Summary
Denne protokol giver en omfattende procedure for fremstilling af humane iPS celle-afledte motoriske nerve organoid gennem spontan samling af en robust bundt axoner udvidet fra en sfæroid i en vævskultur chip.
Abstract
En fascicle af axoner er en af de vigtigste strukturelle motiver observeret i nervesystemet. Forstyrrelse af axon fascicles kan forårsage udviklingsmæssige og neurodegenerative sygdomme. Selv om der er gennemført talrige undersøgelser af axoner, er vores forståelse af dannelse og dysfunktion af axon fascicles stadig begrænset på grund af manglen på robuste tredimensionelle in vitro-modeller. Her beskriver vi en trinvis protokol for den hurtige generation af en motornerveorganoid (MNO) fra human inducerede pluripotente stamceller (iPS) celler i en mikrofluidisk-baseret vævskulturchip. For det første beskrives fremstilling af chips, der anvendes til metoden. Fra menneskelige iPS-celler dannes en motor neuron sfæroid (MNS). Dernæst overføres den differentierede MNS til chippen. Derefter vokser axoner spontant ud af kugleformet og samles i en fascicle i en mikrokanal udstyret i chippen, som genererer et MNO-væv, der bærer et bundt axoner forlænget fra kugleformet. Til downstream-analysen kan MPO'er tages ud af chippen, der skal fastgøres til morfologiske analyser eller dissekeres til biokemiske analyser, samt calciumbilleddannelse og multielektrode array-optagelser. MNOs genereret med denne protokol kan lette test og screening af lægemidler og kan bidrage til forståelsen af mekanismer, der ligger til grund for udvikling og sygdomme i axon fascicles.
Introduction
Spinal motor neuroner (MN) udvide axoner til skeletmuskler til at kontrollere kroppens bevægelse. Deres axonale baner er højt organiserede og regulerede i udviklingsprocessen. På trods af mange undersøgelser af axonforlængelse og vejledning1undersøges der stadig mekanismer til organiseret axonbundtdannelse. Axoner af motoriske neuroner er ofte beskadiget af neurodegenerative sygdomme som amyotrofisk lateral sklerose (ALS)2, men patofysiologiske mekanismer af skaden på axon fascicles er dårligt forstået. Således kræves en fysiologisk og patologisk model til at opsummere axon bundtdannelse og regression i marken.
En menneskelig stamcelle-afledt motor neuron er en lovende platform for forståelse af udvikling og sygdomme som ALS3. Menneskeskabte pluripotente stamceller (iPS-celler) kan bruges til at modellere sygdomme ved hjælp af patient-afledte celler. Til dato er forskellige differentieringsmetoder fra pluripotente stamceller til MN blevet rapporteret4,5,6. Imidlertid er axoner af neuroner i todimensionel kultur tilfældigt orienteret og sammenfatter ikke in vivo mikromiljø inden for udvikling af nerver, hvor axoner er ensrettet samlet gennem tætte axo-axonale interaktioner7. For at løse dette problem har vi udviklet en teknik til at generere et tredimensionelt væv, der ligner motornerven fra menneskelige iPS-celler8, og navngivet vævet som motornerveorganoid (MNO). MNO består af cellelegemer placeret i en motor neuron sfæroid (MNS) og en axonal fascicle forlænget ud fra kugleformet. Axonerne i fascicleen er ensrettet, hvilket ligner axoner i udviklingen af motoriske nerver. Derfor giver MPO'er unikt et fysiologisk axonalt mikromiljø, som ikke blev udført af andre tidligere udviklede neuronale kulturmetoder.
I denne protokol beskriver vi metoder til vævskultur chips fabrikation, hurtig motor neuron differentiering, og motor nerve organoid dannelse i udviklede chips. Vores vævskulturchip er meget enkel, og den indeholder kun et rum til accept af en kugleformet, en mikrokanal til dannelse af et axonbundt og et rum til boliger axonterminaler. Enheden indeholder ikke komplekse strukturer, herunder mikrogrooves eller micropore filtre, der ofte bruges til at adskille axoner og cellelegemer efter størrelse9,10. Derfor kan vores enheder let fremstilles ved at følge de trin, der er beskrevet i denne protokol, hvis en fotolitografiopsætning er tilgængelig.
Hurtig differentiering af menneskelige iPS-celler opnås med en optimeret kombination af inducerende og mønstrende faktorer (SB431542, LDN-193189, retinosyre (RA) og glattet agonist (SAG)) og accelerationsfaktorer (SU5402 og DAPT). Det er blevet rapporteret, at kombinationen af SU5402 og DAPT fremskynder differentieringen af perifere neuroner og neurale crest celler11. I denne protokol tilbyder vi tre forskellige metoder til at generere MPO'er, så læserne kan beslutte sig for en metode, der passer bedst til deres behov. Vi anbefaler at udføre differentiering af menneskelige iPS-celler efter at have dannet en sfæroid (3D-metoden), da den differentierede MNS kan overføres direkte til en vævskulturchip. Alternativt kan menneskelige iPS-celler differentieres til motoriske neuroner i monolayer (2D) kultur og derefter oprettes i tredimensionelle motor neuron-sfæroider, som vi tidligere rapporterede8. Vi har opdateret protokollen, og med den tredimensionelle differentieringsmetode, der er beskrevet i denne protokol, kan overgangen fra 2D til 3D undgås, og MPO'er kan opnås med kortere differentieringstid, færre trin og reducerede tekniske risici uden dissociationstrinet. Kommercielt tilgængelige neuroner kan også bruges til at generere MNS for at reducere tiden til differentiering.
For at generere en MNO dyrkede vi en MNS i vævskulturchippen. Axonerne forlænges fra kugleformen og strækker sig ind i mikrokanalen, hvor axoner samles og justeres ensrettet. Dette letter axo-axonal interaktion og spontan dannelse af et tæt samlet ensrettet bundtvæv af axoner i mikrokanalen, hvilket unikt opnås ved denne protokol, mens enten spontan bundtdannelse eller styret axonal orientering alene kan opnås ved andre protokoller12,13,14. I et typisk eksperiment migrerer få celler ud fra sfæroider til mikrokanalen, og de fleste celler forbliver i nærheden af sfæroider. Denne metode gør det muligt spontant at adskille axoner fra spheroiderne uden at anvende størrelsesafhængige fysiske barrierer (f.eks. mikrogrooves eller microporefiltre) til at adskille axoner fra cellelegemer.
Den resulterende MNO kan underkastes forskellige undersøgelser, herunder morfologiske, biokemiske og fysiske analyser. Cellekroppen og det udvidede axonbundt kan fysisk isoleres ved skæring og kan analyseres separat til downstream-eksperimenter, f.eks. biokemiske assays. Biologiske materialer, herunder RNA og protein kan isoleres fra blot et par axon bundter til regelmæssige biokemiske assays herunder RT-PCR og vestlige blotting. Her beskriver vi en protokol til generering af motornerveorganoid fra iPS-celler, som tilbyder en attraktiv fysiologisk og patologisk model til at studere den mekanisme, der ligger til grund for udvikling og sygdom af axon fascicles.
Protocol
1. SU-8 skimmel fabrikation ved fotolitografi
BEMÆRK: Denne procedure involverer farlige kemikalier. Brug røghætte og PPE hele vejen igennem.
- Rengør silicium wafer (4-tommer i diameter, 1-mm tykkelse, poleret) med acetone og blæse med nitrogen gas. Derefter bages ved 180 °C i 3 minutter for at tørre.
- Dispenser 3 mL SU-8 2100 på en renset wafer.
- Coat SU-8 ensartet på wafer ved hjælp af en spin coater ved 500 omdrejninger i minuttet for 10 s og derefter sekventielt spin ved 1500 rpm i 30 s med en acceleration på 300 rpm / s for at opnå en 150 μm tykt lag su-8.
BEMÆRK: Sørg for, at siliciumskiflen er placeret i midten af spincoateren og korrekt fastgjort ved vakuum. - Varm bage wafer på kogepladen ved 50 °C i 10 min, ved 65 °C i 7 min, og ved 95 °C i 45 min.
- Fotomasken (Figur 1) indstilles til masken og eksponeres for UV-lys (365 nm) i 60 s.
BEMÆRK: Eksponeringstiden skal optimeres ved hjælp af en passende dosis UV-lys. - Efter eksponering bages vaflen ved 65 °C i 6 min. og ved 95 °C i 13 minutter på kogepladen.
- Udvikle wafer i 10-20 min i SU-8 udvikler med agitation ved hjælp af en orbital shaker, ændre udviklingen løsning én gang i løbet af processen.
BEMÆRK: Forlæng udviklingstiden, når resterne af SU-8 forbliver. - Skyl vaflen i isopropanol og tør forsigtigt waferen med nitrogengas.
- Mål højden af den deponerede SU-8 ved et målemikroskop, og sørg for, at den er ca. 150 μm tyk. Det kan opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur.
2. PDMS mikrofluidisk-baseret vævskultur chip fabrikation
- Fastgør den SU-8-deponerede wafer til en beholder (f.eks. 15 cm plast petriskål) med dobbeltsidet tape.
- Blæs støvet af waferen ved hjælp af nitrogengas.
- For at silanisere skal du sætte den SU-8-deponerede wafer i et vakuumkammer sammen med en lille beholder (f.eks. 35 mm skål). 10 μL (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane hældes i den lille beholder. Anvend ikke (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane på SU-8 wafer.
- Luk vakuumkammeret tæt og tænd en vakuumpumpe i mindst 2 timer.
- Tag en plastikkop og hæld silikoneeelastomeren (f.eks. Silpot 184 eller tilsvarende Sylgard 184) og hærdningsmidlet ved et 10:1-vægtforhold. Bland derefter godt ved hjælp af en spatel og degas i vakuumkammeret, indtil bobler fjernes helt.
- Hæld PDMS blandingen i beholderen med SU-8 wafer til den ønskede tykkelse (3-4 mm) og afgas igen for at fjerne bobler.
- PDMS'et bages i en ovn ved 60 °C i mindst 3 timer for at helbrede PDMS'et fuldt ud.
- Efter afkøling skal du afskære det hærdede PDMS fra waferen ved hjælp af en skalpel eller et barberblad.
- For at skabe de to kamre i vævskulturchippen skal du slå to huller, hvor de to rum er placeret ved hjælp af en biopsipunch med en diameter på 1,5 mm.
- For at skabe et medium reservoir skal du forberede en anden PDMS-blanding (silikoneeelastomer og hærdningsmidlet ved et 10:1-vægtforhold) og hælde det i en ny 10 cm petriskål. Juster hældevolumenet til 5 mm tykkelse af PDMS.
- PDMS'et bages i en ovn ved 60 °C i mindst 3 timer for at helbrede PDMS'et fuldt ud.
- Efter afkøling af PDMS skal du afskære det hærdede PDMS med en skalpel for at få en rektangulær ring.
- Lim det nederste lag med mediumbeholderen ved at anvende uhærdet PDMS mellem dem og bage de samlede PDMS-lag. Denne bindingsstruktur resulterer i PDMS-vævskulturchippen.
- Rengør PDMS-vævskulturchippen med et scotch-bånd for at fjerne støv og små partikler fra overfladen. PDMS-vævskulturchips kan opbevares ved stuetemperatur, hvis de beskyttes mod støv og UV.
3. Forberedelse af kulturen
- Kulturmedium
BEMÆRK: Alle medier, der er anført nedenfor, skal filtreres til sterilisering, medmindre andet er angivet. Forberedte medier kan opbevares ved 4 °C og anvendes inden for en måned.- For at forberede mTeSR Plus medium: Kombiner en flaske 100 mL mTeSR Plus 5x supplement med en flaske 400 mL mTeSR Plus Basal Medium.
- Tilberedning af 100 mL KSR-medium: I 85 mL DMEM/F12 tilsættes 15 mL knockout serumerstatning (KSR, 15%), 1 mL kommercielt glutamintilskud (1%) og 1 mL ikke-essentiel aminosyre (NEAA, 1%).
- Tilbered 100 mL N2 medium: I 100 mL neurobasal medium tilsættes 1 mL N2 (100x), 1 mL kommerciel glutamintilskud og 1 mL NEAA.
- Tilberedning af 250 ml modningsmedium: I 250 ml neurobasalmedium tilsættes 5 ml B27 (2%), 2,5 ml kommercielt glutamintilskud (1%) og 2,5 ml Penicillin/Streptomycin (1%).
- Genopstå forbindelserne (retinosyre (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) i cellekultur-grade DMSO til den ønskede koncentration. Forbered aliquots og opbevar dem ved -20 °C i op til 6 måneder. Der anvendes følgende stamopløsninger: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Belægning
BEMÆRK: For at forhindre polymerisering af kældermembranmatrix ved varme skal du undgå gentagne fryse-optøningscyklusser. Håndter alle belægningsprocedurer med forkølede pipettespidser og rør, hvis det er muligt. Kældermembranmatrixen skal optøs natten over ved 4 °C og aliquoted ved hjælp af forkølede pipettespidser og rør. Aliquots kan fryses ved -20 °C eller -80 °C.- Tø den frosne aliquot ved 4 °C på is. Aliquot skal holdes kold under belægningsproceduren. Ved hjælp af en forkølet pipettespids fortyndes kældermembranmatrixen med iskold DMEM/F12 i et forhold på 1:40. Ubrugt fortyndet kældermembranmatrix kan opbevares ved 4 °C i 2-3 dage, da der ikke skete polymerisering.
- Tilsæt 1 ml af kældermembranmatrixen/DMEM-F12-opløsningen for at belægge en brønd af 6-brøndspladen.
- Pladen inkuberes ved stuetemperatur i mindst en time eller 4 °C natten over. Belagte plader kan opbevares ved 4 °C i højst en uge.
4. Vedligeholdelse af iPS-celler
BEMÆRK: Udifferentierede iPS-celler opretholdes i mTeSR Plus medium og subkultureret, når sammenløbet af ≥ 90% observeres i en 6 brøndplade i denne protokol. Der kan være behov for mindre justeringer for iPS-celler, der dyrkes i andre medier.
- Forbered kældermembran matrixbelagte retter som tidligere nævnt i trin 3.2.
- Indsug mTeSR Plus-mediet fuldt ud. Brønden vaskes én gang med PBS, og der tilsættes 0,5 mL reagens til passaging (se materialetabel). Vent et par sekunder, og indsug opløsningen.
- Pladen inkuberes ved 37 °C i inkubatoren i 5 min., eller indtil cellerne bliver runde.
BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere mellem forskellige iPS-cellelinjer og sammenløbet. Kontroller regelmæssigt under mikroskopet for at bestemme dissociationstiden under inkubationen. - Tilsæt 1 mL mTeSR Plus medium og tryk på pladen i 30-60 s for at løsne kolonierne.
- Bland forsigtigt 1 ml af celleaffjedringsopløsningen med 7 ml frisk mTeSR plus medium. Pipetter ikke mere end 5 gange.
- Plade i et forhold på 1:8. Der tilsættes typisk 1 mL af suspensionen fra trin 4.5, og der tilsættes 1 mL mTeSR plus medier suppleret med 5-10 μM Y-27632 (ROCK-hæmmer). Passagefortyndingsforholdet afhænger af iPSC-linjen.
- Cellen anbringes i en 5% CO2/37 °C inkubator. Den næste dag skal du fjerne Y-27632 ved at tilføje frisk mTeSR Plus medium. Derefter skifte medier hver anden dag i første omgang, og hver dag som cellen når højere sammenløb.
5. Differentiering af iPS-celler i motoriske neuroner
BEMÆRK: Alle muligheder nedenfor (5,2, 5,3 og 5,4) producerer MPO'er med > 90% effektivitet.
- Passaging iPSC til motor neuron differentiering
BEMÆRK: Differentiering kan udføres med succes i enten 3D-protokoller (5.2) eller 2D-protokoller (5.3).- Lad udifferentierede iPS-celler vokse, indtil det når sammenløbet på ca. 80% i mTeSR Plus-medium i en 6-brønds plade.
- Helt indsug mediet. Vask straks brønden en gang med steril PBS og tilsæt 0,5 ml celleafkoblingsopløsning til cellerne.
- Pladen inkuberes ved 37 °C i inkubatoren i ca. 2-3 min., eller indtil cellerne adskilles og rundes, men forbliver fastgjort til brønden.
- Der tilsættes 1 mL medium og forsigtigt pipette op og ned et par gange ved hjælp af en 5 mL serologisk pipette. Celleaffjedringen overføres til et 15 mL rør bestående af 4 mL af mediet.
- Centrifuge ved 200 x g i 3 min.
- Aspirér forsigtigt supernatanten, lad pelleten være uforstyrret, og opsættes cellerne i 1 mL af mediet suppleret med 10 μM Y-27632.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, og fortsæt til enten 5,2 (3D-differentiering) eller 5,3 (2D-differentiering).
- Dannelse af motor neuron sfæroid (MNS) i 3D differentiering ("3D-protokol")
BEMÆRK: En fuldstændig medium ændring sker dagligt fra dag 0-12 i differentiering (Figur 2).- Frø iPS-cellerne fra trin 5.1.7 til en 96 brønd U bundplade ved 40.000 celler/brønd i 100 μL mTeSR Plus suppleret med 10 μM Y-27632.
- På den næste dag skal hver brønd udskiftes med 100 μL af det friske medium.
- På dag 0 og 1: Indsug kulturmediet og erstatte med 100 μL KSR-medium (3.1.2) suppleret med 10 μM SB431542 og 100 nM LDN-193189.
- På dag 2 og 3: Aspirat kulturmediet og erstatte med 100 μL KSR medium suppleret med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 4 og 5: Forbered et blandet medium bestående af 75% KSR medium og 25% N2 medium (3.1.3). Derefter aspireres kulturmediet og erstattes med 100 μL blandet medium suppleret med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 6 og 7: Forbered et blandet medium bestående af 50% KSR medium og 50% N2 medium. Derefter aspiratkulturmediet og erstatte det med 100 μL blandet medium suppleret med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinosyre og 1 μM SAG.
- På dag 8 og 9: Forbered et blandet medium bestående af 25% KSR medium og 75% N2 medium. Derefter aspiratkulturmediet og erstattes med 100 μL blandet medium suppleret med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 10 og 11: Udskift medium med 100 μl N2 medium suppleret med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 12: Fortsæt med at overføre MN'erne til vævskulturchippen (trin 6) eller udskift medium med 100 μL af modningsmediet (3.1.4) suppleret med 20 ng/mL hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF).
BEMÆRK: MNS kan overføres til vævskulturchippen fra dag 12 til dag 19. Spheroids, der ikke overføres, bør holdes dyrket i 96 godt U bundplader i Modning medium suppleret med 20 ng /mL BDNF indtil overførsel.
- (Alternativ mulighed) 2D-differentiering og overgang til 3D MNS ("2D-protokol")
- Udsug belægningsopløsningen fra en forlakeret 12 brøndplade.
- Seed iPS-cellerne fra trin 5.1.7 ved en tæthed på 100.000 – 200.000 celler pr. brønd i mTeSR Plus medium med 10 μM Y-27632.
BEMÆRK: Fortsæt med at dyrke de udifferentierede iPS-celler i mTeSR Plus-medium uden Y-27632, indtil cellerne når 80% sammenløb, hvis cellerne er for sparsomme til næste trin (5.3.3). - På dag 0 og 1: Aspiratkulturmedium og erstatte med 1 mL KSR-medium (3.1.2) suppleret med 10 μM SB431542 og 100 nM LDN-193189.
- På dag 2 og 3: Aspiratkulturmedium og erstattes med 1 mL KSR-medium suppleret med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 4 og 5: Forbered et blandet medium bestående af 75% KSR medium og 25% N2 medium (3.1.3). Aspiratkulturmedium og erstatte med 1 mL blandet medium suppleret med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 6 og 7: Forbered et blandet medium bestående af 50% KSR medium og 50% N2 medium. Dyrkningsmediet indsuges, og det erstattes med 1 mL blandet medium suppleret med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinosyre og 1 μM SAG.
- På dag 8 og 9: Forbered et blandet medium bestående af 25% KSR medium og 75% N2 medium. Dyrkningsmediet aspireres og erstattes med 1 mL af det blandede medium suppleret med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 10 og 11: Udskift medium med 1 mL N2 medium suppleret med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 12: Aspirér differentieringsmediet, vask hurtigt godt en gang med PBS og tilsæt 0,5 mL af celleløsningsmediet. Pladen anbringes i en inkubator på 37 °C i 1-3 min. (f.eks. ved brug af TrypLE Express) eller 20-30 min (f.eks. ved brug af Accutase).
- Ved hjælp af en P1000 pipette opsamles cellerne forsigtigt og overføres cellerne til et 15 mL konisk rør med frisk modningsmedium og centrifuge ved 200 x g i 3 min. Hvis cellerne er klodsede, skal du forsigtigt pipette op og ned et par gange. Rør ikke for meget, da dette kan forårsage skade på cellerne.
- Supernatanten aspireres og genbruges pellet i 1 mL modningsmedium (3.1.4) suppleret med 20 ng/mL BDNF.
- Tæl cellen ved hjælp af et hæmocytometer. Plade cellerne på 10.000-40.000 celler per brønd i en 96 godt U bundplade i Modning medium suppleret med 20 ng /ml BDNF. Den oprindelige såfylde skal optimeres afhængigt af iPS-cellelinjen og cellernes tilstand, således at diameteren af kugleformet er 800-900 μm, når den indføres i vævskulturchippen. I de fleste tilfælde skal du starte med 20.000 celler pr. brønd i starten og derefter øge eller reducere antallet af celler i henhold til størrelsen.
- Kultur i yderligere 3-10 dage, indtil cellerne danner en sfæroid med en glat kant.
- (Alternativ mulighed): MNS dannelse fra motor neuroner
BEMÆRK: Kommercielt tilgængelige menneskelige iPS celle-afledte motoriske neuroner (se Tabel over materialer) kan bruges til at generere MPO'er i stedet for at skelne fra menneskelige iPS-celler.- Efter optøning af kryotial af motoriske neuroner, hurtigt genbruges cellerne med 9 mL af motor neuroner medium. Drej ned ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirere supernatant og genbruge pellet med motor neuron medium.
- Følg de samme trin som ovenfor (5.3.12- 5.3.13) for at producere MNS'er.
6. Forberedelse af vævskulturchippen til motornerveorganoid (MNO) dannelse
- Steriliser det forberedte PDMS (fra trin 2.13) ved at nedsænke det i 70% ethanol i petriskålen i mindst 1 time.
BEMÆRK: Alle følgende trin skal manipuleres i et biosikkerhedsskab. - Mikroskopglasset (76 x 52 mm) steriliseres ved at nedsænke det i 70% ethanol i petriskålen.
- Under tørringen af mikroskopglasset skal du placere PDMS-enheden på det halve våde mikroskopglas og lade det tørre helt ved at vente natten over. Når den er helt tørret, skal PDMS-enheden klæbe til glasset.
BEMÆRK: Denne limning er ikke permanent for at tillade afmontering af PDMS-enhederne fra mikroskopglasset efter kulturen til vævsindsamling. Permanent limning af iltplasma kan bruges til at maksimere vedhæftningen mellem PDMS og glas, men det ville forbyde demontering af chips og vævsindsamling. - Overfladen af mikrokanalen belægges i PDMS-enhed og mikroskopglas med 30 μL fortyndet kældermembranmatrix i DMEM/F12 (1:40) ved at lave en dråbe på den ene side af kanalens indløb og derefter suge opløsningen fra den anden side af indløbet med en pipette eller sugepumpe (Figur 3A). Undgå for meget opløsning for at undgå bobleforurening.
- Derefter inkuberes PDMS-enheden i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C i en sekundær beholder (f.eks. petriskål).
7. Motornerve organoid (MNO) dannelse
- Belægningsopløsningen udskiftes med forvarmet 150 μL modningsmedium suppleret med 20 mL BDNF lige før brug.
- Placer derefter MNS fra trin 5.2.9 eller 5.3.13 i mikrokanalens indløb ved hjælp af en mikropipette med en bredborespids. MNS kan spontant slå sig ned i bunden af enheden ved tyngdekraften. Der må ikke udøves for meget tryk ved injektion af MNS (Figur 3B).
BEMÆRK: Hvis MNS sidder fast på siden af et hul i en vævskulturchip, skal opløsningen suges forsigtigt fra en anden side af indløbet. - Fyld et lille reservoir (f.eks. en hætte på 15 mL rør) med sterilt vand og læg det i nærheden af vævskulturchippen i den sekundære beholder for at forhindre medium fordampning. Placer den derefter i en 5% CO2/37 °C inkubator.
- For en medium ændring kan du aspirere det udmattede kulturmedium fra midten af det mellemstore reservoir (Figur 3C). Indsug ikke hele mediet og vævet.
- Tilsæt forsigtigt frisk modningsmedium (med BDNF). Mediet skal ændres hver 2-3 dage. Tør ikke kulturmediet på noget tidspunkt under kulturen. Axoner vokser fra en MNS til kanalen og samles spontant i et enkelt bundt på 2-3 uger, hvilket resulterer i dannelsen af en MNO. MNO kan dyrkes i mere end yderligere 1 måned i enheden.
8. Downstream-analyse af MNO
- Immunostaining af hele holderen
- Bring enheden eller opvasken til en kemisk røghætte. Fix MNO ved at tilføje omtrent lige store mængder af 8% paraformaldehyd (PFA) til medierne for at opnå en endelig koncentration på 4% PFA. Skræl PDMS-enheden af glasset og inkuber i 15-20 minutter ved stuetemperatur.
- Vask MNO med PBS og gentag derefter PBS vask 2x.
- Gennemtræng MNO med 0,2% af Triton X-100 i PBS og inkuberes i 5 min ved stuetemperatur.
- Vask MNO med PBS og gentag derefter PBS vask 2x. Bloker derefter MNO med PBS, der indeholder 1% BSA og inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Primære antistoffer fortyndes i PBS, der indeholder 0,1 % BSA, og MNO inkuberes med den primære antistofopløsning natten over ved 4 °C. Vask MNO med PBS tre gange.
- Sekundære antistoffer fortyndes i PBS med 0,1% BSA og inkuber MNO med den sekundære antistofopløsning i 2 timer ved stuetemperatur. Vask derefter MNO tre gange med PBS.
- Plette MNO med Hoechst i PBS indeholder 0,2% Triton-X og inkubere i 5 min ved stuetemperatur.
- Vask MNO tre gange med PBS. Den immunostained MNO er klar til billeddannelse med fluorescerende eller konfokale lasermikroskoper.
- Vævsopsamling og isolering af axonbundt
- Hæld 10 ml HBSS-opløsning i en 10 cm petriskål. Derefter nedsænkes hele PDMS-enheden i HBSS-løsningen.
- Fjern forsigtigt PDMS'et fra mikroskopglasset under et stereomikroskop. Når vævene klæber til PDMS-enheden, påføres forsigtigt 1 ml HBSS-opløsning fra toppen af hullet ved hjælp af en pipette.
- Når vævet kommer ud fra PDMS, forsigtigt anvende 1 mL HBSS på mikroskopet glas til helt at løsne PDMS fra mikroskopet glas.
- Hvis du vil isolere et axonbundt fra en kugleformet, skal du skære axonbundtet med en kirurgisk kniv eller pincet under mikroskopet. Skær axonbundtet lidt langt væk (> 1 mm) fra kugleformet for at undgå kontaminering af migrerede celler.
- Isolerede axonbundter og sfæroider kan analyseres yderligere ved hjælp af forskellige downstream-analyser såsom RT-PCR, RNA-seq og vestlig blotting.
- PDMS-kulturchippen kan genbruges. For at rengøre dyrkningschippen skal du sonikere dyrkningschippen i destilleret vand i 15 minutter. Derefter sonikere chippen i destilleret vand suppleret med 1% vaskemiddel. Vask dyrkningschippen med destilleret vand 5 gange.
- Calciumbilleddannelse
BEMÆRK: Neuronal aktivitet kan måles med calciumindikator både før og efter indsamling af væv fra vævskulturchippen (fra 8.2). Protokollen er baseret på et specifikt kommercielt sæt (se Materialeoversigt). Alternativt kan andre calciumbilledsæt eller tilsvarende metoder anvendes.- Vask MNO med PBS (uden Ca2+ og Mg2+) i tre gange.
- Inkuber vævet med 5 μM Fluo-4AM i indspilningsmedium (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgCl2, 1,8 mM, CaCl2, 13,8 mM glukose) i 30-60 min ved 37 °C. En tilsætning af 0,01-0,02 % af pluronic F-127 kan hjælpe optagelsen af Fluo-4 AM i cellerne.
- Vask derefter vævet med PBS (uden Ca2+ og Mg2+) og udskift det med optagelsesmedium.
- Anskaf time-lapse-billeder ved hjælp af fluorescerende mikroskopi med et GFP/Cy2-filtersæt. Angiv eksponeringstiden mindre end 20 ms pr. ramme.
- Åbn den anskaffede filmfil som en billedsekvens ved hjælp af Billede J.
- Hvis du bruger et CCD- eller CMOS-farvekamera, skal du konvertere RGB-billeder til 16-bit monobilleder. Åbn "Analyser | Værktøj | ROI Manager", Tegn interesseområdet, og klik på "Tilføj". Klik på "Multi Measure". Middelværdi for intensitet i flere ROI vil blive vist i resultatet.
- Plot ændringen af signalintensiteten ved hjælp af generel dataanalysesoftware.
- Måling af neuronal aktivitet ved Multi-elektrode array
BEMÆRK: Aktiviteten af motoriske neuroner kan fanges af et multielektrodesystem (MEA).- Når du har oprettet en MNO, skal du overføre den til en kældermembranmatrix belagt MEA-sonde. Placer vævet på elektroder.
- Der tilsættes 200 μL modningsmedium og inkuberes 1-2 timer ved 37 °C, så MNO'en kan fastgøres til overfladen.
- Mediet udskiftes med optagelsesmediet (8.3.2). Placer eventuelt mesh og vægt oven på en MNO for at øge kontrakten med elektroderne.
- Indstil MEA-sonden til optagelseshovedstadiet. Tør kontakten mellem MEA-sonden og hovedstadiet med 70% ethanol.
- Begynd at optage neuronal aktivitet ved at følge instruktioner fra producenterne af MEA.
Representative Results
Motorneuroner blev differentieret inden for 12-14 dage i 3D-differentieringsprocedurer(figur 4 og figur 5). Vigtigere er det, mere end 60% af cellerne udtrykt motor neuron markør HB9 under differentieringen. Immunhisokemi viste, at ca. 80% af cellerne i MNS var SMI32-positive motoriske neuroner. HB9 og SMI32 er de etablerede tidlige motor neuron markører15,16. Udtrykket af HB9 og SMI32 er de vigtigste parametre, der skal bekræftes for at sikre cellulær identitet motor neuroner. Efter indførelsen af en MNS i kulturen chip, axoner strækker sig ind i kanalen og en axon bundt former. På grund af mikrokanaler, der tjener som fysiske hjælpelinjer, forlænges axoner fra MNS og danner et bundt ved axo-axonal interaktion (Figur 6A). Det er vigtigt at bekræfte dannelsen af axonbundtet ved mikroskopisk observation for at bekræfte genereringen af en MNO. En vellykket MNO bærer en axon bundt bredere end 50 μm og få isolerede axoner ud af bundtet i kanalen. Indledende forlængelse af axoner kan observeres 24 timer efter indførelsen af kugleformet. Inden for de næste 3-4 dage nåede axonerne til midten af mikrokanalen og når derefter til den anden ende inden for yderligere 10 dage (Figur 6A). Derfor samledes axonerne og dannede et lige og ensrettet bundt på 2-3 uger i en chip, og neuronale aktiviteter blev observeret derefter.
Motoriske nerveorganoider kan opsamles fra chippen ved at løsne PDMS fra mikroskopglasset til biologisk analyse (Figur 6B). Axon bundter og cellelegemer kan dissekeres og isoleres ved at skære ved hjælp af en kirurgisk kniv eller pincet under et mikroskop (Figur 6B). Disse biologiske materialer, herunder RNA og protein kan bruges til regelmæssige biokemiske assays såsom RT-PCR og vestlige blotting. I axonbundter af MPO'er påvises der ikke nukleare eller dendritiske makerproteiner i vestlig blotting (Figur 6C).
I kombination med en calciumindikator (Fluo-4 AM) kan neuronal aktivitet fanges i vævskulturchippen. Spontan aktivitet af motoriske neuroner i kugleformet og axonbundtet blev observeret inden for MNO. De neurale aktiviteter blev også observeret ved hjælp af et multielektrodesystem.
Figur 1: Dimensionen af PDMS-vævskulturchippen.
(A)Fotomaske af vævskulturchippen. (B) Mikrokanalens dimensioner i vævskulturchippen. Diameteren af basiskammeret til at holde motor neuron sfæroid er 2 mm, og hullet i PDMS over kammeret er 1,5 mm. Bredden og højden af en mikrokanal, der forbinder to kamre, er begge 150 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk illustration af motorisk neurondifferentiering.
(A) Differentiering trin involveret neurale induktion, mønstre i motor neuron afstamning, og modning af motoriske neuroner. (B) To muligheder for at skabe motor neuron sfæroid (MNS) fra iPS celler: 3D-protokol, og en 2D-protokol med dissociation trin af motor neuroner. Motornerve organoid (MNO) kan opnås ved begge protokoller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Trin for trin protokol for kælder membran matrix belægning og motor neuron sfæroid introduktion.
(A) Kældermembranmatrixbelægning i vævskulturchippens kanal. (B) MNS indføring i hullet på chippen. (C)Kultur medium forandring ved aspiration af udmattet medium. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Differentiering af 2D- og 3D-motorneuroner.
(A) Tidsforløb for repræsentativ 3D MNS-differentiering (3D-protokol). Størrelsen af MNS gradvist steget over tid. Skalastang: 500 μm. (B) Tidsforløb med 2D-differentiering på -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-protokol). Skalastang: 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Karakterisering af motoriske neuroner.
(A) (Venstre) En kryosection af en MNS farvet med SMI-32 antistof og DAPI. (I midten) Et fasekontrastbillede af replated MNS på en kældermembran matrixbelagt overflade. Axonal forlængelse blev observeret. (Til højre) Axoner af replated MNS farvet med Synapsin I og Tuj1 antistoffer. Skalabjælke: 500 μm (venstre og mellem) og 50μm (højre). (B) Et repræsentativt billede af 2D-motoriske neuroner immunostained med Tuj og HB9 antistoffer. Skalastang: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Karakterisering af en motornerve organoid (MNO) genereret i en kultur chip.
(A) Repræsentative billeder af axon forlængelse og tyk axon bundt dannelse på D32. Skalastang: 500 μm. (B) Immunostaining af motornerve organoid (MNO) af SMI-32 og DAPI. Axoner og cellelegemer kan isoleres ved fysisk skæring. Skalastang: 1 mm. (C) Renhed af proteinet fra axoner og cellelegemer kvantificeret ved vestlig blotting. MAP2, en dendritisk markør, blev ikke påvist i axonalt protein, mens axonal markør Tau1 er beriget med det axonale protein. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver dannelsen af en motor nerve organoid (MNO), som har en axon bundt forlænget fra en motor neuron sfæroid genereret fra menneskelige iPS celler. Det dannede axonbundt er tykt, fleksibelt og velorganiseret i ensrettede strukturer. Ved at dissekere axonbundtet kan der opnås axonalt protein og RNA med høj renhed tilstrækkeligt til biokemiske analyser. Neuronal aktivitet kan måles i axon bundter og sfæroider med calcium billeddannelse. Forurening af nukleare og dendritiske proteiner i axonal lysatet blev ikke opdaget ved vestlig blotting, hvilket viser, at vores metode effektivt adskilt axoner fra cellelegemer og dendritter.
En af fordelene ved denne protokol er den hurtige differentiering og generering af MNO udstyret med et axonbundt, hvor alle processer kan udføres på 4 uger med 3D-protokollen og 5-6 uger ved hjælp af 2D-protokollen. Dette er kort i forhold til andre protokoller, som typisk tager 3-4 uger blot at differentiere til MN fra embryonale stamceller og iPS-celler17, og det tager yderligere 2-4 uger at opnå axonal forlængelse. 3D-protokollen foretrækkes generelt frem for 2D-protokollen på grund af den kortere differentieringstid, færre trin og reducerede tekniske risici uden dissociationstrinnet sammenlignet med 2D-protokollen. Den mikrofluidic-baserede vævskultur chip blev designet på en måde, så axoner af MNS kan forlænge mod det andet rum gennem mikrokanalen, hvilket letter dannelsen af et bundt axoner ved at fremkalde axo-axonale interaktioner og affinitet mellem axoner. På grund af den enkle eksperimentelle opsætning kan alle de protokoller, der er beskrevet her, ikke kun udføres af bioengineers, der er bekendt med manipulation af en vævskulturchip, men også biologer og neuroforskere, der ikke er bekendt med mikrofluidics og mikrofabrikationsteknikker. Det skal bemærkes, at trin 1 og 2 også kan udføres ved hjælp af en ekstern fabrikationsservice.
Et af de kritiske skridt til at opnå protokollen er en sekventiel ændring af kulturmediet. Det anbefales helt at ændre kulturmediet på hvert trin under differentieringen, så faktorer i det brugte medium ikke forstyrrer MN-differentieringen. Et andet kritisk punkt i denne protokol er at opretholde udifferentierede iPS-celler i god kvalitet. Kvaliteten af den oprindelige iPS cellekultur påvirker effektiviteten for at opnå motoriske neuroner og MNO. Et andet punkt er, at diameteren af MNS skal være mindre end størrelsen af hullet i chippen (1,5 mm). Større sfæroider kan ikke komme ind i kammeret, og potentielt opleve svær hypoxisk nekrose i den midterste del. Størrelsen af MNS'er kan styres ved at ændre et indledende såningsnummer af iPS-celler (i 3D-protokol) eller motoriske neuroner (i 2D-protokol). Cellernes såtæthed skal optimeres for hver iPS-cellelinje.
Opdelte mikrofluidiske enheder med mikrogrooves og små porefiltre er i vid udstrækning blevet brugt til at adskille axoner fra cellelegemer og dendritter. Denne teknik kan også adskille axoner fra celle organer og dendrite, med overlegen overflod af axoner i bundtet væv. Sammenlignet med de andre metoder er en væsentlig begrænsning af denne metode, at den ikke kan adskille to forskellige kulturmedier i det nuværende design af vævskulturchippen, hvilket hindrer evnen til medkultur af to forskellige celler, der kræver to forskellige medier. En anden begrænsning er, at PDMS-chippen sætter forudbestemt begrænsning på vævets størrelse. En kugleformet større end hullet kan ikke komme ind i kammeret, og axonbundtet kan ikke blive tykkere end bredden af mikrofluidisk kanal.
Denne metode kan anvendes til andre typer af neuroner. Vores gruppe har vist evne til at modellere en cerebral tarmkanalen ved hjælp af en modificeret metode kombineret med cerebral organoid teknikker18. Kortikale sfæroider blev introduceret i både rum og axoner spontant langstrakt gensidigt mod hver sfæroid, og efterfølgende en axon bundt dannet spontant. Som følge heraf kan to kortikale sfæroider forbindes gennem et axonbundt, og vævet kan opnås som et stykke. Dette viser, at tilgangen er meget alsidig til at danne axon bundtvæv uanset neuronale celletyper. I denne protokol blev der imidlertid anvendt menneskelige iPS-celler, men andre stamceller, herunder menneskelige ES-celler og menneskelige neurale stamceller, kan bruges med ændringer af den præsenterede protokol. 3D-sfæroider af neuroner kan genereres af forskellige protokoller19,20. Denne metode til fremstilling af væv med en axon bundt kan potentielt kombineres i fremtiden med de andre differentiering protokoller for at gøre 3D MN sfæroid. Derudover kan tykkelsen og længden af axonbundtet styres ved blot at ændre bredden og højden af vævskulturchippen til fremtidig udvikling.
Vi mener, at denne protokol kan bruges til test og screening af lægemidler og kan bidrage til forståelsen af de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen og sygdomme i axon fascicles.
Disclosures
I en del af denne protokol, et patent er blevet licenseret til Jiksak Bioengineering, Inc., som blev grundlagt af Jiro Kawada.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 og 18K19903, Core-2-core program, og Beyond AI institut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
| 6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
| Accutase | ICT | AT104 | |
| B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
| Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
| HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
| HBSS | Wako | 085-09355 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
| Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
| MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
| Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
| N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
| Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
| ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
| Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
| SAG | Sigma | SML1314 | |
| SB431542 | Wako | 192-16541 | |
| Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
| Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
| Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
| SU5402 | Sigma | SML0443 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
| TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
| Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
| Y-27632 | Wako | 030-24021 |
References
- Raper, J., Mason, C. Cellular strategies of axonal pathfinding. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).
- Ito, Y., et al. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science. 353 (6299), 603-608 (2016).
- Fujimori, K., et al. Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).
- Chen, H., et al. Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons. Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
- Imamura, K., et al. The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis. Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).
- Wang, L., Marquardt, T. What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).
- Kawada, J., et al. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. JoVE. (141), e58421 (2018).
- Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. JoVE. (147), e59250 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).
- Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions. bioRxiv. , (2020).
- Cullen, D. K., et al. Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids. iScience. 21, 57-67 (2019).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).
- Egawa, N., et al. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).
- Qu, Q., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).
- Kirihara, T., et al. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions. iScience. 14, 301-311 (2019).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).
