Summary
نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة لجراتش الهجرة التي توفر نهجا جديدا لتحديد هجرة الخلايا دون استخدام أساليب مكثفة المعدات. في حين تم استخدام الخلايا الليفية في هذا البروتوكول، يمكن تكييفها واستخدامها لدراسة أنواع الخلايا الإضافية والتأثيرات على ترحيل الخلايا.
Abstract
تعد هجرة الخلايا مكونًا أساسيًا في الأحداث الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. مطلوب ترحيل الخلايا العادية لوظائف أساسية مثل تطوير وتركيب استجابة مناعية. عندما يحدث خلل أو تغيير مع عملية هجرة الخلية ، يمكن أن يكون له نتائج ضارة (أي الانبثاث السرطاني ، والتئام الجروح ، وتشكيل الندبة). نظرا لأهمية هجرة الخلايا، فمن الضروري أن يكون الوصول إلى خلية الهجرة فحص بأسعار معقولة، والتكيف، وتكرار. الاستفادة من اختبار الهجرة الصفر المشتركة، وضعنا نهجا جديدا لتحليل الهجرة الخلية التي تستخدم معدات المختبرات العامة. تستخدم الطريقة الموصوفة علامات بصرية تسمح باستعادة مناطق محددة ذات أهمية دون استخدام المجهر الفاصل الزمني. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر المرونة في التصميم التجريبي، بدءا من تغيير الركيزة مصفوفة الهجرة إلى إضافة المعدلات الدوائية. وعلاوة على ذلك، يحدد هذا البروتوكول طريقة لحساب منطقة ترحيل الخلايا، والتي لا يتم اعتبارها من قبل عدة طرق عند فحص ترحيل الخلايا. يقدم هذا النهج الجديد اختبارًا للهجرة الصفرية لجمهور أكبر وسيتيح فرصة أكبر للباحثين لفحص التأثير الفسيولوجي والفيزيولوجي لهجرة الخلايا.
Introduction
تعد هجرة الخلايا أمرًا حاسمًا للعديد من الأحداث الفسيولوجية وكذلك المرضية. وهو مطلوب أثناء التطوير ، لتركيب استجابة مناعية ، ولتضميد الجروح المناسبة1،2،3. ويمكن أن يتم تشغيل العديد من هذه الأحداث الهجرة الخلية عن طريق الإشارات الفيزيائية أو الكيميائية. على سبيل المثال، أثناء الاستجابة المناعية، سوف تنتقل الكريات البيض نحو موقع الإصابة استجابة لـ2. بالإضافة إلى ذلك، الكريات البيض سوف تطلق أيضا السيتوكينات للحث على الهجرة من الخلايا المناعية إضافية، فضلا عن أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الليفية، التي تشارك في عملية التئام الجروح، وبالتالي، بدء استجابة متعددة الخلايا4. قدرة الخلايا على الهجرة ضرورية لوظيفة فسيولوجية مناسبة; ومع ذلك ، عندما يذهب هجرة الخلايا دون رادع ، يمكن أن يكون لها استجابة سلبية وتساهم في الأحداث المرضية ، مثل الالتهاب المزمن ، وأمراض الأوعية الدموية ، ونقائل السرطان ، وضعف التئام الجروح2،3،4،5،6،7. التئام الجروح الضعيفة هي إصابة شائعة لمرضى السكري بسبب عيوب في هجرة الخلايا ، وإذا لم يتم معالجة هذه العيوب ، فقد يؤدي ذلك إلى مزيد من المضاعفات (على سبيل المثال ، بتر8،9). وقد أشارت هذه الدراسة، فضلا عن غيرها، إلى الحاجة إلى زيادة فهم العملية التي تحدث بها هجرة الخلايا، إما في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية العادية، وهي حيوية لتعزيز هذا المجال من البحوث. ولتحقيق ذلك، يجب أن تكون هناك مقايسات للهجرة متاحة يمكن الوصول إليها وبتكلفة معقولة للباحثين، الذين قد لا يمتلكون المعدات اللازمة لإجراء هذه الأقوال.
حاليا، هناك مجموعة متنوعة من المقايسات الهجرة المتاحة لدراسة مجموعة واسعة من المواضيع المتعلقة بهجرة الخلايا. وقد تم تطوير كلا من نموذجي الهجرة 2D و 3D، كل منهما يستهدف مناطق محددة تؤثر على هجرة الخلايا. ترتبط نماذج الهجرة ثلاثية الأبعاد عادةً بدراسات غزو الخلايا وتقييم تأثير المصفوفة خارج الخلية على هجرة الخلايا10،11،12، في حين أن مقايسات الهجرة 2D لديها نطاق أكبر من التطبيق وتستخدم في المقام الأول لدراسة الهجرة الكيميائية ، والتئام الجروح ، والتغيرات الوظيفية أثناء هجرة الخلايا13،14،15،16. العديد من هذه المقايسات تتطلب معدات إضافية، مثل غرف بويدن أو حلقات الاستبعاد، والتي يمكن أن تقلل من توافر هذه المقايسات لبعض الباحثين. واحدة من أكثر فعالية من حيث التكلفة المقايسات هو الخدش المقايسة، والذي يستخدم عادة لتقييم التئام الجروح والتغيرات العامة في هجرة الخلايا14،17. وفي حين أن معظم المختبرات مجهزة لإجراء فحص الخدش، فإن المعدات المستخدمة لتتبع هجرة الخلايا تميل إلى أن تكون إما غير متوفرة أو مكلفة للغاية لا يمكن شراؤها. وهذا يشمل المجهر الفاصل الزمني، الذي يتطلب مجهر مقلوب ونظام تصوير حي. هذه القطع باهظة الثمن من المعدات ليست متاحة عادة لكل مختبر. ولذلك، تبرز هذه الملاحظة الحاجة إلى بروتوكول جديد يسمح بتقييم هجرة الخلايا بمعدات أكثر سهولة.
البروتوكول المعروض هنا يوفر طريقة جديدة وبأسعار معقولة لتقييم ترحيل الخلايا. ويتبع هذا الأسلوب نفس الإجراء المرتبط بمجرّدات الخدش ولكنه يختلف في تحليل فحص هجرة الخلايا باستخدام معدات أكثر شيوعًا متوفرة في بيئة مختبرية للعلوم الأساسية. يسمح هذا البروتوكول باستخدام المعدات الشائعة بتحديد أكثر دقة لترحيل الخلايا دون استخدام المجهر الفاصل الزمني. بالإضافة إلى تحديد الترحيل، هذه الطريقة أيضاً مسؤولة عن عوامل متغيرة في منطقة الخدش التي تم ملاحظتها إلى تأثير كبير على ترحيل الخلايا. وعموما، فإن هذا البروتوكول الجديد لتحليل هجرة الخلايا يتيح فرصة لمزيد من المختبرات لاستكشاف مجال هجرة الخلايا والمساهمة في هذا المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- ثقافة الخلايا العامة
- الخلايا الليفية القلبية في دولبيككو النسور المعدلة المتوسطة (DMEM) التي تحتوي على 1 غرام / لتر الجلوكوز، بيروفات الصوديوم، L-الجلوتامين، ومكملة مع 14.2 mM NaHCO3، 14.9 mM HEPES، 15٪ تنشيط الحرارة مصل الأبقار الجنين (FBS)، 2٪ L-الجلوتامين، و 0.02٪ كاشف مضاد للميكروبات (انظر جدول المواد)والحفاظ عليها في CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- يتم الوصول إلى الخلايا الليفية القلبية حتى 90-95٪ التقاء عند مرور 0 (P0). عند هذه النقطة الخلايا الليفية على استعداد لتقسيمها إلى لوحة 48-جيدا، والذي يستخدم لمجرحة الهجرة.
2 - إعداد لوحة الهجرة
- إعداد لوحة ثقافة خلية 48-well عن طريق رسم خط، وذلك باستخدام علامة دائمة صفراء أو فاتحة اللون، أسفل مركز البئر. ثم، رسم ثلاث علامات التجزئة تقسيم البئر إلى ثلاثة مجالات منفصلة من الاهتمام. سيتم استخدام هذه الأقسام للتصوير.
ملاحظة: إن استخدام علامة لون فاتح دائم يسمح بسهولة تصوير الخلايا المهاجرة. ستمنع العلامات الداكنة مثل الأسود أو الأزرق من عرض مرئي للخلايا المهاجرة. - إذا كان تقييم الهجرة على ركيزة (مثل الكولاجين)، معطف البئر في هذا الوقت اتباع التعليمات والتركيزات المستخدمة للركيزة محددة.
- لوحة ~ 15،000-20،000 الخلايا الليفية القلبية، P1، في كل بئر والخلايا الثقافة، في ظل ظروف الزرع العادية (الظروف المذكورة في القسم السابق)، حتى تصل إلى 90-95٪ التقاء. وينبغي الوصول إلى التقاء بين 24-48 ساعة.
ملاحظة: عند إعداد لوحة الترحيل تأكد من تضمين عنصر تحكم موجب (خلية مهاجرة معروفة، مثل خلايا 3T318)،عنصر تحكم سالب (خلايا غير مُنصفة) و كذلك فارغ.
3. خدش الهجرة المقايسة والتشطيب
- مرة واحدة الخلايا تصل إلى 90-95٪ التقاء، وإزالة وسائل الإعلام والخدش على طول خط رسم باستخدام تلميح P200 ماصة عقيمة.
ملاحظة: A P200 ماصة تلميح هو تلميح ماصة مشتركة الحجم المستخدمة مع المقايسة الصفر10،14،19. أيضاً، جعل تمريرة واحدة فقط مع تلميح P200 كما قد ينتج عن أكثر من محاولة واحدة خطوط الصفر متعددة. - شطف جيدا مع وسائل الاعلام المصل منخفضة (1.5٪ FBS) لإزالة أي الخلايا الليفية القلبية غير المرتبطة.
- إضافة 500 μL من وسائل الاعلام المصل منخفضة لكل بئر. إذا كان استخدام أي عوامل دوائية، إضافتها في هذا الوقت.
ملاحظة: يتم استخدام وسائط المصل المنخفضة لأنه يسمح / يعزز الهجرة الخلية أن يحدث ويمنع الخلايا الليفية من الانتشار الذي يمكن أن ينحرف نتائج الهجرة20. لهذا البروتوكول، تم استخدام 1.5٪ FBS. - التقاط 0 ح الصور قبل احتضان الخلايا الليفية في 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- التقاط صور 0 ح باستخدام مجهر مقلوب مع هدف 20x. اتخاذ اثنين من الصور 0 ح في البئر. وسيتيح ذلك تغطية أكثر اكتمالا لخط الهجرة.
- باستخدام علامات (خط وشرطات)، وضع البئر لالتقاط النصف العلوي من خط الصفر. تجنب تصوير شرطة الأوسط للتأكد من أن نفس المنطقة من الهجرة لا يتم تصويرها مرتين، مما قد يؤدي إلى انحراف النتائج.
- استخدام برامج التصوير (جدول المواد) لالتقاط 0 ح صورة #1. ثم نقل لوحة لوضع النصف السفلي من بئر / خط الصفر في ضوء الكاميرا. مرة أخرى، تجنب التقاط شرطة الأوسط. مرة واحدة في مكان، والتقاط 0 ح صورة #2 (الشكل 1).
ملاحظة: يؤدي تجنب اندفاعة الأوسط في كل من الصور 0 h إلى منع التقاط مناطق الترحيل مرتين والتي إذا تم ذلك يمكن أن تؤدي إلى تكرار النتائج وحرف البيانات.
- بعد احتضان لمدة 24 ساعة ، وإزالة وسائل الإعلام من البئر ، وغسل البئر مع 1x غير الهستيري PBS (من الآن فصاعدا كل 1X برنامج تلفزيوني المستخدمة غير الهستيري).
- في غطاء الدخان، إضافة 500 μL من 4٪ شبهformaldehyde إلى البئر واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إزالة paraformaldehyde وغسل 3x مع 1X PBS لمدة 5 دقائق كل في RT.
- مرة واحدة يتم غسلها الخلايا، والمضي قدما في التقاط الصور 24 ح أو إضافة 1X برنامج تلفزيوني لكل بئر ومكان في 4 درجة مئوية حتى وقت لاحق. يمكن أن تبقى الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع حتى تصبح جاهزة للصورة.
- Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من حل permeabilizing (1X برنامج تلفزيوني و 0.01٪ تريتون X-100) إلى كل بئر. احتضان الخلايا / لوحة مع لطيف، هزاز المستمر لمدة 30 دقيقة في RT.
- إزالة حل permeabilizing وإضافة 1٪ Coomassie وصمة عار الأزرق الرائعة (3٪ Coomassie الأزرق الرائعة، 10٪ حمض الخليك، 45٪ الميثانول، و 45٪ dH2O) لمدة 10 دقيقة مع لطيف، وهزاز مستمر في RT.
ملاحظة: إذا كانت اللوحات مغلفة بركيزة مصفوفة خارج الخلية تأكد من اختبار لوحة مغلفة مع تلطيخ Coomassie قبل إجراء اختبار الترحيل. ويبين الشكل 2 أنه يمكن استخدام الركيزة مصفوفة مع هذا الفحص وليس تأثير التصور من الخلايا. - غسل الآبار 3x مع 1X برنامج تلفزيوني في RT مع هزاز مستمر لمدة 5 دقائق لكل من.
- بعد يغسل، وأضاف 300 μL من 1X برنامج تلفزيوني والتقاط 24 صور ح.
- التقاط الصور 24 ح عن طريق محاذاة البئر في نفس الموقف الذي كان يستخدم لالتقاط الصور 0 ح. من أجل تحقيق ذلك، فتح الصور 0 ح التي تم التقاطها سابقا واستخدام علامات مصنوعة من علامة دائمة، محاذاة البئر في نفس الموقف. الخط أسفل الأوسط وعلامات اندفاعة إضافية ينبغي أن تسمح محاذاة وثيقة بين صورة 24 ح وصورة 0 ح(الشكل 1).
4. إعداد 0 ح و 24 ح الصور
- فتح 0 ح و 24 ح الصور التي اتخذت من نفس جيدا والموقف في برامج التصوير (جدول المواد).
- إنشاء طبقة جديدة على صورة 0 h. ثم انقر فوق الطبقة الجديدة وقم بتغيير اسم الطبقة إلى "طبقة الخط" بالنقر المزدوج على النص.
ملاحظة: هذه الطبقة سوف يشار إليها على أنها طبقة خط من هذه النقطة فصاعدا. - انقر على أداة الفرشاة (رمز الفرشاة) ثم قم بتعيين الحجم في 10 بكسل واللون إلى الأحمر.
- مع طبقة الخط المحدد، رسم اثنين، خطوط منفصلة التي تحدد مساحة نقطة الصفر. يجب ألا تلمس الخطوط أي خلايا بسبب هذه الخطوط التي تشير إلى منطقة الهجرة.
- انقر على أداة النقل (رمز السهم) ثم اضغط لأسفل Ctrl زر وانقر على كل من طبقات الخط والخلفية.
- انقر في منتصف صورة 0 h واسحب كلتا هاتين الطبقتين إلى منتصف الصورة 24 h.
- الآن باستخدام 24 ح الصورة، انقر على طبقة خلفية 0 ح وتغيير التعتيم إلى 50٪.
- عقد على زر Ctrl، انقر على كل من 0 h الخلفية وطبقة الخط ثم تحويل الحرة الطبقات(تحرير> تحويل الحرة). باستخدام التحول الحر، محاذاة 0 ح الخلفية وصورة خط إلى 24 ح صورة الخلفية. هذه الخطوة ينتج عنه تراكب 0 h و 24 h الصورة، وهو أمر ضروري لوضع الخطوط التي تميز منطقة الهجرة في الموضع الصحيح على صورة 24 h.
- بعد تراكب ناجح لطبقات الخلفية وخط 0 h على صورة خلفية 24 h، احذف طبقة الخلفية 0 h. حذف عن طريق النقر على طبقة خلفية 0 ح، ثم انقر بزر الماوس الأيمن، وانقر على حذف طبقة.
- حذف 0 ح صورة خلفية سيترك فقط الخط و طبقة خلفية 24 ح (يشار إليها الآن باسم صورة الهجرة). وستشير طبقة الخط إلى مساحة الترحيل/الخدش على صورة 24 ساعة ويمكن استخدامها لتحديد عدد الخلايا المهاجرة.
- حفظ صورة الترحيل الجديد كملف Photoshop و TIFF / JPEG. ملاحظة: يتم عرض شخصية تمثيلية تصور هذه العملية في الشكل 3.
5. عد عدد الخلايا المهاجرة
- افتح صورة الترحيل. يمكن القيام بذلك في برنامج يقبل ملفات TIFF/JPEG(جدول المواد).
- حساب عدد الخلايا التي تقع في بين وكذلك لمس الخطين الأحمرين.
- تسجيل عدد الخلايا التي يتم ترحيلها لكل صورة. سيكون هناك صورتان مُنهجتان في البئر، ولا ينبغي دمج هذه القيم إلا بعد تصحيح القيم لمنطقة الترحيل (مفصلة في القسم التالي).
6- تحديد منطقة الهجرة
- فتح صورة 24 ح التي تحتوي على خطوط الهجرة في برنامج التصوير في قسم 5 (جدول المواد).
- حفظ كـ هذه الصورة كـ "صورة منطقة الترحيل".
- بعد الحفظ، انقر فوق طبقة الخلفية، وانقر بزر الماوس الأيمن، وانقر على حذف الطبقة. هذا ينبغي ترك فقط خطوط الصفر على الصورة (الشكل 3).
- باستخدام أداة فرشاة (رمز فرشاة) ملء في المنطقة بين خطوط الصفر. قم بطابق لون الفرشاة مع اللون المستخدم لرسم خطوط الترحيل.
- تغيير الصورة إلى تدرج الرمادي لإنشاء صورة بالأسود والأبيض(صورة> وضع> الرمادي)ثم حفظ الصورة (الشكل 4).
- بدء برنامج التحليل (جدول المواد) ثم افتح ملف "منطقة الهجرة" ضمن برنامج التحليل.
- لتحديد مساحة بند الترحيل، انقر فوق Image>Adjust>Threshold. سيتم تحويل منطقة الترحيل السوداء إلى اللون الأحمر وسيتم الإشارة إلى النسبة المئوية في المربع Threshold. سيتم الإبلاغ عن المنطقة على أنها النسبة المئوية للمنطقة التي يغطيها خط الهجرة مقارنة بالمنطقة بأكملها التي تم التقاطها في الصورة.
- قم بتسجيل ناحية النسبة المئوية لخط الترحيل وتأكد من أن هذه القيمة مقترنة بعدد الخلايا التي يتم ترحيلها لنفس الصورة.
7 - تحليل البيانات
- تطبيع عدد الخلايا التي يتم ترحيلها إلى منطقة النسبة المئوية للخدش. تقسيم عدد الخلايا المُهاجرة على مساحة النسبة المئوية لخط الترحيل (# الخلايا التي تم ترحيلها ٪ منطقة الترحيل). القيام بذلك لكل صورة وليس متوسط على أساس الهجرة في البئر.
- بعد تطبيع القيم لكل صورة، أضف قيم الصورتين، التي تمثل بشكل جيد فردي. سيتم استخدام هذه القيمة للتحليل الرسومي والإحصائي. إذا احتوى التصميم التجريبي على نسخ متماثلة متعددة. متوسط القيم المتماثلة قبل التحليل الإحصائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوثق هذا الإجراء نهجًا جديدًا لدراسة ترحيل الخلايا، وهو نهج فعال من حيث التكلفة وقابل للتكيف بسهولة بالنسبة لمعظم المختبرات. وقد استخدمت العديد من الدراسات مجهرية الفاصل الزمني لتقييم هجرة الخلايا، ولكن المعدات اللازمة لهذه الطريقة ليست متاحة بسهولة للعديد من المختبرات. في حين أن استخدام خطوط وشرطات لترسيم يسمح لقدرة لاستعادة مناطق محددة من الاهتمام في نقاط زمنية مختلفة دون استخدام معدات باهظة الثمن(الشكل 1 & الشكل 3). وفي حين أن استخدام الترسيمات أمر أساسي لهذا النهج الجديد، فإن هناك العديد من المجالات في هذا الأسلوب التي يمكن تكييفها لتناسب احتياجات الباحثين الفردية. وأشار البروتوكول إلى نقطة نهاية 24 ساعة؛ ومع ذلك، يمكن توسيع نقطة النهاية هذه استناداً إلى احتياجات مختبر الفردية. ضبط نقطة نهاية البروتوكول يمكن أن تسمح لاستزراع مستمر من الخلايا لمزيد من الاستخدام. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا البروتوكول بالمرونة لاختبار تأثير المعدلات الدوائية فضلاً عن ركائز المصفوفة خارج الخلية على الترحيل. وأخيراً، فإن العنصر الأكثر تكلفة في هذه الطريقة هو استخدام برامج التصوير، التي قد تكون برامجية مرخصة، ولكن استخدام البرمجيات المرخصة ليس هو الخيار الوحيد. ويمكن الاستفادة من برامج التصوير الأخرى التي تسمح لتوليد خطوط وتراكب الصور مع هذه الطريقة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يقدم إلى الطبيعة الفعالة من حيث التكلفة والقابلة للتكيف لهذه الطريقة، نهجا جديدا لدراسة هجرة الخلايا عن طريق العوملة في منطقة الصفر.
وقد استخدم هذا النهج الجديد مؤخرا في بور وآخرون 2020 لتقييم الاختلافات في الهجرة الليفية القلبية بين الخلايا المعزولة من قلوب السكري وغير السكري20. ويعرض الشكل 3 صوراً تمثيلية تستخدم لتقييم الهجرة الليفية. من هذه الصور، تقرر أن 46 الخلايا الليفية من قلوب غير السكري و 129 الخلايا الليفية من قلوب السكري قد هاجرت خلال الفترة الزمنية 24 ساعة من التجربة. بناء على مقارنات المجموعة، عدد الخلايا من قلوب السكري قد هاجر 2.8x أكبر من الخلايا من قلوب غير السكري(الجدول 1). في حين أن هذه النتائج تشير إلى أن الخلايا من قلوب مرضى السكري قد هاجرت أكثر ، كانت الأرقام مضللة ، لأن منطقة الصفر كانت مختلفة لكل من المجموعتين. وكانت منطقة الخدش غير السكري 24.78٪ من المساحة الإجمالية التي تم قياسها، في حين أن خدش هجرة السكري كان 16.77٪ من المساحة الإجمالية التي تم قياسها. عندما تم النظر في منطقة من نقطة الصفر، فإنه قدم نسبة (خلية رقم / ٪ منطقة الصفر) مشيرا إلى أن الخلايا الليفية من قلوب السكري هاجرت فعلا 4.13x أكبر من الخلايا من قلوب غير السكري. وأبرزت هذه النتائج أهمية النظر في مجال الهجرة عند إجراء عمليات فحص الهجرة.
11- ويوفر التطبيع إلى منطقة الهجرة تقييماً أفضل وأكثر صرامة لهجرة الخلايا وينفي الأخطاء البشرية المحتملة. في حين أن الطريقة الموصوفة تستخدم طرف P200 ماصة، والتي ينبغي أن توفر خدش موحد ومتسق، يمكن أن تحدث خدوش متفاوتة بسبب التناقضات البشرية. ويبرز الشكل 5 أهمية الاختلافات في عوامل الخدش. إذا كان أحد لمقارنة فقط عدد من الخلايا الليفية المهاجرة، فإنه يظهر أن الشكل 5A لديه ضعف عدد الخلايا المهاجرة مقارنة مع الشكل 5B. في حين أنه عندما يتم استخدام مساحة الخدش لتطبيع البيانات ، فإنه يشير إلى أن نسبة الخلايا الليفية إلى منطقة الهجرة متشابهة في كل من الشكل 5A والشكل 5B. على سبيل المثال، استخدمنا الخلايا الليفية غير السكرية غير المعالجة من العزل الليفية المختلفة. ولذلك، ينبغي أن تكون نسبة الهجرة مماثلة النتيجة المتوقعة نظرا لطبيعة الخلايا المستخدمة في الشكل 5. إذا كان أحد تقديم عدد الخلايا التي تم ترحيلها فقط، يمكن أن تكون هذه النتيجة تحريف إذا كانت المنطقة المخدوشة ليست موحدة ومتسقة عبر جميع العينات. ولذلك، من المهم أن حساب للمنطقة خدش مع هذا الأسلوب، فضلا عن غيرها من المقايسات ترحيل الخدش. وقد أظهرت هذه النتائج التي تم عرضها في الشكل 5 كيف أن تطبيع عدد الخلايا التي تم ترحيلها إلى المنطقة المخدوشة يمكن أن يقدم بيانات ترحيل دقيقة وقابلة للتكرار وموثوقة.
الشكل 1: رسم بياني للتصميم التجريبي لجرة هجرة الخدش الليفية. الإعداد: قبل الطلاء الخلايا في جيدا، رسم خط و 3 علامات اندفاعة على الجزء السفلي على لوحة. 0 ح: خلايا الثقافة حتى 95٪ التقاء وإدارة الصفر يوازي الخط يصور. التقاط 0 ح الصور عن طريق اختيار قسم أعلاه وأسفل اندفاعة الأوسط. 24 ساعة: السماح للخلايا بالهجرة لمدة 24 ساعة قبل تحديد وتلطيخ. للصور 24 ساعة، محاذاة بشكل جيد في نفس الموقف مثل 0 ح الصور لالتقاط الخلايا التي تم ترحيلها. تحليل: مخطط منطقة الهجرة على 0 صورة ح ومن ثم تراكب صورة 0 ح على صورة 24 ح لتوليد الهجرة وصور المنطقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الصور التمثيلية التي تظهر تلطيخ كوماسي لا تتداخل مع التصور من الخلايا. كانت مطلية الخلايا الليفية القلبية إما على أي الكولاجين (طبق من البلاستيك)، والكولاجين معزولة من ذيول الفئران غير السكري، أو الكولاجين معزولة من ذيول الفئران السكري. واستخدمت الخلايا في فحص الهجرة الصفر اتباع الطرق المذكورة هنا. كانت الخلايا ملطخة مع 1٪ Coomassie وصمة عار الأزرق الرائعة ومن ثم تم التقاط صور للخلايا المهاجرة. شريط المقياس المصور على الصورة هو 100 ميكرومتر. وترد تفاصيل عن عزل الكولاجين و / أو الهجرة الخلية على الكولاجين في بور وآخرون20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بيانات تمثيلية توضح الفرق في الهجرة الليفية القلبية بين الخلايا غير السكرية وغير السكري. 0 ح و 24 ح الصور المستخدمة لحساب عدد من الخلايا الليفية القلبية المهاجرة معزولة عن الفئران السكري وغير السكري غير (الخط الأحمر يصور منطقة الهجرة والصور التي اتخذت في 20x مع شريط مقياس = 100 μm). وكان لدى الخلايا القلبية السكرية 129 خلية تهاجر في منطقة 16.77 في المائة، مما أدى إلى نسبة هجرة قدرها 7.69. وكان الليفي غير السكري 46 الخلايا الهجرة مع مساحة 24.78٪ مما أدى إلى نسبة 1.86. وقد استخدمت الصور المعروضة في هذا الشكل في النتائج المعروضة في Burr etal. 20، ولكن الصور التي تم تصويرها هنا لم تظهر في Burr etal. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: رسم بياني يصور توليد مساحة صورة الهجرة. الخطوة #1: فتح صورة الترحيل التي تحتوي على خطوط الترحيل. الخطوة #2: تتم إزالة الصورة 24 ح، وترك على خطوط الترحيل في مجال الصورة. الخطوة #3: تم استخدام أداة الفرشاة لملء منطقة الترحيل. الخطوة #4: يتم تحويل الصورة إلى تدرج الرمادي ثم حفظها كصورة جديدة. شريط مقياس يمثل 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مثال على تأثير مناطق الهجرة المختلفة على الهجرة الليفية. مطلية غير السكري القلبية الليفية على أطباق الثقافة البلاستيكية وتستخدم في اختبار الهجرة الصفر، كما هو موضح أعلاه (شريط مقياس = 100 ميكرومتر). (أ) هاجر 92 الخلايا الليفية مع مساحة في المئة من 35.4 ٪ مما أدى إلى نسبة هجرة 2.60. (ب) 45 الخلايا الليفية هاجرت مع مساحة 17.57٪ التي تحسب نسبة 2.56. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نوع الخلايا الليفية | متوسط عدد الخلايا التي تم ترحيلها | متوسط مساحة الخدش | رقم الخلية إلى نسبة المساحة المخدوشة |
| الخلايا الليفية من قلوب غير السكري | 46 | 24.78% | 1.86 |
| الخلايا الليفية من قلوب السكري | 129 | 16.77% | 7.69 |
الجدول 1: بيانات الهجرة من مقايسة خدش الهجرة باستخدام الخلايا الليفية القلبية غير السكرية والسكري. تم تحديد عدد الليفية غير السكري والسكري التي هاجرت باستخدام الشكل 3. تم حساب نسبة النسبة المئوية لكل صورة باستخدام الطرق الموصوفة و ImageJ. تم حساب نسبة الترحيل بقسمة عدد الخلايا الليفية التي تم ترحيلها على منطقة الترحيل في المائة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا النهج الجديد لاختبار الهجرة الصفر يوفر وسيلة أكثر سهولة للباحثين لدراسة التغيرات في هجرة الخلايا. في حين أن هذا الفحص يتبع نفس الإجراء لإدارة خدش مشابه لتشاتد الخدوش الأخرى ، فإنه يوفر طريقة جديدة للتصوير والتحليل الدقيق لهجرة الخلايا10. بدلاً من استخدام أساليب مكثفة المعدات من الوقت الفاصل المجهري والخلايا الحية التصوير غرف، وهذا الأسلوب تفاصيل استخدام معدات المختبر المتاحة عادة. باستخدام المجهر العام المقلوب والكاميرا، يمكن للمرء التقاط صور الهجرة في نفس الوقت مع الحفاظ على ظروف الثقافة متسقة. وبالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الطريقة تصويرا دقيقا لنفس المنطقة ذات الاهتمام دون استخدام المعدات المتقدمة. والتقليل من نفس منطقة الهجرة سيقلل من التناقضات في تحديد ترحيل الخلايا ويوفر قياسا أكثر دقة ودقة لترحيل الخلايا. وأخيراً، تأخذ هذه الطريقة في الاعتبار مساحة نقطة الصفر. في حين أن الحذر يؤخذ لتقليل الاختلافات البشرية في الخدوش ، يمكن أن تحدث حالات عدم اتساق ، مما يدل على أهمية استخدام المنطقة كعامل تطبيع في تحليل هجرة الخلايا. وعموما، يوفر البروتوكول المفصل أعلاه نهجا جديدا لأداة قوية تستخدم عادة لتقييم ترحيل الخلايا.
إن وضع مقايسة للهجرة قابلة للتكيف يوفر سبلا جديدة للبحث. إن اختبار الهجرة المعروض هنا له القدرة على التعديل من أجل دراسة مسائل بحثية محددة. ويمكن إجراء تعديلات بشأن تفعيل أو تثبيط بروتينات معينة من الفائدة. يمكن تطبيق الكواشف مثل المعدلات الدوائية (ناهضات أو الخصوم) وتدخل الحمض النووي الريبي على فحص الهجرة قبل الهجرة أو خلالها أو حتى بعدها لمعالجة الأسئلة حول الهجرة وبروينات محددة. كما يسمح الحجم الصغير لطبق الـ 48 بالآبار بإضافة كميات أقل من المعدلات، وهي طريقة أخرى فعالة من حيث التكلفة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل هذا المقايسة لدراسة تأثير مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) على ترحيل الخلايا. في الآونة الأخيرة قمنا بتطبيق هذه الطريقة، حيث كانت مغلفة لوحات ثقافة الخلية مع الكولاجين معزولة عن الفئران السكري وغير السكري لتقييم تأثير مصفوفة السكري خارج الخلية لديه على الهجرة الخلايا الليفية القلبية20. في حين أن هذه الدراسة تستخدم الكولاجين المعزولة، يمكن تكييف هذه الطريقة مع المكونات الأخرى خارج الخلية التي قد تكون ذات فائدة. القدرة على تقييم تأثير الهجرة ECM مفيد جدا نظرا لدراسات متعددة تشير إلى أهمية ECM على الهجرة20,21,22. وهناك مضاعفات محتملة التي قد تحدث مع استخدام بروتينات ECM وطلاء الآبار مع حل ECM مركزة للغاية هو تأثير على التصور من الخلايا. من المستحسن إذا استخدام ECM، مثل الكولاجين، لمعطف بئر وبقعة مع Coomassie الأزرق لمعرفة ما إذا كان ECM يمكن أن يضعف بصريا التصوير من الخلايا. إذا كان ECM يضعف الخلايا التصور، التخفيف حل ECM تحسين هذه المشكلة والسماح لتصور الخلايا على ECM.
هذا النهج الجديد على تقنية قديمة لا تقدم بعض القيود. وقد تم تكييف هذه الطريقة على نطاق صغير (48-جيدا لوحة ثقافة الخلية) ، وربما لا تنتقل إلى لوحات أكبر بسهولة. ونظرا لحجم البئر والمنطقة التي تم التقاطها في الصور، يمكن لهذا البروتوكول أن يوثق جزءا كبيرا من مساحة الهجرة. ومع ذلك، توسيع هذا الأسلوب إلى أبعاد البئر أكبر قد يؤدي إلى التقاط جزء أقل من منطقة الترحيل. ويمكن حل هذا الأمر عن طريق زيادة عدد الصور الملتقطة، ولكن قد يلزم تطبيق أساليب إضافية لضمان إمكانية إعادة تحديد منطقة الترحيل التي تم تصويرها للصور التي تبلغ 24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، يقتصر هذا الأسلوب على الخلايا التي يمكن استخدامها في إجراء مسح الترحيل الصفر. قد لا تكون الخلايا التي لا تستجيب في عملية فرز هجرة الخدش التقليدية مثالية للنهج المعروض في هذه المخطوطة. وفي حين أن هناك بعض القيود على هذا النهج، فإن تعديل الأساليب المفصلة في هذه المخطوطة يمكن أن يخفف من بعض القيود.
تتبع مقايسة هجرة الخدش نهجًا بسيطًا ولكن هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب اتباعها لإنتاج مقايسة ناجحة. خطوة حاسمة هي رسم علامات تشير على الجزء السفلي من البئر. إذا لم يتم رسم المؤشرات على الآبار سيكون من الصعب جدا / من المستحيل التمييز بين المنطقة التي تحتاج إلى صورة لصورة 24 ح وكذلك منع استعادة نفس المنطقة من الهجرة. أيضا، من المهم استعادة نفس المنطقة من الهجرة في صورة 24 ح التي تم التقاطها في صورة 0 ح. إذا لم يتم التقاط نفس المنطقة في 24 ساعة ثم تراكب الصور للهجرة لن تكون مجدية. بدون الصور المتراكبة لن يكون من الممكن تحديد الخلايا التي تم ترحيلها. الصور المتراكبة ضرورية لهذا الأسلوب، لأنها توفر تحديد دقيق لترحيل الخلايا. منذ طريقة الصفر لا توفر دائما خطوط الصفر مستقيم، فمن الأهمية بمكان أن تكون صور المناطق الصحيحة لتوليد الصور متراكبة. الصور المتراكبة توفر الأساس لدقة هذا الفحص الهجرة المعروضة في هذه المخطوطة.
ويوفر التكيف الجديد لمجرّد الخدش نهجاً أكثر يسراً ومرونة لدراسة هجرة الخلايا. وقد استخدمت الدراسات السابقة المتعلقة بهجرة الخلايا أساليب مكثفة في المعدات غير متوفرة عادة لكل مختبر. إن الإشارة إلى أن وضع مقايسة للهجرة لها نطاق أوسع من إمكانية الوصول أمر ضروري. وصفت هذه المخطوطة مقاربة جديدة لتقنية قديمة من شأنها أن تزيد من إمكانية وصول الباحثين المهتمين بهجرة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يوفر هذا الأسلوب القدرة على تغيير بيئة ثقافة الخلية، سواء عن طريق مكونات المصفوفة خارج الخلية أو استخدام المعدلات الدوائية، لتحديد التأثير الذي له على ترحيل الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من قبل جائزة البحوث الطبية للجيش الأمريكي #81XWH-16-1-0710، جامعة ميسيسيبي كلية الصيدلة وقسم العلوم الحيوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
