Summary
We presenteren een kosteneffectieve methode om de scratch migratie test die een nieuwe aanpak voor het bepalen van celmigratie biedt zonder het gebruik van apparatuur-intensieve methoden. Terwijl fibroblasten werden gebruikt in dit protocol, kan het worden aangepast en gebruikt om extra celtypen en invloeden op celmigratie te bestuderen.
Abstract
Celmigratie is een belangrijke component in zowel fysiologische als pathologische gebeurtenissen. Normale celmigratie is vereist voor essentiële functies zoals ontwikkeling en het monteren van een immuunrespons. Wanneer een defect of wijziging optreedt met het celmigratieproces, kan het schadelijke resultaten hebben (d.w.z. kankermetastase, wondgenezing en littekenvorming). Vanwege het belang van celmigratie is het noodzakelijk om toegang te hebben tot een celmigratietest die betaalbaar, aanpasbaar en herhaalbaar is. Met behulp van de gemeenschappelijke scratch migratie test, hebben we een nieuwe aanpak ontwikkeld voor het analyseren van celmigratie die algemene laboratoriumapparatuur gebruikt. De beschreven methode maakt gebruik van visuele markers die het mogelijk maken om specifieke interessegebieden te heroveren zonder het gebruik van time-lapse microscopie. Daarnaast biedt het flexibiliteit in het experimentele ontwerp, variërend van het veranderen van het migratiematrijssubstraat tot de toevoeging van farmacologische modifiers. Bovendien schetst dit protocol een manier om rekening te houden met het gebied van celmigratie, dat niet door verschillende methoden wordt beschouwd bij het onderzoeken van celmigratie. Deze nieuwe aanpak biedt een scratch migratie test aan een groter publiek en biedt onderzoekers meer mogelijkheden om de fysiologische en pathofysiologische impact van celmigratie te onderzoeken.
Introduction
Celmigratie is cruciaal voor veel fysiologische en pathologische gebeurtenissen. Het is nodig tijdens de ontwikkeling, voor het monteren van een immuunrespons, en voor een goede wondgenezing1,2,3. Veel van deze celmigratiegebeurtenissen kunnen worden veroorzaakt door fysieke of chemische signalen. Bijvoorbeeld, tijdens een immuunrespons, leukocyten zal migreren naar een site van letsel in reactie op een chemoattractant2. Daarnaast zullen leukocyten ook cytokines vrijgeven om migratie van extra immuuncellen te induceren, evenals andere celtypen, zoals fibroblasten, die betrokken zijn bij het wondgenezingsproces, en dus een meercellige respons4in werking treden. Het vermogen van cellen om te migreren is essentieel voor een goede fysiologische functie; wanneer de celmigratie echter ongecontroleerd blijft, kan deze een negatieve respons hebben en bijdragen tot pathologische voorvallen, zoals chronische ontsteking, vasculaire ziekte, metastase van kanker en verminderde wondgenezing2,3,4,5,6,7. Verminderde wondgenezing is een veel voorkomende aandoening van diabetici als gevolg van defecten in celmigratie, en als deze gebreken niet worden aangepakt, kan dit leiden tot verdere complicaties (bijvoorbeeld amputatie8,9). Deze studie, evenals anderen, hebben aangegeven dat het proces waarbij celmigratie plaatsvindt verder moet worden begrepen, hetzij onder normale fysiologische of pathologische omstandigheden, en het is van vitaal belang om dit onderzoeksgebied te bevorderen. Om dit te bereiken, moeten er migratietesten beschikbaar zijn die zowel toegankelijk als betaalbaar zijn voor die onderzoekers, die mogelijk niet over de apparatuur beschikken die nodig is om deze tests uit te voeren.
Momenteel zijn er verschillende migratietesten beschikbaar om een breed scala aan onderwerpen met betrekking tot celmigratie te onderzoeken. Zowel 2D- als 3D-migratiemodellen zijn ontwikkeld, die zich richten op specifieke gebieden die van invloed zijn op celmigratie. 3D-migratiemodellen worden doorgaans geassocieerd met celinvasiestudies en beoordelen de impact van extracellulaire matrix op celmigratie10,11,12, terwijl 2D-migratietesten een groter toepassingsgebied hebben en voornamelijk worden gebruikt om chemotactische migratie, wondgenezing en functionele veranderingen te bestuderen tijdens celmigratie13,14,15,16. Een aantal van deze tests vereisen extra apparatuur, zoals Boyden kamers of uitsluiting ringen, die de beschikbaarheid van deze tests voor bepaalde onderzoekers kan verminderen. Een van de meer kostenefficiënte testen is de scratch-test, die meestal wordt gebruikt om wondgenezing en algemene veranderingen in celmigratie14,17te beoordelen . Terwijl de meeste laboratoria zijn uitgerust om een krastest uit te voeren, de apparatuur die wordt gebruikt om celmigratie te volgen hebben de neiging om ofwel niet beschikbaar of te duur om te kopen. Dit omvat time-lapse microscopie, die een omgekeerde microscoop en een live imaging systeem vereist. Deze dure apparaten zijn niet algemeen toegankelijk voor elk laboratorium. Daarom benadrukt deze observatie de noodzaak van een nieuw protocol dat de beoordeling van celmigratie met gemakkelijker beschikbare apparatuur mogelijk maakt.
Het hier gepresenteerde protocol biedt een nieuwe en betaalbare manier om celmigratie te beoordelen. Deze methode volgt dezelfde procedure in verband met krastesten, maar verschilt in de analyse van het onderzoeken van celmigratie door gebruik te maken van apparatuur die vaker beschikbaar is in een laboratoriumomgeving voor basiswetenschappen. Dit protocol met behulp van gemeenschappelijke apparatuur zorgt voor een nauwkeurigere bepaling van celmigratie zonder het gebruik van time-lapse microscopie. Naast het bepalen van migratie, is deze methode ook verantwoordelijk voor variabele factoren in het krasgebied waarvan is opgemerkt dat deze een grote impact heeft op celmigratie. Over het algemeen biedt dit nieuwe protocol voor celmigratieanalyse de mogelijkheid voor meer laboratoria om te verkennen en bij te dragen aan het gebied van celmigratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Algemene celcultuur
- Cultuur cardiale fibroblasten in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) met 1 g/L glucose, natriumpyruvaat, L-glutamine, en aangevuld met 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% inactief foetaal runderserum (FBS), 2% L-glutamine en 0,02% antimicrobiële reagens (zie tabel met materialen)en gehandhaafd in CO2-incubator bij 37 °C.
- Cultuur cardiale fibroblasten tot 90-95% samenvloeiing wordt bereikt bij passage 0 (P0). Op dit punt zijn de fibroblasten klaar om te worden opgesplitst in een 48-put plaat, die wordt gebruikt voor de migratietest.
2. Bereiding van de migratieplaat
- Bereid een 48-well cel cultuur plaat door het tekenen van een lijn, met behulp van een gele of lichtgekleurde permanente marker, in het midden van de put. Teken vervolgens drie hash-markeringen die de put verdelen in drie afzonderlijke aandachtsgebieden. Deze secties zullen worden gebruikt voor beeldvorming.
OPMERKING: Met behulp van een lichte kleur permanente marker zal zorgen voor een gemakkelijke beeldvorming van migrerende cellen. Donkere markeringen zoals zwart of blauw voorkomen visualisatie van migrerende cellen. - Bij het beoordelen van migratie op een substraat (bijvoorbeeld collageen), de vacht van de put op dit moment volgens instructies en concentraties die worden gebruikt voor het specifieke substraat.
- Plaat ~ 15.000-20.000 cardiale fibroblasten, P1, in elke put en cultuurcellen, onder normale kweekomstandigheden (voorwaarden vermeld in de vorige sectie), totdat ze 90-95% samenvloeiing bereiken. Confluency moet worden bereikt tussen 24-48 uur.
OPMERKING: Zorg er bij het instellen van de migratieplaat voor dat u een positieve controle opneemt (een bekende migratiecel, zoals 3T3-cellen18),een negatieve controle (niet-geëctocchede cellen) en een lege put.
3. Test-test en fixatie voor krassen
- Zodra cellen bereiken 90-95% samenvloeiing, verwijder de media en kras langs de getrokken lijn met behulp van een steriele P200 pipette tip.
LET OP: Een P200 pipet tip is de gemeenschappelijke pipet tip formaat gebruikt met de scratch test10,14,19. Maak ook slechts één pas met de P200-tip, omdat meer dan één poging kan resulteren in meerdere kraslijnen. - Spoel de put af met lage serummedia (1,5% FBS) om niet-aangesloten cardiale fibroblasten te verwijderen.
- Voeg 500 μL lage serummedia toe aan elke put. Als u farmacologische middelen gebruikt, voegt u ze op dit moment toe.
OPMERKING: Lage serummedia worden gebruikt omdat het celmigratie mogelijk maakt/bevordert en voorkomt dat fibroblasten zich vermenigvuldigen, waardoor de resultaten van de migratietest kunnen wordenscheefgetrokken 20. Voor dit protocol werd 1,5% FBS gebruikt. - Leg 0 uur beelden vast voordat u de fibroblasten uitbroedt in een 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende 24 uur.
- Leg 0 uur beelden vast met behulp van een omgekeerde microscoop met een 20x-doelstelling. Neem twee 0 h beelden per put. Dit zal zorgen voor een meer volledige dekking van de lijn van migratie.
- Met behulp van de markeringen (lijn en streepjes), plaats de put om de bovenste helft van de lijn van de kras vast te leggen. Vermijd beeldvorming van het middelste streepje om ervoor te zorgen dat hetzelfde migratiegebied niet twee keer wordt weergegeven, wat de resultaten kan scheeftrekken.
- Gebruik imaging software(Tabel van materialen) om 0 uur beeld #1 vast te leggen. Beweeg vervolgens de plaat om de onderste helft van de put / lijn van de kras in het zicht van de camera positie. Nogmaals, vermijd het vastleggen van het middelste streepje. Eenmaal op zijn plaats, leg 0 uur beeld #2 (Figuur 1).
OPMERKING: Het vermijden van het middelste streepje in beide 0 uur-beelden voorkomt dat het twee keer vastleggen van migratiegebieden wordt vastgelegd, wat als dit gebeurt, herhalende resultaten kan opleveren en de gegevens kan scheeftrekken.
- Na het uitbroeden voor 24 uur, verwijder de media uit de put, en was de put met 1x niet-steriele PBS (voortaan alle 1x PBS gebruikt is niet-steriel).
- Voeg in de rookkap 500 μL van 4% paraformaldehyde toe aan de put en broed gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder paraformaldehyde en was 3x met 1x PBS gedurende 5 minuten per stuk bij RT.
- Zodra cellen zijn gewassen, ga dan over tot het vastleggen van 24 uur beelden of voeg 1x PBS aan elke put en plaats op 4 °C tot een later tijdstip. Cellen kunnen 1-2 weken op 4 °C blijven tot ze klaar zijn om te beelden.
- Permeabiliseren van de cellen door het toevoegen van 300 μL permeabiliserende oplossing (1x PBS en 0,01% triton X-100) aan elke put. Incubeer cellen/plaat met zachte, voortdurende schommelen voor 30 min op RT.
- Verwijder de permeabiliserende oplossing en voeg 1% Coomassie Brilliant Blue vlek (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% azijnzuur, 45% methanol en 45% dH2O) toe voor 10 minuten met zacht, continu schommelen bij RT.
OPMERKING: Als platen zijn bekleed met een extracellulaire matrix substraat zorg ervoor dat een gecoate plaat te testen met Coomassie vlekken voor het uitvoeren van migratie test. Figuur 2 toont aan dat een matrixsubstraat kan worden gebruikt met deze test en geen impact visualisatie van cellen. - Was putten 3x met 1x PBS bij RT met continue rocken voor 5 min per stuk.
- Na wasbeurten, toegevoegd 300 μL van 1x PBS en vangen 24 h beelden.
- Leg 24 uur beelden vast door de put in dezelfde positie uit te lijnen die werd gebruikt om de 0 h-beelden vast te leggen. Om dit te bereiken, open de eerder vastgelegde 0 uur beelden en met behulp van de markering gemaakt met de permanente marker, uitlijnen van de put in dezelfde positie. De lijn omlaag in het midden en extra streepjesmarkeringen moet een nauwe uitlijning tussen de 24 uur-afbeelding en de 0-uurafbeelding mogelijk maken(figuur 1).
4. Voorbereiding van 0 uur en 24 uur beelden
- Open 0 uur en 24 uur foto's genomen van dezelfde put en positie in imaging software (Table of Materials).
- Maak een nieuwe laag op de afbeelding van 0 uur. Klik vervolgens op de nieuwe laag en wijzig de naam van de laag in 'lijnlaag' door op de tekst te dubbelklikken.
OPMERKING: Deze laag wordt vanaf dit punt lijnlaag genoemd. - Klik op het penseelgereedschap (penseelpictogram) en stel de grootte in op 10 px en de kleur op rood.
- Als de lijnlaag is geselecteerd, tekent u twee afzonderlijke regels die het gebied van de kras aangeven. De lijnen mogen geen cellen raken als gevolg van deze lijnen die het migratiegebied markeren.
- Klik op het gereedschap Verplaatsen (pijlpictogram) en druk op de ctrl-knop en klik op zowel de lijn- als achtergrondlagen.
- Klik in het midden van de 0 h afbeelding en sleep beide lagen naar het midden van de 24 uur afbeelding.
- Klik nu met behulp van de 24 uur afbeelding op de 0 h achtergrondlaag en verander de dekking tot 50%.
- Houd ctrl ingedrukt, klik op zowel de achtergrond van 0 uur als de lijnlaag en transformeer de lagen vervolgens vrij(Bewerken>Vrije transformatie). Lijn met behulp van vrije transformatie de achtergrond en lijnafbeelding van 0 uur uit op de achtergrondafbeelding van 24 uur. Deze stap resulteert in de overlaying van de 0 h en 24 h beeld, die nodig is om de lijnen die het gebied van migratie markeren in de juiste positie op de 24 uur beeld.
- Nadat u de achtergrond van 0 uur en lijnlagen op de achtergrondafbeelding van 24 uur hebt uitgevoerd, verwijdert u de achtergrondlaag van 0 uur. Verwijder door op de achtergrondlaag van 0 uur te klikken, klik vervolgens met de rechtermuisknop en klik op laag verwijderen.
- Het verwijderen van de 0 h achtergrond afbeelding zal alleen de lijn en de 24 h achtergrond laag (nu aangeduid als migratie afbeelding). De lijnlaag geeft het migratiegebied/kras op de 24 uur-afbeelding aan en kan worden gebruikt voor het bepalen van het aantal migrerende cellen.
- Opslaan als de nieuwe migratieafbeelding als zowel een photoshop-bestand als een TIFF/JPEG. OPMERKING: een representatief cijfer dat dit proces weergeeft, wordt weergegeven in figuur 3.
5. Tellen van het aantal migrerende cellen
- Open de migratieafbeelding. Dit kan worden gedaan in een programma dat TIFF / JPEG-bestanden(Tabel van materialen)accepteert.
- Tel het aantal cellen dat zich tussenin bevindt en raak de twee rode lijnen aan.
- Het aantal migrerende cellen per afbeelding registreren. Er zullen twee migrerende afbeeldingen per put zijn en deze waarden mogen pas worden gecombineerd nadat de waarden zijn gecorrigeerd voor migratiegebied (beschreven in de volgende sectie).
6. Migratiegebied bepalen
- Open de 24 uur beeld dat de lijnen van migratie bevat in de imaging software programma in sectie 5 (Tabel van materialen).
- Opslaan als deze afbeelding als 'Afbeelding migratiegebied'.
- Klik na opslaan op de achtergrondlaag, klik met de rechtermuisknop en klik op laag verwijderen. Dit moet alleen de kraslijnen op de afbeelding achterlaten(figuur 3).
- Vul met het penseelgereedschap (penseelpictogram) het gebied tussen de kraslijnen in. Overeenkomen met de kleur van het penseel met de kleur die wordt gebruikt om de lijnen te tekenen voor migratie.
- Wijzig de afbeelding in een grijswaarden om een zwart-witafbeelding te genereren(Afbeelding>Modus>Grijswaarden)en sla de afbeelding op (figuur 4).
- Start de analysesoftware(Tabel van materialen)en open vervolgens het bestand "Gebied van migratie" in analysesoftware.
- Als u het gebied van de migratielijn wilt bepalen, klikt u op Afbeelding>Aanpassen>Drempelwaarde. Het zwarte migratiegebied wordt rood en het procentengebied wordt aangegeven in het vak Drempel. Het gebied wordt gerapporteerd als het percentage van het gebied dat de migratielijn dekt in vergelijking met het hele gebied dat in het beeld is vastgelegd.
- Nota van het percentagegebied voor de migratieregel en zorg ervoor dat deze waarde wordt gekoppeld aan het aantal migrerende cellen voor dezelfde afbeelding.
7. Gegevensanalyse
- Normaliseer het aantal migrerende cellen naar het procentuele gebied van de kras. Het aantal migrerende cellen verdelen door het percentage van de migratieregel (# gemigreerde cellen % Migratiegebied). Doe dit per afbeelding en niet een gemiddelde op basis van migratie per put.
- Nadat u waarden per afbeelding hebt genormaliseerd, voegt u de waarden van de twee afbeeldingen toe, die een afzonderlijke put vertegenwoordigen. Deze waarde wordt gebruikt voor grafische en statistische analyse. Als het experimentele ontwerp meerdere replicaties bevatte. Gemiddelde repliceren waarden voor statistische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze procedure documenteert een nieuwe benadering van het bestuderen van celmigratie die zowel kosteneffectief als gemakkelijk aanpasbaar is voor de meeste laboratoria. Veel studies hebben time-lapse microscopie gebruikt om celmigratie te beoordelen, maar de apparatuur die nodig is voor deze methode is niet direct beschikbaar voor veel laboratoria. Overwegende dat het gebruik van lijnen en streepjes voor afbakening het mogelijk maakt om specifieke aandachtsgebieden op verschillende tijdstippen te heroveren zonder het gebruik van dure apparatuur (figuur 1 & figuur 3). Hoewel het gebruik van afbakeningen essentieel is voor deze nieuwe aanpak, zijn er veel gebieden van deze methode die kunnen worden aangepast aan de individuele behoeften van onderzoekers. Het protocol gaf een eindpunt van 24 uur aan; dat eindpunt kan echter worden uitgebreid op basis van de behoeften van een individueel lab. Het aanpassen van het eindpunt van het protocol kan het mogelijk maken om cellen verder te kweken voor verder gebruik. Bovendien maakt dit protocol de flexibiliteit mogelijk om de impact van farmacologische modifiers en extracellulaire matrixsubstraten op migratie te testen. Ten slotte is het duurste onderdeel van deze methode het gebruik van imaging software, die kan worden gelicentieerd software, maar het gebruik van gelicentieerde software is niet de enige optie. Andere imaging software die het mogelijk maken het genereren van lijnen en overlaying beelden kunnen worden gebruikt met deze methode. Bovendien biedt het, gezien het kosteneffectieve en aanpasbare karakter van deze methode, een nieuwe aanpak voor het onderzoeken van celmigratie door rekening te houden met het gebied van de kras.
Deze nieuwe aanpak werd onlangs gebruikt in Burr et al. 2020 om verschillen in cardiale fibroblast migratie tussen cellen geïsoleerd van niet-diabetische en diabetische harten20te beoordelen. Figuur 3 bevat representatieve afbeeldingen die worden gebruikt om fibroblastmigratie te beoordelen. Uit deze beelden werd vastgesteld dat 46 fibroblasten van niet-diabetische harten en 129 fibroblasten uit diabetische harten waren gemigreerd tijdens de 24 uur durende periode van het experiment. Na groepsvergelijkingen was het aantal cellen uit de diabetische harten 2,8x groter gemigreerd dan cellen uit niet-diabetische harten(tabel 1). Terwijl deze resultaten aangegeven cellen uit diabetische harten was meer gemigreerd, de nummers waren misleidend, omdat het gebied van de kras was verschillend voor elk van de twee groepen. De niet-diabetische kras gebied was 24,78% van het totale gebied gemeten, terwijl de diabetische migratie kras was 16,77% van het totale gebied gemeten. Toen het gebied van de kras werd overwogen, verstrekte het een verhouding (celaantal/% krasgebied) dat aangeeft dat fibroblasten van diabetische harten eigenlijk 4.13x groter dan cellen van niet-diabetische harten migreerden. Deze resultaten benadrukten het belang voor het overwegen van migratiegebied bij het uitvoeren van migratietesten.
Normalisering op het gebied van migratie zorgt voor een betere en strengere beoordeling van celmigratie en ontkent mogelijke menselijke fouten. Terwijl de beschreven methode maakt gebruik van een P200 pipet tip, die moet zorgen voor een uniforme en consistente kras, ongelijke krassen kunnen optreden als gevolg van menselijke inconsistenties. Figuur 5 benadrukt het belang van factoring verschillen in krasgebied. Als men alleen het aantal gemigreerde fibroblasten zou vergelijken, zou blijken dat figuur 5A twee keer zoveel gemigreerde cellen heeft in vergelijking met figuur 5B. Terwijl wanneer het gebied van de kras wordt gebruikt om de gegevens te normaliseren, geeft het aan dat de verhouding tussen fibroblasten en migratiegebied vergelijkbaar is in zowel figuur 5A als figuur 5B. Voor dit voorbeeld gebruikten we onbehandelde niet-diabetische cardiale fibroblasten uit verschillende fibroblast-isolaties; Daarom moet een vergelijkbare migratieratio het verwachte resultaat zijn vanwege de aard van de cellen die in figuur 5worden gebruikt . Als men alleen het aantal gemigreerde cellen presenteerde, kunnen deze bevinding onjuist zijn als het bekraste gebied niet uniform en consistent is voor alle monsters. Daarom is het belangrijk om rekening te houden met het bekraste gebied met deze methode, evenals andere scratch migratie tests. Deze weergegeven resultaten in figuur 5 toonden aan hoe het normaliseren van het aantal gemigreerde cellen naar het bekraste gebied nauwkeurige, herhaalbare en betrouwbare migratiegegevens kan opleveren.
Figuur 1: Diagram van het experimentele ontwerp voor de fibroblast scratch migratie test. Setup: Voordat plating cellen in goed, teken een lijn en 3 streepjes merken op de bodem op de plaat. 0 uur: Kweekcellen tot 95% samenvloeiing en beheren van een kras parallel aan de afgebeelde lijn. Leg 0 uur beelden vast door een sectie boven en onder het middelste streepje te selecteren. 24 uur: Laat cellen 24 uur migreren voordat ze worden gerepareerd en bevlekt. Voor 24 uur beelden, goed uitlijnen in dezelfde positie als 0 h beelden om gemigreerde cellen vast te leggen. Analyse: Schets het migratiegebied op 0 uur-afbeelding en overlay vervolgens de 0-uur-afbeelding op de 24-uursafbeelding om migratie- en gebiedsafbeeldingen te genereren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve afbeeldingen die coomassie-kleuring laten zien, interfereert niet met de visualisatie van cellen. Cardiale fibroblasten werden verguld op ofwel geen collageen (plastic schotel), collageen geïsoleerd van niet-diabetische muizen staarten, of collageen geïsoleerd van diabetische muizen staarten. De cellen werden gebruikt in de scratch migratie test volgens de methoden die hier beschreven. Cellen werden gekleurd met 1% Coomassie Brilliant Blue vlek en vervolgens beelden van migrerende cellen werden gevangen. De schaalbalk die op de afbeelding wordt afgebeeld, is 100 μm. Details over collageenisolatie en/of celmigratie op collageen worden gepresenteerd in Burr et al.20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve gegevens waaruit het verschil in hartfiblastmigratie tussen niet-diabetische en diabetische cellen blijkt. 0 uur en 24 uur beelden gebruikt om het aantal gemigreerde cardiale fibroblasten geïsoleerd van niet-diabetische en diabetische muizen te berekenen (rode lijn toont het gebied van migratie en beelden genomen op 20x met schaalbalk = 100 μm). Diabetische hartcellen hadden 129 cellen migreren in een gebied van 16,77%, wat een migratieratio van 7,69 produceerde. Niet-diabetische fibroblasten had 46 cellen migreren met een gebied van 24,78% wat leidde tot een verhouding van 1,86. De beelden gepresenteerd in deze figuur werden gebruikt in de resultaten gepresenteerd in Burr et al.20, maar de hier afgebeelde beelden werden niet getoond in Burr et al.20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Diagram dat het genereren van het migratiegebied weergeeft. Stap #1: Open migratieafbeelding met migratielijnen. Stap #2: De afbeelding van 24 uur wordt verwijderd, waardoor de migratielijnen in het afbeeldingsveld worden verlaten. Stap #3: Het penseel is gebruikt om het migratiegebied in te vullen. Stap #4: de afbeelding wordt geconverteerd naar grijswaarden en vervolgens opgeslagen als een nieuwe afbeelding. Schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Een voorbeeld van de impact van verschillende migratiegebieden op fibroblastmigratie. Niet-diabetische cardiale fibroblasten werden verguld op plastic kweekschotels en gebruikt in de scratch migratie test, zoals hierboven beschreven (schaal bar = 100 μm). (A) 92 gemigreerde fibroblasten met een procentoppervlak van 35,4% wat resulteerde in een migratieratio van 2,60. (B) 45 fibroblasten gemigreerd met een oppervlakte van 17,57% die een verhouding van 2,56 berekent. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Fibroblasttype | Gemiddeld aantal gemigreerde cellen | Gemiddeld gebied van de Scratch | Celnummer naar bekraste gebiedsverhouding |
| Fibroblasten van niet-diabetische harten | 46 | 24.78% | 1.86 |
| Fibroblasten van Diabetic Hearts | 129 | 16.77% | 7.69 |
Tabel 1: Migratiegegevens van migratie scratch test met behulp van niet-diabetische en diabetische cardiale fibroblasten. Het aantal niet-diabetische en diabetische fibroblasten dat gemigreerd werd bepaald met behulp van figuur 3. Het percentagegebied voor elke afbeelding is berekend met behulp van beschreven methoden en ImageJ. De verhouding tussen migratie werd berekend door het aantal gemigreerde fibroblasten te delen door het migratiegebied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze nieuwe benadering van de scratch migratie test biedt een meer toegankelijke methode voor onderzoekers om veranderingen in celmigratie te onderzoeken. Hoewel deze test volgt dezelfde procedure voor het beheer van een kras vergelijkbaar met andere krastesten, het biedt wel een nieuwe methode voor beeldvorming en nauwkeurige analyse van celmigratie10. In plaats van apparatuur-intensieve methoden van time-lapse microscopie en live cel beeldvorming kamers, deze methode details het gebruik van algemeen beschikbare lab apparatuur. Met behulp van een algemene omgekeerde microscoop en camera, kan men vastleggen migratie beelden op hetzelfde moment met behoud van consistente cultuur voorwaarden. Bovendien biedt deze methode een nauwkeurige beeldvorming van dezelfde regio van belang zonder het gebruik van geavanceerde apparatuur. Het vastleggen van hetzelfde migratiegebied vermindert de inconsistenties bij het bepalen van celmigratie en zorgt voor een strengere en nauwkeurigere meting van celmigratie. Ten slotte houdt deze methode rekening met het gebied van de kras. Hoewel voorzichtigheid wordt geboden om menselijke variaties in krassen te minimaliseren, kunnen er nog steeds inconsistenties optreden, waaruit blijkt hoe belangrijk het is om het gebied te gebruiken als normaliserende factor in de analyse van celmigratie. Over het algemeen biedt het hierboven beschreven protocol een nieuwe benadering van een krachtig hulpmiddel dat vaak wordt gebruikt om celmigratie te beoordelen.
Het ontwikkelen van een aanpasbare migratietest biedt nieuwe mogelijkheden voor onderzoek. De hier gepresenteerde migratietest heeft de mogelijkheid om te worden gewijzigd om specifieke onderzoeksvragen te onderzoeken. Er kunnen wijzigingen worden aangebracht met betrekking tot het activeren of remmen van specifieke proteïnen van belang. Reagentia zoals farmacologische modifiers (agonisten of antagonisten) en RNA-interferentie kunnen worden toegepast op migratietest vóór, tijdens of zelfs na migratie om vragen over migratie en specifieke eiwitten aan te pakken. Het kleine volume van de 48 goed schotel maakt het ook mogelijk voor lagere hoeveelheden modifiers worden toegevoegd, dat is een andere kosteneffectieve methode. Bovendien kan deze test worden aangepast om de impact van extracellulaire matrixcomponenten (ECM) op celmigratie te bestuderen. Onlangs hebben we deze methode toegepast, waarbij celkweekplaten werden bekleed met collageen geïsoleerd van diabetische en niet-diabetische muizen om de impact van diabetische extracellulaire matrix te beoordelen heeft op cardiale fibroblast migratie20. Terwijl deze studie geïsoleerd collageen gebruikt, kan deze methode worden aangepast aan andere extracellulaire componenten die van belang kunnen zijn. Het vermogen om het effect van ECM-migratie te beoordelen is zeer nuttig vanwege meerdere studies waaruit het belang van ECM voor migratie20,21,22wordt aangetoond . Een mogelijke complicatie die kan optreden bij het gebruik van ECM-eiwitten en het coaten van de putten met een sterk geconcentreerde ECM-oplossing is een impact op de visualisatie van cellen. Het wordt aanbevolen als het gebruik van ECM, zoals collageen, om een put en vlek met Coomassie blauw jas om te zien of de ECM kan visueel afbreuk doen aan de beeldvorming van cellen. Als ECM het visualiseren van cellen schaadt, zal de verdunnende ECM-oplossing dit probleem verbeteren en cellen op ECM visualiseren.
Deze nieuwe aanpak van een oude techniek brengt wel wat beperkingen met zich mee. Deze methode is aangepast aan een kleine schaal (48-well celkweekplaat) en mag niet gemakkelijk overgaan op grotere platen. Vanwege de grootte van de put en het gebied vastgelegd in de beelden kan dit protocol een groot deel van het migratiegebied documenteren. Het uitbreiden van deze methode naar grotere putafmetingen kan echter resulteren in het vastleggen van een lager gedeelte van het migratiegebied. Dit kan mogelijk worden opgelost door het aantal vastgelegde afbeeldingen te verhogen, maar mogelijk moeten aanvullende methoden worden toegepast om ervoor te zorgen dat het gebied van de afbeelding van de migratie opnieuw kan worden geïdentificeerd voor de 24-uursafbeeldingen. Bovendien is deze methode beperkt tot cellen die kunnen worden gebruikt in een scratch migratie test. Cellen die niet reageren in een traditionele scratch migratie test kan niet ideaal zijn voor de aanpak gepresenteerd in dit manuscript. Hoewel er enkele beperkingen met deze aanpak, het wijzigen van de methoden die in dit manuscript kan verlichten een aantal van de beperkingen.
De scratch migratie test volgt een eenvoudige aanpak, maar er zijn een aantal kritische stappen die moeten worden gevolgd om een succesvolle test te produceren. Een cruciale stap is het tekenen van de markeringen op de bodem van de put. Als de indicatoren niet worden getrokken op de putten zal het zeer moeilijk / onmogelijk om het gebied dat moet worden afgebeeld voor de 24 uur beeld te onderscheiden, alsmede het voorkomen van heroveren hetzelfde gebied van migratie te onderscheiden. Ook is het belangrijk om hetzelfde migratiegebied te heroveren in het 24 uur-beeld dat werd vastgelegd in het 0-uurbeeld. Als hetzelfde gebied niet wordt vastgelegd op 24 uur dan is het niet haalbaar om de afbeeldingen voor migratie te bedekken. Zonder bedekte afbeeldingen zal het niet mogelijk zijn om te bepalen welke cellen zijn gemigreerd. De bedekte beelden zijn van cruciaal belang voor deze aanpak, omdat ze een nauwkeurige bepaling voor celmigratie bieden. Aangezien de krasmethode niet altijd rechte kraslijnen biedt, is het van cruciaal belang dat de juiste gebieden worden afgebeeld om de bedekte beelden te genereren. De bedekte beelden vormen de basis voor de juistheid van deze migratietest die in dit manuscript wordt gepresenteerd.
Een nieuwe aanpassing van de scratch migratie test biedt een meer toegankelijke en flexibele aanpak voor het onderzoeken van celmigratie. Eerdere celmigratiestudies hebben apparatuurintensieve methoden gebruikt die niet algemeen beschikbaar zijn voor elk laboratorium. Het is essentieel dat de ontwikkeling van een migratietest met een breder scala aan toegankelijkheid essentieel is. Dit manuscript beschreef een nieuwe benadering van een oude techniek die de toegankelijkheid voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in celmigratie zal vergroten. Bovendien biedt deze methode de mogelijkheid om de celcultuuromgeving te veranderen, hetzij via extracellulaire matrixcomponenten of het gebruik van farmacologische modifiers, om de impact te bepalen die heeft op celmigratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, University of Mississippi School of Pharmacy en het Department of BioMolecular Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
