Summary
이 프로토콜은 지문에 대한 접근 방식을 제시하고 질량 분석에 결합 된 포괄적 인 2 차원 가스 크로마토그래피에 의해 수집 된 다차원 데이터를 탐구합니다. 전용 패턴 인식 알고리즘(템플릿 매칭)은 엑스트라 버진 올리브 오일 휘발성 분수(즉, 화산술)에서 암호화된 화학 정보를 탐구하기 위해 적용됩니다.
Abstract
데이터 처리 및 평가는 특히 질량 분석과 결합될 때 포괄적인 2차원 가스 크로마토그래피(GCxGC)의 중요한 단계입니다. 데이터에 암호화된 풍부한 정보는 매우 중요하지만 효율적으로 액세스하기 어려울 수 있습니다. 데이터 밀도와 복잡성은 긴 정교화 시간으로 이어질 수 있으며 분석가에 의존하는 힘든 절차가 필요합니다. 따라서 효과적이면서도 접근가능한 데이터 처리 도구는 일상적인 사용을 위해 실험실에서 이 고급 다차원 기술의 확산과 수용을 가능하게 하는 데 핵심적인 것입니다. 이 작품에 제시된 데이터 분석 프로토콜은 크로마토그래픽 지문 링 및 템플릿 매칭을 사용하여 복잡한 2차원 크로마토그램을 개별 화학 적 특징으로 고도로 자동화된 분해하여 개별 크로마토그램 내 및 크로마토그램 세트에 걸쳐 유익한 패턴을 선진적으로 인식한다는 목표를 달성합니다. 이 프로토콜은 개입이 거의 없는 높은 일관성과 신뢰성을 제공합니다. 동시에 다양한 요구 와 목표에 맞게 유연성과 용량을 제공하기 위해 사용자 정의 할 수있는 다양한 설정 및 제약 기능에서 분석가의 감독이 가능합니다. 템플릿 매칭은 엑스트라 버진 올리브 오일 volatilome을 탐구하는 강력한 접근 방식으로 여기에 표시됩니다. 피크의 교차 정렬은 알려진 대상뿐만 아니라 광범위한 응용 분야에 대한 특성화 전력을 크게 증가시키는 표적 화합물에 대해서도 수행됩니다. 예는 유사한 조건하에서 분석된 견본 세트에서 크로마토그래피 패턴의 분류 그리고 비교를 위한 성과를 입증하기 위하여 제시됩니다.
Introduction
비행 시간 질량 분광 검출(GC×GC-TOF MS)과 결합된 포괄적인 2차원 가스 크로마토그래피는 오늘날 복잡한 시료1,2,3,4,5의화학적 특성화를 위한 가장 유익한 분석 접근법이다. GC×GC에서 컬럼은 제1차원(1D)컬럼에서 부품을 2차원(2D) 컬럼으로 재주입하기 전에 용출하는 변조기(예: 열 또는 밸브 기반 초점인터페이스)에 의해 연재되고 인터페이스됩니다. 이 작업은 일반적으로 0.5-8 s 사이로 고정 된 변조 기간(PM)내에서 수행됩니다. 열 변조에 의해, 프로세스는 전체 분리 전력에 대한 몇 가지 이점을 가진 용출 밴드의 냉동 트래핑 및 초점을 포함한다.
GC×GC는 2차원 분리 기술이지만 프로세스는 순차적 데이터 값을 생성합니다. 검출기 아날로그-디지털(A/D) 컨버터는 특정 주파수에서 크로마토그래피 신호 출력을 얻습니다. 그런 다음 데이터는 디지털화된 데이터뿐만 아니라 관련 메타데이터(데이터에 대한 정보)를 포함하는 특정 독점 형식으로 저장됩니다. GC×GC 시스템에 사용되는 A/D 컨버터는 크로마토그래피 신호의 강도를 두 분석 치수에서 시간의 함수로서 디지털 번호(DN)로 매핑하는 데 도움이 됩니다. 단일 채널 검출기(예: 화염 이온화 검출기(FID), 전자 포획 검출기(ECD), 유황 케미닌 검출기(SCD) 등)은 샘플링 시간당 단일 값을 생성하는 반면, 멀티채널 검출기(예를 들어, 질량 분광 검출기(MS))는 샘플링 시간에 따라 여러 값(일반적으로 스펙트럼 범위 이상)을 생성합니다.
2D데이터를 시각화하려면 단일 변조 기간(또는 주기) 데이터 값을 픽셀 열(검출기 이벤트에 대응하는 그림 요소)으로 래스터레이션으로 시작합니다. 좌표(Y축, 아래쪽에서 위에서) 2D분리 시간이 시각화됩니다. 픽셀 열은 복근(X축, 왼쪽에서 오른쪽)이 1D분리 시간을 보고하도록 순차적으로 처리됩니다. 이 순서는 오른손잡이 카르테시안 좌표 시스템에 2D데이터를 제공하며, 1D보존 은 배열에 대한 첫 번째 인덱스로 제공됩니다.
2D크로마토그램의 데이터 처리는 원시 데이터보다 더 높은 수준의 정보에 액세스할 수 있으므로 2D피크 감지, 피크 식별, 정량 적 분석을 위한 응답 데이터 추출 및 교차 비교 분석을 가능하게 합니다.
2D피크 패턴은 효과적인 교차 비교 분석을 위한 미누티아 기능으로 샘플의 고유한 지문 및 검출된 화합물로 처리될 수 있습니다. 템플릿 기반 지문6,7로알려진 이 접근 방식은 생체 인식 지문6에서영감을 받았습니다. 자동 생체 인식 지문 검증 시스템은 사실, 독특한 손가락 특성에 의존: 능선 분기 및 엔딩, 국산화 및 잉크 노출 또는 상세한 이미지에서 추출. 이러한 특성, 명명 된 minutiae 기능, 다음 사용 가능한 저장된템플릿과교차 일치8,9.
위에서 언급한 바와 같이, 모든 GC×GC 분리 패턴은 2차원 평면에 합리적으로 분포된 2D피크로 구성됩니다. 각 피크는 단일 분석기에 해당하며, 유익한 잠재력을 가지며, 비교 패턴 분석을 위한 단일 기능으로 취급될 수 있습니다.
여기서는 GC×GC-TOF MS의 화학 지문에 대한 효과적인 접근법이 탠덤 이온화를 특징으로 합니다. 목표는 크로마토그램 세트의 기능을 포괄적이고 정량적으로 카탈로그화하는 것입니다.
피크 기능 접근 방식을 사용하는 기존 상용 소프트웨어 또는 사내루틴(10)및11에 비해 템플릿 기반 지문은 높은 특이성, 효율성 및 제한된 계산 시간을 특징으로합니다. 또한, 다른 계측물 또는 장시간 프레임 연구에서 획득한 크로마토그램과 같이 심각하게 잘못 정렬된 크로마토그램 사이의 미누티아 기능(즉, 2D피크)의 교차 정렬을 가능하게 하는 본질적인 유연성을 갖는다12,13,14.
제안된 방법의 기본 작업은 독자에게 2D패턴의 복잡성과 정보 력을 잘 이해하도록 안내하기 위해 간략하게 설명된다. 그런 다음 계측기 출력 데이터 매트릭스를 탐색하여 화학 적 식별이 수행되고 2 차원 공간 위에 위치한 표적 분석기로 알려져 있습니다. 그런 다음 대상 피크의 템플릿을 동일한 분석 배치 내에서 획득한 일련의 크로마토그램에 빌드되고 적용됩니다. 보존 시간, 스펙트럼 서명 및 응답(절대 및 상대적)과 관련된 메타데이터는 대상 피크의 재정렬 패턴에서 추출되고 샘플 집합의 조성 차이를 드러내도록 채택됩니다.
프로세스의 추가, 독특한 단계로, 결합 된 대상 및 대상 (UT) 지문은 또한 알려진 및 알 수없는 별문 모두에 지문 잠재력을 확장하기 위해 사전 표적 크로마토그램에 수행됩니다. 이 프로세스는 크게 자동화할 수 있는 포괄적인 비교 분석을 위한 UT 템플릿을 생성합니다.
최종 단계로, 이 방법은 높은 전자 이온화 에너지(70 및 12 eV)로 생성된 두 개의 병렬 검출기 신호에서 피처의 교차 정렬을 수행한다.
이 프로토콜은 단일 크로마토그램 또는 크로마토그램 세트의 분석을 지원하고 가변 크로마토그래피 및/또는 다중 검출기를 사용하여 매우 유연합니다. 여기서 프로토콜은 MS 라이브러리 및 검색 소프트웨어(재료 표 참조)에 결합된 상용 GC×GC 소프트웨어 제품군(재료 표참조)으로 시연됩니다. 필요한 도구 중 일부는 다른 소프트웨어에서 사용할 수 있으며 유사한 도구는 라이헨바흐와 동료15, 16,17,18,19에의해 문학의 설명에서 독립적으로 구현 될 수있다. 데모에 대한 원시 데이터는 저자의 실험실에서 실시 엑스트라 버진 올리브 (EVO) 오일에 대한 연구 연구에서 파생됩니다14. 특히, 이탈리아 EVO 오일의 휘발성 분수(즉, 화산질)는 헤드스페이스 고형 미세 추출(HS-SPME)에 의해 샘플링되고 GC×GC-TOF MS에 의해 분석되어 샘플의 품질 및 감각 적 자격을 위한 진단 지문을 포착한다. 샘플, 샘플링 조건 및 분석 설정에 대한 세부 정보는 재료 표에제공됩니다.
단계 1-6 크로마토그램의 사전 처리를 설명합니다. 단계 7-9 개별 크로마토그램의 처리 및 분석을 설명합니다. 10-12 단계는 교차 샘플 분석의 기초인 템플릿 생성 및 일치를 설명합니다. 13-16 단계는 UT 분석을 위한 14-16 단계와 함께 크로마토그램 집합에 프로토콜을 적용하는 것을 설명합니다.
Protocol
1. 원시 데이터 가져오기
참고: 시각화 및 처리를 위한 2차원 래스터 어레이가 만들어집니다.
- 이미지 소프트웨어를 시작합니다.
- 파일 | 선택 가져오기; "바이올린 101.lsc"라는 GC×GC-TOF MS 시스템에서 획득한 원시 데이터 파일을 탐색하고선택하십시오(보충 파일 1); 그런 다음 열립니다. 크로마토그램이 소프트웨어에서 열립니다.
참고: 원시 데이터 파일 형식은 계측기 제조업체에 따라 다릅니다. 이 소프트웨어는 사용자 가이드에 나열된 다양한 파일 형식을 가져옵니다. - 가져오기 대화 상자에서 변조기간(PM)을 3.5로 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
참고: 일부 획득 소프트웨어는 변조 기간을 기록하지 못할 수 있습니다. - 파일 | 선택 이미지를 로 저장; 원하는 폴더로 이동; 이름 "오일 1 RAW.gci"(보충파일 2);를입력합니다. 그런 다음 저장을 클릭합니다.
2. 변조 단계 의 이동
참고: 이것은 다음 변조기간(20)의보이드 타임으로 변조 기간이 끝날 무렵에 감싸는 피크를 포함하여 각 변조 주기의 모든 피크를 동일한 이미지 열로 넣습니다.
- 처리 | 선택 시프트 단계.
- 시프트 단계 대화 상자에서 시프트 양을 -0.8로 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
3. 기준 수정21
- 그래픽 | 선택 직사각형 그리기.
- 클릭 앤 드래그를 클릭하여 피크가 검색되지 않은 이미지에서 사각형을 그립니다.
- 도구 | 선택 데이터 시각화; 검출기 신호의 평균 및 표준 편차는, 여기, 21.850 ± 1.455 SD 단위가 없는 디지털 번호 (DN); 그런 다음 도구를 닫습니다.
- 처리 | 선택 올바른 기준선입니다.
4. 값 맵과 컬러 맵20을 사용하여 크로마토그래피 이미지 에 색칠
- 보기 | 선택 색칠합니다.
- 대화 상자의 색상화에서 가져오기/내보내기 탭을 선택합니다. 보충 자료로 제공되는 #AAAA(보충 파일 3)사용자 지정 색상 맵을 선택합니다. 그런 다음 가져오기를 클릭합니다.
- 값 매핑 컨트롤에서 값 범위를 최소 값과 최대 값으로 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
5. 2D 피크 (즉, Blobs) 마취제 에 대한 검출18
- 처리 | 선택 기본 설정으로 Blob을 감지합니다. 그런 다음 일부 피크가 분할되고 가짜 감지가 있음을 관찰하십시오.
- | 구성 선택 설정 | Blob 감지; 그런 다음 첫 번째 차원에 대해 0.1로 스무딩을 설정하고 두 번째 차원에 대해 2.0으로 스무딩을 설정하고 최소 볼륨(즉, 합산값에 대한 임계값)을 1.00 E6로 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 처리 | 선택 새 설정으로 Blob을 감지합니다. 그런 다음 개선 사항을 관찰하십시오.
6. 2D 피크 여과
참고: 1D를따라 열이 출혈되고 2D를따라 스트라이크 또는 테일링으로 인해 무의미한 감지를 자동으로 제거하기 위해 수행됩니다.
- 처리 | 선택 대화형 Blob 감지.
- Blob 감지 설정을 기록합니다. 그런 다음 검색을클릭합니다.
- 고급 필터 빌더에서 추가를클릭합니다. 그런 다음 새 제약 조건 대화 상자에서 보존 II를선택합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 제약 조건 슬라이더에서 필터의 최소 및 최대 2D보존 시간을 설정하여 실제 피크를 잃지 않고 거짓 피크 수를 줄입니다.
- 적용을클릭합니다. 그런 다음 예를 클릭하여 새 필터를 사용하여 검색 설정에 저장합니다.
참고: 이온 피크 검출 또는 동조용 에이온 볼루션(19)과 같은 특정 검출문제를 처리하기 위해 고급 도구가 더 필요할 수 있다.
7. 선형 보존 지수 보정
참고: 보존 지수(RI) 표준(일반적으로 n-alkanes)에 걸쳐 특정 보존 시간에 대해 이 단계22(I T)를수행합니다.
- | 구성 선택 RI 테이블 | 보존 지수 (Col I).
- RI 테이블 구성 대화 상자에서 가져오기를 클릭합니다. 그런 다음 "LRI 테이블.csv"라는 이름의 RI 교정 파일(이름, 보존 시간 및 보존 인덱스가 있는 CSV 형식)을 선택합니다(보충파일 4).
- 파일 | 선택 이미지 A를 저장합니다. 원하는 폴더로 이동; 이름 "오일 1 LRI CALIBRATED.gci"(보충파일 5);를입력합니다. 그런 다음 저장을 클릭합니다.
8. NIST17 MS 라이브러리23에서 피크 스펙트럼 검색
- | 구성 선택 설정 | 검색 라이브러리.
- 검색 라이브러리 대화 상자에서 스펙트럼 유형을 피크 MS로 설정, 강도 임계값을 100으로 설정하고, NIST 검색 유형은 단순(유사성), 표준 극지로의 NIST RI 열 유형, NIST RI 허용 오차를 10으로설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. NIST MS Search는 여기에 기본값으로 설정된 다른 많은 설정을 제공합니다.
- 처리 | 선택 모든 Blob에 대한 라이브러리를 검색합니다.
9. 알라바이트 식별을 검토하고 수정
- 도구 팔레트에서 커서 모드를 Blob | 설정합니다. Blob을 선택합니다.
- 이미지 보기에서 원하는 피크를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.
- Blob 속성 대화 상자에서 Blob 속성을 검사합니다. 그런 다음 히트 목록을 클릭합니다.
- 히트 목록을 검사합니다. 그런 다음 식별이 올바르지 않으면 올바른 식별 옆에 체크표시를 선택합니다.
- Blob Properties 대화 상자에서 그룹 이름을 입력하여 화학 클래스 및 기타 원하는 메타데이터를 지정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.
- 파일 | 선택 이미지를 로 저장; 원하는 폴더로 이동; 이름 "오일 1 템플릿 구조에 대한 색소화"(보충파일 6); 그런 다음 저장을 클릭합니다.
참고: 이 파일은 10단계 동안 열 수 있는 보충 아카이브에 포함되어 있습니다.
10. 대상 피크15와 템플릿 만들기
- 이미지 보기(9.1 단계에서 Blob선택 모드)에서 첫 번째 피크를 클릭하고 CTRL +를 클릭하여 원하는 피크를 선택합니다.
- 도구 팔레트에서 템플릿에 추가 단추를 클릭합니다.
- 템플릿이 완료되면 파일 | 선택 템플릿 저장; 폴더 및 파일 이름을 지정합니다. 그런 다음 저장을 클릭합니다.
- 파일 | 선택 이미지를 닫습니다.
참고: 이 시점에서 이러한 지침은 "타겟 tamplate.bt"(보충파일 7)로사용할 수 있는 원하는 대상 피크를 포함하도록 만든 템플릿을 계속 합니다.
11. 템플릿을 일치시키고 적용합니다.
참고: 일치하는 일치는 감지된 피크의 템플릿 패턴을 새 크로마토그램으로 인식합니다. 템플릿의 새 크로마토그램에 일치하는 집합 식별 및 기타 메타데이터를 적용합니다.
- 파일 | 선택 이미지 열기; "오일 2 COLORIZED.gci"(보충파일 8)크로마토그램 파일 (사전 처리됨)으로 이동하여 선택하십시오. 그런 다음 열립니다.
- 도구 팔레트에서 커서 모드를 템플릿 | 설정합니다. 객체를 선택합니다.
- 템플릿 | 선택 템플릿로드.
- 로드 템플릿 대화 상자에서 찾아보기를클릭합니다. 대상 봉우리 템플릿"대상template.bt"(보충파일 7)로이동하여 선택합니다. 그런 다음 열립니다.
- 로드 템플릿 대화 상자에서 로드를클릭한 다음 해제합니다.
- 이미지 보기에서 템플릿 피크를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 그런 다음 qCLIC 및 참조 MS를 포함하여 해당 개체 속성을 검사합니다.
- 템플릿 | 선택 대화형 일치 및 변환 템플릿.
- 대화형 일치 인터페이스에서 모든 일치를 클릭합니다. 그런 다음 테이블과 이미지에서 일치하는 결과를 검토하고 각 템플릿 피크가 채워지지 않은 원으로 표시되고 일치가 이루어지면 감지된 피크에 대한 채워진 원에 대한 링크가 있습니다.
- 원하는 대로 일치 항목을 편집합니다. 만족하면 템플릿에서 크로마토그램으로 메타데이터를 전송하려면 적용을 클릭합니다.
참고: qCLIC와 같은 일치하는 구속조건은 새 크로마토그램의 검출된 피크 중 올바른 패턴을 일치시키는 데 도움이 됩니다. 제약 매개 변수에는 템플릿참조(피크 MS 또는 Blob MS)로사용되는 MS 서명 유형과 스펙트럼 유사성에 대한 임계값(직접 일치 계수(DMF) 및 역일치 계수(RMF)가 포함됩니다. 여기서 매개 변수는 이전 연구13,14에 따라 설정된 거짓 음수 일치를 제한합니다: 피크 MS 및 DMF 및 RMF 유사성 임계값 700.
12. 실질적으로 다른 크로마토그래피에 대한 템플릿 변환
참고: 크로마토그래피 조건이 크게 다르면 템플릿이 새로운 크로마토그램과 잘못 정렬되지 않는 한 이 단계는 필요하지 않습니다. 이러한 경우, 템플릿은 새로운 크로마토그램12,13에더 잘 맞도록 크로마토그래피 보존 시간 평면에서 기하학적으로 변형될 수 있다. 이 예에서 템플릿 및 크로마토그램의 피크 패턴은 유사하지만 다른 크로마토그래피 조건에 대해 볼 수 있는 예년과 같이 보존 시간 형상이 다릅니다.
- 대상 템플릿 2.bt(보충 파일 9)로이동, 선택 및 로드하는 것을 제외하고 11.2-11.5 단계를 반복합니다.
- 템플릿 | 선택 대화형 일치 템플릿; 그런 다음 변환 편집을클릭합니다.
- 변환 템플릿 인터페이스에서는 1D및 2D축척, 번역 및 가위를 변화시켜 템플릿을 감지된 피크와 더 잘 정렬합니다. 그런 다음 변환 템플릿을클릭합니다.
- 변환된 템플릿을 사용하면 일치 편집을클릭합니다. 그런 다음 11.8-11.9 단계를 반복합니다.
13. 크로마토그램 세트에 걸쳐 무표적 및 표적 분석을 결합수행
참고: 특징 템플릿24,25라고도하는 결합된 미표적 및 표적(UT) 템플릿은 각 크로마토그램 세트와 일치할 때 표적및 표적 별문 사이에 통신을 설정한 다음 패턴 인식을 위해 일관된 교차 샘플 피쳐를 추출합니다.
- 세트의 모든 크로마토그램(즉, 오일2D 크로마토그램)에 대해 사전 처리(1단계 1-6단계) 및 UT 템플릿 매칭(단계 11.1-11.9)을 수행합니다. 또는 여기에 설명되지 않은 프로젝트 소프트웨어 또는 이와 유사한 소프트웨어로 이 단계를 자동화합니다.
- 조사자 소프트웨어를 시작합니다.
- 파일 | 선택 열린 분석; 그런 다음 ,기능 조브 su 70 eV.gca"(보충파일 10)를선택하고 엽니다.
- 확인을 클릭하여 결과를 열고 검사합니다.
- 화합물 탭을 클릭하여 특정 분석물(예: 관련 화학 적 이름의 표적 분석물) 또는 모든 크로마토그램에 정렬된 (#) 식별자와 표적 분석물 또는 대상되지 않은 분석물에서 메트릭 값 및 통계를 검토한 다음 아래 단계를 수행합니다.
- 속성 탭을 클릭하여 크로마토그램 전반에 걸친 특정 메트릭에 대한 값 및 통계를 검토합니다.
- 요약 탭을 클릭하여 화합물과 피처 모두에 대한 요약 통계를 검토합니다. 이탈리아의 두 개의 다른 지역에서 수확 된 올리브에서 생산 된 올리브에서 생산 된 오일과 같이 크로마토그램이 다른 클래스에서 온 경우 요약 탭에는 클래스 간의 차별에 대한 기능에 대한 통찰력을 제공하는 피셔 비율 통계 (F 및 FDR)가 나열됩니다.
- 모든 탭에서 다양한 차트를 보고 원하는 경우 특성 탭에서 주성분 분석(PCA)을 수행합니다.
14. 병렬 MS 분석을 위해 UT 템플릿수정
참고: 분석은 70 eV 와 12 eV(즉, 높고 낮은) 전자 이온화에너지(26,27)로수행하였다.
- 12eV 크로마토그램 중 하나를 열면,이"오일 1 12 eV RAW.gci(보충파일 11)를열고 사전 처리(1-6 단계)를 수행하고 UT 템플릿 "UT 템플릿 70 relaxed.bt"(보충파일 12)을11.1-11.6 단계에 설명한 대로 로드합니다. 파일은 보충 자료로 제공됩니다.
- 필요한 경우 12단계에서 설명한 대로 감지된 12eV 피크에 맞게 템플릿을 조정합니다. 여기서는 탠덤 신호가 멀티플렉션되기 때문에 정렬 불량이 없습니다. 그러나 다른 이온화 설정이 서로 다른 단편화를 생성하기 때문에 DMF 및 RMF 스펙트럼 유사성에 대한 qCLIC 제약 조건에 대한 제약 조건을 완화할 필요가 있습니다(여기에 설명되지 않음).
- 파일 | 선택 템플릿 저장; 폴더 및 파일 이름(예: "UT 템플릿 12.bt"(보충파일 13)을 지정합니다. 그런 다음 저장을 클릭합니다.
15. 12 eV 크로마토그램에 걸쳐 무표적 및 표적 분석을 결합 수행
- 파일 | 선택 열린 분석; 그런 다음 "기능 조브 su 12 eV.gca"를 선택하고 엽니 다 - 보충 파일 14 파일 제공.
- 확인을 클릭하여 결과를 열고 검토합니다.
- 컴파운드 탭을 클릭하여 메트릭 값을 검토하고, 특정 분석물(즉, 관련 화학 이름이 있는 표적 분석물) 또는 모든 크로마토그램에 정렬된 (#) 식별자와 표적 분석물 12개 참조, 아래 단계를 수행합니다.
- 속성 탭을 클릭하여 크로마토그램 전반에 걸친 특정 메트릭에 대한 값 및 통계를 검토합니다.
- 요약 탭을 클릭하여 12 eV의 화합물 및 기능에 대한 요약 통계를 검토합니다. 이탈리아의 두 개의 다른 지역에서 수확 된 올리브에서 생산 된 올리브에서 생산 된 오일과 같이 크로마토그램이 다른 클래스에서 온 경우 요약 탭에는 클래스 간의 차별에 대한 기능에 대한 통찰력을 제공하는 피셔 비율 통계 (F 및 FDR)가 나열됩니다.
- 모든 탭에서 사용할 수 있는 다양한 차트를 보고 원하는 경우 특성 탭에서 주성분 분석(PCA)을 수행합니다.
Representative Results
GC×GC-TOF MS 패턴의 고품질 엑스트라 버진 올리브 오일 volatilome는 신호 대 잡음 비율(SNR) 임계값100보다 약 500 2D피크를 나타낸다. 이러한 임계값은 식품 휘발성물질(14)및27에 대한 이전 조사에 의해 임계값을 초과하여 최소 상대 신호로 정의하여 교차 비교 분석을 위한 신뢰할 수 있는 스펙트럼을 얻었다. 구성 요소는 두 크로마토그래피 치수의 상대적 유지에 따라 크로마토그래피 공간에 분포되며, 특히 1D의변동성/극성과 2D의변동성을 기반으로 합니다. 여기서, 컬럼 조합은 극× 반극성(즉, 카보왁스 20M × OV1701)이다.
2D패턴은 높은 수준의 순서를 나타낸다. 동종 류 시리즈 및 클래스에 대 한 상대 보존 패턴선형 포화 탄화수소 (블랙), 불포화 탄화수소 (노란색), 선형 포화 알데히드 (파란색), 단일 불포화 알데히드 (빨간색), 고도 불포화 알데히드 (연어), 1 차 알코올 (녹색), 1 차 알코올 (녹색), 발성 알코올 (녹색) 및 지방 산 (극색)에 대한 주석 (피크에 대한 그래픽) 그림 1A에 표시됩니다.
검출된 2D피크는 전체 2D피크(blob 스펙트럼) 또는 가장 큰스펙트럼(정점 스펙트럼)에서 추출된 평균 MS 스펙트럼을 비교하여 식별할 수 있다. 도 2는 Blob 5에 대한 정점 스펙트럼 검색의 출력을 보여 주며(E)-2-헥세날에 대해 높은 유사성 일치(처음 10안타)를 반환합니다. 탐색된 데이터베이스는 메서드의 8단계에서 분석가가 미리 선택한 데이터베이스입니다.
ID는 활성 보존 인덱싱으로 유효성을 검사합니다. 실험I T 값은 2D피크에 대해 계산되므로 이 단계에서 라이브러리 검색은 tabulated IT의일관된 값으로 결과를 우선 순위를 지정합니다. 공차 창은 분석가 의 경험, 고정 단계에 따른 참조 데이터베이스 값의 안정성 및 적용된 분석 조건에 따라 사용자 지정할 수 있습니다. n-alkanes와 실험 적 교정없이 선형 보존 지수의 스마트 교정을위한 새로운 도구는 최근에 개발 및 라이헨바흐 외19에의해 연구에서 논의되었다.
확인된 2D피크(즉, 표적 봉우리)의 컬렉션은 모든 샘플 크로마토그램에 걸쳐 동일한 화합물 간에 신뢰할 수 있는 서신을 신속하게 확립하기 위해 표적 피크의 템플릿을 구축하기 위해 채택될 수 있다. 대상 템플릿 피크의 컬렉션은 그림 1B에서시각화됩니다. 빨간색 원은 연결 선이있는 템플릿 피크에 연결된 두 개의 내부 표준 (IS)을 포함하여 196 개의 대상 화합물에 해당합니다. IS는 응답 정규화에 사용되며 연결 라인은 각 2D피크/Blob 응답을 정규화하기 위해 포함된 IS 중 어느 IS가 채택될지 시각화하는 데 도움이 됩니다.
도 1B에서채워진 원은 템플릿 피크와 실제 패턴 간의 양수 일치를 나타내며 빈 원은 통신이 확인되지 않은 템플릿 피크용입니다. 거짓 음수 일치는 임계값매개 변수, 참조 스펙트럼 및 제약함수(13,14, 18,19)를적절히 선택하여 제한될 수 있다. 다중 동조가 있는 복잡한 패턴의 경우 스펙트럼 감소에 기반한 이온 피크 검출 기능이 권장되며 유효한옵션(19)이될 수 있다. 템플릿 피크 메타데이터는 (E)-2-헥세날에대한 도 1B의 확대 패널에 표시됩니다.
템플릿 일치의 특이성은 알고리즘의 검색 창 내에 속하는 MS 스펙트럼 유사성이 특정 임계값보다 높은 해당 후보 피크에 긍정적 인 대응을 제한하는 제약 조건 함수를 적용 할 수있는 가능성에 의존합니다. 이 경우, 11단계에서, 유사성임계값(23)은 거짓 음수일치를제한하는 최적의 매개변수를 정의하는 것을 목표로 하는 이전 실험에 따라 700으로 설정하였다.. 도 1B에서 템플릿 피크 속성의 강조 표시된 영역은 참조 MS 스펙트럼 문자열 및 qCLIC 제약 조건 함수(예: 일치("일치"< >") > = 700.0) 및 (RMatch("
세트의 모든 크로마토그램에 템플릿을 적용하면 패턴의 부분 정렬이 부분적으로 정렬되지 는 의 경우와 같이 어려운 상황이 발생할 수 있습니다. 이는 오븐 온도 불일치, 캐리어 가스 흐름/압력 불안정, 또는 컬럼 대체 또는 변조기 루프 모세관 교체14,28의경우와 같이 시스템에 대한 수동 개입으로 인해 이루어질 수 있다. 도 3은 대상 템플릿과 실제 크로마토그램 사이의 부분 정렬 불량 상황을 나타낸다. 정렬 불량을 최소화할 경우 대화형 템플릿변환(그림 3,제어판)은 템플릿 피크를 재배치하여 더 잘 맞을 수 있습니다. 위치를 이동하면 템플릿을 일치하여 서신을 설정할 수 있습니다. 예에서 템플릿(도3,12단계)은 실제 2D패턴과 올바르게 일치합니다. 여기서 논의되지 않은 심각한 정렬 불량의 경우, 매치 변환 업데이트 작업의 반복은템플릿 피크 위치를 실제 피크패턴(12,13,14)에반복적으로 조정할 수 있다.
여기서, 표적 봉우리(즉, 알려진 문분해)는 크로마토그래피 결과의 약 40%를 제공한다(평균 약 500개의 검출 가능한 피크의 196개의 표적 피크). 화합물의 나머지 60% 화합물, 그들은 가지고 있는 정보와 함께, 대상 된 분석에서 고려 되지 않습니다. 조사를 진정으로 포괄적으로 만들기 위해 대상2D 피크의 일관된 교차 정렬도 수립되어야 합니다. 템플릿 매칭이 모든 검출 가능한 별술로 확장된 첫 번째 응용 프로그램은 구운 커피7의복잡한 volatilome을 다루었습니다. 이 프로세스는 14-15 단계에 표시된 소프트웨어(예: 조사자)로 자동화됩니다.
이 과정에서, 연구(20샘플)에서 설정된 샘플에 속하는 사전 표적 이미지는 모든 이미지패턴(29)의교차 일치로 신뢰할 수 있는 피크를 정의하는 데 사용된다. 이어서, 복합 크로마토그램은 소위 피쳐템플릿(17)에서UT 의 신뢰성 있는 피크 및 피크 영역(즉, 2D피크 발자국)을 식별할 수 있는 합성 크로마토그램을 내장한다.
70eV에서 획득한 분석의 경우, 이 공정은 144개의 신뢰할 수 있는 피크를결정했으며,그 중 76개는 대상 봉우리 목록에 속합니다. 이 144개의 신뢰할 수 있는 피크를 기반으로 이 공정은 모든 크로마토그램을 신뢰할 수 있는 피크의 평균 보존 시간과 일관되게 정렬한 다음 이를 결합하여 복합 크로마토그램을 생성합니다. 도 4는 오일(왼쪽)의 생산 영역에 따라 표지된 모든 샘플목록과 각 샘플(오른쪽)에서 신뢰할 수 있는 피크/Blob 부피 목록을 나타낸다.
대상이 되지 않은 피쳐 템플릿은 그림 5A에표시된 복합 크로마토그램에서 검출된 멸문에서 2D피크로 구성되며, 이는 신뢰할 수 있는 피크 템플릿(n = 168 – 대상 피크에 대한 빨간색 원 및 대상 피크에 대한 녹색 원)에 의해 일치합니다. 복합 피크의 질량 스펙트럼뿐만 아니라 보존 시간은 확대 된 영역에서 (Z)-3-헥세놀 아세테이트에 대해 도시된 바와 같이 피처 템플릿에 기록됩니다. 피크 영역은 그림 5B에 빨간색 그래픽으로 표시됩니다. 대신 복합 크로마토그램(n = 3578)에서 검출된 모든 2D피크의 윤곽선에 의해 정의됩니다.
주 성분 분석에 의한 감독되지 않은 패턴 인식이 분석된 20개의 샘플 내에서 표적 피크 분포에 적용될 때, 시칠리아및 토스카나 오일 클러스터는 페도 기후 조건과 테루아가 휘발성의 상대적 유병률에 영향을 미친다는 것을 별도로 시사합니다. 결과는 도 6A에 표시되고 신뢰할 수 있는 피크 분포의 PCA 결과가 도 6B에표시됩니다. 두 가지 접근법은 서로 다른 지리적 영역의 오일이 다르며, 표적 또는 미표적 화합물 또는 둘 다에 관계없이 일관된 화학 적 서명이 매핑되어 있는지 상호 검증합니다.
마지막으로 이 소프트웨어는 병렬 감지 채널에서 패턴의 신속하고 효과적인 재정렬을 가능하게 합니다. 이 응용 프로그램에서는 탠덤 이온화 신호에 대해 재정렬이 제안됩니다. MS 멀티플렉스의 이온 소스는 채널 당 50Hz의 수집 주파수에서 두 개의 이온화 에너지(즉, 70 및 12 eV) 사이에30사이의수집 주파수를 갖는다. 두 개의 결과 크로마토그래피 패턴은 밀접하게 정렬되는 반면 스펙트럼 데이터(즉, 스펙트럼 서명 및 응답)는 응답26,27의다양한 동적 범위로 보완적인 정보를 제공합니다. 정렬된 패턴을 사용하면 고유ID(예:대상 피크에 대한 화학 이름 및 대상 피크 및 피크 영역의 고유 번호 매기기 #)를 추출할 수 있습니다.
템플릿 일치를 사용하면 효과적인 교차 정렬이 가능합니다. 이 경우 정렬 불량은 많지 않지만 UT 피크의 일치를 허용하려면 MS 제약 조건을 완화해야 합니다. 반면, MS 제약 조건이 없는 UT 피크 리전은 거짓 음수 일치 없이 즉시 일치합니다. 도 5C는 70eV 데이터로 빌드된 피쳐 템플릿이 일치하는 12 eV 크로마토그램의 확대 영역을 나타낸다. 신뢰할 수 있는 UT 피크는 낮은 qCLIC 제약 조건(예: DMF 임계값 600)으로 인해 양수일치됩니다. 참고로, 12 eV에서 낮은 이온화 에너지에 의해 유도된 제한된 단편화로 인해 검출된 피크가 적습니다.
그림 1: 바이차원 윤곽 플롯 및 대상 템플릿입니다. (A)토스카나에서 엑스트라 버진 올리브 오일의 휘발성 분획의 윤곽 플롯. 호모로그 시리즈및 클래스의 정렬 된 패턴은 다른 색상과 라인으로 강조표시됩니다 : 선형 포화 탄화수소 (검은 선과 2D윤곽) 불포화 탄화수소 (노란색), 선형 포화 알데히드 (파란색) 모노 불포화 알데히드 (빨간색), 고도 불포화 알데히드 (연어), 기본 알코올 (녹색) 및 짧은 체인 지방산 (시카노). (B)내부 표준(IS)을 연결하는 연결 선과 함께 알려진 애무(빨간색 색 원)의 대상 템플릿을 과도하게 부과합니다. 패널에는 2D피크/Blob 속성 메타데이터(데카날) 또는 템플릿 피크 속성이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 에이펙스 MS 검색. 방울 5에 대한 정점 MS 검색의 출력. 라이브러리에서 사용할 수 있는 유사성 일치 및 관련 메타데이터가 가장 높은 데이터베이스 항목 목록입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 템플릿 재조정. 변환을 통해 템플릿을 다시 정렬할 수 있는 단계를 설명하는 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: GC 조사자 인터페이스. 모든 선택된 이미지가 오일의 생산 영역(왼쪽)과 각 샘플(오른쪽)의 신뢰할 수 있는 피크/Blob 볼륨 목록에 따라 레이블이 지정된 모든 이미지가 있는 조사패널. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대상 및 UT 템플릿입니다. (A)11단계에서 자동 처리로 인한 신뢰할 수 있는 피크; 녹색 원은 알 수 없는 동안 빨간색 원은 알려진 된 문물과 일치합니다. 중첩된 패널에서 템플릿 개체 속성은 (Z)-3-헥세날에 대해 표시됩니다. (B)UT 템플릿의 UT 피크(적색 및 녹색 원) 및 피크 영역(red graphics)을 70 eV 이온화 에너지에서 획득한 샘플 오일에 매칭하는 확대 영역. (C)UT 템플릿은 12 eV 이온화 에너지에서 획득한 샘플 오일에 일치한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: PCA 로딩 플롯입니다. 그들은(A)표적 피크 분포 또는(B)UT 피크 분포에 의해 결과로 샘플 (토스카나와 시칠리아에서 오일)의 자연적인 형성을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
GC×GC-TOF MS 데이터의 시각화는 포괄적인 2차원 분리에 의해 달성된 결과를 적절히 이해하기 위한 기본 단계입니다. 사용자 지정된 색화가 있는 이미지 플롯을 통해 분석가는 검출기 응답 차이를 인식하고 따라서 샘플 구성 요소의 차동 분포를 이해할 수 있습니다. 이 시각적 접근 방식은 크로마토그램의 해석과 정교화에 대한 분석가의 관점을 완전히 바꿉시킵니다. 이 첫 번째 단계는 한때 크로마토그래퍼가 이해하고 자신있게 사용했던 것으로, 추가 처리에 대한 새로운 관점을 열어줍니다.
데이터 처리의 또 다른 근본적인 측면은 단일 검출기 이벤트에 해당하는 모든 샘플 포인트에 대한 전체 데이터 매트릭스(즉, MS 스펙트럼 데이터 및 응답)에 대한 접근성입니다. 이러한 점에서 2D는단일 멸분해에 해당하는 검출기 이벤트의 수집이 중요한 단계를 나타낼 수 있도록 통합을 최대화합니다. 현재 프로토콜에서, 2D피크 검출은 분수령알고리즘(18)을 기반으로 하며, 일부 적응은 부분적인 동례 화합물의 경우 검출 민감도를 향상시킨다. 이 프로세스를 보다 구체적으로 만들려면 deconvolution을 수행해야 하며 보다 정교한 절차를 채택해야 합니다. 이는 MS 데이터에 대한 이온 피크 검출을 수행함으로써 가능합니다. 알고리즘은 데이터 어레이를 처리하고 스펙트럼 프로파일19,31을기반으로 단일 분석기의 응답을 격리합니다.
프로토콜의 중요하면서도 중요한 단계이며 GC×GC-MS 데이터 해석 프로세스는 분석자 식별과 관련이 있습니다. 8단계와 9단계에서 제안된 이 절차는 정통 표준을 가진 확인 분석이 없는 경우 분석가가 신중하게 수행해야 합니다. 자동화된 작업은 모든 상용 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. 여기에는 수집된 기준 스펙트럼(즉, 스펙트럼 라이브러리)에 대한 MS 스펙트럼 서명 유사성 평가와 한정자/정량화이온 간의 특성 비율 평가가 포함됩니다. 그러나 isomers의 식별을 모호하게 하기 위해서는 추가 확인 기준이 필요합니다. 프로토콜은 후보자 목록의 우선 순위를 지정하기 위해 선형 보존 인덱스의 채택을 제안합니다. 여기서 제한은 보존 데이터의 가용성과 일관성과 관련이 있습니다.
이 접근 방식을 고유하게 만드는 주요 특징은 템플릿 일치12,13,15,29입니다. 템플릿 일치를 사용하면 매우 효과적이고 구체적이며 직관적인 방식으로 2D패턴 인식을 할 수 있습니다. 분석가가 변환 함수 매개 변수와 적극적으로 상호 작용하여 절차를 감독할 수 있는 동안 사용자 지정된 임계값 및/또는 제약 조건 함수를 적용하여 감도 및 특이성 측면에서 설정할 수 있습니다. 이 프로세스의 특수성은 균일한 배치의 샘플 간에 표적 및 표적 피크 정보를 교차 정렬할 수 있지만 중간에서 심한 정렬이 잘못되었음에도 불구하고 동일한 명목 조건으로 획득한 샘플 간에도 상호 정렬할 수 있는 가능성에 의존합니다. 이 작업의 장점은 분석가에게 시간이 많이 소요되는 모든 표적 분석자 식별을 보존할 수 있는 가능성과 이전 정교세션에서 대상 및 대상되지 않은 피크에 저장된 모든 메타데이터를 보존할 수 있는 가능성과 관련이 있습니다.
템플릿 일치는 계산 시간 측면에서도 매우 효과적입니다. 저해상도 MS 데이터 파일은 약 1~2Gb의 압축 된 데이터로 구성되며 고해상도 MS 분석은 단일 분석 실행당 10-15 Gb에 도달 할 수 있습니다. 템플릿 일치는 매번 전체 데이터 행렬을 처리하지 는 않지만 처음에는 템플릿 피크를 사용하여 크로마토그램 간의 보존 시간 정렬을 수행하며 템플릿의 참조와 유사성 일치를 위해 검색 창 내에서 후보 피크를 처리합니다. 심한 정렬 불량의 경우 가장 어려운 상황인 글로벌 2차 다항제 변환은 현지 방법보다 더 잘 수행된 동시에 계산시간(13)을줄입니다.
GC×GC 기술이 학계 및 연구 실험실을 넘어 널리 퍼지기 위해 데이터 처리 도구는 시각화 및 크로마토그램 검사를 위한 기본 작업을 용이하게 해야 합니다. 별술의 식별은 표준화 된 알고리즘 및 절차 (예 : NIST 검색 알고리즘 및 IT 교정)를 채택 할 수있는 가능성을 제공해야합니다. 상호 비교 분석은 직관적이고 효과적이며 대화형 도구에서 지원되어야 합니다. 제안된 접근 방식은 이러한 요구를 해결하는 동시에 분석용 복제, 다중 분석 결과 보정, 그룹 유형 분석 및 병렬 감지 정렬과 같은 복잡한 상황을 처리하는 고급 옵션과 도구를 제공합니다.
참조된 문헌은 GC×GC, 보다 일반적으로 포괄적인 2차원 크로마토그래피가 단일 실행 분석에서 1D크로마토그래피를 달성할 수 없는 고유한 솔루션과 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 많은 가능한 시나리오를 잘 다룹니다. 5,32,33 GC×GC는 분리 능력과 감도를 높이는 가장 강력한 도구이지만 분리 전력, 감도 및 기타 전신 용량에는 항상 제한이 있습니다. 이러한 시스템 제한이 접근함에 따라 데이터 분석이 점점 더 어려워집니다. 따라서 연구 개발은 분석 도구를 지속적으로 개선해야 합니다.
Disclosures
스티븐 E. 라이헨바흐 교수와 칭핑 타오 박사는 GC 이미지, LLC에 재정적 이익을 가지고 있습니다. 다니엘라 페로니 박사는 이탈리아와 프랑스의 GC 이미지 유통업체인 SRA 인스트루먼트의 직원입니다. 페데리코 스틸로 박사, 키아라 코데로 교수, 카를로 비치 교수는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
연구는 프로게토 아거에 의해 지원되었다 - 폰다지오니 라 라이스 르카 농업 수레 당 rete에. 프로젝트 약어 바이올린 - 혁신적인 분석 도구 (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto)를 통해 이탈리아 올리브 제품의 용맹화. GC 이미지 소프트웨어는 프로토콜을 시연하고 테스트하려는 독자를 위한 무료 평가판에 사용할 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. | Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia | PN 054796 | Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min. |
| 2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from . | Mega, Legnano, Milan, Italy | PN MEGA-1701 | |
| Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC | SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK | ||
| Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy | Project VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare) | Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14 | |
| Gas chromatograph: Model 7890B GC | Agilent Technologies Wilmington DE, USA | ||
| GC Image GC×GC edition V 2.9 | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
| Image processing software | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
| Mass spectrometer: BenchTOF-Select | Markes International Llantrisant, UK | ||
| Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6) | Merck-Millipore/Supelco | PN: 68982 | |
| Modulator controller: Optimode v2.0 | SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy | ||
| Modulator: KT 2004 loop type | Zoex Corporation Houston, TX, USA | ||
| MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3 | National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD | https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17 | |
| n-alkanes C8-C40 for retention indexing | Merck-Millipore/Supelco | PN: 40147-U | |
| n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv | Merck-Millipore/Supelco | PN: 100795 | |
| Solid Phase Microextraction fiber | Merck-Millipore/Supelco | PN 57914-U | |
| α- /β-thujone (CAS 546-80-5) | Merck-Millipore/Sigma Aldrich | PN: 04314 |
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