Summary
このプロトコルは、組織培養チップ内のスフェロイドから伸びる強い軸索束の自発的な組み立てを通じて、ヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドを作製するための包括的な手順を提供する。
Abstract
軸索の魅力は、神経系で観察される主要な構造モチーフの一つです。軸索のファシクルの破壊は、発達および神経変性疾患を引き起こす可能性があります。軸索の研究は数多く行われてきましたが、軸索の形成と機能不全の理解は、堅牢な3次元インビトロモデルの欠如のために依然として限られています。ここでは、マイクロ流体ベースの組織培養チップにおけるヒト人工多能性幹細胞(iPS)細胞からの運動神経オルガノイド(MNO)の迅速な生成のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。まず、この方法に用いるチップの製造について説明する。ヒトiPS細胞から、運動ニューロンスフェロイド(MNS)が形成される。次に、差別化されたMNSがチップに転送されます。その後、軸索は自発的にスフェロイドから成長し、チップに装備されたマイクロチャネル内の魅惑的に組み立てられ、スフェロイドから伸びる軸索の束を運ぶMNO組織を生成する。下流の分析のために、MMOは、形態学的分析のために固定されるか、生化学的分析のために解剖されるチップから取り出すことができるだけでなく、カルシウムイメージングおよび多電極アレイの記録。このプロトコルで生成されたMNは、薬物検査とスクリーニングを容易にし、軸索のファシクルの発症および疾患の根底にあるメカニズムの理解に貢献することができます。
Introduction
脊髄運動ニューロン(MN)は、体の動きを制御するために骨格筋に軸索を拡張します。彼らの軸索軌道は、発達過程において高度に組織化され、規制されている。軸索拡張とガイダンス1に関する多くの研究にもかかわらず、組織化された軸索束形成のためのメカニズムはまだ調査中である。運動ニューロンの軸索は筋萎縮性側索硬化症(ALS)2などの神経変性疾患によって損傷を受けることが多いが、軸膜の損傷の病態生理学的メカニズムは十分に理解されていない。したがって、軸索束の形成と回帰を再現する生理学的および病理学的モデルが現場で必要とされている。
ヒト幹細胞由来運動ニューロンは、ALS 3などの発症や疾患を理解するための有望なプラットフォームである。ヒト誘導多能性幹細胞(iPS細胞)は、患者由来細胞を用いた疾患のモデル化に使用できる。現在までに、多能性幹細胞からMNへの種々の分化方法が4,5,6に報告されている。しかしながら、二次元培養におけるニューロンの軸索はランダムに配向しており、緻密なアキソ軸索相互作用を介して一方向に組み立てられる神経の中で生体内微小環境を再現しない。この問題を克服するために、ヒトiPS細胞8から運動神経に似た三次元組織を生成する技術を開発し、その組織を運動神経オルガノイド(MNO)と名付けました。MNOは、運動ニューロンスフェロイド(MNS)に位置する細胞体と、スフェロイドから伸びた軸索の魅惑から構成されています。ファシクルの軸索は一方向に向き、運動神経の発達における軸索に似ている。したがって、MNは独特に生理学的軸索微小環境を提供し、これは他の以前に開発された神経培養法では行われなかった。
本プロトコルでは、開発されたチップにおける組織培養チップの製造方法、急速運動ニューロン分化、運動神経オルガノイド形成の方法について述べている。当社の組織培養チップは非常にシンプルで、スフェロイドを受け入れるためのコンパートメント、軸索束を形成するためのマイクロチャネル、およびハウジング軸索端子用のコンパートメントのみが含まれています。デバイスには、サイズ9,10で軸索と細胞体を分離するためによく使用されるマイクログルーブやマイクロポアフィルタを含む複雑な構造は含まれていません。したがって、フォトリソグラフィのセットアップが利用可能な場合、このプロトコルで説明されている手順に従うことによって、当社のデバイスを簡単に製造することができます。
ヒトiPS細胞の急速な分化は、誘導およびパターン化因子(SB431542、LDN-193189、レチノイン酸(RA)、および平滑化アゴニスト(SAG))および加速因子(SU5402およびDAPT)の最適化された組み合わせで達成される。SU5402とDAPTの組み合わせにより、末梢ニューロンと神経堤細胞11の分化が加速することが報告されている。このプロトコルでは、MMOを生成する3つの異なる方法を提供し、読者が自分のニーズに最も適した方法を決定できるようにします。分化したMNSは組織培養チップに直接移すことができるため、スフェロイド(3D法)を形成した後にヒトiPS細胞の分化を行うことを推奨します。あるいは、ヒトiPS細胞は、単層(2D)培養において運動ニューロンに分化され、その後、我々が先に報告した8のように三次元運動ニューロン回転楕円体に作り出すことができる。プロトコルを更新し、このプロトコルで説明した三次元分化法により、2Dから3Dへの移行を回避し、MMOは解離ステップなしでより短い分化時間、より少ないステップ、および技術的リスクの低減で得ることができる。市販のニューロンは、分化のための時間を短縮するためにMNSを生成するために使用することもできる。
MNOを生成するために、組織培養チップでMNSを培養した。軸索は回転楕円体から伸び、軸索が集まって一方向に整列するマイクロチャネルに伸びる。これは、このプロトコルによって独自に達成されるマイクロチャネルにおける軸索の緊密に組み立てられた単一方向バンドル組織のアキソ軸索相互作用および自発的な形成を促進するが、自発的な束形成または導かれた軸索方向は、他のプロトコル12、13、14によって単独で達成することができる。典型的な実験では、少数の細胞がスフェロイドからマイクロチャネルに移行し、ほとんどの細胞は近くのスフェロイドにとどまります。この方法により、軸索をサイズ依存の物理的障壁(マイクログルーブやマイクロポアフィルタなど)を使用せずに、軸索を回転楕円体から自発的に分離して、軸索を細胞体から分離することができます。
結果として得られるMNOは形態学的、生化学的および物理的な分析を含むさまざまな検査を受けることができる。細胞体と拡張軸索束は切断によって物理的に単離することができ、下流の実験、例えば生化学的アッセイのために別々に分析することができる。RNAやタンパク質を含む生物学的材料は、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングを含む通常の生化学的アッセイのためのほんの数個の軸索束から単離することができる。ここでは、軸索の発達と疾患のメカニズムを研究するための魅力的な生理学的および病理学的モデルを提供するiPS細胞から運動神経オルガノイドを生成するためのプロトコルについて述べる。
Protocol
1. 写真リソグラフィによるSU-8金型加工
注:この手順には、有害な化学物質が含まれます。ヒュームフードとPPEを全体に使用してください。
- シリコンウェーハ(直径4インチ、厚さ1mm、研磨)をアセトンで洗浄し、窒素ガスで吹きます。その後、180°Cで3分間乾燥させて焼きます。
- 洗浄されたウエハーにSU-8 2100の3 mLを分配する。
- 10sのスピンコート機を使用してSU-8をウエハーに均一にコーティングし、300rpm/sの加速度で30sの1500rpmで順次回転し、150μmの厚層のSU-8を得ます。
注:シリコンウエハがスピンコーターの中心に配置され、真空によって正しく固定されていることを確認してください。 - ホットプレートのウエハーを50°Cで10分間、65°Cで7分間、95°Cで45分間柔らかく焼きます。
- マスクアライアにフォトマスク(図1)をセットし、60 sのUV光(365 nm)を露出します。
注: 露出時間は、UV ライトの適切な線量で最適化する必要があります。 - 露光後、ウエハースを65°Cで6分間焼き、ホットプレートで95°Cで13分間焼きます。
- 軌道シェーカーを使用して撹拌を行い、プロセス中に開発ソリューションを一度変更して、SU-8開発者の10〜20分間のウエハーを開発します。
メモ:SU-8の破片が残っている場合、開発時間を延長します。 - ウエハをイソプロパノールですすい、窒素ガスでウエハを軽く乾燥させます。
- 測定顕微鏡で堆積したSU-8の高さを測定し、厚さ約150μmであることを確認します。室温で無期限に保存できます。
2. PDMSマイクロ流体組織培養チップ製造
- SU-8堆積ウエハを容器(例えば、15cmプラスチックペトリ皿)に両面テープで固定します。
- 窒素ガスを使用してウエハからほこりを吹き飛ばします。
- シラナ化するには、SU-8堆積ウエハを小さな容器(例えば、35mm皿)と一緒に真空チャンバーに入れます。小さな容器に10 μL(トリデカフルオロ-1,1,2-テトラヒドロコクチル)-1-トリクロロシランを滴下します。SU-8ウエハに直接(トリデカフルオロ-1,1,2-テトラヒドロコクチル)-1-トリクロロシランを適用しないでください。
- 真空チャンバをしっかりと閉じ、真空ポンプを2時間以上オンにします。
- プラスチックカップを取り、シリコーンエラストマー(例えば、シルポット184または同等のシルガード184)と硬化剤を10:1重量比で注ぎます。その後、泡が完全に取り除かれるまで、真空チャンバーでヘラと脱気を使用してよく混ぜます。
- 所望の厚さ(3-4 mm)にSU-8ウエハと容器にPDMS混合物を注ぎ、泡を除去するために再び脱気します。
- PDMSを完全に硬化させるために、60°Cのオーブンで少なくとも3時間焼きます。
- 冷却後、メスまたはカミソリの刃を使用して、ウエハから硬化したPDMSを遮断する。
- 組織培養チップの2つのチャンバーを作成するには、直径1.5mmの生検パンチを使用して、2つのコンパートメントが位置する2つの穴を開けます。
- 培地貯留層を作成するには、別のPDMS混合物(シリコーンエラストマーと硬化剤を10:1重量比で)準備し、新しい10cmペトリ皿に注ぎます。PDMSの厚さの5ミリメートルに注ぐ量を調整します。
- PDMSを完全に硬化させるために、60°Cのオーブンで少なくとも3時間焼きます。
- PDMSを冷却した後、メスで硬化したPDMSを切り落とし、長方形のリングを得る。
- 一番下の層を媒体貯留層と接着するには、未硬化PDMSを適用し、組み立てられたPDMS層を焼成します。この結合構造はPDMS組織培養チップをもたらす。
- 表面からほこりや小さな粒子を除去するために、スコッチテープでPDMS組織培養チップをきれいにします。PDMS組織培養チップは、塵や紫外線から保護されれば室温で保存することができる。
3. 文化の準備
- 培地
注: 特に明記されていない限り、以下に記載されているすべてのメディアを除き、滅菌のためにフィルタリングする必要があります。調製した培地は4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用することができます。- mTeSR Plus培地を準備するには:100 mL mTeSR Plus 5xサプリメントのボトル1本と400mLのmTeSRプラスバサルミディアムのボトル1本を組み合わせます。
- KSR培地の100 mLを調製するには:DMEM/F12の85 mLに、ノックアウト血清置換術の15 mL(KSR、15%)、1mLの市販グルタミンサプリメント(1%)を加える1 mL の非必須アミノ酸 (NEAA, 1%)
- N2培地の100 mLを調製するには:神経基底培地の100 mLに、N2(100x)の1 mL、1 mLの市販グルタミンサプリメント、およびNEAAの1 mLを加える。
- 250 mLの成熟培地を調製するには:250 mLの神経基底培地に、B27の5 mL(2%)、市販グルタミンサプリメント2.5 mL(1%)、ペニシリン/ストレプトマイシン2.5 mL(1%)を加える。
- 化合物(レチノイン酸(RA)、SB431542、LDN-193189、SU5402、DAPT、SAG、Y-27632)中の化合物を所望の濃度まで再懸濁する。アリコートを準備し、6ヶ月まで-20°Cで保管してください。以下のストックソリューションが使用されます: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- コーティング
注:熱による基体膜マトリックスの重合を防ぐために、繰り返し凍結融解サイクルを避けてください。可能であれば、あらかじめ冷却されたピペットチップとチューブですべてのコーティング手順を処理します。基底膜マトリックスは、4 °Cで一晩解凍し、前チルドピペットチップとチューブを使用してアリクォートする必要があります。アリコートは-20°Cまたは-80°Cで凍結することができる。- 氷上で4°Cで凍結したアリコートを解凍します。アリコートは、コーティング手順中に冷たく保たれるべきである。あらかじめ冷却されたピペットチップを使用して、氷冷DMEM/F12で基膜マトリックスを1:40の比率で希釈します。未使用の希釈基質基質マトリックスは、重合が起こらなかったことを考えると、4°Cで2〜3日間保存することができます。
- 6ウェルプレートの1ウェルをコーティングするために、基部膜マトリックス/DMEM-F12溶液の1 mLを追加します。
- プレートを室温で少なくとも1時間、または一晩4°Cインキュベートします。被覆プレートは4°Cで最大1週間保存できます。
4. iPS細胞のメンテナンス
注:未分化iPS細胞は、mTeSR Plus培地で維持され、このプロトコルの6ウェルプレートに≥90%の合流が観察されるとサブ培養されます。他の培地で培養したiPS細胞に対しては、若干の調整が必要な場合があります。
- ステップ 3.2 で前述したように、基質膜マトリックスコーティングされた皿を準備します。
- mTeSRプラス培地を完全に吸引する。PBSで一度井戸を洗い、0.5mLのパッジング試薬を加えます( 材料表を参照)。数秒待って、解決策を吸引します。
- インキュベーターでプレートを37°Cで5分間、または細胞が丸くなるまでインキュベートします。
注: インキュベーション時間は、iPS細胞株と合流性によって異なる場合があります。顕微鏡で定期的に確認し、インキュベーション中の解離時間を確認してください。 - mTeSR Plus培地を1 mL追加し、プレートを30~60sタップしてコロニーを取り外します。
- 新鮮なmTeSRと培地の7 mLでセル懸濁液の1 mLを穏やかに混合します。5回以上ピペットしないでください。
- 1:8の比率でプレート。通常、ステップ4.5から懸濁液を1 mL加え、MTeSRの1 mLとY-27632(ROCK阻害剤)の5-10 μMを添加した培地を加えます。通過希釈率はiPSCラインに依存します。
- 5%CO2/37°Cインキュベーターに細胞を入れる。翌日、新鮮なmTeSR Plus培地を追加してY-27632を取り外します。その後、最初は1日おきにメディアを交換し、細胞がより高い合流に達するにつれて毎日変化する。
5. iPS細胞の運動ニューロンへの分化
注: 以下のすべてのオプション (5.2、5.3、および 5.4) は、> 90% 効率で MMO を生成します。
- 運動ニューロン分化のためのiPSCの通過
注: 3D (5.2) または 2D (5.3) のプロトコルで区別を正常に行うことができます。- 6ウェルプレートでmTeSR Plus培地で約80%の合流度に達するまで、未分化iPS細胞が増殖することを可能にします。
- 培地を完全に吸引する。すぐに滅菌PBSで一度井戸を洗浄し、細胞に細胞解離液の0.5 mLを追加します。
- インキュベーターでプレートを約2〜3分間インキュベーターでインキュベートするか、細胞が分離して丸くなるまで、ウェルに付着したままにします。
- 培地1 mLを加え、5 mL血清ピペットを使用して数回上下にピペットを軽く加えます。細胞懸濁液を培地4mLからなる15mLチューブに移します。
- 200 x g で 3 分間の遠心分離機。
- 上清を慎重に吸引し、ペレットを乱さずに、Y-27632の10μMを添加した培地の1mLで細胞を再懸濁する。
- ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、5.2(3D分化)または5.3(2D分化)に進みます。
- 3D分化における運動ニューロンスフェロイド(MNS)の形成(「3Dプロトコル」)
注: 完全なメディア変更は、日 0 から 12 日の分化 (図 2) から毎日行われます。- ステップ 5.1.7 から 96 ウェル U 底板の iPS 細胞を 40,000 セル/ウェルの 100 μL の mTeSR Plus に 10 μM の Y-27632 を加えてシードします。
- 翌日、各ウェルを100μLの新鮮な培地に交換します。
- 0日と1日:培地を吸引し、10 μM SB431542および100 nM LDN-193189を添加したKSR培地(3.1.2)の100 μLに交換します。
- 2日目と3日目:培地を吸引し、10 μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RAおよび1 μM SAGを補充したKSR培地100μLに交換します。
- 4日目と5日目:75%のKSR培地と25%のN2培地(3.1.3)からなる混合培地を準備します。次いで、培地を吸引し、10 μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、および1 μM SAGを添加した混合培地の100 μLに交換します。
- 6日目および7日目:50%KSR培地と50%N2培地からなる混合培地を調製する。次に、培地を吸引し、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM レチノイン酸、1 μM SAGを添加した混合培地100μLに交換します。
- 8日目および9日目:25%KSR培地と75%N2培地からなる混合培地を調製する。次に、吸引培養培地を5μM DAPT、5μM SU5402、1μM RAおよび1 μM SAGで補充した混合培地100μLに交換します。
- 10日と11日:培地を5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、1 μM SAGで補ったN2培地100μlに交換してください。
- 12日目:MNsを組織培養チップに移す(ステップ6)、または20ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)を添加した成熟培地(3.1.4)の100 μLで培地を交換します。
注:MNSは12日目から19日目まで組織培養チップに移すことができます。転写されていないスフェロイドは、20 ng/mL BDNFを補充した成熟培地において96ウェルU底板で培養して20ng/mL BDNFを移送するまで培養しておくべきである。
- (代替オプション)2D差別化と3D MNSへの移行(「2Dプロトコル」)
- あらかじめコーティングした12ウェルプレートからコーティング溶液を吸引する。
- ステップ 5.1.7 の iPS 細胞に、Y-27632 の 10 μM を持つ mTeSR Plus 培地のウェルあたり 100,000 ~ 200,000 個のセルの密度でシードします。
注:未分化iPS細胞をY-27632なしでmTeSR Plus培地で培養し続け、細胞が次のステップ(5.3.3)に対して疎すぎる場合は、細胞が80%の合流度に達するまで続けてください。 - 0日および1日:吸引培養培地を1mLのKSR培地(3.1.2)に10μM SB431542および100 nM LDN-193189を添加して交換する。
- 2日目と3日目:吸引培養培地を10μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RAおよび1 μM SAGで補充したKSR培地1mLに交換してください。
- 4日目と5日目:75%のKSR培地と25%のN2培地(3.1.3)からなる混合培地を準備します。吸引培養培地と10 μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、および1 μM SAGを添加した混合培地1 mLに交換します。
- 6日目および7日目:50%KSR培地と50%N2培地からなる混合培地を調製する。培地を吸引し、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μMレチノイン酸、1 μM SAGを添加した混合培地1 mLに交換してください。
- 8日目および9日目:25%KSR培地と75%N2培地からなる混合培地を調製する。培地を吸引し、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、1 μM SAGを添加した混合培地の1 mLに交換します。
- 10日と11日:培地を5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、1 μM SAGで補ったN2培地1 mLに交換してください。
- 12日目:分化培地を吸引し、PBSで一度素早く洗浄し、細胞剥離培地を0.5mL加える。プレートを37°Cインキュベーターに1~3分間(例えば、トリプルエクスプレスを使用する場合)または20〜30分(例えば、アキュターゼを使用する場合)に入れる。
- P1000ピペットを使用して、細胞を穏やかに収集し、新鮮な成熟培地と遠心分離機を200 x g で3分間、15 mLの円錐形チューブに移します。細胞が塊状の場合は、数回上下にピペットを軽くします。これは、細胞に損傷を引き起こす可能性がありますので、あまりにも多くのピペットしないでください.
- 上清を吸引し、20 ng/mL BDNFを添加した成熟培地(3.1.4)の1mLでペレットを再懸濁する。
- ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。BDNFの20 ng /mlを添加した成熟培地の96ウェルU底板でウェルあたり10,000-40,000細胞で細胞をプレートします。初期シード密度は、iPS細胞株や細胞の状態に応じて最適化し、組織培養チップに導入した際に回転楕円体の直径が800~900μmになるようにする必要があります。ほとんどの場合、最初はウェルあたり 20,000 個のセルから開始し、サイズに応じてセルの数を増減します。
- 細胞が滑らかなエッジを有する回転楕円体を形成するまで、さらに3〜10日間培養する。
- (代替オプション): 運動ニューロンからのMNS形成
注:市販のヒトiPS細胞由来運動ニューロン( 材料表を参照)は、ヒトiPS細胞と区別する代わりにMMOを生成するために使用することができます。- 運動ニューロンのクライボシャルを解凍した後、すぐに運動ニューロン培地の9 mLで細胞を再中断する。室温で5分間 400×g でスピンダウンします。
- 上清を吸引し、運動ニューロン培地でペレットを再懸濁する。
- MNS を生成するには、上記と同じ手順 (5.3.12- 5.3.13) を実行します。
6. 運動神経オルガノイド(MNO)形成のための組織培養チップの調製
- ペトリ皿に70%エタノールを少なくとも1時間浸漬して(ステップ2.13から)調製したPDMSを殺菌する。
注: 以下の手順はすべて、バイオセーフティキャビネットで操作する必要があります。 - ペトリ皿に70%エタノールに浸漬して顕微鏡ガラス(76 x 52mm)を殺菌します。
- 顕微鏡ガラスの乾燥工程中、PDMS装置を半湿式顕微鏡ガラスの上に置き、一晩待って完全に乾かします。完全に乾燥したら、PDMS装置はガラスに付着する必要があります。
注:この結合は、組織採取のための培養後に顕微鏡ガラスからPDMSデバイスを取り外すことを可能にするために永久的ではありません。酸素プラズマによる永久結合は、PDMSとガラスの接着を最大化するために使用することができますが、それはチップと組織の収集の分解を禁止します。 - マイクロチャネルの表面をPDMSデバイスと顕微鏡ガラスに30μLのDMEM/F12(1:40)の希釈基質膜マトリックスでコーティングし、チャネルの入口の片側に液滴を作り、入口の反対側からピペットまたは吸引ポンプで溶液を吸引する(図3A)。泡の汚染を避けるために溶液の過度の量を吸引しないでください。
- 次いで、PDMS装置を2次容器(例えば、ペトリ皿)に室温または4°Cで一晩で1時間インキュベートする。
7. 運動神経オルガノイド(MNO)形成
- コーティング溶液を、使用直前に20 ng/mLのBDNFを補充した成熟培地の150 μLをあらかじめ温めたものに交換してください。
- 次に、ステップ 5.2.9 または 5.3.13 の MNS を、ワイドボアチップ付きのマイクロピペットを使用してマイクロチャネルの入口に配置します。MNSは、重力によってデバイスの底部に自然に落ち着くことができます。MNSを注入する際に圧力をかけすぎないでください(図3B)。
注:MNSが組織培養チップの穴の側壁に貼り付いている場合は、入口の別の側から溶液をそっと吸引します。 - 小さなリザーバー(例えば、15 mLチューブのキャップ)に滅菌水を充填し、培地の蒸発を防ぐために、組織培養チップの近くに置きます。その後、5%CO2/37°Cインキュベーターに入れ。
- 培地変化の場合、培地貯留部の中心から排出された培養培地を吸引する(図3C)。すべての培地と組織を吸引しないでください。
- 新鮮な成熟培地(BDNF)をそっと加えます。培地は2〜3日ごとに変更する必要があります。培養中は、いつでも培養液を乾燥させないでください。軸索はMNSからチャネルに成長し、2〜3週間で自発的に単一のバンドルに組み立てられ、MNOの形成をもたらす。MNOは、デバイス内で1ヶ月以上培養することができます。
8. MNOの下流解析
- 全マウント免疫染色
- 装置または皿を化学発煙フードに持って来なさい。8%パラホルムアルデヒド(PFA)のほぼ等量を培地に添加してMNOを固定し、最終濃度の4%PFAを達成します。ガラスからPDMS装置を剥がし、室温で15〜20分間インキュベートします。
- PBSでMNOを洗い、PBS洗浄2倍を繰り返します。
- PBSでトリトンX-100の0.2%でMNOを透過させ、室温で5分間インキュベートします。
- PBSでMNOを洗い、PBS洗浄2倍を繰り返します。次いで、1%BSAを含むPBSでMNOをブロックし、室温で1時間インキュベートする。
- 0.1%BSAを含有するPBSの希薄な一次抗体と、一次抗体溶液を一晩4°CでインキュベートMNO。 Pbs で MNO を 3 回洗います。
- PBSで希釈された二次抗体は、0.1%BSAを有し、MNOを室温で2時間用の二次抗体溶液でインキュベートする。その後、PbsでMNOを3回洗います。
- 0.2%トリトン-Xを含むPBSのHoechstでMNOを染色し、室温で5分間インキュベートします。
- MNOをPBSで3回洗います。免疫染色されたMNOは、蛍光または共焦点レーザー顕微鏡でイメージングする準備ができています。
- 軸索束の組織採取と分離
- 10 cmのペトリ皿に10 mLのHBSS溶液を注ぎます。次に、PDMSデバイス全体をHBSSソリューションに浸します。
- 顕微鏡のガラスからPDMSを実体顕微鏡で慎重に取り外します。組織がPDMSデバイスに貼り付ける場合は、ピペットを使用して穴の上から1mLのHBSS溶液を静かに塗布します。
- PDMSから組織が外れたら、顕微鏡ガラスに1mLのHBSSを塗布して、顕微鏡ガラスからPDMSを完全に取り外します。
- 回転楕円体から軸索束を分離するには、顕微鏡下で外科用ナイフまたはツイーザーで軸索束を切断する。移行した細胞の汚染を避けるために、軸索束をスフェロイドから少し離れた場所(>1 mm)カットします。
- 分離した軸索束およびスフェロイドは、RT-PCR、RNA-seq、ウェスタンブロッティングなどの様々なダウンストリーム解析により、さらに解析することができます。
- PDMS カルチャ チップを再利用できます。培養チップを洗浄するには、蒸留水内の培養チップを15分間超音波処理します。その後、1%の洗剤を加えた蒸留水でチップを超音波処理します。蒸留水で培養チップを5回洗います。
- カルシウムイメージング
注:神経活動は、組織培養チップから組織を収集する前後のカルシウム指標(8.2から)で測定することができます。プロトコルは、特定の商用キットに基づいています ( 資料一覧を参照)。あるいは、他のカルシウムイメージングキットまたは同等の方法を使用することができます。- 3回のPBS(Ca2+とMg2+なし)でMNOを洗浄します。
- 記録媒体(20 mM HEPES、115 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.8 mM MgCl 2、1.8 mM、CaCl2、13.8mMグルコース)を37°Cで30〜60分間、Fluo-4AMの5μMでインキュベートします。 Pluronic F-127の0.01-0.02%を添加すると、フルー-4 AMの細胞への取り込みが助けになります。
- 次いで、(Ca2+とMg2+なし)で組織を洗浄し、記録媒体に交換します。
- GFP/Cy2フィルターセットを用いた蛍光顕微鏡を用いて、タイムラプス画像を取得します。フレームあたり 20 ミリ秒未満の露出時間を設定します。
- 取得したムービーファイルをイメージJを使用して画像シーケンスとして開きます。
- カラー CCD または CMOS カメラを使用している場合は、RGB 画像を 16 ビットモノ画像に変換します。開く "分析 | ツール|ROI マネージャ」 をクリックし、対象地域を描画し、[追加] をクリックします。[マルチメジャー] をクリックします。結果には、複数のROIの強度の平均が表示されます。
- 一般的なデータ解析ソフトウェアを使用して、信号強度の変化をプロットします。
- 多電極アレイによる神経活動の測定
メモ:運動ニューロンの活動は、多電極アレイ(MEA)によって捉えることができます。- MNOを作成した後、それを膜マトリックスに転写したMEAプローブに移します。電極上に組織を配置します。
- 200 μLの成熟培地を加え、37°Cで1-2 hをインキュベートして、MNOを表面に取り付けます。
- メディアを記録媒体(8.3.2)に交換してください。必要に応じて、MNO の上にメッシュと重量を配置して、電極との契約を増やします。
- MEAプローブを記録ヘッドステージに設定します。MEAプローブとヘッドステージの接触を70%エタノールで拭きます。
- MEAの製造業者の指示に従って、神経活動の記録を開始します。
Representative Results
運動ニューロンは、3D分化手順で12〜14日以内に分化した(図4および図5)。重要なことに、細胞の60%以上が分化中に運動ニューロンマーカーHB9を発現した。免疫細胞化学は、MNSの細胞の約80%がSMI32陽性運動ニューロンであることを明らかにした。HB9およびSMI32は、確立された初期段階の運動ニューロンマーカー15、16である。HB9およびSMI32の発現は、運動ニューロンの細胞の同一性を確保するために確認する必要がある重要なパラメータである。MNSを培養チップに導入した後、軸索はチャネルに伸び、軸索束が形成されます。物理ガイドとして機能するマイクロチャネルにより、軸索はMNSから伸び、アキソ軸索相互作用によってバンドルを形成する(図6A)。MNOの生成を確認するために顕微鏡観察によって軸索束の形成を確認することが不可欠である。成功したMNOは、50 μmより広い軸索バンドルを、チャネル内のバンドルから少数の孤立した軸索を負担します。軸索の初期伸びは、スフェロイドの導入後24時間で観察することができる。次の3〜4日以内に、軸索はマイクロチャネルの中心に達し、さらに10日以内にもう一方の端まで到達する(図6A)。その結果、軸索は、2〜3週間で一方向のまっすぐな束を組み立てて形成し、その後神経活動が観察された。
運動神経オルガノイドは、生体解析のために顕微鏡ガラスからPDMSを取り外すことによってチップから収集することができる(図6B)。軸索束および細胞体は、顕微鏡下で外科用ナイフまたはツイーザーを用いて切断することによって解剖および単離することができる(図6B)。RNAやタンパク質を含むこれらの生物学的材料は、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングなどの通常の生化学的アッセイに使用することができます。MNの軸索束では、核または樹状のメーカーのタンパク質はウェスタンブロッティングでは検出されない(図6C)。
カルシウムインジケーター(Fluo-4 AM)と組み合わせて、神経細胞活性を組織培養チップに捕捉することができる。MNO内では、回転楕円体および軸索束中の運動ニューロンの自発的な活動が観察された。また、多電極アレイシステムを用いて神経活動を観察した。
図1:PDMS組織培養チップの寸法。
(A)組織培養チップのフォトマスク。(B)組織培養チップ中のマイクロチャネルの寸法。運動ニューロンスフェロイドを保持するためのベースチャンバーの直径は2mmであり、チャンバー上のPDMSの穴は1.5mmである。マイクロチャネルブリッジ2室の幅と高さは、どちらも150 μmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:運動ニューロン分化の模式図。
(A)分化ステップには、神経誘導、運動ニューロン系統へのパターニング、および運動ニューロンの成熟が含まれる。(B) iPS細胞から運動ニューロンスフェロイド(MNS)を作成する2つのオプション:3Dプロトコルと、運動ニューロンの解離ステップを持つ2Dプロトコル。運動神経オルガノイド(MNO)は、両方のプロトコルによって得ることができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:基体膜マトリックスコーティングと運動ニューロン回転楕円体導入のためのステップバイステッププロトコル。
(A)組織培養チップのチャネルにおける基質膜マトリックスコーティング。(B)チップの穴に MNS を導入します。(C)培地を吸引して培地を吸引して培地を変化する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:2Dおよび3D運動ニューロン分化。
(A)代表的な3D MNS分化(3Dプロトコル)の時間経過。MNSのサイズは徐々に増加した。スケールバー:500 μm。(B) -D2、D0、D1、D6、D12 (2D プロトコル) での 2D 分化の時間経過。スケールバー:500 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:運動ニューロンの特性
(A)(左) SMI-32抗体とDAPIで染色されたMNSのクライオセクション。(中央)基部膜マトリックスコーティングされた表面上の再めっきされたMNSの位相コントラスト画像。軸索伸びが認められた。(右)シナプシンIおよびTuj1抗体で染色された再めっきMNSの軸索。スケールバー:500μm(左と中央)と50μm(右)。(B)TujおよびHB9抗体で免疫染色された2D運動ニューロンの代表的な画像。スケールバー:200 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:培養チップで発生する運動神経オルガノイド(MNO)の特性評価。
(A)D32上の軸索伸長と厚い軸索束形成の代表的な画像。スケールバー:500 μm。(B) SMI-32及びDAPIによる運動神経オルガノイド(MNO)の免疫染色軸索および細胞体は物理的に切断することによって隔離することができる。スケールバー:1mm(C)ウェスタンブロッティングによって定量された軸索および細胞体からのタンパク質の純度。樹状マーカーであるMAP2は軸索タンパク質では検出されなかったのに対し、軸索マーカーTau1は軸索タンパク質中に富化した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、ヒトiPS細胞から生成された運動ニューロンスフェロイドから伸長した軸索束を有する運動神経オルガノイド(MNO)の形成を記述する。形成された軸索束は厚く、適用範囲が広く、単方向構造でよく整理されている。軸索束を解剖することにより、生化学的分析のために高純度軸索タンパク質およびRNAを十分に得ることができる。ニューロン活性は、カルシウムイメージングを用いた軸索束およびスフェロイドで測定することができる。軸索リセート中の核タンパク質と樹状タンパク質の汚染は、ウェスタンブロッティングでは検出されず、我々の方法が効率的に軸索を細胞体と樹状突起から分離することを実証した。
このプロトコルの利点の1つは、3Dプロトコルで4週間、2Dプロトコルを使用して5-6週間ですべてのプロセスを行うことができる軸索バンドルを装備したMNOの急速な差別化と生成です。これは、通常、胚性幹細胞およびiPS細胞17 からMNに分化するのに3〜4週間かかる他のプロトコルと比較して短く、軸索伸長を得るのにさらに2〜4週間かかる。3D プロトコルは、2D プロトコルと比較して、分化時間が短く、手順が少なく、技術上のリスクが低減されるため、一般的に 2D プロトコルよりも好まれます。マイクロ流体ベースの組織培養チップは、MNSの軸索がマイクロチャネルを通じて他のコンパートメントに向かって伸びるように設計されており、アクソン間のアキソ軸索相互作用と親和性を誘発することによって軸索の束の形成を容易にする。単純な実験的なセットアップのために、ここで説明するすべてのプロトコルは、組織培養チップの操作に精通しているバイオエンジニアだけでなく、マイクロ流体および微細加工技術に精通していない生物学者や神経科学者によっても実行することができます。手順 1 および 2 は、外部ファブリケーション サービスを使用して実行することもできます。
プロトコルを実現するための重要な手順の 1 つに、培養メディアの順次変更があります。分化中の各工程で培養培地を完全に変更し、使用済み培地の因子がMN分化を妨げないようにすることが推奨される。このプロトコルのもう一つの重要なポイントは、未分化iPS細胞を良好な品質で維持することです。初期iPS細胞培養の品質は、運動ニューロンおよびMNOを得るための効率に大きく影響する。もう1つのポイントは、MNSの直径がチップの穴のサイズ(1.5mm)よりも小さくなるべきであるということです。より大きな回転楕円体はチャンバーに入ることができず、中央部に重度の低酸素壊死を経験する可能性がある。MNSのサイズは、iPS細胞の初期シード数(3Dプロトコル)または運動ニューロン(2Dプロトコル)を変更することで制御できます。細胞の播種密度は、各iPS細胞株に合わせて最適化する必要があります。
マイクログルーブと小さな細孔フィルターを備えた区画化されたマイクロ流体デバイスは、軸索を細胞体および樹状突起から分離するために広く使用されてきました。この技術はまた、細胞体および樹状突起から軸索を分離することができ、束ねられた組織の軸索の優れた豊富さ。他の方法と比較して、この方法の1つの大きな制限は、2つの異なる培地を必要とする2つの異なる細胞の共培養能力を妨げる組織培養チップの現在の設計において2つの異なる培養培地を分離できないことである。もう一つの制限は、PDMSチップが組織のサイズに所定の制限を置くということである。穴より大きい回転楕円体はチャンバに入ることができず、軸索束はマイクロ流体チャネルの幅よりも厚く成長することができません。
この方法は、他のタイプのニューロンに適用することができます。我々のグループは、大脳オルガノイド技術18と組み合わせた修飾法を用いて大脳管をモデル化する能力を示した。コルチカルスフェロイドは両方のコンパートメントに導入され、軸索は各スフェロイドに向かって往復的に伸び、その後自発的に形成された軸索束である。その結果、2つの皮質スフェロイドを軸索束を介して接続することができ、組織を一片として得ることができる。これは、このアプローチが神経細胞タイプに関係なく軸索束組織を形成する汎用性が高いということを示している。このプロトコルでは、ヒトiPS細胞を用いたが、ヒトES細胞およびヒト神経幹細胞を含む他の幹細胞は、提示されたプロトコルに対する改変とともに使用され得る。ニューロンの3Dスフェロイドは、多様なプロトコル19、20によって生成することができる。軸索束を用いて組織を作るこの方法は、将来的に3D MNスフェロイドを作るための他の分化プロトコルと組み合わせることができる。さらに、軸索バンドルの厚さと長さは、将来の発展のために組織培養チップのマイクロチャネルの幅と高さを単に変更することによって制御することができます。
このプロトコルは、薬物検査やスクリーニングに使用でき、軸索の発達と疾患の根底にあるメカニズムの理解に貢献できると考えています。
Disclosures
この議定書の一部として、川田二郎が設立したジクサック・バイオエンジニアリング社に特許が認可されている。
Acknowledgments
本研究は、日本科学振興会(JSPS)の科学研究助成金17H05661および18K19903、コア2コアプログラム、およびビヨンドAI研究所によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
| 6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
| Accutase | ICT | AT104 | |
| B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
| Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
| HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
| HBSS | Wako | 085-09355 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
| Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
| MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
| Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
| N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
| Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
| ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
| Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
| SAG | Sigma | SML1314 | |
| SB431542 | Wako | 192-16541 | |
| Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
| Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
| Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
| SU5402 | Sigma | SML0443 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
| TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
| Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
| Y-27632 | Wako | 030-24021 |
References
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