स का मेयोटिक धुरी क्रायोनिंज5के लिए अधिक असुरक्षित हो सकता है। दूसरे, ठंड से प्रेरित साइटोस्केलेटन नुकसान धुरी रोटेशन, ध्रुवीय शरीर के निष्कासन, प्रोन्यूक्लियर माइग्रेशन और साइटोकिन्सिस को प्रभावित कर सकता है, जिसका ओसाइट विकास चरण के अनुसार अलग-अलग प्रभाव हो सकते हैं, जो मेयोसिस प्रगति या निषेचन के बाद की घटनाओं को प्रभावित करते हैं। अंत में, और शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, जबकि परिपक्व ओसाइट्स निषेचित होने के लिए तैयार हैं, अपरिपक्व गेम परमाणु और साइटोप्लाज्मिक परिपक्वता6के माध्यम से जाने के लिए आसपास के क्यूमुलस कोशिकाओं के समर्थन पर भरोसा करते हैं, और यही कारण है कि पूरे क्यूमुलस-ओसाइट कॉम्प्लेक्स (सीओसी) क्रायोप्रीयरेयव हैं। हालांकि, क्यूमुलस कोशिकाओं का नुकसान और/या गेम्टे और आसपास के दैहिक कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक संबंध का नुकसान शायद अपरिपक्व COCs के क्रायोप्रिजर्वेशन का सबसे हानिकारक प्रभाव है ।

क्रायोप्रिजर्वेशन तकनीकों में, विट्रीफिकेशन एक है जिसे क्षेत्र की स्थितियों में अधिक आसानी से लागू किया जा सकता है। धीमी गति से (या नियंत्रित दर) ठंड की तुलना में, विट्रीफिकेशन तेज है और इसके लिए विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, जैसे कि प्रोग्रामेबल फ्रीजर। विट्रीफिकेशन के तीन मौलिक सिद्धांतों (यानी उच्च चिपचिपाहट, उच्च क्रायोप्रोटेक्टिव एकाग्रता, छोटी मात्रा और अल्ट्रा-रैपिड तापमान में कमी से जुड़े) को संतुष्ट करने के लिए, कई मीडिया और समर्थन विशेष रूप से विकसित किए गए हैं और बिल्लियों में अपरिपक्व और परिपक्व ओसाइट्स दोनों के लिए उपयोग किए जाते हैं। सरल तिनके7के साथ शुरुआत, उपकरणों तो "न्यूनतम मात्रा" लक्ष्य तक पहुंचने के लिए विकसित किया गया । क्रायोलोप8,ओपन खींचा तिनके (ऑप्स)9,प्लास्टिक गटर (संशोधित स्ट्रॉ)10 और क्रायोट्यूब11 का उपयोग किया गया है, जब तक कि एक अधिक कुशल डिवाइस (यानी, क्रायोटॉप)11 नियोजितनहीं किया गया था, अस्तित्व और मेयोसिस बहाली में सुधार। क्रायोटॉप(पूरक चित्रा 1)एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समर्थन है जो विट्रीफिकेशन के लिए वैकल्पिक खुली प्रणाली बन गया है। मानव ओसाइट्स और भ्रूण के विट्रीफिकेशन के लिए विकसित, इसमें एक छोटी सी फिल्म पट्टी होती है जो एक कठोर प्लास्टिक धारक से जुड़ी होती है, जो भंडारण12के दौरान प्लास्टिक ट्यूब कैप द्वारा संरक्षित होती है। इसकी उपयोगिता और विट्रीफिकेशन वॉल्यूम (0.1 माइक्रोन) में अत्यधिक कमी के लिए धन्यवाद, जो बेहद तेजी से ठंडा और वार्मिंग दरों की ओर भी जाता है, यह विट्रीफिकेशन समर्थन घरेलू बिल्ली सहित कई प्रजातियों में तेजी से लागू किया गया है, जिसमें इसका उपयोग विभिन्न प्रकार,के मीडिया13,14, 15,,15,16,17के साथ किया गया है।,

इस पांडुलिपि का उद्देश्य एक संग्रह-विट्रीफिकेशन-वार्मिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करना है, जिसमें मूल रूप से मानव ओसाइट्स के लिए विकसित एक से मामूली संशोधन किए गए हैं, जो न्यूनतम मात्रा विट्रीफिकेशन के लिए प्रयोगशाला-निर्मित मीडिया और वाणिज्यिक समर्थन को नियोजित करते हैं और इमामाचर फेलिन्स के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए क्षेत्र की स्थितियों में आसानी से लागू किया जा सकता है।

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Protocol

इसके द्वारा चित्रित प्रक्रियाओं को नैतिक अनुमोदन से गुजरना नहीं पड़ा क्योंकि बिल्ली अंडाशय पशु चिकित्सा क्लीनिकों में मालिक-अनुरोधित नियमित ओवेरेक्टॉमी या ओवेरिओमायस्टेक्टर से प्रतिउत्पादों के रूप में एकत्र किए गए थे।

1. ऊसाइट संग्रह

  1. प्रयोग शुरू करने से पहले, अंडाशय और ओसाइट संग्रह के लिए समाधान तैयार करें। एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीमाइकोटिक्स (100 आईयू/एमएल ऑफ पेनिसिलिन जी सोडियम, स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट के 0.1 मिलीग्राम/एमएल, 0.25 माइक्रोग्राम/एम एलएल ऑफ एम्फोटेट्रिकिन बी) के मिश्रण के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ अंडाशय संग्रह समाधान तैयार करें। 100 आईयू/एमएल पेनिसिलिन जी सोडियम, 01 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट और 01% (डब्ल्यू/वी) पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) के साथ पीबीएस के साथ ओसाइट कलेक्शन सॉल्यूशन (यानी पीबीएस/पीवीए) तैयार करें।
  2. उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंडाशय और ओसाइट संग्रह के लिए समाधान स्टोर करें।
  3. नमूनों को संसाधित करने से कुछ घंटे पहले क्वींस के स्पेइंग के दिन, अंडाशय और ओसाइट संग्रह समाधानों का हिस्सा लें और उन्हें कमरे के तापमान (आरटी; 25 ± 2 डिग्री सेल्सियस) पर गर्म होने दें।
  4. जब नमूने प्रयोगशाला में पहुंचते हैं, तो अंडाशय को आसपास के संयोजी ऊतक से और अंडाशय से अलग करें और उन्हें पेट्री डिश में ताजा अंडाशय संग्रह माध्यम में धोएं।
  5. आरटी PBS/PVA के बारे में 3 एमएल के साथ प्रत्येक रानी के लिए एक ३५ मिमी पेट्री पकवान भरें, और एक और पकवान oocytes इकट्ठा करने के लिए ।
  6. एक पेट्री डिश में अंडाशय की एक जोड़ी रखें और कॉर्टेक्स को सर्जिकल स्केलपेल के साथ कीमा करें। सुनिश्चित करें कि सभी रोम एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (आवर्धन 8x) की मदद से टूट गए हैं।
  7. एक पिपेट के साथ COCs ले लीजिए और आवंटित पेट्री डिश में उन्हें ताजा पीबीएस/पीवीए में ले जाएं । एक समरूप, अंधेरे साइटोप्लाज्म के साथ अच्छे गुणों कोसी का चयन करें और क्यूमुलस कोशिकाओं (ग्रेड I18)की कई कॉम्पैक्ट परतों से घिरा हुआ है।

2. विट्रीफिकेशन

  1. संतुलन और विट्रीफिकेशन मीडिया तैयार करें।
    1. 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ मध्यम 199 में 7.5% (v/v) एथिलीन ग्लाइकोल (ईजी) और 7.5% (v/v) डिमेथिल्सुल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) के साथ संतुलन समाधान (ईएस) तैयार करें।
    2. 15% (v/v) ईजी, 15% (v/v) DMSO और 0.5 M sucrose के साथ मध्यम 199 में, 20% एफबीएस (19से संशोधित) के साथ विट्रीफिकेशन समाधान (वीएस) तैयार करें।
    3. उपयोग से पहले आरटी पर ES और VS को गर्म होने दें।
      नोट: क्रायोप्रोटेक्टेंट (जैसे, ईजी, डीएमएसओ) को साइटोटॉक्सिक माना जाता है। उनकी विषाक्तता का मुकाबला करने की रणनीति उस तापमान को कम करना है जिस पर कोशिकाएं20के संपर्क में आती हैं, और ओसाइट्स आमतौर पर आरटी में क्रायोप्रोटेक्टेंट के संपर्क में आते हैं। इस प्रकार, पूरी प्रक्रिया, ओसाइट संग्रह से विट्रीफिकेशन तक, तापमान में उतार-चढ़ाव से बचने के लिए इस प्रोटोकॉल में आरटी में की जाती है।
  2. विट्रीफिकेशन डिश (यानी, एक विशेष पकवान तैयार करें जिसमें दो पंक्तियों में विभाजित छह शंकुल कुओं से मिलकर बनता है, जिसे "रेप्रो प्लेट" के नाम से जाना जाता है)। प्रत्येक विट्रीफिकेशन समर्थन के लिए एक पंक्ति (तीन कुएं) तैयार करें।
    1. पहले कुएं के तल पर ईएस के 20 माइक्रोन जोड़ें।
    2. दूसरे (यानी 1VS) और तीसरे (यानी, 2VS) कुओं के तल पर वीएस के 300 माइक्रोल जोड़ें।
  3. ईएस में COCs को समतुलिब्रेट करें।
    1. एक छोटे बोर पिपेट (उदाहरण के लिए, एक पाश्चान् तुले को पतला बनाने के लिए बुनसेन चोंच पर खींचा गया - व्यास कम से कम 200 माइक्रोन होना चाहिए), पहली अच्छी तरह से तल पर एक (या अधिक) COC (s) स्थानांतरित करना चाहिए।
      नोट: oocytes आसपास के क्यूमुलस कोशिकाओं की परतों की संख्या के अनुसार पिपेट के आकार का चयन करें, इसलिए COCs आयामों के लिए, जितना संभव हो उतना मीडिया की मात्रा को कम करने का लक्ष्य है जो प्रत्येक चरण में सीओसी के साथ स्थानांतरित किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, प्रशिक्षित ऑपरेटर प्रत्येक विट्रीफिकेशन समर्थन के अनुसार आठ बिल्ली के समान सीओसी तक सफलतापूर्वक विट्रीफी कर सकते हैं।
    2. धीरे-धीरे ड्रॉप की सीमा पर ईएस के 20 माइक्रोल जोड़ें। 3 मिनट तक रुकें।
    3. धीरे-धीरे ड्रॉप की सीमा पर ईएस के अन्य 20 माइक्रोन जोड़ें। 3 मिनट तक रुकें।
    4. धीरे-धीरे ड्रॉप की सीमा पर ईएस के 240 माइक्रोन जोड़ें। 9 मिनट तक रुकें।
    5. प्रतीक्षा करते समय, तरल नाइट्रोजन (एलएन2)के साथ एक बॉक्स तैयार करें, प्रयोग/बिल्ली पहचान कोड के साथ एक विट्रीफिकेशन समर्थन लेबल करें और इसे खुला छोड़ दें । इन दोनों को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के पास रखें, ताकि काम करते समय ये आसानी से पहुंच सकें।
      सावधानी! एलएन2को संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें ।
    6. वैकल्पिक रूप से, यदि कई सीओसी को विट्रीफाइड करना है, तो सीओसी के एक अन्य समूह के लिए पहला संतुलन चरण (चरण 2.3.1 - 2.3.2 देखें) शुरू करें (जिसे एक नए विट्रीफिकेशन समर्थन पर लोड किया जाएगा)।
  4. 90 सेकंड से भी कम समय में वीएस में विट्रिफ़ी सीओसी।
    1. उसी छोटे बोर के पिपेट का उपयोग करके, इसे 1VS से भरें, पहले कुएं (ईएस) के नीचे से सीओसी लें और उन्हें दूसरे कुएं (1VS) की सतह पर ले जाएं।
    2. पिपेट को 1VS से धो लें।
    3. COCs ले लो और उन्हें अच्छी तरह से एक और क्षेत्र (नीचे) में ले जाते हैं; उनके आसपास के माध्यम को पिपेट के साथ मिलाएं।
    4. पिपेट को कुएं के दूसरे क्षेत्र में 1VS के साथ भरें, सीओसी लें, उन्हें स्थानांतरित करें और उनके आसपास के माध्यम को पिपेट के साथ मिलाएं।
    5. दोहराएं चरण 2.4.4।
    6. पिपेट को 2VS से धो लें।
    7. सीओसी लें और उन्हें तीसरे कुएं (2VS) के तल पर ले जाएं; उनके आसपास के माध्यम को पिपेट के साथ मिलाएं।
    8. कुएं के दूसरे क्षेत्र में 2VS के साथ पिपेट भरें, सीओसी लें, उन्हें स्थानांतरित करें और उनके आसपास के माध्यम को पिपेट के साथ मिलाएं।
    9. दोहराएं चरण 2.4.8।
    10. कुएं के किसी अन्य क्षेत्र में 2VS के साथ पिपेट भरें, सीओसी लें और उन्हें विट्रिफिकेशन समर्थन की पट्टी पर लोड करें, जितना संभव हो टिप के करीब। जितना संभव हो वीएस की मात्रा को कम करने के लिए अतिरिक्त माध्यम को एस्पिरेट करें।
    11. तुरंत एलएन 2 में विट्रीफिकेशन समर्थन को डुबकी लगाते हैं, इसे आगे बढ़ातेहैं। इसे कुछ क्लैंप की मदद से बंद करें, यह सुनिश्चित करें कि यह हमेशा एलएन2में डूबा रहता है।
      नोट: क्रायोप्रोप्रोटेडेंट सेल-विषाक्तता के कारण सही समय रखना महत्वपूर्ण है। विट्रीफिकेशन मीडिया में उनकी उच्च एकाग्रता के कारण, सेल एक्सपोजर को नियंत्रित करने की आवश्यकता है, तकनीक के निर्दोष निष्पादन द्वारा भी21। यदि नमूने प्रचुर मात्रा में हैं, तो उन्हें अधिक तेज़ी से संसाधित करने के लिए विभाजित करने पर विचार करें और ओसाइट संग्रह से विट्रीफिकेशन तक समय की मात्रा को कम करें।
  5. एक गोबलेट में लोडेड विट्रीफिकेशन सपोर्ट स्टोर करें और वार्मिंग तक उन्हें स्टोरेज एलएन2 टैंक में रखें।
    नोट: यदि एलएन2 उपलब्ध है तो प्रोटोकॉल के सभी पिछले चरणों को फ़ील्ड स्थितियों में भी लागू किया जा सकता है. नमूनों को सुरक्षित रूप से प्रयोगशाला में ले जाने और फिर निम्नलिखित चरणों के साथ वहां आगे बढ़ने के लिए एक शुष्क शिपर आवश्यक होगा।

3. वार्मिंग

  1. वार्मिंग मीडिया तैयार करें।
    1. 20% एफबीएस के साथ, मध्यम 199 में 1 एम सुक्रोज के साथ विगलन समाधान (टीएस) तैयार करें।
    2. 20% एफबीएस के साथ मीडियम 199 में 0.5 एम सुक्रोज के साथ कमजोर पड़ने का समाधान (डीएस) तैयार करें।
    3. 20% एफबीएस के साथ मीडियम 199 के साथ वॉशिंग सॉल्यूशन (डब्ल्यूएस) तैयार करें।
    4. उपयोग से पहले, टीएस को 38 डिग्री सेल्सियस और डीएस और डब्ल्यूएस को आरटी पर गर्म करें।
  2. यदि आवश्यक हो, तो गर्म COCs (उदाहरण के लिए, इन विट्रो परिपक्वता, आईवीएम) के बाद के उपयोग के लिए संस्कृति माध्यम तैयार करें।
  3. हीटिंग चरण को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के करीब रखें और इसे चालू करें (38 डिग्री सेल्सियस)। गर्म करने के लिए पेट्री डिश का ढक्कन लगा दें।
  4. जब सब कुछ तैयार हो जाता है, तो विट्रीफिकेशन का समर्थन स्थानांतरित करें जिसे स्टोरेज टैंक से एलएन2के साथ एक बॉक्स में गर्म किया जाना चाहिए, और बॉक्स को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के पास रखा जाना चाहिए।
  5. "रिप्रो प्लेट" तैयार करें। प्रत्येक विट्रीफिकेशन समर्थन के लिए एक पंक्ति तैयार करें जिसे गर्म किया जाना है।
    1. पहले कुएं के तल पर डीएस के 300 माइक्रोन जोड़ें।
    2. दूसरे (यानी 1WS) और तीसरे (यानी, 2WS) कुओं के तल पर डब्ल्यूएस के 300 माइक्रोन जोड़ें।
  6. पेट्री डिश के ढक्कन पर टीएस (100 माइक्रोन) की एक बूंद बनाएं।
  7. क्लैंप के साथ, एलएन 2 में एक विट्रीफिकेशन समर्थनखोलें।
  8. टीएस ड्रॉप को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें और एक तेज आंदोलन के साथ एलएन2 से विट्रीफिकेशन समर्थन लें और ड्रॉप में अपनी पट्टी विसर्जित करें, इसे तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि सभी सीओसी अलग न हो जाएं। जैसे ही यह खाली हो, ड्रॉप से समर्थन निकालें, लेकिन कुल में 1 मिनट के लिए टीएस में COCs छोड़ (विसर्जन से निम्नलिखित चरण तक) ।
  9. विट्रीफिकेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले एक पिपेट लें और इसे डीएस से भरें। ड्रॉप (टीएस) से COCs ले लो और उन्हें पहले अच्छी तरह से (डीएस) के नीचे करने के लिए ले जाते हैं। 3 मिनट तक रुकें।
  10. पिपेट को 1WS से धोएं। COCs ले लो और उन्हें दूसरे कुएं (1WS) के तल पर ले जाते हैं। 5 मिनट तक रुकें।
  11. पिपेट को 2WS से धोएं। COCs ले लो और उन्हें तीसरे कुएं (2WS) की सतह पर ले जाते हैं। उनके लिए कुएं के नीचे छूने का इंतजार करें।
  12. कुएं के किसी अन्य क्षेत्र का उपयोग करके चरण 3.11 दोहराएं।
  13. पिपेट को संस्कृति माध्यम से धोएं और निम्नलिखित उपयोग (उदाहरण के लिए, आईवीएम) के लिए ओसाइट्स को संस्कृति पकवान में ले जाएं।

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Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल (चित्रा 1 और पूरकचित्रा 1) के अनुसार बिल्ली ओसाइट विट्रीफिकेशन और वार्मिंग के बाद, अधिकांश गेम्स जीवित रहतेहैं। विट्रीफिकेशन के बाद, अन्य तकनीकों के बीच, व्यवहार्यता का मूल्यांकन ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में रूपात्मक अखंडता22 के रूप में या महत्वपूर्ण दाग के उपयोग के साथ किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध में से एक फ्लोरोसिन डायसेटेट/प्रोपिडियम आयोडाइड (एफडीए/पीआई) है, जो व्यवहार्य (उज्ज्वल हरित फ्लोरेसेंस) और मृत कोशिकाओं (लाल फ्लोरेसेंस) की पहचान की अनुमति देता है। चित्रा 2 वार्मिंग के ठीक बाद एफडीए/पीआई के साथ दाग vitrified-गरम बिल्ली COCs की एक प्रतिनिधि तस्वीर से पता चलता है । विट्रिफिकेशन के बाद जीवित रहने के प्रतिशत को दर्शाने वाले प्रयोगों के आंकड़े तालिका 1में सूचित किए जाते हैं, जिसमें इन विट्रो परिपक्वता17 या इन विट्रो भ्रूण उत्पादन16के लिए इरादा ओसाइट्स के पोस्ट-वार्मिंग डेटा को दर्शाया गया है। कुल मिलाकर, यहां उदाहरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले दो प्रयोगों में16,,17,395 में से 435 ओसाइट्स बच गए, कुल मिलाकर 90.8% पोस्ट-वार्मिंग व्यवहार्यता स्कोरिंग।

हालांकि, वार्मिंग(चित्र 3)के बाद कुछ रूपात्मक परिवर्तन देखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के बाद गेम्ट्स विट्रीफाइड-गरम में, सबसे लगातार रूपात्मक असामान्यताएं ओप्लाज्म आकार और ग्रैन्युलेशन में परिवर्तन होती हैं, आंशिक (या, शायद ही कभी, कुल) क्यूमुलस कोशिकाओं की हानि और (शायद ही कभी) जोना पेलुसिडा फ्रैक्चर। दूसरी ओर, जैसा कि एक ही समर्थन के साथ न्यूनतम मात्रा विट्रीफिकेशन पर हमारे पिछले कार्यों में रिपोर्ट किया गया है, ये विट्रीफाइड COCs17 परिपक्व हो सकते हैं और विट्रो16में भ्रूण में विकसित हो सकते हैं, भले ही ताजा COCs की तुलना में कम दरों पर। इसके अलावा, वे आमतौर पर जोना पेलुसिडा सख्त (जो क्रायोप्रिजर्वेशन का एक और प्रसिद्ध परिणाम है) पेश नहीं करते हैं, क्योंकि इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ)सफल 16है।

Figure 1
चित्रा 1: ओसाइट विट्रीफिकेशन-वार्मिंग प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण।
कृपया पूर्ण संकेत के लिए पांडुलिपि पाठ का उल्लेख करें। COCs = क्यूमुलस-ओसाइट परिसर; ES = संतुलन समाधान; VS=vitrification समाधान; टीएस = विगलन समाधान; डीएस = कमजोर पड़ने का समाधान; WS = वाशिंग समाधान; एलएन2= तरल नाइट्रोजन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: वार्मिंग के बाद विट्रीफाइड बिल्ली ओसाइट्स की व्यवहार्यता।
Vitrified cumulus-oocyte फ्लोरोसिन डायसेटेट/प्रोपिडियम आयोडाइड (एफडीए/पीआई) के साथ दाग परिसरों हरे फ्लोरेसेंस दिखाने के लिए जब व्यवहार्य(ए)या लाल या कमजोर फ्लोरेसेंस जब मृत(बी)। उत्तेजन/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य: एफडीए के लिए ४९५ एनएम/517 एनएम; पीजीआइ के लिए 538 एनएम/617 एनएम। स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ताजा और विट्रीफाइड बिल्ली ओसाइट्स के हल्के माइक्रोग्राफ।
(A)संग्रह के बाद ताजा क्यूमुलस-ओसाइट परिसर, विट्रीफिकेशन से पहले। (ख)वार्मिंग के बाद विट्रीफाइड क्यूमुलस-ओसाइट परिसर, कुछ विट्रीफिकेशन-प्रेरित चोटों (क्यूमुलस कोशिकाओं के आकार और हानि में परिवर्तन, काला तीर) दिखाते हैं। स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रयोग समूह गरम ऊसाइट्स (एन) व्यवहार्य ऊसाइट्स (n) व्यवहार्यता (%) व्यवहार्यता (मतलब% ± एसडी)
1† 1 13 12 92.31 91.54 ± 3.66
2 47 44 93.62
3 52 45 86.54
4 26 24 92.31
5 41 40 97.56
6 21 19 90.48
7 50 44 88.00
2‡ 1 17 17 100.00 91.51 ± 9.16
2 17 17 100.00
3 9 8 88.89
4 21 21 100.00
5 30 23 76.67
6 26 23 88.46
7 17 13 76.47
8 10 10 100.00
9 15 14 93.33
10 23 21 91.30

तालिका 1: बिल्ली विट्रीफाइड-गर्म ओसाइट्स में व्यवहार्यता के प्रतिनिधि परिणाम। †कोलंबो एट अल से डेटा 201916 और ♫ कोलंबो एट अल 202017।

पूरक चित्रा 1: ओसाइट विट्रीफिकेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले समर्थनों की प्रतिनिधि तस्वीर। वाणिज्यिक समर्थन 13 सेमी उपाय करता है और संभालना और स्टोर करना आसान है। Oocytes को डिवाइस के शीर्ष पर पतली प्लास्टिक पट्टी पर लोड किया जाना चाहिए, टिप के पास काले निशान के जितना संभव हो उतना करीब। कॉपीराइट: Kitazato निगम। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ऊसाइट क्रायोप्रिजर्वेशन एक महत्वपूर्ण जर्मप्लाज्म संरक्षण तकनीक है, विशेष रूप से टैक्सा में जहां कई प्रजातियां खतरे में हैं, जैसे फेलिडी परिवार। इस पांडुलिपि में अपरिपक्व बिल्ली ओसाइट्स के विट्रीफिकेशन के लिए एक सरल और क्षेत्र के अनुकूल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया था। प्रयोगशाला में निर्मित मीडिया, न्यूनतम मात्रा विट्रीफिकेशन समर्थन करता है और प्रशिक्षित कार्मिक इस विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं, जो लगातार और बार-बार व्यवहार्य ओसाइट्स प्राप्त करने की अनुमति देता है, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों द्वारा दिखाया गया है।

मीडिया की तैयारी के साथ शुरुआत, प्रोटोकॉल का सही पालन किया जाना चाहिए ताकि सर्वोत्तम परिणाम सुनिश्चित किए जा सकें, लेकिन ऑपरेटर का कौशल प्रमुख मुद्दा है। मीडिया को विट्रीफिकेशन प्रक्रिया के उसी दिन तैयार किया जाना चाहिए, या यदि ऐसा संभव नहीं है, तो उन्हें एक दिन पहले तैयार किया जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। किसी भी मामले में, नमूना प्रसंस्करण से पहले, समाधान को आरटी तक गर्म करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त समय छोड़ा जाना चाहिए। Oocyte संग्रह और COCs चयन त्वरित और सरल प्रक्रियाएं हैं जो नियमित रूप से हर एआरटीएस प्रयोगशाला द्वारा की जाती हैं। हालांकि, क्रायोप्रिजर्वेशन सबसे नाजुक प्रक्रिया है। जबकि वार्मिंग प्रक्रिया इतनी महत्वपूर्ण नहीं है, अगर प्रोटोकॉल और समय का पालन कर रहे हैं, vitrification और अधिक जटिल हो सकता है । संतुलन के बाद, जिसमें देखभाल सिर्फ समय का संमान करने में लिया जाना चाहिए, सबसे चुनौतीपूर्ण चरण के लिए विट्रीफिकेशन कदम होने की संभावना है (वर्तमान प्रोटोकॉल के २.४. देखें) । दरअसल, oocyte स्थानान्तरण और पिपेट धोने के लिए अच्छी तरह से समय की जरूरत है और, सब एक साथ, कम से कम ९० सेकंड में प्रदर्शन किया । शुरुआती लोगों के लिए, प्रशिक्षण के दौरान स्टॉपवॉच के साथ प्रक्रिया को समय देना उचित है, जबकि प्रशिक्षित व्यक्तियों के लिए भी यह एक चेतावनी के रूप में 60 सेकंड के बाद टाइमर बीप करना उपयोगी हो सकता है कि समय बढ़ रहा है। इसके अलावा, यह एक उच्च मानकीकरण की अनुमति देगा, क्योंकि ऑपरेटरों 6-8 COCs के समूहों को vitrifying repro प्लेट के तीसरे कुएं के लिए दूसरे से oocytes के हस्तांतरण के करीब होना चाहिए (वर्तमान प्रोटोकॉल के कदम २.४.७ देखें) जब अलार्म बंद हो जाता है । उम्मीद है, इस लेख की सहायता से, व्यक्तियों और प्रयोगशालाओं के बीच एक उच्च मानकीकरण प्राप्त किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमाएं क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रियाओं की आंतरिक विशेषताएं बनी हुई हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, विट्रीफिकेशन गैर-शारीरिक और संभावित रूप से हानिकारक स्थितियों के लिए ओसाइट्स को उजागर करता है, भले ही यह निर्दोष रूप से किया जाता है। क्रायोप्रोटेक्टेंट्स के साथ इनक्यूबेशन और तापमान में कमी सबसे महत्वपूर्ण घटनाएंहैं 20 और उन्हें सख्त नियंत्रण में रखने की जरूरत है । सबसे आम क्रायोइंजियों में, कुछ ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (जैसे, क्यूमुलस सेल हानि, सेलुलर आकार और आकार के परिवर्तन) पर आसानी से नमूदार होते हैं, जबकि अन्य दिखाई नहीं देते हैं और अक्सर उपकोशिकीय संरचनाओं को प्रभावित करते हैं (जैसे, जोना पेलुसिडा सख्त, ऑक्सीडेटिव तनाव, साइटोस्केलेटन हर्जाना, मेइओटिक स्पिंडल और डीएनए परिवर्तन)23,,24। हालांकि ज्यादातर व्यवहार्य, इस प्रोटोकॉल के बाद COCs vitrified अक्सर वार्मिंग के बाद कुछ स्पष्ट रूपात्मक विसंगतियों मौजूद हैं । हालांकि, आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता के बीच कोई संबंध नहीं है, जो उपकोशिकीय क्षति3,,25के कारण भी बाधित हो सकता है, लेकिन रूपात्मक परिवर्तन क्रायोनिंजरी का परिणाम है और आंशिक रूप से विट्रीफाइड ओसाइट्स के इन विट्रो विकासात्मक परिणामों का एक कारण है, जो ताजा ऊट्स की तुलना में काफी खराब हैं। विट्रीफिकेशन मीडिया की सावधानीपूर्वक तैयारी और प्रोटोकॉल समय की सटीक अवलोकन अच्छी पोस्ट-वार्मिंग व्यवहार्यता और रूपात्मक अखंडता प्राप्त करने में योगदान देती है, लेकिन ओसाइट्स और भ्रूण विकास के विट्रो परिपक्वता में सुधार अभी भी आवश्यक हैं, क्योंकि निम्नलिखित संस्कृति16के दौरान व्यवहार्यता अक्सर कम हो जाती है।

ठंड से प्रेरित चोटों दुर्भाग्य से हर क्रायोप्रिजर्वेशन विधि24के साथ होते हैं । इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले न्यूनतम वॉल्यूम विट्रीफिकेशन समर्थन को यथासंभव विट्रीफिकेशन वॉल्यूम को कम करने के लिए विकसित किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप निर्माता विनिर्देशों के अनुसार अन्य क्रायोप्रिजर्वेशन उपकरणों (--23,000 डिग्री सेल्सियस/मिनट और 42,000 डिग्री सेल्सियस/मिनट) की तुलना में बेहतर कूलिंग और वार्मिंग दर ों में परिणामी है। एक परिणाम के रूप में, मानव चिकित्सा में, जहां नैदानिक अध्ययन दोनों में विट्रो (यानी, निषेचन और भ्रूण के विकास) और वीवो मापदंडों (यानी, गर्भावस्था दर और जीवित जन्म) का आकलन उपलब्ध हैं, न्यूनतम मात्रा विप्राइफिकेशन के बाद वार्मिंग अस्तित्व के मामले में अपने अतुलनीय परिणामों के कारण oocyte क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए सबसे आम विकल्प है और, अंत में, जीवित जन्म12 इसके अलावा, अन्य विट्रीफिकेशन उपकरणों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला उपयोग करना आसान है और12को स्टोर करने के लिए सुरक्षित है, क्योंकि यह संभालने में आरामदायक है और भंडारण के दौरान एक टोपी द्वारा संरक्षित है। उदाहरण के लिए, न्यूनतम वॉल्यूम लक्ष्य तक पहुंचने के लिए क्राईलोप भी एक कुशल समर्थन है, लेकिन इसकी संरचना (समाधान की एक फिल्म का समर्थन करने वाला एक लूप जिस पर ओसाइट्स लोड किए जाते हैं) नाजुक है और आकस्मिक वार्मिंग12से ग्रस्त है। तिनके (0.25 एमएल वॉल्यूम) या खुले खींचा तिनके (ऑप्स) का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन वे विट्रीफिकेशन वॉल्यूम में महत्वपूर्ण कमी की अनुमति नहीं देते हैं और भरने और खाली करने के लिए चुनौतीपूर्ण भी हैं, क्योंकि कुछ ओसाइट्स26खो सकते हैं। कई अन्य समर्थन2विकसित किए गए हैं, लेकिन उनमें से प्रत्येक की अपनी कमियां हैं। इसके बजाय, धीमी ठंड की तुलना में, जो पहले सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली क्रायोप्रिजर्वेशन तकनीक थी, वाणिज्यिक समर्थन पर न्यूनतम मात्रा विट्रीफिकेशन के मुख्य फायदे इसकी व्यवहार्यता और गति हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, विट्रीफिकेशन को प्रोग्राम करने योग्य फ्रीजर की आवश्यकता नहीं होती है, और जबकि ओसाइट्स की धीमी ठंड को समाप्त होने में लगभग एक घंटे और आधे लगते हैं25,विट्रीफिकेशन वर्तमान प्रोटोकॉल के बाद लगभग 17 मिनट में पूरा किया जा सकता है।

अंत में, कर्मचारियों के कौशल और अंतर-ऑपरेटर मानकीकरण एक विट्रीफाइड ओसाइट बैंक शुरू करते समय सबसे चुनौतीपूर्ण आवश्यकताएं हो सकती हैं, लेकिन उन्हें कार्मिक प्रशिक्षण के साथ प्राप्त किया जाएगा। बिल्ली अपरिपक्व ओसाइट्स के लिए यह न्यूनतम वॉल्यूम विट्रीफिकेशन प्रोटोकॉल अनुभवी ऑपरेटरों द्वारा किए जाने पर लगातार और दोहराने योग्य परिणाम देता है। हालांकि, वहां अभी भी oocyte विकास दरों में सुधार के लिए संभावना है, भले ही बाद वार्मिंग व्यवहार्यता और अखंडता संतोषजनक हैं । आगे अनुकूलन के साथ, वर्तमान प्रोटोकॉल को जंगली फेलिड्स के लिए क्षेत्र की स्थिति में भी लागू किया जा सकता है, जिसके लिए ओसाइट क्रायोप्रिजर्वेशन से संबंधित प्रकाशित डेटा अभी भी दुर्लभहै 27। इस विधि के आवेदन को चौड़ा करने से न केवल क्रायोप्रिजर्वेशन प्रोटोकॉल में सुधार की संभावना बढ़ जाएगी, बल्कि फेलिड्स में प्रजनन क्षमता और जैव विविधता संरक्षण के लिए विट्रीफाइड ओसाइट बायोबैंक स्थापित करने की भी अनुमति मिलेगी ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से ईव्ससार (यूरोपियन वेटनरी सोसाइटी फॉर स्मॉल एनिमल रिप्रोडक्शन) ग्रांट 2016 और यूनीवर्सिटा डेगली स्टडी डि मिलानो, पियानो डी सोस्टेग्नो अल्ला राइसर्का 2019 (लिना 2 अजिओन ए) द्वारा समर्थित किया गया था। हम डॉ मारियाजिर्जिया मोर्सेली को इसके द्वारा चित्रित और छवि अधिग्रहण के प्रयोगों में उनके योगदान के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2942 /
Automatic pipettes & tips / / Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL
Surgical scalpels / / Size 10 is usually ok
Bunsen beak / / /
Clamps / / Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen
Cryotop Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) 01.CR Distributors and catalog number may change in different countries
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 /
Ethylene glycol (EG) Sigma-Aldrich E9129 /
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665 /
Glass Pasteur pipettes / / Advised lenght 230 mm (100+130)
Gobelets / / According to the canisters of the storage tank
Heating stage / / All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC
Liquid nitrogen / / /
Medium 199 Sigma-Aldrich M4530 /
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 /
Penicillin G sodium Sigma-Aldrich P3032 /
Polyvinyl alcohol (PVA) Sigma-Aldrich P8136 /
Repro plate Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies) 01.K-2 Distributors and catalog number may change in different countries
Stereomicroscope / / As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok
Storage tank / / Any regularly filled tank is ok
Streptomycin sulphate Sigma-Aldrich S9137 /
Styrofoam/nitrogen resistant box / / All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack"
Sucrose Sigma-Aldrich S1888 /
Timers / / All timers which can be set on times until 9 minutes are ok

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References

  1. Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
  2. Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
  3. Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
  4. Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
  5. Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
  6. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  7. Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
  8. Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
  9. Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
  10. Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).
  11. Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
  12. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
  13. Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
  14. Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
  15. Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
  16. Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
  17. Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
  18. Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
  19. Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
  20. Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
  21. Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
  22. Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
  23. Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
  24. Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
  25. Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
  26. Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
  27. Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).

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Colombo, M., Luvoni, G. C. Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes. J. Vis. Exp. (160), e61523, doi:10.3791/61523 (2020).

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