Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

एक लागत प्रभावी और अनुकूलनीय स्क्रैच माइग्रेशन परख

Published: June 30, 2020 doi: 10.3791/61527
Automatic Translation
1, 1
1Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi

Summary

हम खरोंच माइग्रेशन परख के लिए एक लागत प्रभावी विधि प्रस्तुत करते हैं जो उपकरण-गहन तरीकों के उपयोग के बिना सेल माइग्रेशन का निर्धारण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है। जबकि इस प्रोटोकॉल में फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग किया गया था, इसे सेल माइग्रेशन पर अतिरिक्त सेल प्रकारों और प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित और उपयोग किया जा सकता है।

Abstract

सेल माइग्रेशन शारीरिक और पैथोलॉजिकल दोनों घटनाओं में एक प्रमुख घटक है। सामान्य सेल माइग्रेशन विकास और बढ़ते प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जैसे आवश्यक कार्यों के लिए आवश्यक है। जब सेल माइग्रेशन प्रक्रिया के साथ कोई दोष या परिवर्तन होता है, तो इसके हानिकारक परिणाम हो सकते हैं (यानी, कैंसर मेटास्टेसिस, घाव भरने और निशान गठन)। सेल माइग्रेशन के महत्व के कारण, सेल माइग्रेशन परख तक पहुंच होना आवश्यक है जो सस्ती, अनुकूलनीय और दोहराने योग्य है। आम खरोंच प्रवास परख का उपयोग करते हुए, हमने कोशिका प्रवास का विश्लेषण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण विकसित किया है जो सामान्य प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करता है। वर्णित विधि दृश्य मार्कर का उपयोग करती है जो समय-चूक माइक्रोस्कोपी के उपयोग के बिना ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों को फिर से कब्जा करने की अनुमति देती है। इसके अलावा, यह प्रायोगिक डिजाइन में लचीलापन प्रदान करता है, माइग्रेशन मैट्रिक्स सब्सट्रेट में फेरबदल करने से लेकर औषधीय संशोधकों के अलावा । इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल सेल माइग्रेशन के क्षेत्र के लिए खाते में जाने का एक तरीका रेखांकित करता है, जिसे सेल माइग्रेशन की जांच करते समय कई तरीकों से नहीं माना जाता है। यह नया दृष्टिकोण एक बड़े दर्शकों के लिए एक खरोंच प्रवास परख प्रदान करता है और शोधकर्ताओं को सेल माइग्रेशन के शारीरिक और रोगविज्ञानी प्रभाव की जांच करने के लिए अधिक अवसर प्रदान करेगा।

Introduction

सेल माइग्रेशन कई शारीरिक और साथ ही रोग की घटनाओं के लिए महत्वपूर्ण है। यह विकास के दौरान, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ाने के लिए, और उचित घाव भरने के लिए आवश्यक है1,2,3। इनमें से कई सेल माइग्रेशन इवेंट्स को भौतिक या रासायनिक संकेतों से ट्रिगर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान, ल्यूकोसाइट्स एक केमोटाट्रेक्टेंट2के जवाब में चोट की साइट की ओर प्रवास करेंगे। इसके अतिरिक्त, ल्यूकोसाइट्स अतिरिक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवास को प्रेरित करने के लिए साइटोकिन्स भी जारी करेंगे, साथ ही फाइब्रोब्लास्ट जैसे अन्य सेल प्रकार, जो घाव भरने की प्रक्रिया में शामिल हैं, और इस प्रकार, एक बहुकोशिकीय प्रतिक्रिया4शुरू करेंगे। कोशिकाओं को माइग्रेट करने की क्षमता उचित शारीरिक कार्य के लिए आवश्यक है; हालांकि, जब सेल माइग्रेशन अनियंत्रित हो जाता है, तो इसकी प्रतिकूल प्रतिक्रिया हो सकती है और पुरानी सूजन, संवहनी रोग, कैंसर मेटास्टेसिस, और बिगड़ा घावउपचार2,3,4,5,6,7जैसी रोग की घटनाओं में योगदान देसकताहै। बिगड़ा घाव उपचार कोशिका प्रवास में दोषों के कारण मधुमेह रोगियों का एक आम दुःख है, और यदि इन दोषों को दूर नहीं किया जाता है, तो यह आगे की जटिलताओं (जैसे, विच्छेदन8,9)का कारण बन सकता है। इस अध्ययन के साथ-साथ अन्य लोगों ने इस प्रक्रिया को और अधिक समझने की आवश्यकता का संकेत दिया है जिसके द्वारा कोशिका प्रवास होता है, या तो सामान्य शारीरिक या रोग की स्थिति में, और अनुसंधान के इस क्षेत्र को आगे बढ़ाने के लिए यह महत्वपूर्ण है । आदेश में इस को पूरा करने के लिए, वहां के लिए उपलब्ध प्रवास परख की जरूरत है कि दोनों सुलभ और उन शोधकर्ताओं, जो इन परख का संचालन करने के लिए आवश्यक उपकरण के अधिकारी नहीं हो सकता है के लिए सस्ती हैं ।

वर्तमान में, सेल माइग्रेशन के बारे में विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए विभिन्न प्रकार के माइग्रेशन परख उपलब्ध हैं। 2डी और 3डी माइग्रेशन दोनों मॉडल विकसित किए गए हैं, जिनमें से प्रत्येक सेल माइग्रेशन को प्रभावित करने वाले विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित करता है। 3डी माइग्रेशन मॉडल आमतौर पर सेल आक्रमण अध्ययनों से जुड़े होते हैं और सेल माइग्रेशन10, 11,12पर एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के प्रभाव का आकलन करते हैं, जबकि2डीमाइग्रेशन परख में आवेदन की एक बड़ी श्रृंखला होती है और मुख्य रूप से सेल माइग्रेशन13,14, 15,16के दौरान केमोटेक्टिक माइग्रेशन, घाव भरने और कार्यात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए उपयोग कियाजाताहै। इनमें से कई परख के लिए अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता होती है, जैसे कि बॉयडन चैम्बर्स या अपवर्जन के छल्ले, जो कुछ शोधकर्ताओं को इन परख की उपलब्धता को कम कर सकते हैं। अधिक लागत-कुशल परख में से एक खरोंच परख है, जिसका उपयोग आमतौर पर कोशिका प्रवास14, 17में घाव भरने और सामान्य परिवर्तनों का आकलन करने के लिए कियाजाताहै। जबकि अधिकांश प्रयोगशालाओं को खरोंच परख का संचालन करने के लिए सुसज्जित किया जाता है, सेल माइग्रेशन को ट्रैक करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण या तो अनुपलब्ध होते हैं या खरीदने के लिए बहुत महंगे होते हैं। इसमें टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी शामिल है, जिसके लिए उल्टे माइक्रोस्कोप और लाइव इमेजिंग सिस्टम की जरूरत होती है । उपकरणों के ये महंगे टुकड़े आमतौर पर हर प्रयोगशाला के लिए सुलभ नहीं हैं। इसलिए, यह अवलोकन एक नए प्रोटोकॉल की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है जो अधिक आसानी से उपलब्ध उपकरणों के साथ सेल माइग्रेशन के आकलन की अनुमति देता है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सेल माइग्रेशन का आकलन करने के लिए एक नया और किफायती तरीका प्रदान करता है। यह विधि स्क्रैच परख से जुड़ी एक ही प्रक्रिया का पालन करती है लेकिन एक बुनियादी विज्ञान प्रयोगशाला सेटिंग में अधिक सामान्यतः उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करके सेल माइग्रेशन की जांच के विश्लेषण में भिन्न होती है। सामान्य उपकरणों का उपयोग करने वाला यह प्रोटोकॉल समय-चूक माइक्रोस्कोपी के उपयोग के बिना सेल माइग्रेशन के अधिक सटीक निर्धारण की अनुमति देता है। माइग्रेशन का निर्धारण करने के अलावा, यह विधि स्क्रैच क्षेत्र में चर कारकों के लिए भी खाता है जिसे सेल माइग्रेशन को बहुत प्रभावित करने के लिए नोट किया गया है। कुल मिलाकर, सेल माइग्रेशन विश्लेषण के लिए यह नया प्रोटोकॉल सेल माइग्रेशन के क्षेत्र में अधिक प्रयोगशालाओं का पता लगाने और योगदान करने का अवसर प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सामान्य सेल संस्कृति

  1. दुलबेको के संशोधित ईगल्स माध्यम (DMEM) में संस्कृति कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट 1 ग्राम/एल ग्लूकोज, सोडियम पायरुवेट युक्त, एल-ग्लूटामाइन, और 14.2 m NaHCO3,14.9 m M M HEPES, 15% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2% एल-ग्लूटामाइन, और 0.02% एंटीमाइक्रोबियल रिएजेंट (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पूरक और 37 सी पर सीओ2 इनक्यूबेटर में बनाए रखा गया।
  2. संस्कृति कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट जब तक 90-95% संकुचन मार्ग 0 (P0) पर पहुंच जाता है । इस बिंदु पर फाइब्रोब्लास्ट एक 48-अच्छी तरह से प्लेट में विभाजित होने के लिए तैयार हैं, जिसका उपयोग माइग्रेशन परख के लिए किया जाता है।

2. माइग्रेशन प्लेट की तैयारी

  1. एक लाइन ड्राइंग द्वारा एक 48-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट तैयार करें, पीले या हल्के रंग के स्थायी मार्कर का उपयोग करके, अच्छी तरह से केंद्र के नीचे। फिर, ब्याज के तीन अलग-अलग क्षेत्रों में कुएं को विभाजित करने वाले तीन हैश अंक ड्रा करें। इन सेक्शन का इस्तेमाल इमेजिंग के लिए किया जाएगा।
    नोट: एक हल्के रंग स्थायी मार्कर का उपयोग करने से माइग्रेटिंग कोशिकाओं की आसान इमेजिंग की अनुमति मिलेगी। काले या नीले जैसे काले मार्कर माइग्रेट कोशिकाओं के दृश्य को रोकेंगे।
  2. यदि सब्सट्रेट (जैसे, कोलेजन) पर माइग्रेशन का आकलन करते हैं, तो विशिष्ट सब्सट्रेट के लिए उपयोग किए जाने वाले निर्देशों और सांद्रता का पालन करते हुए इस समय अच्छी तरह से कोट करें।
  3. प्लेट ~ 15,000-20,000 कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट, पी 1, प्रत्येक अच्छी तरह से और संस्कृति कोशिकाओं में, सामान्य संस्कृति स्थितियों (पिछले खंड में सूचीबद्ध शर्तों) के तहत, जब तक वे 90-95% पूर्णता तक नहीं पहुंच जाते। 24-48 घंटे के बीच तक पहुंच जाना चाहिए।
    नोट: माइग्रेशन प्लेट स्थापित करते समय एक सकारात्मक नियंत्रण (एक ज्ञात प्रवासी कोशिका, जैसे 3T3 कोशिकाएं18),एक नकारात्मक नियंत्रण (बिना फैलाया कोशिकाएं) और एक खाली अच्छी तरह से शामिल करना सुनिश्चित करें।

3. स्क्रैच माइग्रेशन परख और निर्धारण

  1. एक बार कोशिकाओं को 90-95% संकुचन तक पहुंचने, एक बाँझ P200 पिपेट टिप का उपयोग कर खींचा लाइन के साथ मीडिया और खरोंच को हटा दें ।
    नोट: एक P200 पिपेट टिप आम पिपेट टिप है जो खरोंच परख10 , 14,19के साथ उपयोग कियाजाताहै। इसके अलावा, केवल P200 टिप के साथ एक पास बनाने के रूप में एक से अधिक प्रयास कई खरोंच लाइनों में परिणाम हो सकता है ।
  2. किसी भी असंबद्ध कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट को हटाने के लिए कम सीरम मीडिया (1.5% एफबीएस) के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से कम सीरम मीडिया के 500 माइक्रोन जोड़ें। यदि किसी औषधीय एजेंटों का उपयोग कर रहे हैं, तो उन्हें इस समय जोड़ें।
    नोट: कम सीरम मीडिया का उपयोग कियाजाताहै क्योंकि यह सेल माइग्रेशन को घटित होने की अनुमति देता है/ इस प्रोटोकॉल के लिए, 1.5% एफबीएस का उपयोग किया गया था।
  4. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में फाइब्रोब्लास्ट इनक्यूबेटर इनक्यूबेटर से पहले 0 एच छवियों को कैप्चर करें।
    1. 20x उद्देश्य के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 0 एच छवियों को कैप्चर करें। प्रति अच्छी तरह से दो 0 एच छवियां लें। यह माइग्रेशन की लाइन के अधिक पूर्ण कवरेज के लिए अनुमति देगा।
    2. चिह्नों (रेखा और डैश) का उपयोग करके, खरोंच की रेखा के शीर्ष आधे हिस्से को पकड़ने के लिए अच्छी तरह से स्थिति करें। यह सुनिश्चित करने के लिए बीच के डैश इमेजिंग से बचें कि माइग्रेशन का एक ही क्षेत्र दो बार इमेज नहीं किया गया है, जो परिणामों को तिरछा कर सकता है।
    3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका) काउपयोग करने के लिए 0 एच छवि #1 पर कब्जा करने के लिए । फिर प्लेट को कैमरे को ध्यान में रखते हुए खरोंच की अच्छी तरह से नीचे की आधी स्थिति में ले जाएं। फिर, बीच डैश पर कब्जा करने से बचें। एक बार जगह में, कैप्चर 0 एच इमेज #2(चित्रा 1)।
      नोट: दोनों 0 एच छवियों में मध्य डैश से बचने से प्रवास के क्षेत्रों पर कब्जा करने से रोकने के दो बार जो अगर किया दोहरा परिणाम का उत्पादन और डेटा तिरछा सकता है ।
  5. 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग के बाद, मीडिया को अच्छी तरह से हटा दें, और 1x नॉन बाँझ पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोएं (अब से उपयोग किए जाने वाले सभी 1x पीबीएस गैर-बाँझ हैं)।
  6. धूम हुड में, कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए कुएं में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के 500 माइक्रोन जोड़ें और इनक्यूबेट करें।
  7. पैराफॉर्मलडिहाइड निकालें और आरटी में 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं ।
  8. एक बार कोशिकाओं को धो दिया जाता है, तो 24 एच छवियों को कैप्चर करने के लिए आगे बढ़ें या प्रत्येक अच्छी तरह से 1x पीबीएस जोड़ें और बाद के समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। कोशिकाओं को छवि के लिए तैयार होने तक 1-2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रह सकते हैं।
    1. प्रत्येक कुएं में 300 माइक्रोन पारमेबिलिंग समाधान (1x पीबीएस और 0.01% ट्राइटन एक्स-100) जोड़कर कोशिकाओं को पार करें। इनक्यूबेट कोशिकाओं/आरटी में 30 मिनट के लिए कोमल, नित्य कमाल के साथ थाली ।
    2. परमीलिपन समाधान निकालें और आरटी में कोमल, नित्य कमाल के साथ 10 मिनट के लिए 1% कूमासी ब्रिलियंट ब्लू दाग (3% कूमासी ब्रिलियंट ब्लू, 10% एसिटिक एसिड, 45% मेथनॉल और 45% डीएच2ओ) जोड़ें।
      नोट: यदि प्लेटों को एक बाहृशिक मैट्रिक्स सब्सट्रेट के साथ लेपित किया जाता है तो माइग्रेशन परख का संचालन करने से पहले कूमासी स्टेनिंग के साथ एक कोटेड प्लेट का परीक्षण करना सुनिश्चित करें। चित्रा 2 दर्शाता है कि इस परख के साथ मैट्रिक्स सब्सट्रेट का उपयोग किया जा सकता है और कोशिकाओं के दृश्य को प्रभावित नहीं किया जा सकता है।
    3. 5 मिनट प्रत्येक के लिए नित्य कमाल के साथ आर टी पर 1x PBS के साथ कुओं 3x धोएं ।
    4. वॉश के बाद, 1x पीबीएस के 300 माइक्रोन जोड़े और 24 एच छवियों को कैप्चर करें।
    5. 0 एच छवियों को कैप्चर करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही स्थिति में अच्छी तरह से संरेखित करके 24 एच छवियों को कैप्चर करें। इसे पूरा करने के लिए, पहले से कैप्चर की गई 0 एच छवियों को खोलें और स्थायी मार्कर के साथ किए गए अंकन का उपयोग करके, अच्छी तरह से एक ही स्थिति में संरेखित करें। मध्य और अतिरिक्त डैश निशान नीचे लाइन 24 एच छवि और 0 एच छवि(चित्रा 1)के बीच बंद संरेखण की अनुमति चाहिए ।

4. 0 घंटे और 24 घंटे छवियों की तैयारी

  1. एक ही अच्छी तरह से लिया 0 एच और 24 एच छवियों को खोलें और इमेजिंग सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)में स्थिति ।
  2. 0 एच छवि पर एक नई परत बनाएं। फिर, नई परत पर क्लिक करें और पाठ पर डबल क्लिक करके परत का नाम "लाइन लेयर" में बदल दें।
    नोट: इस परत को इस बिंदु से लाइन परत के रूप में संदर्भित किया जाएगा।
  3. ब्रश टूल (ब्रश आइकन) पर क्लिक करें और 10 पिक्सल पर आकार और लाल रंग सेट करें।
  4. चयनित लाइन परत के साथ, दो, अलग लाइनें खींचें जो खरोंच के क्षेत्र को रेखांकित करते हैं। इन रेखाओं के कारण किसी भी कोशिकाओं को नहीं छूना चाहिए जो प्रवास के क्षेत्र को चिह्नित करते हैं ।
  5. मूव टूल (एरो आइकन) पर क्लिक करें और फिर सीटीआरएल बटन को दबाएं और लाइन और बैकग्राउंड दोनों परतों पर क्लिक करें।
  6. 0 एच छवि के केंद्र में क्लिक करें और 24 घंटे की छवि के बीच में इन दोनों परतों खींचें।
  7. अब 24 घंटे की इमेज का इस्तेमाल करते हुए 0 h बैकग्राउंड लेयर पर क्लिक करें और अस्पष्टता को 50% तक बदल दें।
  8. सीटीआरएल बटन को पकड़े हुए, 0 एच बैकग्राउंड और लाइन लेयर दोनों पर क्लिक करें और फिर परतों को फ्री ट्रांसफॉर्मकरें (एडिट एंड जीटी; फ्री ट्रांसफॉर्म)। मुफ्त परिवर्तन का उपयोग करके, 0 एच पृष्ठभूमि और लाइन छवि को 24 घंटे की पृष्ठभूमि छवि में संरेखित करें। इस चरण के परिणामस्वरूप 0 एच और 24 एच छवि की ओवरलेइंग होती है, जो 24 एच छवि पर सही स्थिति में माइग्रेशन के क्षेत्र को चिह्नित करने वाली रेखाओं को स्थिति में रखने के लिए आवश्यक है।
  9. 24 घंटे पृष्ठभूमि छवि पर 0 एच पृष्ठभूमि और लाइन परतों के सफल ओवरलेइंग के बाद, 0 एच पृष्ठभूमि परत को हटा दें। 0 h बैकग्राउंड लेयर पर क्लिक करके डिलीट करें, फिर राइट क्लिक करें और डिलीट लेयर पर क्लिक करें।
  10. 0 एच पृष्ठभूमि छवि को हटाने से सिर्फ लाइन और 24 एच बैकग्राउंड लेयर (जिसे अब माइग्रेशन इमेज के रूप में जाना जाता है) छोड़ दिया जाएगा। लाइन लेयर 24 घंटे की छवि पर माइग्रेशन/स्क्रैच के क्षेत्र का संकेत देगी और इसका उपयोग माइग्रेटिंग कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है ।
  11. दोनों एक फोटोशॉप फ़ाइल और एक झगड़ा/ नोट: एक प्रतिनिधि आंकड़ा है कि इस प्रक्रिया को दर्शाया गया है चित्रा 3में प्रस्तुत किया है ।

5. पलायन कक्षों की संख्या की गिनती

  1. माइग्रेशन इमेज खोलें। यह एक कार्यक्रम में किया जा सकता है जो झगड़ा/जेपीईजी फाइलों(सामग्रियों की तालिका) कोस्वीकार करता है।
  2. बीच में स्थित कोशिकाओं की संख्या की गणना करें और साथ ही दो लाल रेखाओं को छूएं।
  3. प्रति छवि माइग्रेट कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड करें। प्रति अच्छी तरह से दो माइग्रेटिंग छवियां होंगी, और इन मूल्यों को तब तक संयुक्त नहीं किया जाना चाहिए जब तक कि मानों को माइग्रेशन के क्षेत्र के लिए ठीक नहीं किया गया है (अगले खंड में विस्तृत)।

6. प्रवास के क्षेत्र का निर्धारण

  1. 24 एच छवि है कि धारा 5(सामग्रीकी तालिका) में इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में प्रवास की लाइनें शामिल खोलें ।
  2. "माइग्रेशन एरिया इमेज" के रूप में इस छवि के रूप में सहेजें।
  3. सेविंग करने के बाद बैकग्राउंड लेयर, राइट क्लिक और डिलीट लेयर पर क्लिक करें। यह छवि(चित्र 3)पर केवल खरोंच लाइनों छोड़ देना चाहिए ।
  4. ब्रश टूल (ब्रश आइकन) का उपयोग करना खरोंच की रेखाओं के बीच के क्षेत्र में भरें। माइग्रेशन के लिए लाइनों को आकर्षित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रंग के साथ ब्रश के रंग से मेल खाते हैं।
  5. एक काले और सफेद छवि(छवि और gt;Mode>Grayscale)उत्पन्न करने के लिए छवि को ग्रेस्केल में बदलें और फिर छवि(चित्र 4)को सहेजें।
  6. विश्लेषण सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)शुरू करें और फिर विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर "माइग्रेशन का क्षेत्र" फ़ाइल खोलें।
  7. प्रवास की रेखा के क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए, क्लिक करें Image>समायोजित करें। काला प्रवास क्षेत्र लाल हो जाएगा और प्रतिशत क्षेत्र सीमा बॉक्स में इंगित किया जाएगा । क्षेत्र क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में सूचित किया जाएगा प्रवास की लाइन छवि में कब्जा कर लिया पूरे क्षेत्र की तुलना में शामिल हैं ।
  8. माइग्रेशन की रेखा के लिए प्रतिशत क्षेत्र रिकॉर्ड करें और सुनिश्चित करें कि इस मूल्य को एक ही छवि के लिए माइग्रेटिंग कोशिकाओं की संख्या के साथ जोड़ा जाता है।

7. डेटा विश्लेषण

  1. खरोंच के प्रतिशत क्षेत्र में पलायन कोशिकाओं की संख्या को सामान्य करें। प्रवास की रेखा के प्रतिशत क्षेत्र (# माइग्रेट सेल% माइग्रेशन के क्षेत्र) द्वारा पलायन कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करें। प्रति छवि ऐसा करें और प्रति अच्छी तरह से माइग्रेशन के आधार पर औसत न करें।
  2. प्रति छवि मूल्यों को सामान्य करने के बाद, दो छवियों के मूल्यों को जोड़ें, जो एक व्यक्ति को अच्छी तरह से प्रतिनिधित्व करता है। इस मूल्य का उपयोग चित्रमय और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया जाएगा। यदि प्रायोगिक डिजाइन में कई प्रतिकृतियां होती हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले औसत दोहराने मूल्य।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यह प्रक्रिया सेल माइग्रेशन का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण दस्तावेज करती है जो अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए लागत प्रभावी और आसानी से अनुकूलनीय है। कई अध्ययनों ने सेल माइग्रेशन का आकलन करने के लिए समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया है, लेकिन इस विधि के लिए आवश्यक उपकरण कई प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं है। जबकि सीमांकन के लिए लाइनों और डैश का उपयोग महंगे उपकरणों के उपयोग के बिना विभिन्न समय बिंदुओं पर ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों को फिर से कब्जा करने की क्षमता के लिए अनुमतिदेता है (चित्र 1 और चित्रा 3)। हालांकि इस नए दृष्टिकोण के लिए सीमांकन का उपयोग आवश्यक है, इस विधि के कई क्षेत्र हैं जिन्हें व्यक्तिगत शोधकर्ता की जरूरतों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल ने 24 घंटे के अंत बिंदु का संकेत दिया; हालांकि, उस एंडपॉइंट को एक व्यक्तिगत प्रयोगशाला की जरूरतों के आधार पर बढ़ाया जा सकता है। प्रोटोकॉल के अंतिम बिंदु को समायोजित करने से आगे के उपयोग के लिए कोशिकाओं की निरंतर खेती की अनुमति मिल सकती है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल औषधीय संशोधकों के प्रभाव के साथ-साथ माइग्रेशन पर बाहृशीकरण मैट्रिक्स सब्सट्रेट्स का परीक्षण करने के लिए लचीलेपन की अनुमति देता है। अंत में, इस विधि का सबसे महंगा घटक इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग है, जो लाइसेंस प्राप्त सॉफ्टवेयर हो सकता है, लेकिन लाइसेंस प्राप्त सॉफ्टवेयर का उपयोग एकमात्र विकल्प नहीं है। अन्य इमेजिंग सॉफ्टवेयर जो लाइनों की पीढ़ी और ओवरलेइंग छवियों को इस विधि के साथ उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि की लागत प्रभावी और अनुकूलनीय प्रकृति के लिए, यह खरोंच के क्षेत्र को फैक्टरिंग करके सेल माइग्रेशन की जांच करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है।

इस नए दृष्टिकोण हाल ही में Burr एट अल में इस्तेमाल किया गया था २०२० गैर मधुमेह और मधुमेह दिल20से अलग कोशिकाओं के बीच हृदय फाइब्रोब्लास्ट प्रवास में अंतर का आकलन करने के लिए । चित्रा 3 फाइब्रोब्लास्ट माइग्रेशन का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिनिधि छवियों को प्रस्तुत करता है। इन छवियों से, यह निर्धारित किया गया था कि गैर मधुमेह दिलों से ४६ फाइब्रोब्लास्ट और मधुमेह दिलों से १२९ फाइब्रोब्लास्ट प्रयोग की 24 घंटे की समय अवधि के दौरान चले गए थे । समूह तुलना पर, मधुमेह दिलों से कोशिकाओं की संख्या गैर मधुमेह दिलों (तालिका 1) से कोशिकाओं की तुलना में2.8xअधिक पलायन कर गया था । हालांकि इन परिणामों से पता चला मधुमेह दिलों से कोशिकाओं को और अधिक चले गए थे, संख्या भ्रामक थे, क्योंकि खरोंच के क्षेत्र में दो समूहों में से प्रत्येक के लिए अलग था । गैर मधुमेह खरोंच क्षेत्र कुल मापा क्षेत्र का 24.78% था, जबकि मधुमेह प्रवास खरोंच कुल क्षेत्र का 16.77% मापा गया था. जब खरोंच के क्षेत्र पर विचार किया गया था, यह एक अनुपात (सेल संख्या/% खरोंच क्षेत्र) प्रदान की है कि मधुमेह दिलों से फाइब्रोब्लास्ट वास्तव में गैर मधुमेह दिलों से कोशिकाओं की तुलना में 4.13x अधिक चले गए । इन परिणामों में प्रवास परख करते समय प्रवास के क्षेत्र पर विचार करने के महत्व पर प्रकाश डाला गया ।

प्रवास के क्षेत्र को सामान्य बनाना सेल माइग्रेशन का बेहतर और अधिक कठोर आकलन प्रदान करता है और संभावित मानवीय त्रुटि को नकारता है। जबकि वर्णित विधि एक P200 पिपेट टिप का उपयोग करती है, जिसे एक समान और लगातार खरोंच प्रदान करना चाहिए, मानव विसंगतियों के कारण असमान खरोंच हो सकते हैं। चित्रा 5 खरोंच क्षेत्र में फैक्टरिंग मतभेदों के महत्व पर प्रकाश डाला गया। यदि किसी को केवल माइग्रेट फाइब्रोब्लास्ट की संख्या की तुलना करनी थी, तो यह दिखाएगा कि चित्रा 5A में चित्रा 5Bकी तुलना में माइग्रेट कोशिकाओं की संख्या दोगुनी है। जबकि जब डेटा को सामान्य करने के लिए खरोंच के क्षेत्र का उपयोग किया जाता है, तो यह इंगित करता है कि माइग्रेशन क्षेत्र में फाइब्रोब्लास्ट का अनुपात चित्रा 5A और चित्रा 5B दोनों में समान है। इस उदाहरण के लिए, हमने विभिन्न फाइब्रोब्लास्ट आइसोलेशन से अनुपचारित गैर-मधुमेह कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग किया; इसलिए, एक समान माइग्रेशन अनुपात की उम्मीद आंकड़ा 5में इस्तेमाल कोशिकाओं की प्रकृति के कारण परिणाम होना चाहिए . यदि कोई केवल माइग्रेट कोशिकाओं की संख्या प्रस्तुत कर रहा था, तो ये निष्कर्ष गलत बयानी हो सकता है यदि खरोंच क्षेत्र सभी नमूनों में एक समान और सुसंगत नहीं है। इसलिए, इस विधि के साथ खरोंच वाले क्षेत्र के साथ-साथ अन्य खरोंच माइग्रेशन परख के लिए खाते में आना महत्वपूर्ण है। चित्रा 5 में प्रस्तुत इन परिणामों ने यह दर्शाया कि खरोंच वाले क्षेत्र में माइग्रेट कोशिकाओं की संख्या को सामान्य बनाने से सटीक, दोहराने योग्य और विश्वसनीय माइग्रेशन डेटा कैसे प्रस्तुत किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: फाइब्रोब्लास्ट स्क्रैच माइग्रेशन परख के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन का आरेख। सेटअप: अच्छी तरह से कोशिकाओं चढ़ाना से पहले, थाली पर नीचे पर एक लाइन और 3 डैश निशान आकर्षित । 0 एच: संस्कृति कोशिकाओं 95% तक प्रदान की गई और चित्रित रेखा को समानांतर करने वाली खरोंच को प्रशासित करें। मध्य डैश के ऊपर और नीचे एक अनुभाग का चयन करके 0 एच छवियों को कैप्चर करें। 24 घंटे: कोशिकाओं को फिक्सिंग और धुंधला करने से पहले 24 घंटे के लिए माइग्रेट करने की अनुमति दें। 24 एच छवियों के लिए, माइग्रेट कोशिकाओं को कैप्चर करने के लिए 0 एच छवियों के समान स्थिति में अच्छी तरह से संरेखित करें। विश्लेषण: 0 एच छवि पर माइग्रेशन के क्षेत्र की रूपरेखा तैयार करें और फिर माइग्रेशन और क्षेत्र छवियों को उत्पन्न करने के लिए 24 एच छवि पर 0 एच छवि को ओवरले करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: कूमासी धुंधला दिखाने वाले प्रतिनिधि चित्र कोशिकाओं के दृश्य में हस्तक्षेप नहीं करते हैं। कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स को या तो कोई कोलेजन (प्लास्टिक डिश), कोलेजन गैर-मधुमेह चूहों की पूंछ से अलग, या मधुमेह चूहों की पूंछ से अलग कोलेजन पर चढ़ाया गया था। कोशिकाओं को यहां वर्णित तरीकों के बाद खरोंच प्रवास परख में इस्तेमाल किया गया । कोशिकाओं को 1% Coomassie शानदार नीले दाग के साथ दाग रहे थे और फिर माइग्रेट कोशिकाओं की छवियों पर कब्जा कर लिया गया । छवि पर चित्रित स्केल बार 100 माइक्रोन है। कोलेजन अलगाव और/या कोलेजन पर सेल माइग्रेशन पर विवरण बर्र एट अल20में प्रस्तुत किए जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: गैर मधुमेह और मधुमेह कोशिकाओं के बीच कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट प्रवास में अंतर का प्रदर्शन प्रतिनिधि डेटा । 0 एच और 24 एच छवियों को गैर मधुमेह और मधुमेह चूहों से अलग माइग्रेट कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट की संख्या की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया (लाल रेखा प्रवास और पैमाने बार = १०० μm के साथ 20x पर लिया छवियों के क्षेत्र को दर्शाया गया है) । मधुमेह हृदय कोशिकाओं में 16.77% के क्षेत्र में 129 कोशिकाएं प्रवास करती थीं, जिसने 7.69 का प्रवास अनुपात उत्पन्न किया। गैर-मधुमेह फाइब्रोब्लास्ट में 46 कोशिकाएं 24.78% के क्षेत्र के साथ स्थानांतरित हो गई थीं, जिसके कारण 1.86 का अनुपात हुआ। इस आंकड़े में प्रस्तुत छवियों का उपयोग बर्र एट अल में प्रस्तुत परिणामों में किया गया थालेकिन यहां चित्रित छवियों को बर्र एट अलअल 20में नहीं दिखाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: आरेख जो माइग्रेशन छवि के क्षेत्र की पीढ़ी को दर्शाता है। स्टेप #1: ओपन माइग्रेशन इमेज जिसमें माइग्रेशन की लाइनें होती हैं। चरण #2: 24 घंटे की छवि को हटा दिया जाता है, जो छवि क्षेत्र में माइग्रेशन की तर्ज पर छोड़ता है। चरण #3: ब्रश उपकरण का उपयोग माइग्रेशन के क्षेत्र में भरने के लिए किया जाता था। स्टेप #4: छवि को ग्रेस्केल में परिवर्तित किया जाता है और फिर एक नई छवि के रूप में बचाया जाता है। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: फाइब्रोब्लास्ट माइग्रेशन पर विभिन्न माइग्रेशन क्षेत्रों के प्रभाव का एक उदाहरण। गैर मधुमेह कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट प्लास्टिक संस्कृति व्यंजन पर चढ़ाया गया था और खरोंच प्रवास परख में इस्तेमाल किया, के रूप में ऊपर वर्णित (स्केल बार = 100 μm). (क)92 ने 354 प्रतिशत क्षेत्रफल के साथ फाइब्रोब्लास्ट माइग्रेट किया जिसके परिणामस्वरूप 260 का प्रवास अनुपात हुआ। (ख)45 फाइब्रोब्लास्ट 17.57% के क्षेत्र के साथ चले गए जो 2.56 के अनुपात की गणना करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फाइब्रोब्लास्ट प्रकार माइग्रेट सेल की औसत संख्या स्क्रैच का औसत क्षेत्र स्क्रैच एरिया रेशियो के लिए सेल नंबर
गैर मधुमेह दिलों से फाइब्रोब्लास्ट 46 24.78% 1.86
मधुमेह दिलों से फाइब्रोब्लास्ट 129 16.77% 7.69

तालिका 1: माइग्रेशन स्क्रैच से माइग्रेशन डेटा गैर-मधुमेह और मधुमेह कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके परख करता है। गैर-मधुमेह और मधुमेह फाइब्रोब्लास्ट की संख्या जो माइग्रेट हुई, चित्र 3का उपयोग करके निर्धारित की गई थी । प्रत्येक छवि के लिए प्रतिशत क्षेत्र वर्णित तरीकों और ImageJ का उपयोग करके गणना की गई थी। माइग्रेशन के अनुपात की गणना माइग्रेट फाइब्रोब्लास्ट की संख्या को प्रतिशत माइग्रेशन क्षेत्र द्वारा विभाजित करके की गई थी ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

खरोंच प्रवास परख के लिए यह नया दृष्टिकोण शोधकर्ताओं के लिए सेल प्रवास में परिवर्तन की जांच करने के लिए एक और अधिक सुलभ विधि प्रदान करता है । हालांकि यह परख अन्य खरोंच परख के समान खरोंच के प्रशासन के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करता है, यह सेल माइग्रेशन10के इमेजिंग और सटीक विश्लेषण के लिए एक नई विधि प्रदान करता है। समय-चूक माइक्रोस्कोपी और लाइव सेल इमेजिंग कक्षों के उपकरण-गहन तरीकों का उपयोग करने के बजाय, यह विधि आमतौर पर उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरणों के उपयोग का विवरण देती है। एक सामान्य उल्टे माइक्रोस्कोप और कैमरे का उपयोग करते हुए, कोई भी लगातार संस्कृति स्थितियों को बनाए रखते हुए एक ही समय में माइग्रेशन छवियों को कैप्चर कर सकता है। इसके अलावा, यह विधि उन्नत उपकरणों के उपयोग के बिना ब्याज के उसी क्षेत्र की सटीक इमेजिंग प्रदान करती है। माइग्रेशन के एक ही क्षेत्र को कैप्चर करने से सेल माइग्रेशन का निर्धारण करने में विसंगतियों को कम किया जा सकेगा और सेल माइग्रेशन का अधिक कठोर और सटीक माप प्रदान होगा। अंत में, यह विधि खरोंच के क्षेत्र को ध्यान में रखती है। जबकि खरोंच में मानव विविधताओं को कम करने के लिए सावधानी बरती जाती है, विसंगतियां अभी भी हो सकती हैं, सेल माइग्रेशन के विश्लेषण में एक सामान्य कारक के रूप में क्षेत्र का उपयोग करने के महत्व का प्रदर्शन करती हैं। कुल मिलाकर, ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल आमतौर पर सेल माइग्रेशन का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक शक्तिशाली उपकरण के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है।

एक अनुकूलनीय प्रवास परख विकसित करना अनुसंधान के लिए नए रास्ते प्रदान करता है । यहां प्रस्तुत माइग्रेशन परख में विशिष्ट शोध प्रश्नों की जांच करने के लिए संशोधित करने की क्षमता है । संशोधनों को सक्रिय करने या ब्याज की विशिष्ट प्रोटीन बाधा के बारे में किया जा सकता है । औषधीय संशोधक (agonists या विरोधी) और आरएनए हस्तक्षेप जैसे अभिकर्षकों को माइग्रेशन और विशिष्ट प्रोटीन के बारे में प्रश्नों को संबोधित करने के लिए माइग्रेशन परख से पहले, दौरान, या यहां तक कि माइग्रेशन के बाद भी लागू किया जा सकता है। 48 अच्छी तरह से पकवान की छोटी मात्रा भी संशोधक की कम मात्रा के लिए अनुमति देता है, जो एक और लागत प्रभावी विधि है। इसके अलावा, सेल माइग्रेशन पर एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स घटकों (ईसीएम) के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस परख को संशोधित किया जा सकता है। हाल ही में हमने इस विधि को लागू किया, जहां कोशिका संस्कृति प्लेटों को मधुमेह और गैर-मधुमेह चूहों से अलग कोलेजन के साथ लेपित किया गया था ताकि मधुमेह के एक्सपेरि़कोशिक मैट्रिक्स के प्रभाव का आकलन किया जा सके कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट माइग्रेशन20पर है। हालांकि इस अध्ययन में अलग-थलग कोलेजन का उपयोग किया गया था, इस विधि को अन्य बाह्राश घटकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो रुचि के हो सकते हैं। ईसीएम माइग्रेशन के प्रभाव का आकलन करने की क्षमता बहुत उपयोगी है क्योंकि कई अध्ययनों से यह संकेत मिलता है कि माइग्रेशन 20 ,21,22पर ईसीएम का महत्व है । एक संभावित जटिलता जो ईसीएम प्रोटीन के उपयोग और अत्यधिक केंद्रित ईसीएम समाधान के साथ कुओं को कोटिंग के साथ हो सकती है, कोशिकाओं के दृश्य पर प्रभाव डालती है। यह सिफारिश की है अगर ECM का उपयोग कर, कोलेजन की तरह, एक अच्छी तरह से कोट और Coomassie नीले रंग के साथ दाग को देखने के लिए अगर ECM नेत्रहीन कोशिकाओं की इमेजिंग सकता है । यदि ईसीएम कोशिकाओं की कल्पना को बाधित करता है, तो ईसीएम समाधान को कमजोर करने से इस समस्या में सुधार होगा और ईसीएम पर कोशिकाओं की कल्पना करने की अनुमति मिलेगी।

एक पुरानी तकनीक पर यह नया दृष्टिकोण कुछ सीमाएं पेश करता है। इस विधि को एक छोटे पैमाने (48-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट) के अनुकूलित किया गया है और आसानी से बड़ी प्लेटों में संक्रमण नहीं हो सकता है। कुएं के आकार और छवियों में कैप्चर किए गए क्षेत्र के कारण यह प्रोटोकॉल माइग्रेशन के क्षेत्र के एक बड़े हिस्से को दस्तावेज कर सकता है। हालांकि, इस विधि को बड़े अच्छी आयामों में विस्तार करने से माइग्रेशन क्षेत्र के निचले हिस्से पर कब्जा हो सकता है। यह संभावित रूप से कैप्चर की गई छवियों की संख्या बढ़ाकर हल किया जा सकता है, लेकिन माइग्रेशन इमेज्ड के क्षेत्र को सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त तरीकों को लागू करने की आवश्यकता हो सकती है 24 एच छवियों के लिए फिर से पहचाना जा सकता है। इसके अलावा, यह विधि उन कोशिकाओं तक सीमित है जिनका उपयोग स्क्रैच माइग्रेशन परख में किया जा सकता है। कोशिकाएं जो पारंपरिक खरोंच माइग्रेशन परख में प्रतिक्रिया नहीं देती हैं, वे इस पांडुलिपि के भीतर प्रस्तुत दृष्टिकोण के लिए आदर्श नहीं हो सकती हैं। हालांकि इस दृष्टिकोण के साथ कुछ सीमाएं हैं, इस पांडुलिपि में विस्तृत तरीकों को संशोधित करने से कुछ सीमाएं कम हो सकती हैं।

खरोंच प्रवास परख एक सरल दृष्टिकोण का पालन करता है, लेकिन वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि एक सफल परख का उत्पादन करने के लिए पालन करने की जरूरत है । एक महत्वपूर्ण कदम के लिए अच्छी तरह से नीचे पर संकेत निशान आकर्षित है । यदि कुओं पर संकेतक नहीं खींचे जाते हैं तो उस क्षेत्र में अंतर करना बहुत कठिन/असंभव होगा जिसे 24 घंटे की छवि के लिए चित्रित करने की आवश्यकता है और साथ ही प्रवास के एक ही क्षेत्र को फिर से कब्जा करने से रोकना होगा । इसके अलावा, 0 एच छवि में कब्जा कर लिया गया था कि 24 घंटे छवि में प्रवास के एक ही क्षेत्र को फिर से कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि एक ही क्षेत्र 24 घंटे पर कब्जा नहीं है तो प्रवास के लिए छवियों को ओवरले करना संभव नहीं होगा। मढ़ा छवियों के बिना यह निर्धारित करने के लिए जो कोशिकाओं चले गए है संभव नहीं होगा । मढ़ा छवियों को इस दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि वे सेल प्रवास के लिए एक सटीक दृढ़ संकल्प प्रदान करते हैं । चूंकि खरोंच विधि हमेशा सीधे खरोंच रेखाएं प्रदान नहीं करती है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि मढ़ा छवियों को उत्पन्न करने के लिए सही क्षेत्रों को चित्रित किया जाए। मढ़ा छवियों इस पांडुलिपि के भीतर प्रस्तुत इस प्रवास परख की सटीकता के लिए नींव प्रदान करते हैं ।

स्क्रैच माइग्रेशन परख का एक नया अनुकूलन सेल माइग्रेशन की जांच करने के लिए अधिक सुलभ और लचीला दृष्टिकोण प्रदान करता है। पिछले सेल माइग्रेशन अध्ययनों ने उपकरण-गहन तरीकों का उपयोग किया है जो आमतौर पर हर प्रयोगशाला के लिए उपलब्ध नहीं हैं। यह दर्शाता है कि एक प्रवास परख है कि पहुंच की एक व्यापक रेंज है के विकास के लिए आवश्यक है । इस पांडुलिपि ने एक पुरानी तकनीक के लिए एक नया दृष्टिकोण वर्णित किया है जो सेल माइग्रेशन में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं तक पहुंच बढ़ाएगा । इसके अलावा, यह विधि सेल संस्कृति पर्यावरण को बदलने की क्षमता प्रदान करती है, चाहे वह एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स घटकों के माध्यम से हो या औषधीय संशोधकों के उपयोग के माध्यम से, सेल माइग्रेशन पर पड़ने वाले प्रभाव को निर्धारित करने के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार #81XWH-16-1-0710, मिसिसिपी स्कूल ऑफ फार्मेसी विश्वविद्यालय और बायोमॉलिक्यूलर साइंसेज विभाग द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe All Apps Adobe This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile MIDSCI AVR1 Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera Zeiss 426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher Scientific BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells Fisher Scientific 07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate Fisher Scientific MT10014CM
Image J NIH This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum Innovative Research IFBS-HU
Primocin InvivoGEN ant-pm-2 This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope Zeiss 491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software Zeiss software comes with camera purchase

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
  2. Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
  3. Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
  4. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
  5. Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
  6. Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
  7. Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
  8. Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
  9. Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
  10. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  11. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
  12. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
  13. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
  14. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  15. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  16. Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
  17. Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
  18. Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
  19. Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
  20. Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  21. Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
  22. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).

Tags

जीव विज्ञान अंक 160 माइग्रेशन परख स्क्रैच माइग्रेशन परख फाइब्रोब्लास्ट एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स अनुकूलनीय माइग्रेशन परख लागत प्रभावी माइग्रेशन परख
एक लागत प्रभावी और अनुकूलनीय स्क्रैच माइग्रेशन परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A… More

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter