Summary
Presentamos un método rentable para el ensayo de migración de arañazos que proporciona un nuevo enfoque para determinar la migración celular sin el uso de métodos intensivos en equipos. Mientras que los fibroblastos se utilizaron en este protocolo, se pueden adaptar y utilizar para estudiar tipos celulares adicionales e influencias en la migración celular.
Abstract
La migración celular es un componente clave en eventos fisiológicos y patológicos. La migración celular normal es necesaria para funciones esenciales como el desarrollo y el montaje de una respuesta inmunitaria. Cuando se produce un defecto o alteración con el proceso de migración celular, puede tener resultados perjudiciales (es decir, metástasis de cáncer, cicatrización de heridas y formación de cicatrices). Debido a la importancia de la migración celular, es necesario tener acceso a un ensayo de migración celular que sea asequible, adaptable y repetible. Utilizando el ensayo común de migración de arañazos, hemos desarrollado un nuevo enfoque para analizar la migración celular que utiliza equipos de laboratorio generales. El método descrito utiliza marcadores visuales que permiten recuperar áreas específicas de interés sin el uso de microscopía de lapso de tiempo. Además, proporciona flexibilidad en el diseño experimental, que van desde la alteración del sustrato de la matriz de migración hasta la adición de modificadores farmacológicos. Además, este protocolo describe una manera de tener en cuenta el área de migración celular, que no se considera mediante varios métodos al examinar la migración de celdas. Este nuevo enfoque ofrece un ensayo de migración de arañazos a un público más amplio y proporcionará una mayor oportunidad para que los investigadores examinen el impacto fisiológico y fisiopatológico de la migración celular.
Introduction
La migración celular es crucial para muchos eventos fisiológicos y patológicos. Es necesario durante el desarrollo, para el montaje de una respuesta inmune, y para la cicatrización de heridas adecuada1,2,3. Muchos de estos eventos de migración celular pueden desencadenarse por señales físicas o químicas. Por ejemplo, durante una respuesta inmunitaria, los leucocitos migrarán hacia un sitio de lesión en respuesta a un quimioatractant2. Además, los leucocitos también liberarán citoquinas para inducir la migración de células inmunitarias adicionales, así como otros tipos de células, como los fibroblastos, que están involucrados en el proceso de cicatrización de heridas, y por lo tanto, iniciando una respuesta multicelular4. La capacidad de las células para migrar es esencial para la función fisiológica adecuada; sin embargo, cuando la migración celular no se controla, puede tener una respuesta adversa y contribuir a eventos patológicos, como inflamación crónica, enfermedad vascular, metástasis de cáncer, y deterioro de la cicatrización de heridas2,3,4,5,6,7. El deterioro de la cicatrización de heridas es una aflicción común de los diabéticos debido a defectos en la migración celular, y si estos defectos no se abordan, podría conducir a complicaciones adicionales (por ejemplo, amputación8,9). Este estudio, así como otros, han indicado la necesidad de comprender mejor el proceso por el cual se produce la migración celular, ya sea en condiciones fisiológicas o patológicas normales, y es vital para promover este campo de investigación. Para lograrlo, es necesario que haya ensayos de migración disponibles que sean accesibles y asequibles para aquellos investigadores, que pueden no poseer el equipo necesario para llevar a cabo estos ensayos.
Actualmente, hay una variedad de ensayos de migración disponibles para examinar una amplia gama de temas relacionados con la migración celular. Se han desarrollado modelos de migración 2D y 3D, cada uno dirigido a áreas específicas que afectan a la migración celular. Los modelos de migración 3D se asocian típicamente con estudios de invasión celular y evalúan el impacto de la matriz extracelular en la migración celular10,11,12, mientras que los ensayos de migración 2D tienen un mayor rango de aplicación y se utilizan principalmente para estudiar la migración quimiotáctica, la cicatrización de heridas, y los cambios funcionales durante la migración celular13,14,15,16. Varios de estos ensayos requieren equipos adicionales, como cámaras Boyden o anillos de exclusión, lo que puede reducir la disponibilidad de estos ensayos a ciertos investigadores. Uno de los ensayos más rentables es el ensayo de arañazos, que se utiliza normalmente para evaluar la cicatrización de heridas y los cambios generales en la migración celular14,17. Mientras que la mayoría de los laboratorios están equipados para llevar a cabo un ensayo de rasguño, el equipo utilizado para rastrear la migración celular tiende a no estar disponible o demasiado caro para comprar. Esto incluye la microscopía de lapso de tiempo, que requiere un microscopio invertido y un sistema de imágenes en vivo. Estas costosas piezas de equipo no son comúnmente accesibles para todos los laboratorios. Por lo tanto, esta observación pone de relieve la necesidad de un nuevo protocolo que permita evaluar la migración celular con equipos más fácilmente disponibles.
El protocolo presentado aquí proporciona una forma nueva y asequible de evaluar la migración celular. Este método sigue el mismo procedimiento asociado con los ensayos de arañazos, pero difiere en el análisis del examen de la migración celular mediante la utilización de equipos más comúnmente disponibles en un entorno de laboratorio de ciencias básicas. Este protocolo que utiliza equipos comunes permite una determinación más precisa de la migración celular sin el uso de microscopía de lapso de tiempo. Además de determinar la migración, este método también tiene en cuenta los factores variables en el área de rayado que se ha observado que afectan en gran medida a la migración de celdas. En general, este nuevo protocolo para el análisis de migración celular ofrece una oportunidad para que más laboratorios exploren y contribuyan al campo de la migración celular.
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Protocol
1. Cultivo celular general
- Cultivo de fibroblastos cardíacos en el medio de águilas modificadas (DMEM) de Dulbecco que contienen 1 g/L de glucosa, piruvato de sodio, L-glutamina, y suplementado con 14,2 mM de NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% de suero bovino fetal inactivado térmicamente (FBS), 2% L-glutamina y 0,02% de reactivo antimicrobiano (ver Tabla de materiales)y mantenido en incubadora deCO2 a 37 oC.
- Cultivo de fibroblastos cardíacos hasta que se alcanza una confluencia del 90-95% en el paso 0 (P0). En este punto, los fibroblastos están listos para dividirse en una placa de 48 pozos, que se utiliza para el ensayo de migración.
2. Preparación de la placa de migración
- Preparar una placa de cultivo celular de 48 pozos dibujando una línea, usando un marcador permanente amarillo o de color claro, en el centro del pozo. A continuación, dibuje tres marcas hash que dividan el pozo en tres áreas de interés separadas. Estas secciones se utilizarán para la toma de imágenes.
NOTA: El uso de un marcador permanente de color claro permitirá obtener imágenes fáciles de las células migratorias. Los marcadores oscuros, como el negro o el azul, impedirán la visualización de las celdas migratorias. - Si evalúa la migración sobre un sustrato (por ejemplo, colágeno), cubra el pozo en este momento siguiendo las instrucciones y concentraciones utilizadas para el sustrato específico.
- Placa de 15.000-20.000 fibroblastos cardíacos, P1, en cada pozo y células de cultivo, en condiciones normales de cultivo (condiciones enumeradas en la sección anterior), hasta que alcanzan el 90-95% de confluencia. La confluencia debe alcanzarse entre 24-48 horas.
NOTA: Al configurar la placa de migración, asegúrese de incluir un control positivo (una celda migratoria conocida, como celdas 3T318),un control negativo (celdas sin rascacielos) y un pozo en blanco.
3. Scratch migración ensayo y fijación
- Una vez que las células alcancen el 90-95% de confluencia, retire los medios y rasque a lo largo de la línea dibujada usando una punta de pipeta estéril P200.
NOTA: Una punta de pipeta P200 es la punta de pipeta común de tamaño utilizado con el ensayo dearañazos 10,14,19. Además, solo haga una pasada con la punta P200 ya que más de un intento puede dar lugar a varias líneas de rayado. - Enjuague el pozo con medios séricos bajos (1,5% FBS) para eliminar cualquier fibroblastos cardíacos no asociados.
- Añadir 500 l de medios séricos bajos a cada pocól. Si utiliza algún agente farmacológico, agréguelos en este momento.
NOTA: Se utilizan medios séricos bajos porque permiten/promueven la migración celular y evitan que los fibroblastos proliferen, lo que podría sesgar los resultados del ensayo demigración 20. Para este protocolo, se utilizó el 1,5% de FBS. - Capturar imágenes de 0 h antes de incubar los fibroblastos en una incubadora de 5% deCO2 a 37oC durante 24 h.
- Captura imágenes de 0 h con un microscopio invertido con un objetivo de 20x. Tome dos imágenes de 0 horas por pozo. Esto permitirá una cobertura más completa de la línea de migración.
- Usando las marcas (línea y guiones), coloque el pozo para capturar la mitad superior de la línea de rasguño. Evite tomar imágenes en el tablero central para asegurarse de que la misma área de migración no se toma una imagen dos veces, lo que podría sesgar los resultados.
- Utilice el software de imágenes (Tabla de materiales) para capturar #1 de imagen de 0 h. A continuación, mueva la placa para colocar la mitad inferior del pozo /línea de arañazo a la vista de la cámara. Una vez más, evite capturar el tablero central. Una vez en su lugar, capture la imagen de 0 h #2 (Figura 1).
NOTA: Evitar el guión medio en ambas imágenes de 0 h evitará capturar áreas de migración dos veces las cuales si se hace podría producir resultados repetidos y sesgar los datos.
- Después de la incubación durante 24 h, retire el medio del pozo, y lave el pozo con 1x PBS no estéril (en adelante, la 1x PBS utilizada no es estéril).
- En la campana de humos, añadir 500 l de 4% de paraformaldehído al pozo e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Retire el paraformaldehído y lave 3x con 1x PBS durante 5 minutos cada uno en RT.
- Una vez que las células se lavan, proceda a capturar imágenes de 24 h o agregue 1x PBS a cada pozo y colóquelos a 4 oC hasta un momento posterior. Las células pueden permanecer a 4 oC durante 1-2 semanas hasta que estén listas para la imagen.
- Permeabilizar las células mediante la adición de 300 l de solución permeabilizante (1x PBS y 0.01% tritón X-100) a cada pocómata. Incubar células/placas con balanceo suave y continuo durante 30 min en RT.
- Retire la solución permeabilizante y agregue una mancha de 1% Coomassie Brilliant Blue (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% ácido acético, 45% metanol y 45% dH2O) durante 10 min con un balanceo suave y continuo en RT.
NOTA: Si las placas están recubiertas con un sustrato de matriz extracelular, asegúrese de probar una placa recubierta con tinción de Coomassie antes de realizar el ensayo de migración. La Figura 2 muestra que un sustrato de matriz se puede utilizar con este ensayo y no la visualización del impacto de las células. - Lavar los pozos 3x con 1x PBS en RT con balanceo continuo durante 5 minutos cada uno.
- Después de lavados, añada 300 l de 1x PBS y capture imágenes de 24 h.
- Capture imágenes de 24 h alineando el pozo en la misma posición que se utilizó para capturar las imágenes de 0 h. Para lograr esto, abra las imágenes de 0 h capturadas previamente y utilizando la marca hecha con el marcador permanente, alinee el pozo en la misma posición. La línea hacia abajo las marcas de guiones centrales y adicionales debe permitir una alineación estrecha entre la imagen de 24 horas y la imagen de 0 h (Figura 1).
4. Preparación de imágenes de 0 h y 24 h
- Abrir imágenes de 0 h y 24 h tomadas del mismo pozo y posición en software de imagen (Tabla de materiales).
- Cree una nueva capa en la imagen de 0 h. A continuación, haga clic en la nueva capa y cambie el nombre de la capa a "capa de línea" haciendo doble clic en el texto.
NOTA: Esta capa se denominará capa de línea desde este punto. - Haz clic en la Herramienta Pincel (icono de pincel) y establece el tamaño en 10 px y el color en rojo.
- Con la capa de línea seleccionada, dibuje dos líneas separadas que delineen el área del rasguño. Las líneas no deben tocar ninguna celda debido a estas líneas que marcan el área de migración.
- Haga clic en la herramienta Mover (icono de flecha) y luego presione el botón Ctrl y haga clic en las capas de línea y fondo.
- Haga clic en el centro de la imagen de 0 h y arrastre ambas capas al centro de la imagen de 24 horas.
- Ahora usando la imagen de 24 h, haga clic en la capa de fondo 0 h y cambie la opacidad a 50%.
- Manteniendo presionado el botón Ctrl, haga clic en la capa de fondo y línea 0 h y luego transforme libremente las capas (Editar> Transformación Libre). Usando la transformación libre, alinee el fondo de 0 h y la imagen de línea con la imagen de fondo de 24 horas. Este paso da como resultado la superposición de la imagen 0 h y 24 h, que es necesaria para colocar las líneas que marcan el área de migración en la posición correcta en la imagen de 24 horas.
- Después de superponer correctamente las capas de fondo y línea de 0 h en la imagen de fondo de 24 horas, elimine la capa de fondo 0 h. Para eliminar, haga clic en la capa de fondo 0 h, haga clic con el botón derecho y haga clic en Eliminar capa.
- La eliminación de la imagen de fondo de 0 h dejará solo la línea y la capa de fondo de 24 horas (ahora denominada imagen de migración). La capa de línea indicará el área de migración/arañazo en la imagen de 24 horas y se puede utilizar para determinar el número de celdas migratorias.
- Guardar como la nueva imagen de migración como un archivo de photoshop y un TIFF/JPEG. NOTA: una figura representativa que representa este proceso se presenta en la Figura 3.
5. Contar el número de células migratorias
- Abra la imagen de migración. Esto se puede hacer en un programa que acepta archivos TIFF/JPEG (Tabla de materiales).
- Cuente el número de celdas que se encuentran en el medio, así como tocar las dos líneas rojas.
- Registre el número de celdas migratorias por imagen. Habrá dos imágenes de migración por pozo, y estos valores no deben combinarse hasta después de que los valores se hayan corregido para el área de migración (detallada en la sección siguiente).
6. Determinar el área de migración
- Abra la imagen de 24 horas que contiene las líneas de migración en el programa de software de imágenes en la sección 5 (Tabla de materiales).
- Guardar como esta imagen como "Imagen de área de migración".
- Después de guardar, haga clic en la capa de fondo, haga clic con el botón derecho y haga clic en Eliminar capa. Esto debe dejar sólo las líneas de arañazo en la imagen (Figura 3).
- Usando la Herramienta Pincel (icono de pincel) rellena el área entre las líneas de scratch. Haga coincidir el color del pincel con el color utilizado para dibujar las líneas para la migración.
- Cambie la imagen a una escala de grises para generar una imagen en blanco y negro (Imagen>Modo>Escala de grises)y, a continuación, guarde la imagen (Figura 4).
- Inicie el software de análisis (Tabla de materiales) y, a continuación, abra el archivo "Area of Migration" dentro del software de análisis.
- Para determinar el área de la línea de migración, haga clic en Imagen>Ajustar>Umbral. El área de migración negra se volverá roja y el área de porcentaje se indicará en el cuadro Umbral. El área se notificará como el porcentaje de área que cubre la línea de migración en comparación con toda el área capturada en la imagen.
- Registre el área de porcentaje para la línea de migración y asegúrese de que este valor está emparejado con el número de celdas de migración para la misma imagen.
7. Análisis de datos
- Normalice el número de celdas migratorias al área de porcentaje del rasguño. Divida el número de celdas migratorias por el área porcentual de la línea de migración (en % de migración de las celdas migradas). Haga esto por imagen y no un promedio basado en la migración por pozo.
- Después de normalizar los valores por imagen, agregue los valores de las dos imágenes, lo que representa un pozo individual. Este valor se utilizará para el análisis gráfico y estadístico. Si el diseño experimental contenía varias réplicas. Valores de réplica promedio antes del análisis estadístico.
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Representative Results
Este procedimiento documenta un nuevo enfoque para estudiar la migración celular que es rentable y fácilmente adaptable para la mayoría de los laboratorios. Muchos estudios han utilizado la microscopía de lapso de tiempo para evaluar la migración celular, pero el equipo necesario para este método no está fácilmente disponible para muchos laboratorios. Mientras que la utilización de líneas y guiones para la demarcación permite la capacidad de recapturar áreas específicas de interés en diferentes puntos de tiempo sin el uso de equipos costosos(Figura 1 y Figura 3). Si bien el uso de demarcaciones es esencial para este nuevo enfoque, hay muchas áreas de este método que se pueden adaptar para adaptarse a las necesidades individuales del investigador. El protocolo indicaba un punto final de 24 h; sin embargo, ese punto final se puede extender en función de las necesidades de un laboratorio individual. Ajustar el punto final del protocolo puede permitir el cultivo continuo de las células para su uso posterior. Además, este protocolo permite la flexibilidad para probar el impacto de los modificadores farmacológicos, así como los sustratos de matriz extracelular en la migración. Por último, el componente más rentable de este método es el uso de software de imágenes, que puede ser software con licencia, pero el uso de software con licencia no es la única opción. Con este método se puede utilizar otro software de imágenes que permite la generación de líneas e imágenes superpuestas. Además, a la naturaleza rentable y adaptable de este método, presenta un nuevo enfoque para examinar la migración celular factorizando el área del rasguño.
Este nuevo enfoque se utilizó recientemente en Burr et al. 2020 para evaluar las diferencias en la migración de fibroblastos cardíacos entre células aisladas de corazones no diabéticos y diabéticos20. La Figura 3 presenta imágenes representativas utilizadas para evaluar la migración de fibroblastos. A partir de estas imágenes, se determinó que 46 fibroblastos de corazones no diabéticos y 129 fibroblastos de corazones diabéticos habían migrado durante el período de tiempo de 24 horas del experimento. Tras las comparaciones de grupos, el número de células de los corazones diabéticos había migrado 2,8 veces más que las células de corazones no diabéticos (Tabla 1). Si bien estos resultados indicaban que las células de los corazones diabéticos habían migrado más, los números eran engañosos, porque el área del rasguño era diferente para cada uno de los dos grupos. El área de arañazos no diabéticos fue del 24,78% del área total medida, mientras que el rasguño migratorio diabético fue del 16,77% del área total medida. Cuando se consideró el área del rasguño, proporcionó una relación (número de célula/% área de arañazos) que indicaba que los fibroblastos de los corazones diabéticos realmente migraron 4.13 veces más que las células de corazones no diabéticos. Estos resultados pusieron de relieve la importancia de considerar el área de migración al realizar ensayos de migración.
Normalizarse al área de migración proporciona una evaluación mejor y más rigurosa de la migración celular y niega un posible error humano. Mientras que el método descrito utiliza una punta de pipeta P200, que debe proporcionar un rasguño uniforme y consistente, pueden ocurrir arañazos desiguales debido a incoherencias humanas. La Figura 5 destaca la importancia de factorizar las diferencias en el área de arañazos. Si se compara sólo el número de fibroblastos migrados, se mostraría que la Figura 5A tiene el doble del número de células migradas en comparación con la Figura 5B. Mientras que cuando el área del scratch se utiliza para normalizar los datos, indica que la relación de fibroblastos a área de migración es similar tanto en la Figura 5A como en la Figura 5B. Para este ejemplo, utilizamos fibroblastos cardíacos no diabéticos no tratados de diferentes aislamientos de fibroblastos; por lo tanto, una relación de migración similar debe ser el resultado esperado debido a la naturaleza de las células utilizadas en la Figura 5. Si uno presentaba sólo el número de celdas migradas, estos hallazgos podrían ser tergiversatorios si el área rayada no es uniforme y coherente en todas las muestras. Por lo tanto, es importante tener en cuenta el área rayada con este método, así como otros ensayos de migración de arañazos. Estos resultados representados presentados en la Figura 5 demostraron cómo normalizar el número de celdas migradas al área rayada puede presentar datos de migración precisos, repetibles y confiables.
Figura 1: Diagrama del diseño experimental para el ensayo de migración de arañazos de fibroblastos. Configuración: Antes de enchapar las celdas en el pozo, dibuje una línea y 3 marcas de guión en la parte inferior de la placa. 0 h: Células de cultivo hasta el 95% de confluencia y administrar un rasguño paralelo a la línea representada. Captura imágenes de 0 h seleccionando una sección por encima y por debajo del tablero central. 24 h: Permita que las células migren durante 24 horas antes de fijar y manchar. Para imágenes de 24 horas, alinee bien en la misma posición que las imágenes de 0 h para capturar celdas migradas. Análisis: Esboce el área de migración en la imagen de 0 h y luego superponga la imagen de 0 h en la imagen de 24 horas para generar imágenes de migración y área. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las imágenes representativas que muestran la tinción de Coomassie no interfieren con la visualización de las células. Los fibroblastos cardíacos fueron chapados en no hay colágeno (plato plástico), colágeno aislado de colas de ratones no diabéticos o colágeno aislado de colas de ratones diabéticos. Las celdas se utilizaron en el ensayo de migración de arañazos siguiendo los métodos descritos aquí. Las células se tiñeron con una mancha azul brillante de Coomassie y luego se capturaron imágenes de células migratorias. La barra de escala que se muestra en la imagen es de 100 m. Los detalles sobre el aislamiento de colágeno y/o la migración celular en colágeno se presentan en Burr et al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Datos representativos que demuestran la diferencia en la migración de fibroblastos cardíacos entre las células no diabéticas y diabéticas. Imágenes de 0 h y 24 h utilizadas para calcular el número de fibroblastos cardíacos migrados aislados de ratones no diabéticos y diabéticos (la línea roja representa el área de migración y las imágenes tomadas a 20x con la barra de escala a 100 m). Las células cardíacas diabéticas tenían 129 células migrando en un área del 16,77%, lo que produjo una relación de migración de 7,69. Los fibroblastos no diabéticos tenían 46 células migrando con un área del 24,78%, lo que llevó a una proporción de 1,86. Las imágenes presentadas en esta figura se utilizaron en los resultados presentados en Burr et al.20, pero las imágenes representadas aquí no se mostraron en Burr et al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diagrama que representa la generación de área de imagen de migración. Paso #1: abrir la imagen de migración que contiene líneas de migración. Paso #2: La imagen de 24 h se elimina, dejando en las líneas de migración en el campo de imagen. Paso #3: La herramienta de pincel se utilizó para rellenar el área de migración. Paso #4: La imagen se convierte a escala de grises y, a continuación, se guarda como una nueva imagen. La barra de escala representa 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Un ejemplo del impacto de diferentes áreas de migración en la migración de fibroblastos. Los fibroblastos cardíacos no diabéticos fueron chapados en platos de cultivo plástico y utilizados en el ensayo de migración de arañazos, como se describió anteriormente (barra de escala de 100 m). (A) 92 migraron fibroblastos con un área porcentual del 35,4%, lo que dio lugar a una relación de migración del 2,60. (B) 45 fibroblastos migrados con un área del 17,57% que calcula una proporción de 2,56. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tipo de fibroblasto | Número medio de células migradas | Zona promedio del rasguño | Número de celda a relación de área rayada |
| Fibroblastos de corazones no diabéticos | 46 | 24.78% | 1.86 |
| Fibroblastos de corazones diabéticos | 129 | 16.77% | 7.69 |
Tabla 1: Datos de migración del ensayo de arañazos de migración utilizando fibroblastos cardíacos no diabéticos y diabéticos. El número de fibroblastos no diabéticos y diabéticos que migraron se determinó utilizando la Figura 3. El área de porcentaje para cada imagen se calculó utilizando los métodos descritos y ImageJ. La proporción de migración se calculó dividiendo el número de fibroblastos migrados por el área de migración porcentual.
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Discussion
Este nuevo enfoque para el ensayo de migración de arañazos proporciona un método más accesible para que los investigadores examinen los cambios en la migración celular. Si bien este ensayo sigue el mismo procedimiento para administrar un rasguño similar a otros ensayos de scratch, proporciona un nuevo método para la creación de imágenes y el análisis preciso de la migración celular10. En lugar de utilizar métodos intensivos en equipos de microscopía de lapso de tiempo y cámaras de imágenes de células vivas, este método detalla el uso de equipos de laboratorio comúnmente disponibles. Utilizando un microscopio y una cámara invertidos generales, se pueden capturar imágenes de migración al mismo tiempo mientras se mantienen condiciones de cultivo consistentes. Además, este método proporciona una imagen precisa de la misma región de interés sin el uso de equipos avanzados. Capturar la misma área de migración reducirá las incoherencias en la determinación de la migración celular y proporcionará una medición más rigurosa y precisa de la migración celular. Por último, este método tiene en cuenta el área del rasguño. Si bien se toma precaución para minimizar las variaciones humanas en los arañazos, todavía pueden ocurrir incoherencias, lo que demuestra la importancia de usar el área como factor de normalización en el análisis de la migración celular. En general, el protocolo detallado anteriormente proporciona un nuevo enfoque para una herramienta poderosa que se utiliza comúnmente para evaluar la migración celular.
El desarrollo de un ensayo de migración adaptable proporciona nuevas vías para la investigación. El ensayo de migración presentado aquí tiene la capacidad de ser modificado para examinar cuestiones específicas de investigación. Se pueden realizar modificaciones con respecto a la activación o inhibición de proteínas específicas de interés. Los reactivos como los modificadores farmacológicos (agonistas o antagonistas) y la interferencia del ARN se pueden aplicar al ensayo de migración antes, durante o incluso después de la migración para abordar preguntas sobre la migración y proteínas específicas. El pequeño volumen del plato de 48 pozos también permite añadir cantidades más bajas de modificadores, que es otro método rentable. Además, este ensayo se puede modificar para estudiar el impacto de los componentes de matriz extracelular (ECM) en la migración celular. Recientemente aplicamos este método, donde las placas de cultivo celular fueron recubiertas con colágeno aislado de ratones diabéticos y no diabéticos para evaluar el impacto de la matriz extracelular diabética tiene en la migración de fibroblastoscardíacos 20. Mientras que este estudio utilizó colágeno aislado, este método se puede adaptar a otros componentes extracelulares que pueden ser de interés. La capacidad de evaluar el impacto de la migración de ECM es muy útil debido a múltiples estudios que indican la importancia de ECM en lamigración 20,21,22. Una complicación potencial que puede ocurrir con el uso de proteínas ECM y el recubrimiento de los pozos con una solución de ECM altamente concentrada es un impacto en la visualización de las células. Se recomienda si se utiliza ECM, como colágeno, para recubrir un pozo y manchar con Coomassie azul para ver si el ECM podría afectar visualmente la imagen de las células. Si el ECM afecta a la visualización de las células, la dilución de la solución ECM mejorará este problema y permitirá visualizar las células en ELC.
Este nuevo enfoque sobre una técnica antigua presenta algunas limitaciones. Este método se ha adaptado a una pequeña escala (placa de cultivo celular de 48 pozos) y puede que no pase a placas más grandes fácilmente. Debido al tamaño del pozo y el área capturada en las imágenes, este protocolo puede documentar una gran parte del área de migración. Sin embargo, la expansión de este método a dimensiones de pozo más grandes puede dar lugar a la captura de una parte inferior del área de migración. Esto se puede resolver potencialmente aumentando el número de imágenes capturadas, pero es posible que sea necesario aplicar métodos adicionales para garantizar que el área de migración de imágenes se pueda volver a identificar para las imágenes de 24 horas. Además, este método se limita a las celdas que se pueden utilizar en un ensayo de migración de cero. Las células que no responden en un ensayo tradicional de migración de arañazos pueden no ser ideales para el enfoque presentado dentro de este manuscrito. Si bien hay algunas limitaciones con este enfoque, modificar los métodos detallados en este manuscrito podría aliviar algunas de las limitaciones.
El ensayo de migración de arañazos sigue un enfoque simple, pero hay algunos pasos críticos que deben seguirse para producir un ensayo exitoso. Un paso crucial es dibujar las marcas indicativas en la parte inferior del pozo. Si los indicadores no se dibujan en los pozos será muy difícil/imposible diferenciar el área que necesita ser imagen para la imagen de 24 h, así como evitar la recaptura de la misma área de migración. Además, es importante volver a capturar la misma área de migración en la imagen de 24 horas que se capturó en la imagen de 0 h. Si no se captura la misma área a las 24 horas, no será factible superponer las imágenes para la migración. Sin imágenes superpuestas no será posible determinar qué celdas se han migrado. Las imágenes superpuestas son fundamentales para este enfoque, ya que proporcionan una determinación precisa para la migración celular. Dado que el método scratch no siempre proporciona líneas de rayado rectas, es fundamental que se imaginen las áreas correctas para generar las imágenes superpuestas. Las imágenes superpuestas proporcionan la base para la exactitud de este ensayo de migración presentado dentro de este manuscrito.
Una nueva adaptación del ensayo de migración de arañazos proporciona un enfoque más accesible y flexible para examinar la migración celular. Estudios previos de migración celular han utilizado métodos intensivos en equipos que no están comúnmente disponibles para todos los laboratorios. Es esencial indicar que el desarrollo de un ensayo de migración que tenga una gama más amplia de accesibilidad es esencial. Este manuscrito describió un nuevo enfoque de una técnica antigua que aumentará la accesibilidad a los investigadores interesados en la migración celular. Además, este método proporciona la capacidad de alterar el entorno de cultivo celular, ya sea a través de componentes de matriz extracelular o el uso de modificadores farmacológicos, para determinar el impacto que tiene en la migración celular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por el Premio de Investigación Médica del Ejército de los Estados Unidos #81XWH-16-1-0710, la Escuela de Farmacia de la Universidad de Mississippi y el Departamento de Ciencias Biomoleculares.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
