Summary
Dit protocol biedt een uitgebreide procedure om menselijke iPS-cel-afgeleide motorische zenuw organoïde te fabriceren door spontane assemblage van een robuuste bundel axonen uitgebreid van een sferoïde in een weefselkweekchip.
Abstract
Een fascicle van axonen is een van de belangrijkste structurele motieven die in het zenuwstelsel worden waargenomen. Verstoring van axon fascicles kan ontwikkelings- en neurodegeneratieve ziekten veroorzaken. Hoewel talrijke studies van axonen zijn uitgevoerd, is ons begrip van vorming en disfunctie van axon fascicles nog steeds beperkt vanwege het gebrek aan robuuste driedimensionale in vitro modellen. Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de snelle generatie van een motorische zenuw organoïde (MNO) uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) in een op microfluïdische basis gebaseerde weefselkweekchip. Ten eerste wordt de fabricage van chips die voor de methode worden gebruikt, beschreven. Uit menselijke iPS-cellen wordt een motorneuron sferoïde (MNS) gevormd. Vervolgens wordt de gedifferentieerde MNS overgezet naar de chip. Daarna groeien axonen spontaan uit de sferoïde en assembleren ze zich tot een fascicle in een microkanaal dat in de chip is uitgerust, wat een MNO-weefsel genereert dat een bundel axonen draagt die uit de sferoïde zijn verlengd. Voor de downstreamanalyse kunnen MNO's uit de te repareren chip worden gehaald voor morfologische analyses of ontleed voor biochemische analyses, evenals calciumbeeldvorming en multi-elektrode array-opnamen. MBO's die met dit protocol worden gegenereerd, kunnen het testen en screenen van geneesmiddelen vergemakkelijken en kunnen bijdragen aan het begrijpen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en ziekten van axon-fascicles.
Introduction
Spinale motorische neuronen (MN) strekken axonen uit naar skeletspieren om de beweging van het lichaam te regelen. Hun axonale trajecten zijn sterk georganiseerd en gereguleerd in het ontwikkelingsproces. Ondanks vele studies over axon uitbreiding en begeleiding1, worden de mechanismen voor georganiseerde axon bundelvorming nog onderzocht. Axonen van motorneuronen worden vaak beschadigd door neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS)2, maar pathofysiologische mechanismen van de schade aan axon fascicles worden slecht begrepen. Zo is een fysiologisch en pathologisch model vereist om axonbundelvorming en regressie in het veld te recapituleren.
Een menselijk stamcel-afgeleid motorneuron is een veelbelovend platform voor het begrijpen van de ontwikkeling en ziekten zoals ALS3. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen) kunnen worden gebruikt om ziekten te modelleren met behulp van van de patiënt afgeleide cellen. Tot op heden zijn verschillende differentiatiemethoden van pluripotente stamcellen in MN gerapporteerd4,5,6. Axonen van neuronen in de tweedimensionale cultuur zijn echter willekeurig georiënteerd en vatten niet samen in vivo micromilieu binnen zich ontwikkelende zenuwen waarin axo-axonale interacties unidirectioneel worden geassembleerd7. Om dit probleem op te lossen, hebben we een techniek ontwikkeld om een driedimensionaal weefsel te genereren dat lijkt op motorische zenuw uit menselijke iPS-cellen8, en het weefsel benoemd als motorische zenuw organoïde (MNO). De MNO bestaat uit cellichamen in een motorneuron sferoïde (MNS) en een axonale fascicle die zich uitstrekt uit de sferoïde. De axonen in de fascicle zijn unidirectioneel georiënteerd, wat lijkt op axonen bij het ontwikkelen van motorische zenuwen. Daarom bieden MNOs op unieke wijze een fysiologisch axonaal micromilieu, wat niet werd gedaan door andere eerder ontwikkelde neuronale kweekmethoden.
In dit protocol beschrijven we methoden voor weefselkweekchips fabricage, snelle motorneuron differentiatie en motorische zenuw organoïde vorming in ontwikkelde chips. Onze weefselkweekchip is heel eenvoudig en bevat alleen een compartiment voor het accepteren van een sferoïde, een microkanaal voor het vormen van een axonbundel en een compartiment voor het huisvesten van axonterminals. Het apparaat bevat geen complexe structuren, waaronder microgrooves of microporefilters die vaak worden gebruikt om axonen en cellichamen te scheiden op maat9,10. Daarom kunnen onze apparaten eenvoudig worden gefabriceerd door de stappen te volgen die in dit protocol worden beschreven als er een fotolithografie-installatie beschikbaar is.
Snelle differentiatie van menselijke iPS-cellen wordt bereikt met een geoptimaliseerde combinatie van inducerende en patroonfactoren (SB431542, LDN-193189, retinoïnezuur (RA) en gladgestreken agonist (SAG)) en versnellingsfactoren (SU5402 en DAPT). Er is gemeld dat de combinatie van SU5402 en DAPT de differentiatie van perifere neuronen en neurale crestcellenversnelt 11. In dit protocol bieden we drie verschillende methoden om MBO's te genereren, zodat lezers kunnen beslissen over een methode die het meest geschikt is voor hun behoeften. We raden aan om differentiatie van menselijke iPS-cellen uit te voeren na het vormen van een sferoïde (de 3D-methode), omdat het gedifferentieerde MNS rechtstreeks in een weefselkweekchip kan worden overgebracht. Als alternatief kunnen menselijke iPS-cellen worden onderscheiden in motorneuronen in de monolaagse (2D) cultuur en vervolgens worden gemaakt in driedimensionale motorneuronen sferoïden zoals we eerder meldden8. We hebben het protocol bijgewerkt en met de driedimensionale differentiatiemethode die in dit protocol wordt beschreven, kan de overgang van 2D naar 3D worden vermeden en kunnen MBO's worden verkregen met kortere differentiatietijd, minder stappen en verminderde technische risico's zonder de dissociatiestap. Commercieel verkrijgbare neuronen kunnen ook worden gebruikt om MNS te genereren om de tijd voor differentiatie te verkorten.
Om een MNO te genereren, kweekten we een MNS in de weefselkweekchip. De axonen verlengen zich van de sferoïde en strekken zich uit tot de microkanaal waarin axonen zich unidirectioneel verzamelen en uitlijnen. Dit vergemakkelijkt axo-axonale interactie en spontane vorming van een strak geassembleerd unidirectioneel bundelweefsel van axonen in de microkanaal, wat uniek wordt bereikt door dit protocol, terwijl spontane bundelvorming of begeleide axonale oriëntatie alleen kan worden bereikt door andere protocollen12,13,14. In een typisch experiment migreren maar weinig cellen van sferoïden naar de microkanaal en blijven de meeste cellen in de buurt van sferoïden. Met deze methode kunnen axonen spontaan worden gescheiden van de sferoïden zonder gebruik te maken van grootteafhankelijke fysieke barrières (bijv. microgrooves of microporefilters) om axonen van cellichamen te scheiden.
De resulterende MNO kan worden onderworpen aan verschillende onderzoeken, waaronder morfologische, biochemische en fysische analyses. Het cellichaam en de uitgebreide axonbundel kunnen fysiek worden geïsoleerd door te snijden en kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd voor downstream-experimenten, bijvoorbeeld biochemische tests. Biologische materialen, waaronder RNA en eiwit, kunnen worden geïsoleerd uit slechts een paar axonbundels voor regelmatige biochemische tests, waaronder RT-PCR en western blotting. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van motorische zenuw organoïde uit iPS-cellen, dat een aantrekkelijk fysiologisch en pathologisch model biedt om het mechanisme te bestuderen dat ten grondslag ligt aan de ontwikkeling en ziekte van axon fascicles.
Protocol
1. SU-8 malfabricage door fotolithografie
OPMERKING: Deze procedure heeft betrekking op gevaarlijke chemische stoffen. Gebruik overal een afzuigkap en PBM.
- Reinig de siliciumwafel (4-inch in diameter, 1 mm dikte, gepolijst) met aceton en blaas met stikstofgas. Bak vervolgens op 180 °C gedurende 3 minuten om te drogen.
- Doseer 3 ml SU-8 2100 op een gereinigd wafeltje.
- Bedek de SU-8 gelijkmatig op de wafer met behulp van een spincoater bij 500 tpm gedurende 10 s en draai vervolgens opeenvolgend bij 1500 tpm gedurende 30 s met een versnelling van 300 tpm/s om een 150 μm dikke laag SU-8 te verkrijgen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de siliconen wafer in het midden van de spincoater is geplaatst en correct door vacuüm is bevestigd. - Bak de wafel zachtjes op de kookplaat op 50 °C gedurende 10 minuten, op 65 °C gedurende 7 minuten en op 95 °C gedurende 45 min.
- Stel het fotomasker (figuur 1) in op de maskeruitlijner en stel UV-licht (365 nm) gedurende 60 s bloot.
OPMERKING: De blootstellingstijd moet worden geoptimaliseerd door een geschikte dosis UV-licht. - Bak de wafer na blootstelling gedurende 6 minuten op 65 °C en gedurende 13 minuten op 95 °C op de kookplaat.
- Ontwikkel de wafer gedurende 10-20 minuten in SU-8-ontwikkelaar met agitatie met behulp van een orbitale shaker, waarbij de ontwikkelende oplossing eenmaal tijdens het proces wordt gewijzigd.
OPMERKING: Verleng de ontwikkeltijd wanneer het vuil van SU-8 achterblijft. - Spoel de wafer af in isopropanol en droog de wafel voorzichtig af met stikstofgas.
- Meet de hoogte van de afgezette SU-8 met een meetmicroscoop en zorg ervoor dat deze ongeveer 150 μm dik is. Het kan voor onbepaalde tijd worden bewaard bij kamertemperatuur.
2. PDMS microfluïdische weefselcultuur chip fabricage
- Bevestig de SU-8-gedeponeerde wafel aan een container (bijv. 15 cm plastic Petrischaal) met dubbele zijtape.
- Blaas het stof van de wafer met behulp van stikstofgas.
- Om te verzanden, plaatst u de SU-8-gedeponeerde wafel in een vacuümkamer samen met een kleine container (bijv. 35 mm schotel). Laat 10 μL (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlooretlooretilane in de kleine container vallen. Breng de (tridecafluoro-1,1,2,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichloortilane niet rechtstreeks aan op SU-8 wafer.
- Sluit de vacuümkamer goed en zet een vacuümpomp minstens 2 uur aan.
- Neem een plastic beker en giet het siliconen elastomeer (bijv. Silpot 184 of gelijkwaardig Sylgard 184) en het uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10:1. Meng vervolgens goed met behulp van een spatel en ontgas in de vacuümkamer totdat de bellen volledig zijn verwijderd.
- Giet het PDMS-mengsel met de SU-8 wafer in de container tot de gewenste dikte (3-4 mm) en ontgas opnieuw om bellen te verwijderen.
- Bak de PDMS in een oven op 60 °C gedurende ten minste 3 uur om het PDMS volledig uit te harden.
- Snijd na het koelen het uitgeharde PDMS van de wafel af met behulp van een scalpel of een scheermesje.
- Om de twee kamers van de weefselkweekchip te creëren, ponst u twee gaten waar de twee compartimenten zich bevinden met behulp van een biopsiepons met een diameter van 1,5 mm.
- Om een medium reservoir te creëren, bereidt u een ander PDMS-mengsel (siliconen elastomeer en het uithardingsmiddel met een gewichtsverhouding van 10:1) en giet u het in een nieuwe Petrischaal van 10 cm. Stel het gietvolume in op 5 mm dikte PDMS.
- Bak de PDMS in een oven op 60 °C gedurende ten minste 3 uur om het PDMS volledig uit te harden.
- Na het koelen van het PDMS, snijd het uitgeharde PDMS af met een scalpel om een rechthoekige ring te krijgen.
- Verlijm de onderste laag met het medium reservoir door er ongedekte PDMS tussen aan te brengen en de geassembleerde PDMS-lagen te bakken. Deze gebonden structuur resulteert in de PDMS weefselkweekchip.
- Reinig de PDMS weefselkweekchip met een scotch tape om stof en kleine deeltjes van het oppervlak te verwijderen. PDMS-weefselkweekchips kunnen bij kamertemperatuur worden opgeslagen als ze worden beschermd tegen stof en UV.
3. Voorbereiding van cultuur
- Het middelgrote van de cultuur
OPMERKING: Alle onderstaande media moeten worden gefilterd op sterilisatie, tenzij anders vermeld. Bereide media mogen bij 4 °C worden bewaard en binnen een maand worden gebruikt.- Om mTeSR Plus medium te bereiden: combineer één fles van 100 ml mTeSR Plus 5x supplement met één fles van 400 ml mTeSR Plus Basal Medium.
- Om 100 ml KSR-medium te bereiden: Voeg in 85 ml DMEM/F12 15 ml Knockout serumvervanging (KSR, 15%), 1 ml commercieel glutaminesupplement (1%) en 1 ml niet-essentieel aminozuur (NEAA, 1%).
- Om 100 ml N2-medium te bereiden: Voeg in 100 ml neurobasaal medium 1 ml N2 (100x), 1 ml commercieel glutaminesupplement en 1 ml NEAA toe.
- Om 250 ml rijpingsmedium voor te bereiden: Voeg in 250 ml neurobasaal medium 5 ml B27 (2%), 2,5 ml commercieel glutaminesupplement (1%) en 2,5 ml penicilline/streptomycine (1%) toe.
- Resuspend de verbindingen (retinoïnezuur (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) in cel-cultuur-grade DMSO tot de gewenste concentratie. Bereid aliquots en bewaar ze tot 6 maanden bij -20 °C. De volgende voorraadoplossingen worden gebruikt: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Coating
OPMERKING: Om polymerisatie van keldermembraanmatrix door warmte te voorkomen, vermijdt u herhaalde vriesdooicycli. Behandel indien mogelijk alle coatingprocedures met voorgekoelde pipetpunten en buizen. De keldermembraanmatrix moet 's nachts bij 4 °C worden ontdooid en met behulp van voorgekoelde pipetpunten en -buizen worden geïciteerd. De aliquots kunnen worden ingevroren bij -20 °C of -80 °C.- Ontdooi de bevroren aliquot bij 4°C op ijs. De aliquot moet koud worden gehouden tijdens de coatingprocedure. Verdun met behulp van een voorgekoelde pipettip de keldermembraanmatrix met ijskoude DMEM/F12 in een verhouding van 1:40. Ongebruikte verdunde keldermembraanmatrix kan 2-3 dagen bij 4 °C worden bewaard, aangezien er geen polymerisatie heeft plaatsgevonden.
- Voeg 1 ml van de keldermembraanmatrix/DMEM-F12-oplossing toe om een put van de 6 putplaat te coaten.
- Incubeer de plaat minstens een uur op kamertemperatuur, of 4 °C 's nachts. Gecoate platen kunnen maximaal een week bij 4 °C worden bewaard.
4. Onderhoud van iPS-cellen
OPMERKING: Ongedifferentieerde iPS-cellen worden onderhouden in mTeSR Plus medium en sub-gekweekt wanneer gelijktijdigheid van ≥ 90% wordt waargenomen in een 6 putplaat in dit protocol. Er kunnen kleine aanpassingen nodig zijn voor iPS-cellen die in andere media worden gekweekt.
- Bereid keldermembraan matrix gecoate gerechten zoals eerder vermeld in stap 3.2.
- Aspireer het mTeSR Plus medium volledig. Was de put eenmaal met PBS en voeg 0,5 ml passagingreagens toe (zie Tabel met materialen). Wacht een paar seconden en aspirate de oplossing.
- Incubeer de plaat op 37 °C in de incubator gedurende 5 minuten of totdat de cellen rond worden.
OPMERKING: De incubatietijd kan variëren tussen verschillende iPS-cellijnen en de samenvloeiing. Controleer regelmatig onder de microscoop om de dissociatietijd tijdens de incubatie te bepalen. - Voeg 1 ml mTeSR Plus medium toe en tik 30-60 s op de plaat om de kolonies los te maken.
- Meng voorzichtig 1 ml van de celsuspensieoplossing met 7 ml verse mTeSR plus medium. Niet meer dan 5 keer pipetten.
- Plaat met een verhouding van 1:8. Voeg meestal 1 ml van de suspensie toe vanaf stap 4.5 en voeg 1 ml mTeSR plus media toe aangevuld met 5-10 μM Y-27632 (ROCK-remmer). De doorgangsverdunningsverhouding is afhankelijk van de iPSC-lijn.
- Plaats de cel in een incubator van 5% CO2/37 °C. Verwijder de volgende dag Y-27632 door een nieuw mTeSR Plus medium toe te voegen. Verander daarna in eerste instantie om de andere dag van media en elke dag wanneer de cel een hogere confluency bereikt.
5. Differentiatie van iPS-cellen in motorneuronen
OPMERKING: Alle onderstaande opties (5.2, 5.3 en 5.4) produceren MBO's met > 90% efficiëntie.
- Passivering iPSC voor motorische neuron differentiatie
OPMERKING: Differentiatie kan met succes worden uitgevoerd in 3D-protocollen (5.2) of 2D -protocollen (5.3).- Laat ongedifferentieerde iPS-cellen groeien totdat het een samenvloeiing van ongeveer 80% bereikt in mTeSR Plus-medium in een plaat met 6 putten.
- Zuig het medium volledig aan. Was de put onmiddellijk met steriele PBS en voeg 0,5 ml celdissociatieoplossing toe aan de cellen.
- Incubeer de plaat bij 37 °C in de incubator gedurende ongeveer 2-3 minuten, of totdat cellen gescheiden en rond worden, maar aan de put blijven vastzitten.
- Voeg 1 ml medium toe en pipet voorzichtig een paar keer op en neer met een serologische pipet van 5 ml. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml bestaande uit 4 ml van het medium.
- Centrifugeren bij 200 x g gedurende 3 min.
- Adem de supernatant voorzichtig aan, laat de pellet ongestoord en resuspendeer de cellen in 1 ml van het medium aangevuld met 10 μM Y-27632.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en ga verder met 5,2 (3D-differentiatie) of 5,3 (2D-differentiatie).
- Vorming van motorneuronenferoïde (MNS) bij 3D-differentiatie ("3D-protocol")
OPMERKING: Een volledige middelgrote verandering wordt dagelijks uitgevoerd vanaf dag 0-12 van differentiatie (figuur 2).- Zaai de iPS-cellen van stap 5.1.7 tot een 96 put U bodemplaat op 40.000 cellen/put in 100 μL mTeSR Plus aangevuld met 10 μM Y-27632.
- Vervang de volgende dag elke put door 100 μL van het verse medium.
- Op dag 0 en 1: Aspirateer het kweekmedium en vervang door 100 μL KSR medium (3.1.2) aangevuld met 10 μM SB431542 en 100 nM LDN-193189.
- Op dag 2 en 3: Aspirateer het kweekmedium en vervang door 100 μL KSR medium aangevuld met 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG.
- Op dag 4 en 5: Bereid een gemengd medium voor bestaande uit 75% KSR medium en 25% N2 medium (3.1.3). Aspirateer vervolgens het kweekmedium en vervang het door 100 μL gemengd medium aangevuld met 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG.
- Op dag 6 en 7: Bereid een gemengd medium bestaande uit 50% KSR medium en 50% N2 medium. Aspirateer vervolgens kweekmedium en vervang het door 100 μL gemengd medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinoïnezuur en 1 μM SAG.
- Op dag 8 en 9: Bereid een gemengd medium bestaande uit 25% KSR medium en 75% N2 medium. Vervolgens aspiratie kweekmedium en vervangen door 100 μL gemengd medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG.
- Op dag 10 en 11: Vervang medium door 100 μl N2 medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG.
- Op dag 12: Ga verder met het overbrengen van de MN's in de weefselkweekchip (stap 6) of vervang het medium door 100 μL van het rijpingsmedium (3.1.4) aangevuld met 20 ng/ml hersen-afgeleide neurotrofe factor (BDNF).
OPMERKING: De MNS kan vanaf dag 12 tot dag 19 worden overgebracht naar de weefselkweekchip. Sferoïden die niet worden overgedragen, moeten worden gekweekt in 96 goed U-bodemplaten in rijpingsmedium aangevuld met 20 ng/ml BDNF tot overdracht.
- (Alternatieve optie) 2D-differentiatie en overgang naar 3D MNS ("2D-protocol")
- Aspirateer de coatingoplossing uit een voorgecoate 12 putplaat.
- Zaai de iPS-cellen uit stap 5.1.7 met een dichtheid van 100.000 – 200.000 cellen per put in mTeSR Plus medium met 10 μM Y-27632.
OPMERKING: Blijf de ongedifferentieerde iPS-cellen cultiveren in mTeSR Plus-medium zonder Y-27632 totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken als de cellen te schaars zijn voor de volgende stap (5.3.3). - Op dag 0 en 1: Aspirate kweekmedium en vervangen door 1 ml KSR-medium (3.1.2) aangevuld met 10 μM SB431542 en 100 nM LDN-193189.
- Op dag 2 en 3: Aspirate kweekmedium en vervang het door 1 ml KSR-medium aangevuld met 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG.
- Op dag 4 en 5: Bereid een gemengd medium voor bestaande uit 75% KSR medium en 25% N2 medium (3.1.3). Aspirate kweekmedium en vervang door 1 ml gemengd medium aangevuld met 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG.
- Op dag 6 en 7: Bereid een gemengd medium bestaande uit 50% KSR medium en 50% N2 medium. Aspirateer het kweekmedium en vervang het door 1 ml gemengd medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinoïnezuur en 1 μM SAG.
- Op dag 8 en 9: Bereid een gemengd medium bestaande uit 25% KSR medium en 75% N2 medium. Aspirateer het kweekmedium en vervang door 1 ml van het gemengde medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG.
- Op dag 10 en 11: Vervang medium door 1 ml N2 medium aangevuld met 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA en 1 μM SAG.
- Op dag 12: Aspirateer het differentiatiemedium, was snel goed eenmaal met PBS en voeg 0,5 ml van het celloslatingsmedium toe. Plaats de plaat gedurende 1-3 minuten in een incubator van 37 °C (bijv. bij gebruik van TrypLE Express) of 20-30 min (bijv. bij gebruik van Accutase).
- Verzamel met behulp van een P1000 pipet voorzichtig de cellen en breng de cellen over in een conische buis van 15 ml met vers rijpingsmedium en centrifugeer gedurende 3 minuten op 200 x g. Als cellen klonterig zijn, pipetteer dan een paar keer zachtjes op en neer. Pipetteer niet te veel, omdat dit schade aan de cellen kan veroorzaken.
- Aspirateer de supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml rijpingsmedium (3.1.4) aangevuld met 20 ng/ml BDNF.
- Tel de cel met behulp van een hemocytometer. Plaat de cellen op 10.000-40.000 cellen per put in een 96 put U bodemplaat in Rijpingsmedium aangevuld met 20 ng/ml BDNF. De initiële zaaidichtheid moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de iPS-cellijn en de toestand van cellen, zodat de diameter van de sferoïde 800-900 μm is wanneer deze in de weefselkweekchip wordt geïntroduceerd. Begin in de meeste gevallen in eerste instantie bij 20.000 cellen per put en verhoog of verlaag vervolgens het aantal cellen op basis van de grootte.
- Kweek nog 3-10 dagen tot de cellen een sferoïde vormen met een gladde rand.
- (Alternatieve optie): MNS-vorming uit motorneuronen
OPMERKING: In de handel verkrijgbare menselijke iPS-cel-afgeleide motorneuronen (zie Tabel met materialen)kunnen worden gebruikt om MBO's te genereren in plaats van te differentiëren van menselijke iPS-cellen.- Na het ontdooien van de cryoviale motorneuronen, snel resuspend de cellen met 9 ml van de motor neuronen medium. Draai op 400 x g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
- Aspirateer de supernatant en resuspend de pellet met het motorische neuron medium.
- Volg dezelfde stappen als hierboven (5.3.12- 5.3.13) om MNS's te produceren.
6. Voorbereiding van de weefselkweekchip voor motorische zenuw organoïde (MNO) vorming
- Steriliseer het bereide PDMS (vanaf stap 2.13) door het gedurende ten minste 1 uur onder te dompelen in 70% ethanol in de Petrischaal.
OPMERKING: Alle volgende stappen moeten worden gemanipuleerd in een bioveiligheidskast. - Steriliseer het microscoopglas (76 x 52 mm) door het onder te dompelen in 70% ethanol in de Petrischaal.
- Plaats tijdens het droogproces van het microscoopglas het PDMS-apparaat op het half natte microscoopglas en laat het volledig drogen door 's nachts te wachten. Zodra het volledig is gedroogd, moet het PDMS-apparaat zich aan het glas hechten.
OPMERKING: Deze hechting is niet permanent om het losmaken van de PDMS-apparaten van het microscoopglas na de cultuur voor weefselverzameling mogelijk te maken. Permanente binding door zuurstofplasma kan worden gebruikt om de hechting tussen PDMS en glas te maximaliseren, maar het zou demontage van de chips en weefselverzameling verbieden. - Bedek het oppervlak van de microkanaal in PDMS-apparaat en microscoopglas met 30 μL verdunde keldermembraanmatrix in DMEM/F12 (1:40) door een druppel aan één kant van de inlaat van het kanaal te maken en vervolgens de oplossing van de andere kant van de inlaat aan te zuigen met een pipet of zuigpomp (figuur 3A). Zuig niet te veel hoeveelheid oplossing aan om besmetting met bellen te voorkomen.
- Incubeer vervolgens het PDMS-apparaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C in een secundaire container (bijv. Petrischaal).
7. Motorische zenuw organoïde (MNO) vorming
- Vervang de coatingoplossing door voorverwarmd 150 μL rijpingsmedium aangevuld met 20 ng/ml BDNF vlak voor gebruik.
- Plaats vervolgens de MNS van stap 5.2.9 of 5.3.13 in de inlaat van de microkanaal met behulp van een micropipette met een tip met brede boring. MNS kan zich spontaan aan de onderkant van het apparaat nestelen door de zwaartekracht. Oefen niet te veel druk uit bij het injecteren van de MNS (figuur 3B).
OPMERKING: Als de MNS vastzit aan de zijwand van een gat in een weefselkweekchip, aspireer de oplossing dan voorzichtig vanaf een andere kant van de inlaat. - Vul een klein reservoir (bijv. een dop van 15 ml buis) met steriel water en plaats het in de buurt van de weefselkweekchip in de secundaire container om gemiddelde verdamping te voorkomen. Plaats het vervolgens in een CO2 /37°C incubator van 5%.
- Voor een middelgrote verandering, aspirateer het uitgeputte cultuurmedium uit het midden van het middelgrote reservoir (figuur 3C). Aspirateer niet al het medium en het weefsel.
- Voeg voorzichtig een vers rijpingsmedium toe (met BDNF). Het medium moet elke 2-3 dagen worden gewijzigd. Droog het kweekmedium op geen enkel moment tijdens de cultuur. Axonen groeien van een MNS in het kanaal en assembleren spontaan in één bundel in 2-3 weken, wat resulteert in de vorming van een MNO. MNO kan meer dan 1 maand extra in het apparaat worden gekweekt.
8. Downstream-analyse van MNO
- Immunostaining op de hele berg
- Breng het apparaat of de borden naar een chemische afzuigkap. Fix MNO door ongeveer gelijk volume van 8% paraformaldehyde (PFA) aan de media toe te voegen om een uiteindelijke concentratie van 4% PFA te bereiken. Verwijder het PDMS-apparaat van het glas en incubeer gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de MNO met PBS en herhaal vervolgens de PBS-was 2x.
- Permeabiliseer de MNO met 0,2% Triton X-100 in PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de MNO met PBS en herhaal vervolgens de PBS-was 2x. Blokkeer vervolgens de MNO met PBS die 1% BSA bevat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verdun primaire antilichamen in PBS die 0,1% BSA bevatten en incubeer MNO met de primaire antilichaamoplossing 's nachts bij 4 °C. Was de MNO drie keer met PBS.
- Verdun secundaire antilichamen in PBS met 0,1% BSA en incubeer MNO gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met de secundaire antilichaamoplossing. Was de MNO vervolgens drie keer met PBS.
- Beits de MNO met Hoechst in PBS met 0,2% Triton-X en broed gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de MNO drie keer met PBS. De immunostained MNO is klaar voor beeldvorming met fluorescerende of confocale lasermicroscopen.
- Weefselverzameling en isolatie van axonbundel
- Giet 10 ml HBSS-oplossing in een Petrischaal van 10 cm. Dompel vervolgens het hele PDMS-apparaat onder in de HBSS-oplossing.
- Maak het PDMS voorzichtig los van het microscoopglas onder een stereomicroscoop. Wanneer de weefsels aan het PDMS-apparaat blijven kleven, breng u voorzichtig 1 ml HBSS-oplossing aan vanaf de bovenkant van het gat met behulp van een pipet.
- Zodra het weefsel van het PDMS afkomt, brengt u voorzichtig 1 ml HBSS aan op het microscoopglas om het PDMS volledig los te maken van het microscoopglas.
- Om een axonbundel te isoleren van een sferoïde, snijd je de axonbundel met een chirurgisch mes of pincet onder de microscoop. Snijd de axonbundel iets ver weg (> 1 mm) van de sferoïde om besmetting van gemigreerde cellen te voorkomen.
- Geïsoleerde axonbundels en sferoïden kunnen verder worden geanalyseerd door verschillende downstream-analyses zoals RT-PCR, RNA-seq en western blotting.
- De PDMS-cultuurchip kan worden hergebruikt. Om de kweekchip schoon te maken, soniceer je de kweekchip gedurende 15 minuten in gedestilleerd water. Soniceer vervolgens de chip in gedestilleerd water aangevuld met 1% wasmiddel. Was de kweekchip 5 keer met gedestilleerd water.
- Calcium beeldvorming
OPMERKING: Neuronale activiteit kan worden gemeten met calciumindicator zowel voor als na het verzamelen van weefsel uit de weefselkweekchip (vanaf 8.2). Het protocol is gebaseerd op een specifieke commerciële kit (zie Materialentabel). Als alternatief kunnen andere Calcium imaging kits of gelijkwaardige methoden worden gebruikt.- Was de MNO drie keer met PBS (zonder Ca2+ en Mg2+).
- Incubeer het weefsel met 5 μM Fluo-4AM in registratiemedium (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgCl2,1,8 mM, CaCl2,13,8 mM glucose) gedurende 30-60 min bij 37 °C. Een toevoeging van 0,01-0,02 % pluronische F-127 kan helpen bij de opname van Fluo-4 AM in de cellen.
- Was vervolgens het weefsel met PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) en vervang het door opnamemedium.
- Verkrijg time-lapse-afbeeldingen met behulp van fluorescerende microscopie met een GFP/Cy2-filterset. Stel de belichtingstijd in op minder dan 20 ms per frame.
- Open het verkregen filmbestand als een afbeeldingsreeks met afbeelding J.
- Als u een ccd- of CMOS-kleurencamera gebruikt, converteert u RGB-afbeeldingen naar 16-bits monoafbeeldingen. Openen> | analyseren Hulpmiddelen | ROI Manager", Teken de interesseregio en klik op "Toevoegen". Klik op "Multi Measure". Het gemiddelde van de intensiteit in meerdere ROI's wordt weergegeven in het resultaat.
- Plot de verandering van signaalintensiteit met behulp van algemene data-analysesoftware.
- Meting van neuronale activiteit door multi-elektrode array
OPMERKING: De activiteit van motorneuronen kan worden vastgelegd door een multi-elektrode array (MEA).- Breng deze na het maken van een MNO over op een mea-sonde met keldermembraanmatrixcoating. Plaats het weefsel op elektroden.
- Voeg 200 μL rijpingsmedium toe en incubeer 1-2 uur bij 37 °C om de MNO aan het oppervlak te laten hechten.
- Vervang het medium door opnamemedium (8.3.2). Plaats eventueel gaas en gewicht bovenop een MNO om het contract met de elektroden te verhogen.
- Stel de MEA-sonde in op het opnamehoofdstadium. Veeg het contact tussen de MEA-sonde en de kopfase af met 70% ethanol.
- Begin met het registreren van neuronale activiteit door de instructies van de fabrikanten van de MEA op te volgen.
Representative Results
Motorneuronen werden binnen 12-14 dagen gedifferentieerd in 3D-differentiatieprocedures(figuur 4 en figuur 5). Belangrijk is dat meer dan 60% van de cellen motorneuronmarker HB9 uitdrukte tijdens de differentiatie. Immunohistochemie onthulde dat ongeveer 80% van de cellen in het MNS SMI32-positieve motorneuronen waren. HB9 en SMI32 zijn de gevestigde motorneuronmarkers in een vroeg stadium15,16. De expressie van HB9 en SMI32 zijn de belangrijkste parameters die moeten worden bevestigd om de cellulaire identiteit van motorneuronen te garanderen. Na de introductie van een MNS in de cultuurchip strekken axonen zich uit in het kanaal en vormt zich een axonbundel. Omdat microkanalen dienen als fysieke gidsen, verlengen axonen zich uit het MNS en vormen ze een bundel door axo-axonale interactie (figuur 6A). Het is essentieel om de vorming van de axonbundel te bevestigen door microscopische observatie om de generatie van een MNO te bevestigen. Een succesvolle MNO draagt een axonenbundel breder dan 50 μm en weinig geïsoleerde axonen uit de bundel in het kanaal. De eerste rek van axonen kan 24 uur na de introductie van de sferoïde worden waargenomen. Binnen de volgende 3-4 dagen bereikten de axonen het centrum van de microkanaal en bereiken vervolgens binnen nog eens 10 dagen het andere uiteinde (figuur 6A). Bijgevolg assembleerden en vormden de axonen een rechte en unidirectionele bundel in 2-3 weken in een chip, en neuronale activiteiten werden daarna waargenomen.
Motorische zenuworganoïden kunnen uit de chip worden verzameld door het PDMS los te maken van het microscoopglas voor biologische analyse (figuur 6B). Axonbundels en cellichamen kunnen worden ontleed en geïsoleerd door te snijden met een chirurgisch mes of pincet onder een microscoop (figuur 6B). Deze biologische materialen, waaronder RNA en eiwit, kunnen worden gebruikt voor regelmatige biochemische tests zoals RT-PCR en western blotting. In axonbundels van MBO's worden nucleaire of dendritische makereiwitten niet gedetecteerd in westerse vlekken (figuur 6C).
In combinatie met een calciumindicator (Fluo-4 AM) kan neuronale activiteit worden vastgelegd in de weefselkweekchip. Spontane activiteit van motorneuronen in de sferoïde en de axonbundel werden waargenomen binnen de MNO. Ook werden de neurale activiteiten waargenomen met behulp van een multi-elektrode array systeem.
Figuur 1: De dimensie van PDMS weefselkweekchip.
(A) Fotomasker van de weefselkweekchip. (B) Afmetingen van microkanaal in de weefselkweekchip. De diameter van de basiskamer voor het vasthouden van motorneuronenferoïd is 2 mm en het gat van PDMS boven de kamer is 1,5 mm. De breedte en hoogte van een microkanaaloverbrugging van twee kamers zijn beide 150 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische illustratie van motorische neuron differentiatie.
(A) De differentiatiestappen hadden betrekking op neurale inductie, patroonvorming in motorneuronenlijn en rijping van motorneuronen. (B) Twee opties om motorneuron sferoïde (MNS) te maken van iPS-cellen: 3D-protocol en een 2D-protocol met dissociatiestap van motorneuronen. Motorische zenuw organoïde (MNO) kan worden verkregen door beide protocollen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stap voor stap protocol voor keldermembraan matrix coating en motor neuron sferoïde introductie.
(A) Keldermembraanmatrixcoating in het kanaal van de weefselkweekchip. (B) MNS introductie in het gat van de chip. (C) Cultuurmediumverandering door aspiratie van uitgeput medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: 2D en 3D motor neuron differentiatie.
(A) Tijdscursus van representatieve 3D MNS-differentiatie (3D-protocol). De grootte van de MNS nam in de loop van de tijd geleidelijk toe. Schaalbalk: 500 μm. (B) Tijdsverloop van 2D-differentiatie op -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-protocol). Schaalbalk: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Karakterisering van motorneuronen.
(A) (Links) Een cryosection van een MNS bevlekt met SMI-32 antilichaam en DAPI. (Midden) Een fasecontrastbeeld van opnieuw geplateerde MNS op een met keldermembraanmatrix bedekt oppervlak. Axonale verlenging werd waargenomen. (Rechts) Axonen van opnieuw geplateerde MNS bevlekt met Synapsin I en Tuj1 antilichamen. Schaalbalk: 500 μm (links en midden) en 50μm (rechts). (B) Een representatief beeld van 2D-motorneuronen immunostained met Tuj- en HB9-antilichamen. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Karakterisering van een motorische zenuw organoïde (MNO) gegenereerd in een cultuurchip.
(A) Representatieve beelden van axon rek en dikke axon bundelvorming op D32. Schaalbalk: 500 μm. (B) Immunostaining van motorische zenuw organoïde (MNO) door SMI-32 en DAPI. Axonen en cellichamen kunnen worden geïsoleerd door fysiek te snijden. Schaalbalk: 1 mm. (C) Zuiverheid van het eiwit uit axonen en cellichamen gekwantificeerd door western blotting. MAP2, een dendritische marker, werd niet gedetecteerd in axonaal eiwit, terwijl axonale marker Tau1 is verrijkt in het axonale eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit protocol beschrijft de vorming van een motorische zenuw organoïde (MNO) die een axon bundel uitgebreid van een motor neuron sferoïde gegenereerd uit menselijke iPS cellen. De gevormde axonbundel is dik, flexibel en goed georganiseerd in unidirectionele structuren. Door de axonbundel te ontleden, kunnen hoogzuiver axon-eiwit en RNA voldoende worden verkregen voor biochemische analyses. Neuronale activiteit kan worden gemeten in axonbundels en sferoïden met calciumbeeldvorming. Verontreiniging van nucleaire en dendritische eiwitten in het axonale lysaat werd niet gedetecteerd door westerse vlekken, wat aantoont dat onze methode axonen efficiënt scheidde van cellichamen en dendrieten.
Een van de voordelen van dit protocol is de snelle differentiatie en generatie van MNO uitgerust met een axon bundel, waarbij alle processen in 4 weken kunnen worden uitgevoerd met het 3D protocol en 5-6 weken met behulp van het 2D protocol. Dit is kort in vergelijking met andere protocollen die meestal 3-4 weken duren om eenvoudigweg te differentiëren in MN van embryonale stamcellen en iPS-cellen17 en het duurt nog eens 2-4 weken om axonale verlenging te verkrijgen. Het 3D-protocol heeft over het algemeen de voorkeur boven het 2D-protocol vanwege de kortere differentiatietijd, minder stappen en verminderde technische risico's zonder de dissociatiestap in vergelijking met het 2D-protocol. De op microfluïdische basis gebaseerde weefselkweekchip is zo ontworpen dat de axoonen van MNS zich via het microkanaal naar het andere compartiment kunnen verlengen, wat de vorming van een bundel axoonen vergemakkelijkt door axo-axonale interacties en affiniteit tussen axonen te induceren. Vanwege de eenvoudige experimentele opzet kunnen alle hier beschreven protocollen niet alleen worden uitgevoerd door bio-ingenieurs, die bekend zijn met de manipulatie van een weefselkweekchip, maar ook biologen en neurowetenschappers die niet bekend zijn met microfluïdische en microfabricatietechnieken. Opgemerkt moet worden dat stappen 1 en 2 ook kunnen worden uitgevoerd met behulp van een externe fabricageservice.
Een van de kritieke stappen om het protocol te bereiken is een opeenvolgende verandering van cultuurmedium. Het wordt geadviseerd om het cultuurmedium bij elke stap tijdens de differentiatie volledig te veranderen, zodat factoren in het gebruikte medium de MN-differentiatie niet verstoren. Een ander kritiek punt van dit protocol is om ongedifferentieerde iPS-cellen in goede kwaliteit te houden. De kwaliteit van de initiële iPS-celcultuur heeft een aanzienlijke invloed op de efficiëntie om motorneuronen en MNO te verkrijgen. Een ander punt is dat de diameter van MNS kleiner moet zijn dan de grootte van het gat van de chip (1,5 mm). Grotere sferoïden kunnen de kamer niet binnendringen en kunnen ernstige hypoxische necrose in het middelste deel ervaren. De grootte van MNS'en kan worden geregeld door een eerste zaaigetal van iPS-cellen (in 3D-protocol) of motorneuronen (in 2D-protocol) te wijzigen. De zaaidichtheid van cellen moet worden geoptimaliseerd voor elke iPS-cellijn.
Gecompartimenteerde microfluïdische apparaten met microgrooves en kleine poriefilters zijn veel gebruikt om axonen te scheiden van cellichamen en dendrieten. Deze techniek kan ook axonen scheiden van cellichamen en dendriet, met superieure overvloed aan axonen in gebundelde weefsels. In vergelijking met de andere methoden is een belangrijke beperking van deze methode dat het twee verschillende kweekmedia niet kan scheiden in het huidige ontwerp van de weefselkweekchip, wat het vermogen van co-cultuur van twee verschillende cellen die twee verschillende media vereisen, belemmert. Een andere beperking is dat de PDMS-chip vooraf bepaalde beperking op de grootte van het weefsel heeft geplaatst. Een sferoïde groter dan het gat kan de kamer niet binnendringen en de axonbundel kan niet dikker worden dan de breedte van het microfluïdische kanaal.
Deze methode kan worden toegepast op andere soorten neuronen. Onze groep heeft aangetoond dat het mogelijk is om een hersenkanaal te modelleren met behulp van een aangepaste methode in combinatie met cerebrale organoïde technieken18. Corticale sferoïden werden geïntroduceerd in beide compartimenten en de axonen spontaan verlengd wederkerig naar elke sferoïde, en vervolgens een axon bundel spontaan gevormd. Als gevolg hiervan kunnen twee corticale sferoïden worden verbonden via een axonbundel en kan het weefsel als één stuk worden verkregen. Dit toont aan dat de aanpak zeer veelzijdig is om axon bundelweefsels te vormen, ongeacht neuronale celtypen. In dit protocol werden menselijke iPS-cellen gebruikt, maar andere stamcellen, waaronder menselijke ES-cellen en menselijke neurale stamcellen, kunnen worden gebruikt met wijzigingen in het gepresenteerde protocol. 3D-sferoïden van neuronen kunnen worden gegenereerd door verschillende protocollen19,20. Deze methode om weefsels te maken met een axonbundel kan in de toekomst mogelijk worden gecombineerd met de andere differentiatieprotocollen voor het maken van 3D MN-sferoïde. Bovendien kunnen de dikte en de lengte van de axonbundel worden geregeld door eenvoudigweg de breedte en hoogte van microkanalen van de weefselkweekchip te wijzigen voor toekomstige ontwikkelingen.
Wij geloven dat dit protocol kan worden gebruikt voor drugstests en screening en kan bijdragen aan het begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en ziekten van axon fascicles.
Disclosures
In een deel van dit protocol is een patent verleend aan Jiksak Bioengineering, Inc. dat is opgericht door Jiro Kawada.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 en 18K19903, Core-2-core program en Beyond AI institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
| 6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
| Accutase | ICT | AT104 | |
| B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
| Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
| HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
| HBSS | Wako | 085-09355 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
| Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
| MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
| Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
| N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
| Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
| ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
| Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
| SAG | Sigma | SML1314 | |
| SB431542 | Wako | 192-16541 | |
| Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
| Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
| Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
| SU5402 | Sigma | SML0443 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
| TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
| Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
| Y-27632 | Wako | 030-24021 |
References
- Raper, J., Mason, C. Cellular strategies of axonal pathfinding. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).
- Ito, Y., et al. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science. 353 (6299), 603-608 (2016).
- Fujimori, K., et al. Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).
- Chen, H., et al. Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons. Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
- Imamura, K., et al. The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis. Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).
- Wang, L., Marquardt, T. What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).
- Kawada, J., et al. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. JoVE. (141), e58421 (2018).
- Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. JoVE. (147), e59250 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).
- Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions. bioRxiv. , (2020).
- Cullen, D. K., et al. Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids. iScience. 21, 57-67 (2019).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).
- Egawa, N., et al. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).
- Qu, Q., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).
- Kirihara, T., et al. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions. iScience. 14, 301-311 (2019).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).
