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Biology

Un saggio di migrazione dei graffi economico e adattabile

doi: 10.3791/61527 Published: June 30, 2020

Summary

Presentiamo un metodo conveniente per il test di migrazione dei graffi che fornisce un nuovo approccio per determinare la migrazione cellulare senza l'uso di metodi ad alta intensità di apparecchiature. Mentre i fibroblasti sono stati utilizzati in questo protocollo, possono essere adattati e utilizzati per studiare ulteriori tipi di cellule e influenze sulla migrazione cellulare.

Abstract

La migrazione cellulare è una componente chiave sia negli eventi fisiologici che patologici. La normale migrazione cellulare è necessaria per funzioni essenziali come lo sviluppo e il montaggio di una risposta immunitaria. Quando si verifica un difetto o un'alterazione con il processo di migrazione cellulare, può avere esiti dannosi (ad esempio, metastasi del cancro, guarigione delle ferite e formazione di cicatrici). A causa dell'importanza della migrazione cellulare, è necessario avere accesso a un test di migrazione cellulare conveniente, adattabile e ripetibile. Utilizzando il comune test di migrazione dei graffi, abbiamo sviluppato un nuovo approccio all'analisi della migrazione cellulare che utilizza apparecchiature di laboratorio generali. Il metodo descritto utilizza marcatori visivi che consentono di riconquistare aree specifiche di interesse senza l'uso di microscopia time-lapse. Inoltre, fornisce flessibilità nella progettazione sperimentale, che va dall'alterazione del substrato della matrice di migrazione all'aggiunta di modificatori farmacologici. Inoltre, questo protocollo delinea un modo per tenere conto dell'area di migrazione delle celle, che non viene presa in considerazione da diversi metodi quando si esamina la migrazione delle celle. Questo nuovo approccio offre un saggio di migrazione dei graffi a un pubblico più ampio e offrirà maggiori opportunità ai ricercatori di esaminare l'impatto fisiologico e fisiopatico della migrazione cellulare.

Introduction

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La migrazione cellulare è fondamentale per molti eventi fisiologici e patologici. È necessario durante lo sviluppo, per montare una risposta immunitaria e per una corretta guarigione delleferite 1,2,3. Molti di questi eventi di migrazione cellulare possono essere innescati da segnali fisici o chimici. Ad esempio, durante una risposta immunitaria, i leucociti migreranno verso un sito di lesione in risposta a un chemioattrattante2. Inoltre, i leucociti rilasceranno anche citochine per indurre la migrazione di cellule immunitarie aggiuntive, così come altri tipi di cellule, come i fibroblasti, che sono coinvolti nel processo di guarigione delle ferite, e quindi, avviando una risposta multicellulare4. La capacità delle cellule di migrare è essenziale per una corretta funzione fisiologica; tuttavia, quando la migrazione cellulare non viene controllata, può avere una risposta avversa e contribuire a eventi patologici, come infiammazione cronica, malattia vascolare, metastasi tumorale e alterazione della guarigione delleferite 2,3,4,5,6,7. La guarigione delle ferite compromessa è una comune afflizione dei diabetici a causa di difetti nella migrazione cellulare e, se questi difetti non vengono affrontati, potrebbe portare a ulteriori complicazioni (ad esempio, amputazione8,9). Questo studio, così come altri, hanno indicato la necessità di comprendere ulteriormente il processo attraverso il quale avviene la migrazione cellulare, sia in normali condizioni fisiologiche che patologiche, ed è vitale per promuovere questo campo di ricerca. A tal fine, sono disponibili test di migrazione accessibili e accessibili a quei ricercatori, che potrebbero non possedere le attrezzature necessarie per condurre questi test.

Attualmente, sono disponibili una varietà di test di migrazione per esaminare un'ampia gamma di argomenti relativi alla migrazione cellulare. Sono stati sviluppati sia modelli di migrazione 2D che 3D, ognuno dei quali mira ad aree specifiche che hanno un impatto sulla migrazione cellulare. I modelli di migrazione 3D sono tipicamente associati a studi sull'invasione cellulare e valutano l'impatto della matrice extracellulare sulla migrazionecellulare 10,11,12, mentre i test di migrazione 2D hanno una maggiore gamma di applicazioni e vengono utilizzati principalmente per studiare la migrazione chemiotattica, la guarigione delle ferite e i cambiamenti funzionali durante la migrazione cellulare13,14,15,16. Molti di questi saggi richiedono attrezzature aggiuntive, come camere Boyden o anelli di esclusione, che possono ridurre la disponibilità di questi test per alcuni ricercatori. Uno dei saggi più economici è il test scratch, che viene in genere utilizzato per valutare la guarigione delle ferite e i cambiamenti generali nella migrazione cellulare14,17. Mentre la maggior parte dei laboratori sono attrezzati per condurre un test scratch, le apparecchiature utilizzate per tenere traccia della migrazione cellulare tendono ad essere non disponibili o troppo costose da acquistare. Ciò include la microscopia time-lapse, che richiede un microscopio invertito e un sistema di imaging dal vivo. Questi costosi pezzi di equipaggiamento non sono comunemente accessibili a tutti i laboratori. Pertanto, questa osservazione evidenzia la necessità di un nuovo protocollo che consenta la valutazione della migrazione cellulare con apparecchiature più prontamente disponibili.

Il protocollo qui presentato fornisce un modo nuovo e conveniente per valutare la migrazione cellulare. Questo metodo segue la stessa procedura associata ai test scratch ma differisce nell'analisi dell'esame della migrazione cellulare utilizzando apparecchiature più comunemente disponibili in un laboratorio di scienze di base. Questo protocollo che utilizza apparecchiature comuni consente una determinazione più accurata della migrazione cellulare senza l'uso di microscopia time-lapse. Oltre a determinare la migrazione, questo metodo rappresenta anche fattori variabili nell'area scratch che è stato notato per influire notevolmente sulla migrazione delle celle. Nel complesso, questo nuovo protocollo per l'analisi della migrazione cellulare offre a più laboratori l'opportunità di esplorare e contribuire al campo della migrazione cellulare.

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Protocol

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1. Coltura cellulare generale

  1. Fibroblasti cardiaci in coltura nel mezzo delle aquile modificate (DMEM) di Dulbecco contenente 1 g/L di glucosio, piruvato di sodio, L-glutammina, e integrato con 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% siero bovino fetale inattivato termicamente (FBS), 2% L-glutammina e 0,02% reagente antimicrobico (vedi Tabella dei materiali)e mantenuto in incubatrice di CO2 a 37 °C.
  2. I fibroblasti cardiaci di coltura fino al 90-95% di confluenza raggiunte si raggiunge al passaggio 0 (P0). A questo punto i fibroblasti sono pronti per essere divisi in una piastra da 48 po ', che viene utilizzata per il test di migrazione.

2. Preparazione della piastra di migrazione

  1. Preparare una piastra di coltura cellulare di 48 po 'disegnando una linea, usando un marcatore permanente giallo o di colore chiaro, verso il centro del pozzo. Quindi, disegna tre segni hash che dividono il pozzo in tre aree di interesse separate. Queste sezioni verranno utilizzate per l'imaging.
    NOTA: l'utilizzo di un marcatore permanente a colori chiaro consentirà una facile imaging delle cellule migrate. Marcatori scuri come il nero o il blu impediranno la visualizzazione delle celle di migrazione.
  2. Se si valuta la migrazione su un substrato (ad esempio, collagene), rivestire il pozzo in questo momento seguendo le istruzioni e le concentrazioni utilizzate per il substrato specifico.
  3. Placca ~15.000-20.000 fibroblasti cardiaci, P1, in ogni pozzo e cellule di coltura, in normali condizioni di coltura (condizioni elencate nella sezione precedente), fino a raggiungere il 90-95% di confluenza. La confluenza dovrebbe essere raggiunta tra le 24 e le 48 ore.
    NOTA: quando si imposta la piastra di migrazione assicurarsi di includere un controllo positivo (una cella migratrice nota, ad esempio celle 3T318), un controllo negativo (celle non rimescolate) e un pozzo vuoto.

3. Test e fissazione della migrazione dei graffi

  1. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza del 90-95%, rimuovere il supporto e graffiare lungo la linea disegnata utilizzando una punta sterile per pipetta P200.
    NOTA: Una punta di pipetta P200 è la comune punta della pipetta dimensionata utilizzata con il saggio scratch10,14,19. Inoltre, fai solo un passaggio con la punta P200 poiché più di un tentativo può causare più linee scratch.
  2. Risciacquare il pozzo con mezzi sieri bassi (1,5% FBS) per rimuovere eventuali fibroblasti cardiaci non attaccati.
  3. Aggiungere 500 μL di mezzi a basso contenuto di siero ad ogni pozzo. Se si utilizzano agenti farmacologici, aggiungerli in questo momento.
    NOTA: Viene utilizzato un basso supporto siero perché consente/promuove la migrazione cellulare e impedisce la proliferazione di fibroblasti che potrebbero distorcere i risultati del saggio di migrazione20. Per questo protocollo, è stato utilizzato l'1,5% di FBS.
  4. Cattura immagini di 0 ore prima di incubare i fibroblasti in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per 24 ore.
    1. Cattura immagini 0 h usando un microscopio invertito con un obiettivo 20x. Scatta due immagini da 0 ore per pozzo. Ciò consentirà una copertura più completa della linea di migrazione.
    2. Utilizzando le marcature (linea e trattini), posizionare il pozzo per catturare la metà superiore della linea di graffi. Evitare di creare immagini del trattino centrale per assicurarsi che la stessa area di migrazione non sia immagine due volte, il che potrebbe distorcere i risultati.
    3. Utilizzare il software di imaging (Table of Materials) per acquisire immagini a 0 #1. Quindi spostare la piastra per posizionare la metà inferiore del pozzo / linea di graffio in vista della fotocamera. Ancora una volta, evitare di catturare il trattino centrale. Una volta in posizione, acquisire l'immagine 0 h #2(Figura 1).
      NOTA: Evitare il trattino centrale in entrambe le immagini 0 h impedirà di acquisire aree di migrazione due volte, il che, se fatto, potrebbe produrre risultati ripetuti e distorcere i dati.
  5. Dopo aver incubato per 24 ore, rimuovere il supporto dal pozzo e lavare il pozzo con 1 PBS nonsterile (d'ora in poi tutti i 1x PBS utilizzati non sono asterile).
  6. Nella cappa aspirante aggiungere al pozzo 500 μL di paraformaldeide al 4% e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
  7. Rimuovere la paraformaldeide e lavare 3 volte con 1 PBS per 5 minuti ciascuno a RT.
  8. Una volta lavate le cellule, procedere all'acquisizione di immagini 24 ore su 24 o aggiungere 1 PBS a ciascun pozzo e posizionarlo a 4 °C fino a un secondo momento. Le cellule possono rimanere a 4 °C per 1-2 settimane fino a quando non sono pronte per l'immagine.
    1. Permeabilizzare le cellule aggiungendo 300 μL di soluzione permeabilizzabile (1x PBS e 0,01% tritone X-100) ad ogni pozzo. Incubare cellule / piastre con dondolo delicato e continuo per 30 minuti a RT.
    2. Rimuovere la soluzione permeabilizzante e aggiungere l'1% di macchia Blu Brillante Coomassie (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% acido acetico, 45% metanolo e 45% dH2O) per 10 min con dondolo delicato e continuo a RT.
      NOTA: Se le piastre sono rivestite con un substrato a matrice extracellulare, assicurarsi di testare una piastra rivestita con colorazione Coomassie prima di condurre il test di migrazione. La figura 2 dimostra che un substrato matriciale può essere utilizzato con questo saggio e non con la visualizzazione dell'impatto delle cellule.
    3. Lavare i pozzi 3x con 1x PBS a RT con dondolo continuo per 5 minuti ciascuno.
    4. Dopo i lavaggi, aggiunto 300 μL di 1x PBS e catturare immagini 24 ore su 24.
    5. Cattura immagini 24 ore su 24 allineando il pozzo nella stessa posizione utilizzata per catturare le immagini 0 h. Per raggiungere questo obiettivo, aprire le immagini 0 h acquisite in precedenza e utilizzando la marcatura effettuata con il marcatore permanente, allineare il pozzo nella stessa posizione. La linea lungo i trattini centrali e aggiuntivi deve consentire uno stretto allineamento tra l'immagine 24 ore su 24 e l'immagine 0 h (Figura 1).

4. Preparazione di immagini da 0 h e 24 ore

  1. Aprire le immagini di 0 h e 24 ore prese dello stesso pozzo e della stessa posizione nel software di imaging(Table of Materials).
  2. Create un nuovo livello sull'immagine 0 h. Quindi, fate clic sul nuovo livello e modificate il nome del livello in "livello linea" facendo doppio clic sul testo.
    NOTA: questo livello verrà definito livello linea da questo punto in poi.
  3. Fare clic sull'strumento Pennello (icona del pennello) e impostare la dimensione su 10 px e il colore su rosso.
  4. Con il livello linea selezionato, disegnare due linee separate che delineano l'area del graffio. Le linee non devono toccare alcuna parte a causa di queste linee che contrassegnano l'area di migrazione.
  5. Fare clic sullo strumento Sposta (icona a forma di freccia), quindi premere CTRL e fare clic sui livelli linea e sfondo.
  6. Fate clic al centro dell'immagine 0 h e trascinate entrambi i livelli al centro dell'immagine di 24 ore.
  7. Ora usando l'immagine 24 ore su 24, fai clic sul livello di sfondo 0 h e cambia l'opacità al 50%.
  8. Tenendo premuto il pulsante CTRL, fate clic sia sullo sfondo 0 che sul livello linea, quindi liberate la trasformazione dei livelli (Edit>Free Transform). Utilizzando la trasformazione gratuita, allineare lo sfondo 0 h e l'immagine di linea all'immagine di sfondo di 24 ore. Questo passaggio comporta la sovrapposizione dell'immagine 0 h e 24 h, necessaria per posizionare le linee che contrassegnano l'area di migrazione nella posizione corretta sull'immagine 24 ore su 24.
  9. Dopo aver superato correttamente la sovrapposizione dei livelli di sfondo e linea 0 h sull'immagine di sfondo di 24 ore, eliminare il livello di sfondo 0 h. Eliminare facendo clic sul livello di sfondo 0 h, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere elimina livello.
  10. L'eliminazione dell'immagine di sfondo 0 h lascerà solo la linea e il livello di sfondo di 24 ore (ora indicato come immagine di migrazione). Il livello linea indicherà l'area di migrazione/graffio sull'immagine 24 ore su 24 e può essere utilizzato per determinare il numero di celle migrate.
  11. Salvate come nuova immagine di migrazione sia come file photoshop che come TIFF/JPEG. NOTA: una figura rappresentativa che illustra questo processo è presentata nella figura 3.

5. Conteggio del numero di celle migrate

  1. Aprire l'immagine di migrazione. Questa impostazione può essere eseguita in un programma che accetta file TIFF/JPEG (Table of Materials).
  2. Contare il numero di celle che si trovano nel mezzo e toccare le due linee rosse.
  3. Registrare il numero di celle di migrazione per immagine. Ci saranno due immagini di migrazione per pozzo e questi valori non devono essere combinati fino a quando i valori non saranno stati corretti per l'area di migrazione (dettagliata nella sezione successiva).

6. Determinare l'area di migrazione

  1. Aprire l'immagine 24 ore su 24 contenente le linee di migrazione nel programma software di imaging nella sezione 5 (Tabella dei materiali).
  2. Salvare come immagine come "Immagine area di migrazione".
  3. Dopo il salvataggio, fare clic sul livello di sfondo, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere elimina livello. Ciò dovrebbe lasciare solo le linee scratch sull'immagine (Figura 3).
  4. Utilizzando lo strumento Pennello (icona pennello) riempire l'area tra le linee di graffio. Abbinare il colore del pennello al colore utilizzato per disegnare le linee per la migrazione.
  5. Modificare l'immagine in una scala di grigi per generare un'immagine in bianco e nero (Image>Mode>Grayscale) e quindi salvare l'immagine (Figura 4).
  6. Avviare il software di analisi (Table of Materials) e quindi aprire il file "Area of Migration" all'interno del software di analisi.
  7. Per determinare l'area della riga di migrazione, fare clic su Immagine>Regola>Threshold. L'area di migrazione nera diventerà rossa e l'area percentuale verrà indicata nella casella Soglia. L'area verrà segnalata come percentuale di area che la linea di migrazione copre rispetto all'intera area catturata nell'immagine.
  8. Registrare l'area percentuale per la riga di migrazione e assicurarsi che questo valore sia associato al numero di celle di migrazione per la stessa immagine.

7. Analisi dei dati

  1. Normalizzare il numero di celle di migrazione nell'area percentuale del graffio. Dividere il numero di celle migrate per l'area percentuale della riga di migrazione (# celle migrate % Area di migrazione). Eseguire questa attività per immagine e non una media basata sulla migrazione per pozzo.
  2. Dopo aver normalizzare i valori per immagine, aggiungere i valori delle due immagini, che rappresentano un pozzo individuale. Questo valore verrà utilizzato per l'analisi grafica e statistica. Se il progetto sperimentale conteneva più repliche. Valori medi di replica prima dell'analisi statistica.

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Representative Results

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Questa procedura documenta un nuovo approccio allo studio della migrazione cellulare che sia conveniente e facilmente adattabile per la maggior parte dei laboratori. Molti studi hanno utilizzato la microscopia time-lapse per valutare la migrazione cellulare, ma le attrezzature necessarie per questo metodo non sono prontamente disponibili per molti laboratori. considerando che l'utilizzo di linee e trattini per la demarcazione consente di riconquistare aree specifiche di interesse in diversi punti di tempo senza l'uso diattrezzature costose (figura 1 e figura 3). Mentre l'uso di demarcazioni è essenziale per questo nuovo approccio, ci sono molte aree di questo metodo che possono essere adattate alle esigenze dei singoli ricercatori. Il protocollo indicava un endpoint di 24 ore; tuttavia, tale endpoint può essere esteso in base alle esigenze di un singolo lab. La regolazione dell'endpoint del protocollo può consentire una coltivazione continua delle celle per un ulteriore utilizzo. Inoltre, questo protocollo consente la flessibilità di testare l'impatto dei modificatori farmacologici e dei substrati della matrice extracellulare sulla migrazione. Infine, il componente più economico di questo metodo è l'uso di software di imaging, che può essere software concesso in licenza, ma l'uso di software concesso in licenza non è l'unica opzione. Con questo metodo è possibile utilizzare altri software di imaging che consentono la generazione di linee e immagini sovrapposte. Inoltre, alla natura economica e adattabile di questo metodo, presenta un nuovo approccio per esaminare la migrazione cellulare fattorizzando l'area del graffio.

Questo nuovo approccio è stato recentemente utilizzato in Burr et al. La figura 3 presenta immagini rappresentative utilizzate per valutare la migrazione dei fibroblasti. Da queste immagini, è stato determinato che 46 fibroblasti provenienti da cuori non diabetici e 129 fibroblasti provenienti da cuori diabetici erano migrati durante il periodo di 24 ore dell'esperimento. Nei confronti di gruppo, il numero di cellule provenienti dai cuori diabetici era migrato 2,8 volte superiore a quello delle cellule provenienti da cuori non diabetici (Tabella 1). Mentre questi risultati indicavano che le cellule dei cuori diabetici erano migrate di più, i numeri erano fuorvianti, perché l'area del graffio era diversa per ciascuno dei due gruppi. L'area di graffio non diabetica era il 24,78% dell'area totale misurata, mentre il graffio di migrazione diabetica era il 16,77% dell'area totale misurata. Quando l'area del graffio è stata considerata, ha fornito un rapporto (numero cellulare /% area scratch) che indica che i fibroblasti provenienti dai cuori diabetici sono effettivamente migrati 4,13 volte più grandi delle cellule provenienti da cuori non diabetici. Questi risultati hanno evidenziato l'importanza di considerare l'area di migrazione quando si conducono test di migrazione.

La normalizzazione all'area di migrazione fornisce una valutazione migliore e più rigorosa della migrazione cellulare e nega il potenziale errore umano. Mentre il metodo descritto utilizza una punta di pipetta P200, che dovrebbe fornire un graffio uniforme e coerente, possono verificarsi graffi irregolari a causa di incongruenze umane. La figura 5 evidenzia l'importanza di fattorizzare le differenze nell'area dei graffi. Se si confrontava solo il numero di fibroblasti migrati, si mostrerebbe che la figura 5A ha il doppio del numero di cellule migrate rispetto alla figura 5B. Mentre quando l'area del graffio viene utilizzata per normalizzare i dati, indica che il rapporto tra fibroblasti e area di migrazione è simile sia nella figura 5A che nella figura 5B. Per questo esempio, abbiamo usato fibroblasti cardiaci non diabetici non trattati da diversi isolamenti di fibroblasti; pertanto, un rapporto di migrazione simile dovrebbe essere il risultato atteso a causa della natura delle cellule utilizzate nella figura 5. Se si presenta solo il numero di celle migrate, questi risultati potrebbero essere travisati se l'area graffiata non è uniforme e coerente in tutti i campioni. Pertanto, è importante tenere conto dell'area graffiata con questo metodo e altri test di migrazione dei graffi. Questi risultati rappresentati presentati nella figura 5 hanno dimostrato come la normalizzazione del numero di celle migrate nell'area graffiata possa presentare dati di migrazione accurati, ripetibili e affidabili.

Figure 1
Figura 1: Diagramma del progetto sperimentale per il saggio di migrazione dei graffi dei fibroblasti. Configurazione: Prima di placcare le celle in pozzo, disegnare una linea e 3 segni di trattino sul fondo sulla piastra. 0 h: Celle di coltura fino al 95% di confluenza e somministrare un graffio parallelo alla linea raffigurata. Cattura immagini 0 h selezionando una sezione sopra e sotto il trattino centrale. 24 h: Consentire alle celle di migrare per 24 ore prima di fissare e macchiare. Per le immagini a 24 ore, allineati bene nella stessa posizione delle immagini di 0 ore per acquisire le celle migrate. Analisi: delineare l'area di migrazione sull'immagine 0 h e quindi sovrapporre l'immagine 0 h all'immagine 24 ore su 24 per generare migrazione e immagini di area. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Le immagini rappresentative che mostrano la colorazione Coomassie non interferiscono con la visualizzazione delle cellule. I fibroblasti cardiaci erano placcati senza collagene (piatto di plastica), collagene isolato dalle code dei topi non diabetici o collagene isolato dalle code dei topi diabetici. Le cellule sono state utilizzate nel test di migrazione dei graffi seguendo i metodi descritti qui. Le celle sono state macchiate con l'1% di macchia blu brillante Coomassie e poi sono state catturate immagini di cellule migratorie. La barra di scala raffigurata sull'immagine è di 100 μm. I dettagli sull'isolamento del collagene e/o sulla migrazione cellulare sul collagene sono presentati in Burr etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Dati rappresentativi che dimostrano la differenza nella migrazione dei fibroblasti cardiaci tra cellule non diabetiche e diabetiche. Immagini di 0 h e 24 ore utilizzate per calcolare il numero di fibroblasti cardiaci migrati isolati da topi non diabetici e diabetici (la linea rossa raffigura l'area di migrazione e le immagini scattate a 20x con barra di scala = 100 μm). Le cellule cardiache diabetiche avevano 129 cellule migrare in un'area del 16,77%, il che ha prodotto un rapporto di migrazione di 7,69. I fibroblasti non diabetici avevano 46 cellule che migrano con un'area del 24,78% che ha portato a un rapporto di 1,86. Le immagini presentate in questa figura sono state utilizzate nei risultati presentati in Burr etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Diagramma che illustra la generazione dell'area dell'immagine di migrazione. Passaggio #1: Aprire l'immagine di migrazione contenente linee di migrazione. Passaggio #2: l'immagine 24 ore viene rimossa, lasciando le linee di migrazione nel campo dell'immagine. Passaggio #3: lo strumento pennello è stato utilizzato per riempire l'area di migrazione. Passaggio #4: l'immagine viene convertita in scala di grigi e quindi salvata come nuova immagine. La barra di scala rappresenta 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Un esempio dell'impatto delle diverse aree di migrazione sulla migrazione dei fibroblasti. I fibroblasti cardiaci non diabetici sono stati placcati su piatti di coltura plastica e utilizzati nel saggio di migrazione dei graffi, come descritto sopra (barra di scala = 100 μm). (A) 92 fibroblasti migrati con una superficie percentuale del 35,4% che ha portato a un rapporto migratorio di 2,60. (B) 45 fibroblasti migrati con una superficie del 17,57% che calcola un rapporto di 2,56. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tipo fibroblasto Numero medio di celle migrate Area media del graffio Rapporto tra numero di cella e area graffiata
Fibroblasti da cuori non diabetici 46 24.78% 1.86
Fibroblasti dai cuori diabetici 129 16.77% 7.69

Tabella 1: Dati sulla migrazione dal test di migrazione scratch utilizzando fibroblasti cardiaci non diabetici e diabetici. Il numero di fibroblasti non diabetici e diabetici migrati è stato determinato utilizzando la figura 3. L'area percentuale per ogni immagine è stata calcolata utilizzando i metodi descritti e ImageJ. Il rapporto tra migrazione è stato calcolato dividendo il numero di fibroblasti migrati per l'area di migrazione percentuale.

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Discussion

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Questo nuovo approccio al test di migrazione dei graffi fornisce un metodo più accessibile per i ricercatori per esaminare i cambiamenti nella migrazione cellulare. Sebbene questo saggio segua la stessa procedura per la somministrazione di un graffio simile ad altri test scratch, fornisce un nuovo metodo per l'imaging e l'analisi accurata della migrazionecellulare 10. Invece di utilizzare metodi ad alta intensità di apparecchiature di microscopia time-lapse e camere di imaging a celle vive, questo metodo descrive in dettaglio l'uso di apparecchiature da laboratorio comunemente disponibili. Utilizzando un microscopio e una fotocamera invertiti generali, è possibile acquisire immagini di migrazione contemporaneamente mantenendo condizioni cultura coerenti. Inoltre, questo metodo fornisce un'immagine precisa della stessa regione di interesse senza l'uso di attrezzature avanzate. L'acquisizione della stessa area di migrazione ridurrà le incoerenze nel determinare la migrazione delle celle e fornirà una misurazione più rigorosa e accurata della migrazione cellulare. Infine, questo metodo prende in considerazione l'area del graffio. Mentre si fa attenzione a ridurre al minimo le variazioni umane nei graffi, possono ancora verificarsi incongruenze, dimostrando l'importanza di utilizzare l'area come fattore di normalizzazione nell'analisi della migrazione cellulare. Nel complesso, il protocollo sopra descritto fornisce un nuovo approccio a un potente strumento comunemente utilizzato per valutare la migrazione delle celle.

Lo sviluppo di un saggio di migrazione adattabile offre nuove strade per la ricerca. Il saggio di migrazione qui presentato ha la possibilità di essere modificato al fine di esaminare specifiche domande di ricerca. Possono essere apportate modifiche per quanto riguarda l'attivazione o l'inibizione di specifiche proteine di interesse. Reagenti come modificatori farmacologici (agonisti o antagonisti) e interferenze dell'RNA possono essere applicati al test di migrazione prima, durante o anche dopo la migrazione per affrontare domande sulla migrazione e proteine specifiche. Il piccolo volume del piatto da 48 pozzi consente anche di aggiungere quantità inferiori di modificatori, che è un altro metodo conveniente. Inoltre, questo saggio può essere modificato per studiare l'impatto dei componenti della matrice extracellulare (ECM) sulla migrazione cellulare. Recentemente abbiamo applicato questo metodo, in cui le piastre di coltura cellulare sono state rivestite con collagene isolato da topi diabetici e non diabetici per valutare l'impatto della matrice extracellulare diabetica sulla migrazione dei fibroblasticardiaci 20. Mentre questo studio ha utilizzato collagene isolato, questo metodo può essere adattato ad altri componenti extracellulari che possono essere di interesse. La capacità di valutare l'impatto della migrazione ECM è molto utile grazie a molteplici studi che indicano l'importanza di ECMsulla migrazione 20,21,22. Una potenziale complicazione che può verificarsi con l'uso di proteine ECM e il rivestimento dei pozzi con una soluzione ECM altamente concentrata è un impatto sulla visualizzazione delle cellule. Si consiglia di utilizzare ECM, come il collagene, per rivestire un pozzo e macchiare con blu Coomassie per vedere se l'ECM potrebbe compromettere visivamente l'imaging delle cellule. Se ECM compromette la visualizzazione delle celle, la diluizione della soluzione ECM migliorerà questo problema e consentirà di visualizzare le celle su ECM.

Questo nuovo approccio a una vecchia tecnica presenta alcune limitazioni. Questo metodo è stato adattato su piccola scala (piastra di coltura cellulare da 48 po ') e potrebbe non passare facilmente a piastre più grandi. A causa delle dimensioni del pozzo e dell'area catturata nelle immagini, questo protocollo può documentare gran parte dell'area di migrazione. Tuttavia, l'espansione di questo metodo a dimensioni di pozzo più grandi può comportare l'acquisizione di una parte inferiore dell'area di migrazione. Questo problema può essere potenzialmente risolto aumentando il numero di immagini acquisite, ma potrebbe essere necessario applicare metodi aggiuntivi per garantire che l'area di migrazione dell'immagine possa essere riidentificata per le immagini di 24 ore. Inoltre, questo metodo è limitato alle celle che possono essere utilizzate in un test di migrazione dei graffi. Le cellule che non rispondono in un tradizionale saggio di migrazione dei graffi potrebbero non essere ideali per l'approccio presentato all'interno di questo manoscritto. Mentre ci sono alcune limitazioni con questo approccio, modificare i metodi dettagliati in questo manoscritto potrebbe alleviare alcuni dei limiti.

Il test di migrazione dei graffi segue un approccio semplice, ma ci sono alcuni passaggi critici che devono essere seguiti per produrre un test di successo. Un passo cruciale è quello di disegnare i segni che indicano sul fondo del pozzo. Se gli indicatori non vengono disegnati sui pozzi sarà molto difficile / impossibile differenziare l'area che deve essere immagine per l'immagine 24 ore su 24 e prevenire la riconquista della stessa area di migrazione. Inoltre, è importante riconquistare la stessa area di migrazione nell'immagine di 24 ore catturata nell'immagine 0 h. Se la stessa area non viene acquisita a 24 ore, la sovrapposizione delle immagini per la migrazione non sarà fattibile. Senza immagini sovrapposte non sarà possibile determinare quali celle sono state migrate. Le immagini sovrapposte sono fondamentali per questo approccio, perché forniscono una determinazione accurata per la migrazione delle celle. Poiché il metodo scratch non sempre fornisce linee di graffio dritte, è fondamentale che le aree corrette siano immagini per generare le immagini sovrapposte. Le immagini sovrapposte forniscono le basi per l'accuratezza di questo saggio di migrazione presentato all'interno di questo manoscritto.

Un nuovo adattamento del saggio sulla migrazione dei graffi fornisce un approccio più accessibile e flessibile all'esame della migrazione cellulare. Precedenti studi sulla migrazione cellulare hanno utilizzato metodi ad alta intensità di apparecchiature che non sono comunemente disponibili per ogni laboratorio. Indicare che lo sviluppo di un saggio di migrazione che ha una gamma più ampia di accessibilità è essenziale. Questo manoscritto ha descritto un nuovo approccio a una vecchia tecnica che aumenterà l'accessibilità ai ricercatori interessati alla migrazione cellulare. Inoltre, questo metodo fornisce la capacità di alterare l'ambiente di coltura cellulare, sia tramite componenti della matrice extracellulare che tramite l'uso di modificatori farmacologici, per determinare l'impatto che ha sulla migrazione cellulare.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato dallo US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, dalla University of Mississippi School of Pharmacy e dal Dipartimento di Scienze BioMolecolari.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe All Apps Adobe This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol
Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile MIDSCI AVR1 Tips are autoclaved to sterilize
AxioCam Erc 5s Camera Zeiss 426540-9901-000
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher Scientific BP101-25
Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells Fisher Scientific 07-200-86
DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate Fisher Scientific MT10014CM
Image J NIH This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416785000
Premium US origin fetal bovine serum Innovative Research IFBS-HU
Primocin InvivoGEN ant-pm-2 This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts
Zeiss Primovert Microscope Zeiss 491206-0002-000
Zen Blue Edition 2.3 software Zeiss software comes with camera purchase

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Un saggio di migrazione dei graffi economico e adattabile
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Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).More

Burr, S. D., Stewart, Jr., J. A. A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay. J. Vis. Exp. (160), e61527, doi:10.3791/61527 (2020).

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