Summary
Vi presenterer en kostnadseffektiv metode for ripemigrasjonsanalysen som gir en ny tilnærming for å bestemme cellemigrasjon uten bruk av utstyrsintensive metoder. Mens fibroblaster ble brukt i denne protokollen, kan den tilpasses og brukes til å studere flere celletyper og påvirkninger på cellemigrasjon.
Abstract
Cellemigrasjon er en viktig komponent i både fysiologiske og patologiske hendelser. Normal cellemigrasjon er nødvendig for viktige funksjoner som utvikling og montering av immunrespons. Når en defekt eller endring oppstår med cellemigrasjonsprosessen, kan det ha skadelige resultater (det vil si kreftmetastase, sårheling og arrdannelse). På grunn av viktigheten av cellemigrasjon, er det nødvendig å ha tilgang til en cellemigrasjonsanalyse som er rimelig, tilpasningsdyktig og repeterbar. Ved hjelp av den vanlige ripemigrasjonsanalysen har vi utviklet en ny tilnærming til å analysere cellemigrasjon som bruker generelt laboratorieutstyr. Metoden som er beskrevet, bruker visuelle markører som gjør det mulig å gjenerobre bestemte interesseområder uten bruk av time-lapse mikroskopi. I tillegg gir det fleksibilitet i eksperimentell design, alt fra å endre migrasjonsmatrisesubstratet til tilsetning av farmakologiske modifikatorer. Videre skisserer denne protokollen en måte å ta hensyn til celleoverføringsområdet, som ikke vurderes av flere metoder ved undersøkelse av cellemigrasjon. Denne nye tilnærmingen gir en ripemigrasjonsanalyse til et større publikum og vil gi forskerne større mulighet til å undersøke den fysiologiske og patofysiologiske virkningen av cellemigrasjon.
Introduction
Cellemigrasjon er avgjørende for mange fysiologiske så vel som patologiske hendelser. Det er nødvendig under utvikling, for å montere en immunrespons, og for riktig sårheling1,2,3. Mange av disse cellemigrasjonshendelsene kan utløses av fysiske eller kjemiske signaler. For eksempel, under en immunrespons, vil leukocytter migrere mot et skadested som svar på et kjemoattractant2. I tillegg vil leukocytter også frigjøre cytokiner for å indusere migrering av flere immunceller, samt andre celletyper, for eksempel fibroblaster, som er involvert i sårhelingsprosessen, og dermed initiere en flercellet respons4. Cellenes evne til å migrere er avgjørende for riktig fysiologisk funksjon; Men når cellemigrasjon går ukontrollert, kan det ha en negativ respons og bidra til patologiske hendelser, for eksempel kronisk betennelse, vaskulær sykdom, kreftmetastase og nedsatt sårheling2,3,4,5,6,7. Nedsatt sårheling er en vanlig lidelse av diabetikere på grunn av defekter i cellemigrasjon, og hvis disse feilene ikke er adressert, kan det føre til ytterligere komplikasjoner (f.eks.amputasjon 8,9). Denne studien, så vel som andre, har indikert behovet for å ytterligere forstå prosessen der cellemigrasjon oppstår, enten under normale fysiologiske eller patologiske forhold, og det er viktig for å fremme dette forskningsfeltet. For å oppnå dette må det være migrasjonsanalyser tilgjengelig som er både tilgjengelige og rimelige for de forskerne, som kanskje ikke har utstyret som trengs for å gjennomføre disse analysene.
For øyeblikket finnes det en rekke overføringsanalyser tilgjengelig for å undersøke et bredt spekter av emner angående cellemigrasjon. Både 2D- og 3D-migreringsmodeller er utviklet, hver rettet mot bestemte områder som påvirker cellemigrasjon. 3D migrasjon modeller er vanligvis forbundet med celle invasjon studier og vurdere virkningen av ekstracellulær matrise på celle migrasjon10,11,12,mens 2D migrasjon analyser har et større spekter av søknad og er primært brukt til å studere chemotactic migrasjon, sårheling, og funksjonelle endringer under cellemigrasjon13,14,15,16. Flere av disse analysene krever ekstra utstyr, for eksempel Boyden kamre eller eksklusjonsringer, noe som kan redusere tilgjengeligheten av disse analysene til visse forskere. En av de mer kostnadseffektive analysene er ripeanalysen, som vanligvis brukes til å vurdere sårheling og generelle endringer i cellemigrasjon14,17. Mens de fleste laboratorier er utstyrt for å gjennomføre en ripeanalyse, har utstyret som brukes til å spore cellemigrasjon, en tendens til å enten være utilgjengelig eller for dyrt å kjøpe. Dette inkluderer time-lapse mikroskopi, som krever et omvendt mikroskop og et levende bildesystem. Disse dyre delene av utstyret er ikke allment tilgjengelig for hvert laboratorium. Derfor understreker denne observasjonen behovet for en ny protokoll som gjør det mulig å vurdering av cellemigrasjon med lettere tilgjengelig utstyr.
Protokollen som presenteres her gir en ny og rimelig måte å vurdere cellemigrasjon på. Denne metoden følger samme prosedyre forbundet med ripeanalyser, men varierer i analysen av å undersøke cellemigrasjon ved å bruke utstyr som er mer tilgjengelig i en grunnleggende vitenskapslaboratoriuminnstilling. Denne protokollen ved hjelp av felles utstyr gir en mer nøyaktig bestemmelse av cellemigrasjon uten bruk av time-lapse mikroskopi. I tillegg til å bestemme overføring, står denne metoden også for variable faktorer i kladdeområdet som har blitt notert for å ha stor innvirkning på celleoverføring. Samlet sett gir denne nye protokollen for celleoverføringsanalyse en mulighet for flere laboratorier til å utforske og bidra til cellemigrasjonsområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generell cellekultur
- Kultur hjertefibroblaster i Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) som inneholder 1 g / L glukose, natriumpyuvat, L-glutamin og supplert med 14,2 mM NaHCO3,14,9 mM HEPES, 15 % varmeinaktivert fostervinserum (FBS), 2 % L-glutamin og 0,02 % antimikrobiell reagens (se Materialtabell)og vedlikeholdes i CO2 inkubator ved 37 °C.
- Kultur hjertefibroblaster til 90-95% samløpet nås ved passasje 0 (P0). På dette punktet fibroblastene er klare til å deles inn i en 48-brønns plate, som brukes til migrasjonsanalysen.
2. Utarbeidelse av migreringsplaten
- Forbered en 48-brønns cellekulturplate ved å tegne en linje, ved hjelp av en gul eller lysfarget permanent markør, ned i midten av brønnen. Deretter trekker du tre hash-merker som deler brønnen i tre separate interesseområder. Disse delene vil bli brukt til bildebehandling.
MERK: Ved hjelp av en lysfarge permanent markør vil tillate enkel avbildning av migrerende celler. Mørke markører som svart eller blått vil forhindre visualisering av migrering av celler. - Hvis du vurderer migrering på et substrat (f.eks. kollagen), belegge brønnen på dette tidspunktet etter instruksjoner og konsentrasjoner som brukes til det spesifikke substratet.
- Plate ~ 15.000-20.000 hjertefibroblaster, P1, inn i hver brønn og kulturceller, under normale kulterende forhold (forhold oppført i forrige avsnitt), til de når 90-95% samløpet. Samløpet bør nås mellom 24-48 timer.
MERK: Når du konfigurerer overføringsplaten, må du passe på å inkludere en positiv kontroll (en kjent trekkcelle, for eksempel 3T3-celler18),en negativ kontroll (uskratched celler) og en tom brønn.
3. Scratch migrasjon analyse og fiksering
- Når cellene når 90-95% samløpet, fjern media og skrap langs den tegnede linjen ved hjelp av en steril P200 pipettespiss.
MERK: En P200 pipettespiss er den vanlige pipettespissen som brukes med ripeanalysen10,14,19. Også, bare gjøre ett pass med P200 tips som mer enn ett forsøk kan resultere i flere skrapelinjer. - Skyll brønnen med lavt serummedie (1,5 % FBS) for å fjerne eventuelle ufestede hjertefibroblaster.
- Tilsett 500 μL med lavt serummedi til hver brønn. Hvis du bruker farmakologiske midler, legg dem til på dette tidspunktet.
MERK: Lavt serummedie brukes fordi det tillater / fremmer cellemigrasjon å forekomme og forhindrer fibroblaster fra å spre seg som kan forvrenge resultatene av migrasjonsanalysen20. For denne protokollen ble 1,5% FBS brukt. - Ta 0 t bilder før du inkuberer fibroblastene i en 5 % CO2-inkubator ved 37 °C i 24 timer.
- Ta 0 t bilder ved hjelp av et invertert mikroskop med et 20x mål. Ta to 0 t bilder per brønn. Dette vil gi en mer fullstendig dekning av overføringslinjen.
- Bruk markeringene (linje og bindestreker) til å plassere brønnen for å fange den øverste halvdelen av skrapelinjen. Unngå å forestille deg den midterste streken for å sikre at det samme migrasjonsområdet ikke blir avbildet to ganger, noe som kan forskyve resultatene.
- Bruk bildebehandlingsprogramvare (Table of Materials) til å ta 0 timer #1. Flytt deretter platen for å plassere den nederste halvdelen av brønnen/ripelinjen i lys av kameraet. Igjen, unngå å fange den midterste dashbordet. Når du er på plass, ta 0 t #2 (Figur 1).
MERK: Unngå den midterste streken i begge 0 h-bildene vil hindre at du fanger opp migreringsområder to ganger, noe som hvis det gjøres kan gi gjentatte resultater og forvrenge dataene.
- Etter inkubering i 24 timer, fjern mediet fra brønnen, og vask brønnen med 1x nonsterile PBS (heretter er alle 1x PBS brukt ikke-fratrekk).
- I røykhetten tilsetter du 500 μL med 4 % paraformaldehyd til brønnen og inkuberer i 10 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern paraformaldehyd og vask 3x med 1x PBS i 5 min hver ved RT.
- Når cellene er vasket, fortsett til å ta 24 h bilder eller legge til 1x PBS til hver brønn og plasser ved 4 ° C til et senere tidspunkt. Celler kan bo ved 4 °C i 1-2 uker til de er klare til bilde.
- Gjennomsyre cellene ved å legge til 300 μL permeabiliserende oppløsning (1x PBS og 0,01% triton X-100) til hver brønn. Inkuber celler/plate med skånsom, kontinuerlig gynge i 30 min ved RT.
- Fjern permeabiliserende løsning og legg til 1% Coomassie Brilliant Blue flekk (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% eddiksyre, 45% metanol og 45% dH2O) i 10 min med mild, kontinuerlig gynge ved RT.
MERK: Hvis platene er belagt med et ekstracellulært matrisesubstrat, må du teste en belagt plate med Coomassie-farging før du utfører migreringsanalyse. Figur 2 viser at et matrisesubstrat kan brukes med denne analysen og ikke påvirke visualisering av celler. - Vask brønner 3x med 1x PBS ved RT med kontinuerlig gynge i 5 min hver.
- Etter vask, tilsett 300 μL 1x PBS og ta 24 timer bilder.
- Ta 24 t bilder ved å justere brønnen i samme posisjon som ble brukt til å ta 0 h bilder. For å oppnå dette, åpne de tidligere tatt 0 h bilder og bruke merkingen laget med den permanente markøren, justere brønnen i samme posisjon. Linjen ned i midten og flere strekmerker bør tillate nær justering mellom 24 h bildet og 0 h bildet (Figur 1).
4. Tilberedning av 0 t og 24 t bilder
- Åpne 0 t og 24 t bilder tatt av samme brønn og posisjon i bildeprogramvare (Table of Materials).
- Opprett et nytt lag på 0 t-bildet. Deretter klikker du det nye laget og endrer navnet på laget til "linjelag" ved å dobbeltklikke på teksten.
MERK: Dette laget vil bli referert til som linjelag fra dette punktet og frem. - Klikk penselverktøyet (penselikonet) og angi størrelsen på 10 px og fargen til rød.
- Når linjelaget er merket, tegner du to separate linjer som skisserer området for ripet. Linjene bør ikke berøre noen celler på grunn av disse linjene som markerer migrasjonsområdet.
- Klikk Flytt verktøy (pilikon), og trykk deretter ned Ctrl-knappen og klikk på både linje- og bakgrunnslagene.
- Klikk midt på 0 h-bildet og dra begge disse lagene til midten av 24 h-bildet.
- Nå bruker 24 h bildet, klikk på 0 h bakgrunnslaget og endre tettheten til 50%.
- Hold Ctrl knappen, klikk på både 0 h bakgrunn og linje lag og deretter gratis transformere lagene (Rediger> Free Transform). Bruk gratis transformasjon til å justere 0 t bakgrunns- og linjebildet til 24-h bakgrunnsbildet. Dette trinnet resulterer i overlegging av 0 t og 24 h bildet, som er nødvendig for å plassere linjene som markerer migrasjonsområdet i riktig posisjon på 24 h bildet.
- Etter vellykket overlegging av 0 t bakgrunns- og linjelagene på 24 h bakgrunnsbilde, sletter du 0 h bakgrunnslaget. Slett ved å klikke 0 t bakgrunnslaget, høyreklikk, og klikk slett lag.
- Hvis du sletter bakgrunnsbildet på 0 t, blir bare linjen og 24 t-bakgrunnslaget (nå referert til som migreringsbilde). Linjelaget vil indikere området for migrering/ripe på 24 h bildet og kan brukes til å bestemme antall migrerende celler.
- Lagre som det nye overføringsbildet som både en photoshop-fil og en TIFF/JPEG. MERK: En representativ figur som viser denne prosessen, presenteres i figur 3.
5. Telle antall migrerende celler
- Åpne overføringsbildet. Dette kan gjøres i et program som godtar TIFF / JPEG-filer (Table of Materials).
- Telle antall celler som er plassert i mellom, samt berøre de to røde linjene.
- Registrer antall overførte celler per bilde. Det vil være to migreringsbilder per brønn, og disse verdiene skal ikke kombineres før etter at verdiene er korrigert for overføringsområde (beskrevet i neste avsnitt).
6. Bestem migrasjonsområdet
- Åpne 24 h bildet som inneholder linjene for migrering i bildebehandlingsprogrammet i avsnitt 5 (Materials tabell).
- Lagre som dette bildet som "Migration Area Image".
- Når du har lagret, klikker du bakgrunnslaget, høyreklikker og klikker slett lag. Dette bør bare la skrapelinjene på bildet (figur 3).
- Bruk penselverktøyet (penselikonet) til å fylle ut området mellom kladdelinjene. Samsvarer med fargen på penselen med fargen som brukes til å tegne linjene for overføring.
- Endre bildet til en gråtoner for å generere et svart-hvitt-bilde (Bilde>Modus>Gråtoner), og lagre deretter bildet (Figur 4).
- Start analyseprogramvaren (Table of Materials) og åpne deretter filen "Area of Migration" i analyseprogramvare.
- Hvis du vil bestemme området for overføringslinjen, klikker du Bilde>Juster>Terskel. Det svarte overføringsområdet blir rødt, og prosentområdet vises i Terskel-boksen. Området vil bli rapportert som prosent av området linjen av migrasjon dekker sammenlignet med hele området fanget i bildet.
- Registrer prosentområdet for overføringslinjen, og kontroller at denne verdien er paret med antall overførte celler for det samme bildet.
7. Dataanalyse
- Normaliser antall migrerende celler til prosentområdet på ripen. Del antall migrerende celler etter prosentområdet for overføringslinjen (# overførte celler % Overføringsområde). Gjør dette per bilde og ikke et gjennomsnitt basert på migrering per brønn.
- Når du har normalisert verdier per bilde, legger du til verdiene for de to bildene, som representerer en enkeltbrønn. Denne verdien vil bli brukt til grafisk og statistisk analyse. Hvis den eksperimentelle designen inneholdt flere repliker. Gjennomsnittlige replikeringsverdier før statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne prosedyren dokumenterer en ny tilnærming til å studere cellemigrasjon som er både kostnadseffektiv og lett tilpasningsdyktig for de fleste laboratorier. Mange studier har brukt time-lapse mikroskopi for å vurdere cellemigrasjon, men utstyret som kreves for denne metoden er ikke lett tilgjengelig for mange laboratorier. Mens bruk av linjer og bindestreker for avgrensning gir mulighet til å gjenerobre bestemte interesseområder på forskjellige tidspunkter uten bruk av dyrt utstyr (figur 1 og figur 3). Selv om bruk av avgrensninger er avgjørende for denne nye tilnærmingen, er det mange områder av denne metoden som kan tilpasses individuelle forskeres behov. Protokollen indikerte et 24 h endepunkt; Dette endepunktet kan imidlertid utvides basert på et enkelt laboratoriums behov. Justering av endepunktet i protokollen kan tillate fortsatt dyrking av celler for videre bruk. I tillegg tillater denne protokollen fleksibiliteten til å teste virkningen av farmakologiske modifikatorer samt ekstracellulære matriseunderstrater på migrasjon. Til slutt er den dyreste komponenten i denne metoden bruk av bildebehandlingsprogramvare, som kan være lisensiert programvare, men bruk av lisensiert programvare er ikke det eneste alternativet. Annen bildebehandling programvare som tillater generering av linjer og overlegg bilder kan benyttes med denne metoden. I tillegg, til den kostnadseffektive og tilpasningsdyktige naturen til denne metoden, presenterer den en ny tilnærming til å undersøke cellemigrasjon ved å faktorere området av ripen.
Denne nye tilnærmingen ble nylig brukt i Burr et al. 2020 for å vurdere forskjeller i hjertefibroblastmigrasjon mellom celler isolert fra ikke-diabetikere og diabetikerhjerter20. Figur 3 presenterer representative bilder som brukes til å vurdere fibroblastmigrasjon. Fra disse bildene ble det fastslått at 46 fibroblaster fra ikke-diabetikere hjerter og 129 fibroblaster fra diabetiske hjerter hadde migrert i løpet av 24-timersperioden av eksperimentet. Ved gruppesammenligninger hadde antall celler fra diabetikerhjertene migrert 2,8x større enn celler fra ikke-diabetiske hjerter (tabell 1). Mens disse resultatene indikerte celler fra diabetiske hjerter hadde migrert mer, tallene var misvisende, fordi området av scratch var forskjellig for hver av de to gruppene. Det ikke-diabetiske skrapeområdet var 24,78 % av det totale arealet som ble målt, mens diabetisk migreringsskrape var 16,77 % av det totale målte arealet. Når området av riper ble vurdert, det gitt et forhold (cellenummer /% scratch område) indikerer at fibroblaster fra diabetiske hjerter faktisk migrert 4.13x større enn celler fra ikke-diabetiske hjerter. Disse resultatene understreket viktigheten av å vurdere migrasjonsområde når du gjennomfører migrasjonsanalyser.
Normalisering til migrasjonsområdet gir en bedre og strengere vurdering av cellemigrasjon og negerer potensielle menneskelige feil. Mens den beskrevne metoden bruker en P200 pipettespiss, som skal gi en jevn og konsekvent ripe, kan ujevne riper oppstå på grunn av menneskelige uoverensstemmelser. Figur 5 understreker viktigheten av å faktoriere forskjeller i skrapeområdet. Hvis man skulle sammenligne bare antall migrerte fibroblaster, ville det vise at figur 5A har dobbelt så mange overførte celler sammenlignet med figur 5B. Mens når området av riper brukes til å normalisere dataene, indikerer det at forholdet mellom fibroblaster og migrasjonsområde er lik i både figur 5A og figur 5B. For dette eksemplet brukte vi ubehandlede ikke-diabetiske hjertefibroblaster fra forskjellige fibroblastisolasjoner; Derfor bør et lignende overføringsforhold være det forventede resultatet på grunn av arten av cellene som brukes i figur 5. Hvis man bare presenterer antall overførte celler, kan disse funnet være feilrepresentativ hvis det ripede området ikke er ensartet og konsekvent på tvers av alle prøver. Derfor er det viktig å ta hensyn til det oppskrapede området med denne metoden, samt andre ripeoverføringsanalyser. Disse representerte resultatene som presenteres i figur 5, viste hvordan normalisering av antall overførte celler til det ripede området kan presentere nøyaktige, repeterbare og pålitelige overføringsdata.
Figur 1: Diagram over eksperimentell design for fibroblast scratch migrasjon analyse. Oppsett: Før du plating celler i brønnen, tegne en linje og 3 strekmerker på bunnen på platen. 0 h: Kulturceller til 95% samløpet og administrer en ripe parallelt med den avbildede linjen. Ta 0 t bilder ved å velge en seksjon over og under den midterste streken. 24 t: La cellene migrere i 24 timer før festing og farging. For 24 t bilder, juster godt i samme posisjon som 0 h bilder for å fange overførte celler. Analyse: Skissere migrasjonsområdet på 0 t bilde og legg deretter 0 h-bildet på 24-h-bildet for å generere migrerings- og områdebilder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder som viser Coomassie farging forstyrrer ikke visualisering av celler. Hjertefibroblaster ble belagt på enten ingen kollagen (plastfat), kollagen isolert fra ikke-diabetiske mus haler, eller kollagen isolert fra diabetiske mus haler. Cellene ble brukt i scratch migreringsanalysen etter metodene som er beskrevet her. Cellene ble farget med 1% Coomassie Brilliant Blue flekk og deretter bilder av migrerende celler ble tatt. Skalalinjen avbildet på bildet er 100 μm. Detaljer om kollagenisolasjon og/eller cellemigrasjon på kollagen presenteres i Burr et al.20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative data som viser forskjellen i hjertefibroblastmigrasjon mellom ikke-diabetikere og diabetikerceller. 0 t og 24 t bilder som brukes til å beregne antall migrerte hjertefibroblaster isolert fra ikke-diabetiker og diabetikermus (rød linje viser området migrasjon og bilder tatt på 20x med skala bar = 100 μm). Diabetiske hjerteceller hadde 129 celler migrere i et område på 16,77%, som produserte en migrasjonsforhold på 7,69. Ikke-diabetiske fibroblaster hadde 46 celler migrere med et areal på 24,78% som førte til et forhold på 1,86. Bildene som presenteres i denne figuren ble brukt i resultatene presentert i Burr et al.20, men bildene avbildet her ble ikke vist i Burr et al.20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Diagram som viser generering av område av migreringsbilde. Trinn #1: Åpne overføringsbilde som inneholder overføringslinjer. Trinn #2: 24 h bildet fjernes, slik at på linjene for overføring i bildefeltet. Trinn #3: Penselverktøyet ble brukt til å fylle ut overføringsområdet. Trinn #4: Bildet konverteres til gråtoner og lagres deretter som et nytt bilde. Skalalinjen representerer 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Et eksempel på virkningen av ulike migrasjonsområder på fibroblastmigrasjon. Ikke-diabetiske hjertefibroblaster ble belagt på plastkulturretter og brukt i ripemigrasjonsanalysen, som beskrevet ovenfor (skala bar = 100 μm). (A) 92 migrerte fibroblaster med et prosentområde på 35,4% som resulterte i en migrasjonsgrad på 2,60. (B) 45 fibroblaster migrert med et areal på 17,57% som beregner et forhold på 2,56. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Fibroblast Type | Gjennomsnittlig antall overførte celler | Gjennomsnittlig areal på scratch | Cellenummer til et områdeforhold |
| Fibroblaster fra ikke-diabetiske hjerter | 46 | 24.78% | 1.86 |
| Fibroblaster fra Diabetic Hearts | 129 | 16.77% | 7.69 |
Tabell 1: Overføringsdata fra migreringsskrapeanalyse ved hjelp av ikke-diabetikere og diabetiske hjertefibroblaster. Antall ikke-diabetikere og diabetiske fibroblaster som migrerte ble bestemt ved hjelp av figur 3. Prosentområdet for hvert bilde ble beregnet ved hjelp av beskrevne metoder og ImageJ. Forholdet mellom migrasjon ble beregnet ved å dele antall migrerte fibroblaster med prosentmigrasjonsområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne nye tilnærmingen til scratch migrasjon analyse gir en mer tilgjengelig metode for forskere å undersøke endringer i cellemigrasjon. Selv om denne analysen følger samme prosedyre for å administrere en ripe som ligner på andre ripeanalyser, gir den en ny metode for avbildning og nøyaktig analyse av cellemigrasjon10. I stedet for å bruke utstyrsintensive metoder for tidsforløp mikroskopi og levende celle bildekamre, denne metoden detaljer bruk av allment tilgjengelig lab utstyr. Ved hjelp av et generelt omvendt mikroskop og kamera, kan man fange migreringsbilder samtidig samtidig som man opprettholder konsekvente kulturforhold. I tillegg gir denne metoden en presis avbildning av samme interesseområde uten bruk av avansert utstyr. Å fange opp det samme migrasjonsområdet vil redusere uoverensstemmelsene i å bestemme cellemigrasjon og gi en strengere og mer nøyaktig måling av cellemigrasjon. Til slutt tar denne metoden hensyn til området av ripen. Mens forsiktighet er tatt for å minimere menneskelige variasjoner i riper, kan uoverensstemmelser fortsatt forekomme, noe som viser viktigheten av å bruke området som en normaliseringsfaktor i analysen av cellemigrasjon. Samlet sett gir protokollen som er beskrevet ovenfor en ny tilnærming til et kraftig verktøy som vanligvis brukes til å vurdere cellemigrasjon.
Utvikling av en tilpasningsdyktig migrasjonsanalyse gir nye veier for forskning. Migrasjonsanalysen som presenteres her har evnen til å bli endret for å undersøke spesifikke forskningsspørsmål. Endringer kan gjøres når det gjelder aktivering eller hemming av spesifikke proteiner av interesse. Reagenser som farmakologiske modifikatorer (agonister eller antagonister) og RNA-interferens kan brukes på migrasjonsanalyse før, under eller til og med etter migrasjon for å ta opp spørsmål om migrasjon og spesifikke proteiner. Det lille volumet av 48-brønnfatet gjør det også mulig å legge til lavere mengder modifikatorer, noe som er en annen kostnadseffektiv metode. I tillegg kan denne analysen endres for å studere virkningen av ekstracellulære matrisekomponenter (ECM) på cellemigrasjon. Nylig brukte vi denne metoden, hvor cellekulturplater ble belagt med kollagen isolert fra diabetiker og ikke-diabetikermus for å vurdere effekten av diabetisk ekstracellulær matrise har på hjertefibroblastmigrasjon20. Mens denne studien benyttet isolert kollagen, kan denne metoden tilpasses andre ekstracellulære komponenter som kan være av interesse. Evnen til å vurdere virkningen av ECM migrasjon er svært nyttig på grunn av flere studier som indikerer viktigheten av ECM på migrasjon20,21,22. En potensiell komplikasjon som kan oppstå ved bruk av ECM-proteiner og belegg brønnene med svært konsentrert ECM-løsning er en innvirkning på visualisering av celler. Det anbefales hvis du bruker ECM, som kollagen, å belegge en brønn og flekk med Coomassie blå for å se om ECM kan synshemmede avbildning av celler. Hvis ECM svekker visualiseringsceller, vil fortynning av ECM-løsning forbedre dette problemet og tillate visualisering av celler på ECM.
Denne nye tilnærmingen på en gammel teknikk presenterer noen begrensninger. Denne metoden er tilpasset en liten skala (48-brønns cellekulturplate) og kan ikke gå over til større plater lett. På grunn av størrelsen på brønnen og området som er tatt i bildene, kan denne protokollen dokumentere en stor del av migrasjonsområdet. Utvidelse av denne metoden til større brønndimensjoner kan imidlertid føre til at du fanger opp en lavere del av overføringsområdet. Dette kan potensielt løses ved å øke antall bilder som er tatt, men flere metoder må kanskje brukes for å sikre at området med migreringsbilder kan identifiseres på nytt for de 24 h bildene. I tillegg er denne metoden begrenset til celler som kan benyttes i en ripeoverføringsanalyse. Celler som ikke reagerer i en tradisjonell ripemigrasjonsanalyse, er kanskje ikke ideelle for tilnærmingen som presenteres i dette manuskriptet. Selv om det er noen begrensninger med denne tilnærmingen, kan endring av metodene som er beskrevet i dette manuskriptet, lindre noen av begrensningene.
Scratch migrasjon analyse følger en enkel tilnærming, men det er noen kritiske skritt som må følges for å produsere en vellykket analyse. Et avgjørende skritt er å trekke de indikerer merkene på bunnen av brønnen. Hvis indikatorene ikke tegnes på brønnene, vil det være svært vanskelig/umulig å skille mellom området som må avbildes for 24-h-bildet, samt hindre innfanging av det samme migrasjonsområdet. Det er også viktig å gjenerobre det samme migrasjonsområdet i 24 h-bildet som ble tatt i 0 h-bildet. Hvis det samme området ikke er tatt på 24 timer, vil overlegging av bildene for migrasjon ikke være mulig. Uten overlagte bilder vil det ikke være mulig å avgjøre hvilke celler som har migrert. De overlagte bildene er avgjørende for denne tilnærmingen, fordi de gir en nøyaktig bestemmelse for cellemigrasjon. Siden scratch-metoden ikke alltid gir rette skrapelinjer, er det avgjørende at de riktige områdene avbildet for å generere de overlagte bildene. De overlagte bildene gir grunnlaget for nøyaktigheten av denne migrasjonsanalysen som presenteres i dette manuskriptet.
En ny tilpasning av ripeoverføringsanalysen gir en mer tilgjengelig og fleksibel tilnærming til å undersøke cellemigrasjon. Tidligere cellemigrasjonsstudier har brukt utstyrsintensive metoder som ikke er allment tilgjengelige for hvert laboratorium. Indikerer at utviklingen av en migrasjonsanalyse som har et bredere spekter av tilgjengelighet er avgjørende. Dette manuskriptet beskrev en ny tilnærming til en gammel teknikk som vil øke tilgjengeligheten til forskere som er interessert i cellemigrasjon. I tillegg gir denne metoden muligheten til å endre cellekulturmiljøet, enten via ekstracellulære matrisekomponenter eller bruk av farmakologiske modifikatorer, for å bestemme hvilken innvirkning som har på cellemigrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, University of Mississippi School of Pharmacy og Institutt for biomolekylære vitenskaper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
