Summary
Vi presenterar en kostnadseffektiv metod för att scratch migration analys som ger en ny metod för att fastställa cell migration utan användning av utrustning-intensiva metoder. Medan fibroblaster användes i detta protokoll, det kan anpassas och utnyttjas för att studera ytterligare celltyper och influenser på cell migration.
Abstract
Cellmigration är en nyckelkomponent i både fysiologiska och patologiska händelser. Normal cellmigration krävs för viktiga funktioner som utveckling och montering av ett immunsvar. När en defekt eller förändring inträffar med cellmigrationsprocessen, det kan ha skadliga resultat (dvs. cancer metastasering, sårläkning, och ärrbildning). På grund av vikten av cellmigration är det nödvändigt att ha tillgång till en cell migration assay som är prisvärd, anpassningsbar, och repeterbara. Utnyttja den gemensamma rep migration analys, har vi utvecklat en ny metod för att analysera cell migration som använder allmän laboratorieutrustning. Metoden som beskrivs använder visuella markörer som möjliggör återerövring av specifika områden av intresse utan användning av time-lapse mikroskopi. Dessutom ger det flexibilitet i den experimentella designen, allt från att förändra underlaget migrationsmatris till tillsats av farmakologiska modifierare. Vidare skisserar detta protokoll ett sätt att redogöra för området för cellmigration, vilket inte anses med flera metoder när man undersöker cellmigration. Denna nya metod erbjuder en skrapmigration analys till en större publik och kommer att ge större möjligheter för forskare att undersöka fysiologiska och patofysiologiska effekterna av cellmigration.
Introduction
Cellmigration är avgörande för många fysiologiska såväl som patologiska händelser. Det krävs under utveckling, för montering av ett immunsvar, och för korrekt sårläkning1,2,3. Många av dessa cellmigreringshändelser kan utlösas av fysiska eller kemiska signaler. Till exempel, under ett immunsvar, leukocyter kommer att migrera mot en plats för skada som svar på en chemoattractant2. Dessutom kommer leukocyter också släppa cytokiner att inducera migration av ytterligare immunceller, liksom andra celltyper, såsom fibroblaster, som är involverade i sårläkningsprocessen, och därmed, initiera en flercellig svar4. Cellernas förmåga att migrera är avgörande för korrekt fysiologisk funktion; emellertid, när cell migration går okontrollerat, det kan ha en negativ respons och bidra till patologiska händelser, såsom kronisk inflammation, kärlsjukdom, cancer metastasering, och nedsatt sårläkning2,3,4,5,6,7. Nedsatt sårläkning är en vanlig åkomma av diabetiker på grund av defekter i cellmigration, och om dessa defekter inte åtgärdas, kan det leda till ytterligare komplikationer (t.ex. amputation8,9). Denna studie, liksom andra, har visat på behovet av att ytterligare förstå den process genom vilken cellmigration sker, antingen under normala fysiologiska eller patologiska förhållanden, och det är avgörande för att främja detta forskningsområde. För att åstadkomma detta, det måste finnas migration analyser tillgängliga som är både tillgängliga och överkomliga för de forskare, som kanske inte har den utrustning som behövs för att genomföra dessa analyser.
För närvarande finns det en mängd olika migrationsanalyser tillgängliga för att undersöka ett brett spektrum av ämnen när det gäller cellmigration. Både 2D och 3D-migreringsmodeller har utvecklats, var och en som riktar sig till specifika områden som påverkar cellmigrationen. 3D-migreringsmodeller är vanligtvis förknippade med cellinvasionstudier och bedömer effekten av extracellulär matris på cellmigration10,11,12, medan 2D-flyttningsanalyser har ett större användningsområde och används främst för att studera chemotaktisk migration, sårläkning och funktionella förändringar under cellmigration13,14,15,16. Flera av dessa analyser kräver ytterligare utrustning, såsom Boyden kammare eller uteslutning ringar, vilket kan minska tillgången på dessa analyser till vissa forskare. En av de mer kostnadseffektiva analyserna är skraplotterna, som vanligtvis används för att bedöma sårläkning och allmänna förändringar i cellmigration14,17. Medan de flesta laboratorier är utrustade för att genomföra en repastäs, den utrustning som används för att spåra cell migration tenderar att antingen vara otillgänglig eller för dyrt att köpa. Detta inkluderar timelapsemikroskopi, som kräver ett inverterat mikroskop och ett livebildsystem. Dessa dyra delar av utrustning är inte allmänt tillgängliga för alla laboratorium. Därför belyser denna observation behovet av ett nytt protokoll som möjliggör bedömning av cellmigration med mer lättillgänglig utrustning.
Det protokoll som presenteras här ger ett nytt och prisvärt sätt att bedöma cellmigration. Denna metod följer samma förfarande i samband med scratch analyser men skiljer sig i analysen av att undersöka cell migration genom att utnyttja utrustning mer allmänt tillgängliga i en grundläggande vetenskaper laboratorieinställning. Detta protokoll med hjälp av gemensam utrustning möjliggör en mer exakt bestämning av cellmigration utan användning av time-lapse mikroskopi. Förutom att fastställa migration, denna metod står också för variabla faktorer i scratch området som har noterats för att kraftigt påverka cell migration. Sammantaget ger detta nya protokoll för cellmigrationsanalys en möjlighet för fler laboratorier att utforska och bidra till området cellmigration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allmän cellkultur
- Kulturfibroblaster i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) som innehåller 1 g/L glukos, natriumpyuvat, L-glutamin, och kompletterat med 14,2 mM NaHCO3, 14,9 mM HEPES, 15% värme-inaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 2% L-glutamin, och 0,02% antimikrobiell reagens (se Tabell över material) och bibehålls i CO2 inkubator vid 37 °C.
- Kultur cardiac fibroblaster tills 90-95% konfluency nås vid passage 0 (P0). Vid denna punkt fibroblaster är redo att delas upp i en 48-brunnsplatta, som används för migration analys.
2. Förberedelse av migrationsplattan
- Förbered en 48-väl cellodlingsplatta genom att rita en linje, med hjälp av en gul eller ljusfärgad permanent markör, ner i mitten av brunnen. Dra sedan tre hash-märken som delar upp brunnen i tre separata intresseområden. Dessa avsnitt kommer att användas för bildbehandling.
OBS: Med hjälp av en ljus färg permanent markör kommer att möjliggöra enkel avbildning av migrerande celler. Mörka markörer som svart eller blått kommer att förhindra visualisering av migrerande celler. - Om man bedömer migration på ett substrat (t.ex., kollagen), belägga brunnen vid denna tidpunkt efter instruktioner och koncentrationer som används för det specifika substratet.
- Plate ~15.000-20.000 hjärtfibroblaster, P1, i varje brunn och kulturceller, under normala odlingsförhållanden (förhållanden som anges i föregående avsnitt), tills de når 90-95% konfluency. Konfluency bör nås mellan 24-48 timmar.
OBS: När du ställer in migreringsplattan se till att inkludera en positiv kontroll (en känd flyttande cell, till exempel 3T3 celler18), en negativ kontroll (unscratched celler) och en tom brunn.
3. Scratch migration assay & fixering
- När celler når 90-95% konfluency, ta bort media och repa längs den ritade linjen med hjälp av en steril P200 pipett spets.
OBS: En P200-pipettspets är den vanliga pipettspetsen som används med skrapset10,14,19. Också, bara göra ett pass med P200 spets som mer än ett försök kan resultera i flera replinjer. - Skölj brunnen med lågt serummedia (1,5% FBS) för att avlägsna eventuella obundna hjärtfibroster.
- Tillsätt 500 μL låg serummedia till varje brunn. Om du använder några farmakologiska medel, lägg till dem vid denna tidpunkt.
OBS: Låg serum media används eftersom det tillåter / främjar cell migration ske och förhindrar fibroblaster från proliferering som skulle kunna skeva resultaten av den migration assay20. För detta protokoll användes 1,5% FBS. - Fånga 0 h bilder innan du inkuberar fibroblasterna i en 5% CO2 inkubator vid 37 °C i 24 h.
- Fånga 0 h bilder med hjälp av ett inverterat mikroskop med en 20x målsättning. Ta två 0 h bilder per brunn. Detta kommer att möjliggöra en mer fullständig täckning av migrationslinjen.
- Med hjälp av markeringarna (linje och streck), placera brunnen för att fånga den övre halvan av raden av scratch. Undvik att avbilda det mellersta strecket för att säkerställa att samma område av migreringen inte avbildas två gånger, vilket kan skeva resultat.
- Använd bildhanteringsprogram (Table of Materials) för att fånga 0 h bild #1. Flytta sedan plattan för att placera den nedre halvan av brunnen / raden av scratch med tanke på kameran. Återigen, undvika att fånga mitten streck. Väl på plats, fånga 0 h bild #2 (Bild 1).
OBS: Undvika mitten streck i båda 0 h bilder kommer att förhindra att fånga områden av migration två gånger som om det görs skulle kunna ge upprepande resultat och skeva data.
- Efter inkuberingen i 24 h, ta bort media från brunnen, och tvätta brunnen med 1x nonsterile PBS (hädanefter alla 1x PBS används är nonsterile).
- I draghuven, tillsätt 500 μL av 4% paraformaldehyd till brunnen och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort paraformaldehyd och tvätta 3x med 1x PBS i 5 min vardera vid RT.
- När celler tvättas, fortsätt att fånga 24 h bilder eller lägga till 1x PBS till varje brunn och placera vid 4 °C tills en senare tidpunkt. Celler kan stanna på 4 °C i 1-2 veckor tills redo att bilden.
- Permeabilisera cellerna genom att tillsätta 300 μL permeabiliserande lösning (1x PBS och 0,01% triton X-100) till varje brunn. Inkubera celler/platta med varsam, ständigt gungande i 30 min vid RT.
- Ta bort permeabiliserande lösning och tillsätt 1% Coomassie Brilliant Blue fläck (3% Coomassie Brilliant Blue, 10% ättiksyra, 45% metanol, och 45% dH2O) för 10 min med mild, kontinuerlig gunga vid RT.
OBS: Om plattor är belagda med en extracellulär matris substrat se till att testa en belagd platta med Coomassie färgning innan du genomför migration analys. Bild 2 visar att ett matrixunderlag kan användas med denna analys och inte påverkansvisualisering av celler. - Tvätta brunnar 3x med 1x PBS vid RT med ständigt gungande i 5 min vardera.
- Efter tvättar, tillsatt 300 μL av 1x PBS och fånga 24 h bilder.
- Fånga 24 h bilder genom att justera brunnen i samma läge som användes för att fånga 0 h bilder. För att åstadkomma detta, öppna de tidigare fångade 0 h bilder och med hjälp av märkningen görs med den permanenta markör, rikta in brunnen i samma läge. Linjen nedför de mellersta och ytterligare streckmärkena ska tillåta nära justering mellan 24 h-bilden och 0 h-bilden (Bild 1).
4. Beredning av 0 h och 24 h bilder
- Öppna 0 h och 24 h bilder tagna av samma brunn och position i bildhanteringsprogram (Table of Materials).
- Skapa ett nytt lager på 0 h-bilden. Klicka sedan på det nya lagret och ändra namnet på lagret till "linjelager" genom att dubbelklicka på texten.
OBS: Detta lager kommer att kallas linjeskikt från denna punkt och fram. - Klicka på penselverktyget (penselikonen) och ställ in storleken på 10 px och färgen till röd.
- Med linjeskiktet markerat ritar du två, separata linjer som konturerar området för repa. Linjerna bör inte röra några celler på grund av dessa linjer som markerar området för migration.
- Klicka på Move Tool (pilikonen) och tryck sedan ned Ctrl-knappen och klicka på både linje- och bakgrundslager.
- Klicka i mitten av 0 h-bilden och dra båda dessa lager till mitten av 24 h-bilden.
- Nu använder 24 h bilden, klicka på 0 h bakgrundsskiktet och ändra opacitet till 50%.
- Hålla Ctrl-knappen, klicka på både 0 h bakgrund och linjeskikt och sedan fri förvandla lagren (Redigera> Fri transform). Med hjälp av fri transformation, justera 0 h bakgrund och linje bild till 24 h bakgrundsbild. Detta steg resulterar i överlagringen av 0 h och 24 h bilden, vilket är nödvändigt för att placera linjerna som markerar migrationsområdet i rätt läge på 24 h bilden.
- Efter lyckad överlagring av 0 h bakgrund och linje lager på 24 h bakgrundsbild, ta bort 0 h bakgrundsskiktet. Ta bort genom att klicka på 0 h-bakgrundslagret, sedan högerklicka och klicka på ta bort lager.
- Ta bort 0 h bakgrundsbild kommer att lämna just linjen och 24 h bakgrundslagret (nu kallad migration bild). Linjeskiktet kommer att indikera området för migration/scratch på 24 h-bilden och kan användas för att bestämma antalet migrerande celler.
- Spara som den nya migreringsbilden som både en photoshop-fil och en TIFF/JPEG. OBS: en representativ figur som skildrar denna process presenteras i figur 3.
5. Räkna antalet migrerande celler
- Öppna migreringsbilden. Detta kan göras i ett program som accepterar TIFF/JPEG-filer (Table of Materials).
- Räkna antalet celler som finns däremellan samt vidrör de två röda linjerna.
- Registrera antalet migrerande celler per bild. Det kommer att finnas två migrerande bilder per brunn, och dessa värden bör inte kombineras förrän efter det att värdena har korrigerats för område för migration (närmare i nästa avsnitt).
6. Bestäm område för migration
- Öppna 24 h-bilden som innehåller linjerna för migrering i programmet för bildåtergivningsprogram i avsnitt 5 (Materialförteckning ).
- Spara som denna bild som "Migrationsområde Bild".
- Klicka på bakgrundslagret, högerklicka och klicka på Ta bort lager när du har sparat. Detta bör lämna endast replinjerna på bilden (Bild 3).
- Använda penselverktyget (penselikonen) fyll i området mellan linjerna i scratch. Matcha färgen på penseln med färgen som används för att rita linjerna för migrering.
- Ändra bilden till en gråskala för att generera en svartvit bild (Bild>Läge>Gråskala) och spara sedan bilden (Bild 4).
- Starta analysprogramvaran (Table of Materials) och öppna sedan "Area of Migration"-filen inom analysprogramvara.
- Du bestämmer området för migrationsraden genom att klicka på Bild>Justera>Tröskelvärde. Det svarta migrationsområdet blir rött och procentområdet kommer att anges i rutan Tröskelvärde. Området kommer att rapporteras som den procent av området linjen av migration täcker jämfört med hela området fångas i bilden.
- Registrera procentområdet för raden av migrering och se till att det här värdet är ihopkopplat med antalet migrerande celler för samma bild.
7. Dataanalys
- Normalisera antalet migrerande celler till procentområdet för repa. Dividera antalet migrerande celler med procentytan för raden av migration (# migrerade celler % Område av migration). Gör detta per bild och inte ett genomsnitt baserat på migrering per brunn.
- Lägg till värdena för de två bilderna, som representerar en individuell brunn, när du normaliserat värden per bild. Detta värde kommer att användas för grafisk och statistisk analys. Om den experimentella designen innehöll flera replikat. Genomsnittliga replikatvärden före statistisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den här proceduren dokumenterar en ny metod för att studera cellmigration som är både kostnadseffektiv och lätt att anpassa för de flesta labb. Många studier har använt time-lapse mikroskopi för att bedöma cell migration, men den utrustning som krävs för denna metod är inte lätt tillgänglig för många laboratorier. Medan utnyttjande av linjer och streck för avgränsning möjliggör möjlighet att återta särskilda intresseområden vid olika tidpunkter utan användning av dyrbar utrustning (figur 1 & figur 3). Medan användningen av avgränsningar är väsentlig för denna nya metod, finns det många områden av denna metod som kan anpassas för att passa enskilda forskares behov. Protokollet indikerade en 24 h-slutpunkt; dock att slutpunkten kan förlängas utifrån ett enskilt labs behov. Justera slutpunkten för protokollet kan möjliggöra fortsatt odling av celler för vidare användning. Dessutom tillåter detta protokoll flexibiliteten att testa påverkan av farmakologiska modifierare samt extracellulära matrissubstrat på migration. Slutligen är den mest costliest komponenten av denna metod bruket av imagingprogramvara, som kan vara licensierad programvara, men bruket av licensierad programvara är inte det enda alternativet. Andra bildhanteringsprogram som tillåter generering av linjer och överläggning av bilder kan utnyttjas med denna metod. Dessutom, till den kostnadseffektiva och anpassningsbara karaktär av denna metod, presenterar den en ny metod för att undersöka cell migration genom factoring området av scratch.
Denna nya metod användes nyligen i Burr et al. 2020 för att bedöma skillnader i hjärtfibroblast migration mellan celler isolerade från icke-diabetiker och diabetiker hjärtan20. Figur 3 presenterar representativa bilder som används för att bedöma fibroblastmigration. Från dessa bilder, det bestämdes att 46 fibroblaster från icke-diabetiker hjärtan och 129 fibroblaster från diabetiker hjärtan hade migrerat under 24 h tidsperioden för experimentet. Vid gruppjämförelser hade antalet celler från de diabetikera hjärtan migrerat 2,8x större än celler från icke-diabetiska hjärtan (Tabell 1). Medan dessa resultat anges celler från diabetiker hjärtan hade migrerat mer, siffrorna var vilseledande, eftersom området för scratch var olika för var och en av de två grupperna. Den icke-diabetes reparea var 24,78% av den totala mätt areal, medan diabetiker migration scratch var 16,77% av den totala mätt areal. När området för repa ansågs, det gav ett förhållande (cell nummer /% scratch area) som anger att fibroblaster från diabetiker hjärtan faktiskt migrerat 4.13x större än celler från icke-diabetiker hjärtan. Dessa resultat betonade vikten av att beakta migrationsområdet när man genomför migreringsanalyser.
Normalisering till migrationsområdet ger en bättre och mer rigorös bedömning av cellmigration och förnekar potentiella mänskliga fel. Medan den beskrivna metoden använder en P200 pipett spets, som bör ge en enhetlig och konsekvent repa, kan ojämna repor uppstå på grund av mänskliga inkonsekvenser. I figur 5 framhålls vikten av att dela ut skillnader i reparea. Om man skulle jämföra endast antalet migrerade fibroblaster skulle det visa att figur 5A har dubbelt så många migrerade celler jämfört med figur 5B. Medan när området för repet används för att normalisera uppgifterna, indikerar det att förhållandet mellan fibroblaster och migrationsområde är liknande i både figur 5A och figur 5B. För detta exempel, Vi använde obehandlad icke-diabetiska hjärt fibroblaster från olika fibroblast isoleringar; därför bör ett liknande migrationsförhållande vara det förväntade utfallet på grund av arten av de celler som används i figur 5. Om man bara presenterade antalet migrerade celler, kan dessa fynd vara missvisande om det repiga området inte är enhetligt och konsekvent över alla prover. Därför är det viktigt att redogöra för det repad området med denna metod samt andra repor migration analyser. Dessa representerade resultat som presenteras i figur 5 visade hur normalisering av antalet migrerade celler till det repiga området kan presentera exakta, repeterbara och tillförlitliga migrationsdata.
Bild 1: Diagram över den experimentella konstruktionen för den fibroblast repa migreringsanalysen. Setup: Innan plätering celler i väl, rita en linje och 3 streck märken på botten på plattan. 0 h: Odlingsceller tills 95% konfluency och administrera en repa parallellt den avbildade linjen. Fånga 0 h bilder genom att välja ett avsnitt ovanför och under mitten streck. 24 h: Låt celler migrera i 24 h före fixering och färgning. För 24 h bilder, anpassa väl i samma position som 0 h bilder för att fånga migrerade celler. Analys: Skissera området för migrering på 0 h bild och sedan överlagra 0 h bilden på 24 h bilden för att generera migration och bilder område. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Representativa bilder som visar Coomassie-färgning stör inte visualiseringen av celler. Hjärt fibroblaster var pläterade på antingen inget kollagen (plast skålen), kollagen isolerade från icke-diabetiker möss svansar, eller kollagen isolerade från diabetiker möss svansar. Cellerna användes i den repa migrering analysen efter de metoder som beskrivs här. Celler var färgas med 1% Coomassie Brilliant Blå fläck och sedan bilder av migrerande celler fångades. Skalstrecket som avbildas på bilden är 100 μm. Detaljer om kollagenisolering och/eller cellmigration på kollagen presenteras i Burr et al.20. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa uppgifter som visar skillnaden i hjärtfibroblastmigration mellan icke-diabetiker och diabetikerceller. 0 h och 24 h bilder som används för att beräkna antalet migrerade hjärtfibroster som isolerats från icke-diabetiker- och diabetiska möss (röd linje visar migrationsområdet och bilder tagna vid 20x med skala bar = 100 μm). Diabetiker hjärtceller hade 129 celler migrera i ett område på 16,77%, som producerade en migration förhållandet 7,69. Icke-diabetiker fibroblaster hade 46 celler migrera med en area på 24,78% vilket ledde till ett förhållande på 1,86. Bilderna som presenteras i denna figur användes i de resultat som presenterades i Burr et al.20 men bilderna som avbildas här visades inte i Burr et al.20. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Diagram som avbildar genereringen av område med migrationsbild. Steg #1: Öppna migreringsbild som innehåller linjer för migrering. Steg #2: 24 h bilden tas bort, lämnar på linjerna för migrering i fältet bild. Steg #3: Penselverktyget användes för att fylla i området för migrering. Steg #4: Bilden konverteras till gråskala och sparas sedan som en ny bild. Skala bar representerar 100 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Ett exempel på hur olika migrationsområden påverkar fibroblastmigrationen. Icke-diabetiker hjärt fibroblaster var pläterade på plast kultur rätter och används i den rep migration analys, som beskrivs ovan (skala bar = 100 μm). (A) 92 migrerade fibroblaster med en procentig yta på 35,4% vilket resulterade i en migrationskvot på 2,60. (B) 45 fibroblaster migrerade med en yta på 17,57% som beräknar ett förhållande på 2,56. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Fibroblast Typ | Genomsnittligt antal migrerade celler | Genomsnittligt område för scratch | Celltal till repig area ratio |
| Fibroblaster från icke-diabetiker Hearts | 46 | 24.78% | 1.86 |
| Fibroblaster från Diabetic Hearts | 129 | 16.77% | 7.69 |
Tabell 1: Migrationsdata från repaftanalys vid migrering med icke-diabetiker och diabetesdiablar. Antalet icke-diabetiker och diabetiska fibroblaster som migrerat bestämdes med hjälp av figur 3. Procentytan för varje bild beräknades med beskrivna metoder och ImageJ. Förhållandet mellan migrationen beräknades genom att dividera antalet migrerade fibroblaster med procent migrationsområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna nya metod för repmigreringsanalys ger en mer tillgänglig metod för forskare att undersöka förändringar i cellmigrationen. Medan denna analys följer samma förfarande för att administrera en repa som liknar andra repastanalyser, det ger en ny metod för bildbehandling och korrekt analys av cell migration10. Istället för att använda utrustning-intensiva metoder för time-lapse mikroskopi och levande cell bildbehandling kammare, denna metod detaljer användningen av allmänt tillgängliga lab utrustning. Utnyttja en allmän inverterad mikroskop och kamera, kan man fånga migration bilder samtidigt samtidigt som konsekvent kultur villkor. Dessutom ger denna metod en exakt bildbehandling av samma intresseregion utan användning av avancerad utrustning. Att fånga upp samma migrationsområde kommer att minska inkonsekvenserna vid fastställandet av cellmigration och ge en mer rigorös och exakt mätning av cellmigration. Slutligen tar denna metod hänsyn till området för scratch. Medan försiktighet vidtas för att minimera mänskliga variationer i repor, inkonsekvenser fortfarande kan uppstå, visar vikten av att använda område som en normaliserande faktor i analysen av cellmigration. Sammantaget ger protokollet som beskrivs ovan en ny metod för ett kraftfullt verktyg som vanligen används för att bedöma cellmigration.
Att utveckla en anpassningsbar flyttningsanalys ger nya vägar för forskning. Den flyttningsanalys som presenteras här har förmågan att modifieras för att undersöka specifika forskningsfrågor. Ändringar kan göras avseende aktiverande eller hämmande av specifika proteiner av intresse. Reagenser som farmakologiska modifierare (agonister eller antagonister) och RNA-interferens kan appliceras på migreringsanalys före, under eller till och med efter migreringen för att ta itu med frågor om migration och specifika proteiner. Den lilla volymen av 48 väl skålen möjliggör också lägre mängder av modifierare som skall läggas till, vilket är en annan kostnadseffektiv metod. Dessutom kan denna analys modifieras för att studera de extracellulära matriskomponenternas (ECM) inverkan på cellmigrationen. Nyligen tillämpade vi denna metod, där cellodlingsplattor var belagda med kollagen isolerade från diabetiker och icke-diabetiker möss för att bedöma effekterna av diabetiska extracellulära matris har på hjärt fibroblast migration20. Medan denna studie utnyttjas isolerade kollagen, denna metod kan anpassas till andra extracellulära komponenter som kan vara av intresse. Förmågan att bedöma ECM-migrationens inverkan är mycket användbar på grund av flera studier som visar ECM:s betydelse förmigrationen 20,21,22. En potentiell komplikation som kan uppstå vid användning av ECM proteiner och beläggning brunnarna med mycket koncentrerad ECM lösning är en inverkan på visualisering av celler. Det rekommenderas om du använder ECM, som kollagen, att belägga en brunn och fläck med Coomassie blå för att se om ECM kan synskada bildframställning av celler. Om ECM försämrar visualisera celler, kommer spädning ECM lösning förbättra denna fråga och möjliggöra visualisering celler på ECM.
Denna nya strategi på en gammal teknik ger vissa begränsningar. Denna metod har anpassats till en liten skala (48-väl cellodlingsplatta) och får inte övergå till större plattor lätt. På grund av storleken på brunnen och det område som fångas i bilderna detta protokoll kan dokumentera en stor del av området för migration. Men att utvidga denna metod till större väl dimensioner kan resultera i att fånga en lägre del av migrationsområdet. Detta kan eventuellt lösas genom att öka antalet tagna bilder, men ytterligare metoder kan behöva tillämpas för att säkerställa området för migration avbildning kan identifieras om för 24 h bilderna. Dessutom är denna metod begränsad till celler som kan utnyttjas i en repa migrering analys. Celler som inte svarar i en traditionell repa migration assay kanske inte är idealisk för den strategi som presenteras inom detta manuskript. Även om det finns vissa begränsningar med detta tillvägagångssätt, ändra de metoder som beskrivs i detta manuskript skulle kunna lindra några av de begränsningar.
Den repa migration assay följer en enkel strategi men det finns några kritiska steg som måste följas för att producera en framgångsrik analys. Ett avgörande steg är att rita in indikerarmärkena på brunnens botten. Om indikatorerna inte ritas på brunnarna kommer det att vara mycket svårt / omöjligt att differentiera det område som måste avbildas för 24 h bilden samt förhindra återerövra samma område av migration. Det är också viktigt att återerövra samma område av migration i 24 h bild som fångades i 0 h bilden. Om samma område inte fångas vid 24 h sedan överlägga bilderna för migration kommer inte att vara genomförbart. Utan överlagrad bilder kommer det inte att vara möjligt att avgöra vilka celler som har migrerat. De överlagrada bilderna är kritiska för detta tillvägagångssätt, eftersom de ger en korrekt bestämning för cellmigration. Eftersom scratch-metoden inte alltid ger raka replinjer är det viktigt att rätt områden avbildas för att generera de överlagrada bilderna. De överlagrada bilderna utgör grunden för riktigheten i denna migreringsanalys som presenteras i detta manuskript.
En ny anpassning av analysen av repmigrationen ger en mer tillgänglig och flexibel metod för att undersöka cellmigration. Tidigare cellmigrationsstudier har använt utrustningsintensiva metoder som inte är allmänt tillgängliga för alla laboratorium. Som anger att utvecklingen av en flyttningsanalys som har ett bredare spektrum av tillgänglighet är viktigt. Detta manuskript beskrev ett nytt förhållningssätt till en gammal teknik som kommer att öka tillgängligheten till forskare som är intresserade av cellmigration. Dessutom ger denna metod möjlighet att förändra cellodlingsmiljön, oavsett om den sker via extracellulära matriskomponenter eller användning av farmakologiska modifierare, för att bestämma vilken inverkan som har på cellmigrationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, University of Mississippi School of Pharmacy och Institutionen för biomolekylära vetenskaper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
