Summary
이 프로토콜은 조직 배양 칩에서 스페로이드에서 확장 된 축축의 강력한 번들의 자발적인 조립을 통해 인간 iPS 세포 유래 모터 신경 오르가노이드를 제조하는 포괄적 인 절차를 제공합니다.
Abstract
축삭의 매심은 신경계에서 관찰되는 주요 구조 적분 중 하나입니다. 축 하 매심의 중단 개발 및 신경 퇴행 성 질환을 일으킬 수 있습니다. 축축의 수많은 연구가 수행되었지만, 축축기의 형성과 기능 장애에 대한 우리의 이해는 여전히 강력한 3차원 체외 모델의 부족으로 인해 제한됩니다. 여기서, 우리는 미세유체계 조직 배양 칩에서 인간 유도만능 줄기(iPS) 세포로부터 모터 신경 오르가노이드(MNO)의 신속한 생성을 위한 단계별 프로토콜을 설명한다. 첫째, 방법에 사용되는 칩의 제조가 설명된다. 인간 iPS 세포로부터, 운동 신경 세포 (MNS)가 형성된다. 다음으로, 차별화된 MNS는 칩으로 전달된다. 그 후, 축삭은 자발적으로 스페로이드에서 자라서 칩에 장착된 마이크로채널 내의 근막으로 조립되어 스페로이드에서 확장된 축삭 뭉치를 운반하는 MNO 조직을 생성한다. 다운스트림 분석을 위해, MMO는 형태학적 분석을 위해 고정되거나 생화학 적 분석을 위해 해부될 칩에서 꺼내질 수 있을 뿐만 아니라 칼슘 이미징 및 다중 전극 어레이 기록을 위해 제거될 수 있다. 이 프로토콜로 생성된 MMO는 약물 검사 및 스크리닝을 용이하게 할 수 있으며 축축기 근막의 근본적인 발달 및 질병 메커니즘에 대한 이해에 기여할 수 있습니다.
Introduction
척추 운동 뉴런(MN)은 골격 근육에 축축을 확장하여 신체 움직임을 조절합니다. 그들의 축축궤적 궤적은 발달 과정에서 고도로 조직되고 규제됩니다. 축 사 확장 및 지침 에 많은 연구에도 불구 하 고1,조직 축 하 번 들 형성에 대 한 메커니즘은 여전히 조사. 운동 신경의 축삭은 종종 근위축성 측삭 경화증 (ALS)2와같은 신경 퇴행성 질환에 의해 손상되지만 축삭 파시클에 손상의 병리학 적 메커니즘은 제대로 이해되지 않습니다. 따라서, 축축 묶음 형성 및 회귀를 재구성하는 생리학적 및 병리학적 모델이 현장에서 요구된다.
인간 줄기세포 유래 모터뉴런은 ALS3과같은 발달 및 질병을 이해하기 위한 유망한 플랫폼이다. 인간 유도만능 줄기세포(iPS 세포)는 환자 유래 세포를 이용한 질병을 모델링하는 데 사용될 수 있다. 현재까지 만능 줄기세포로부터 MN으로의 다양한 분화 방법은4,5,6로보고되었다. 그러나, 2차원 배양에서 뉴런의 축축은 임의로 지향되며 축축이 조밀한 축축산 상호작용을 통해 단방향적으로 조립되는 신경 개발 내의 생체 내 미세환경에서 회수하지않는다. 이 문제점을 극복하기 위하여는, 인간 iPS 세포8에서운동 신경을 닮은 3차원 조직을 생성하는 기술을 개발하고, 모터 신경 오르가노이드(MNO)로 조직을 명명했습니다. MNO는 운동 뉴런 스페로이드(MNS)와 스페로이드에서 확장된 축삭 근막에 위치한 세포 체로 구성됩니다. 근막의 축삭은 단방향 지향적이며, 이는 운동 신경 개발의 축삭과 유사합니다. 따라서 MMO는 이전에 개발된 다른 뉴런 배양 방법에 의해 수행되지 않은 생리적 축축미세 환경을 독특하게 제공합니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 개발된 칩에 있는 조직 배양 칩 제조, 급속한 운동 신경 신경 분화 및 모터 신경 organoid 대형을 위한 방법을 기술합니다. 우리의 조직 배양 칩은 매우 간단하며, 그것은 단지 스페로이드를 수용하기위한 구획을 포함, 축축묶을 형성하기위한 마이크로 채널, 축축단을 하우징하기위한 구획. 이 장치는 종종 크기9,10에의해 축축과 세포 체를 분리하는 데 사용되는 마이크로 그루브 또는 마이크로 포어 필터를 포함한 복잡한 구조를 포함하지 않습니다. 따라서 포토리소그래피 설정을 사용할 수 있는 경우 이 프로토콜에 설명된 단계를 수행하여 장치를 쉽게 조작할 수 있습니다.
인간 iPS 세포의 신속한 분화는 유도 및 패터닝 인자(SB431542, LDN-193189, 망막산(RA), 그리고 매끄러운 고뇌스트(SAG) 및 가속 인자(SU5402 및 DAPT)의 최적화된 조합으로 달성된다. SU5402와 DAPT의 조합은 말초 뉴런과 신경 문장세포(11)의분화를 가속화하는 것으로 보고되었다. 이 프로토콜에서는 독자가 필요에 가장 적합한 방법을 결정할 수 있도록 MMO를 생성하는 세 가지 방법을 제공합니다. 분화된 MNS가 조직 배양 칩으로 직접 전달될 수 있기 때문에 스페로이드(3D 방법)를 형성한 후 인간 iPS 세포의 분화를 수행하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 인간 iPS 세포는 단층 (2D) 배양에서 모터 뉴런으로 분화한 다음 이전에 보고된 대로 3차원 운동 뉴런 스페로이드로 생성될 수있다 8. 우리는 프로토콜을 업데이트하고, 이 프로토콜에 설명된 3차원 분화 방법으로, 2D에서 3D로의 전환을 피할 수 있고 MMO는 짧은 분화 시간, 적은 단계 및 해리 단계 없이 기술적 위험을 감소시켰습니다. 시판되는 뉴런은 또한 분화의 시간을 줄이기 위해 MNS를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
MNO를 생성하기 위해, 우리는 조직 배양 칩에 MNS를 배양. 축축은 스페로이드에서 길게 게이트하고 축축이 모여 단방향으로 정렬되는 마이크로 채널로 확장됩니다. 이는 이러한 프로토콜에 의해 유일하게 달성되는 마이크로채널에서 축축물의 단단히 조립된 단방향 번들 조직의 축소 상호 작용 및 자발적인 형성을 용이하게 하는 반면, 자발적인 번들 형성 또는 유도축방향만으로는 다른프로토콜(12,13,14)에의해 달성될 수 있다. 일반적인 실험에서는, 몇몇 세포는 마이크로 채널로 스페로이드에서 밖으로 이동하고 대부분의 세포는 가까운 스페로이드를 유지합니다. 이 방법을 사용하면 축축을 세포 체에서 분리하기 위해 크기에 의존하는 물리적 장벽(예: 마이크로그루브 또는 마이크로포어 필터)을 사용하지 않고 스페로이드에서 자발적으로 분리할 수 있습니다.
결과 MNO는 형태학, 생화학 적 및 물리적 분석을 포함한 다양한 검사를 받을 수 있습니다. 세포 체및 확장축축묶음은 절단에 의해 물리적으로 분리될 수 있으며, 다운스트림 실험, 예를 들어 생화학적 분석 등을 위해 별도로 분석될 수 있다. RNA와 단백질을 포함하는 생물학 물질은 RT-PCR 및 서쪽 얼룩을 포함하여 정규 생화확적인 분석을 위한 단지 몇몇 축축 묶음에서 격리될 수 있습니다. 여기서는 축슨 파종의 기전과 질병을 연구하기 위한 매력적인 생리적 및 병리학적 모델을 제공하는 iPS 세포로부터 모터 신경 오르가노이드를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
1. PHOTOlithography에 의한 SU-8 금형 제작
참고: 이 절차는 유해 화학 물질을 포함합니다. 연기 후드와 PPE를 전체적으로 사용하십시오.
- 실리콘 웨이퍼 (직경 4 인치, 두께 1mm, 광택)를 아세톤으로 청소하고 질소 가스로 날려 버릴 수 있습니다. 그런 다음 180 °C에서 3 분 동안 구워 건조시.
- 세척 된 웨이퍼에 SU-8 2100의 3 mL을 분배합니다.
- 10s50rpm의 스핀 코터를 사용하여 웨이퍼에 SU-8을 균일하게 코팅한 다음, 300rpm/s의 가속로 30s에 대해 1500 rpm에서 순차적으로 회전하여 SU-8의 150 μm 두께층을 얻습니다.
참고: 실리콘 웨이퍼가 스핀 코터의 중앙에 위치하고 진공으로 올바르게 고정되어 있는지 확인합니다. - 핫 플레이트에 웨이퍼를 50°C에서 10분, 65°C에서 7분간, 95°C에서 45분간 부드럽게 구워줍니다.
- 포토마스크(도1)를마스크 정렬기로 설정하고 60s용 UV 라이트(365nm)를 노출한다.
참고: 노출 시간은 적절한 양의 UV 광에 의해 최적화되어야 합니다. - 노출 후 웨이퍼를 65°C에서 6분간, 95°C에서 뜨거운 플레이트에서 13분간 굽습니다.
- 궤도 셰이커를 사용하여 동요를 가진 SU-8 개발자에서 10-20 분 동안 웨이퍼를 개발하여 공정 중에 개발 솔루션을 한 번 변경합니다.
참고: SU-8의 잔해가 남아 있는 개발 시간을 연장합니다. - 웨이퍼를 이소프로파놀로 헹구고 질소 가스로 웨이퍼를 부드럽게 건조시다.
- 측정 현미경에 의해 증착 된 SU-8의 높이를 측정하고 약 150 μm 두께인지 확인하십시오. 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다.
2. PDMS 미세 유체 기반 조직 배양 칩 제조
- SU-8 증착 웨이퍼를 양면 테이프로 용기(예: 15cm 플라스틱 페트리 접시)에 고정합니다.
- 질소 가스를 사용하여 웨이퍼에서 먼지를 날려 버리면 됩니다.
- 실란화하려면 SU-8 증착 웨이퍼를 진공 챔버에 작은 용기(예: 35mm 접시)와 함께 넣습니다. 10 μL (트리데카플루오로-1,2,2-테트라하이드로옥틸)-1-트리클로로실란을 작은 용기에 넣습니다. SU-8 웨이퍼에 (tridecafluoro-1,2,2-테트라 하이드로옥틸)-1-트리클로로실란을 직접 적용하지 마십시오.
- 진공 챔버를 단단히 닫고 진공 펌프를 2시간 이상 켭니다.
- 플라스틱 컵을 가지고 실리콘 엘라스토머 (예를 들어, 실팟 184 또는 이와 동등한 실가드 184)와 경화제를 10:1 중량 비율로 붓습니다. 그런 다음, 거품이 완전히 제거 될 때까지 진공 챔버에서 주걱과 드가를 사용하여 잘 섞는다.
- 원하는 두께(3-4mm)에 SU-8 웨이퍼를 사용하여 PDMS 혼합물을 용기에 붓고 다시 기포를 제거합니다.
- PDMS를 완전히 치료하기 위해 적어도 3 시간 동안 60 °C에서 오븐에서 PDMS를 굽습니다.
- 냉각 후 메스 나 면도날을 사용하여 웨이퍼에서 경화 된 PDMS를 잘라냅니다.
- 조직 배양 칩의 두 챔버를 만들려면 1.5mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 두 개의 구획이 있는 두 개의 구멍을 펀치하십시오.
- 중간 저수지를 만들려면 다른 PDMS 혼합물(실리콘 엘라스토머 및 경화제)을 10:1 중량 비율로 준비하고 새로운 10cm 페트리 접시에 붓습니다. 쏟아지는 볼륨을 PDMS 두께5mm로 조정합니다.
- PDMS를 완전히 치료하기 위해 적어도 3 시간 동안 60 °C에서 오븐에서 PDMS를 굽습니다.
- PDMS를 냉각한 후 메스로 경화 된 PDMS를 잘라 직사각형 링을 얻습니다.
- 처리되지 않은 PDMS를 적용하고 조립된 PDMS 층을 굽음으로써 바닥층을 중간 저장소와 결합합니다. 이러한 결합 된 구조는 PDMS 조직 배양 칩을 초래한다.
- 표면에서 먼지와 작은 입자를 제거하기 위해 스카치 테이프에 의해 PDMS 조직 배양 칩을 청소합니다. PDMS 조직 배양 칩은 먼지와 자외선으로부터 보호하면 실온에서 보관할 수 있습니다.
3. 문화준비
- 배양 매체
참고: 아래에 나열된 모든 미디어는 별도로 명시되지 않는 한 멸균을 위해 필터링해야 합니다. 제조된 매체는 4°C에 저장되어 한 달 이내에 사용될 수 있다.- mTeSR 플러스 매체를 준비하려면: 100mL mTeSR 플러스 5x 보충제 1병과 mTeSR 플러스 기저형 400mL 1병을 결합합니다.
- KSR 배지 100mL 준비: DMEM/F12 85mL에서 녹아웃 세럼 교체(KSR, 15%), 상업용 글루타민 보충제 1mL(1%) 및 비필수 아미노산의 1 mL (NEAA, 1 %).
- N2 배지 의 100 mL을 준비하려면 : 신경 배지의 100 mL에서, N2 (100x), 상업 글루타민 보충제의 1 mL, NEAA의 1 mL을 추가합니다.
- 성숙 배지 250mL를 준비하기: 신경병대 배지 250mL에서 B27(2%), 상업용 글루타민 보충제 2.5mL(1%), 페니실린/스트렙토마이신 2.5mL(1%)를 추가한다.
- 화합물(retinoic acid (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632)를 세포 배양 등급 DMSO에서 원하는 농도로 재차 중단한다. 알리쿼트준비하여 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 다음 재고 솔루션은 1mM RA, 10mM M M SB431542, 100 μM LDN-193189, 10mM SU5402, 10mM DAPT, 1mM SAG, 10mM Y-27632를 사용한다.
- 코팅
참고: 열에 의한 지하 막 매트릭스의 중합을 방지하기 위해 반복적인 동결 해동 주기를 피하십시오. 가능한 경우 미리 냉각된 파이펫 팁과 튜브로 모든 코팅 절차를 처리합니다. 지하 멤브레인 매트릭스는 4 °C에서 하룻밤 동안 해동되어야하며 미리 차가운 파이펫 팁과 튜브를 사용하여 알리 인용해야합니다. 알리쿼트는 -20°C 또는 -80°C에서 동결될 수 있다.- 얼음 에 4 ° C에서 냉동 알리쿼트해동. aliquot는 코팅 절차 중에 차갑게 유지되어야합니다. 미리 냉각된 파이펫 팁을 사용하여 지하 멤브레인 매트릭스를 1:40의 비율로 얼음냉DMEM/F12로 희석시킵니다. 사용하지 않은 희석 된 지하 멤브레인 매트릭스는 중합이 발생하지 않는다는 점을 감안할 때 2-3 일 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
- 지하 멤브레인 매트릭스/DMEM-F12 용액 1mL을 추가하여 6웰 플레이트 중 1개를 코팅합니다.
- 플레이트를 실온에서 최소 한 시간 또는 하룻밤 동안 4°C로 배양합니다. 코팅 된 플레이트는 최대 1 주일 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
4. iPS 셀의 유지 보수
참고: 미분화 iPS 세포는 mTeSR Plus 배지및 하위 배양으로 유지되며, 이 프로토콜에서 6웰 플레이트에서 ≥ 90%의 합류가 관찰될 때 하위 배양된다. 다른 배지에서 배양된 iPS 세포에 대해 경미한 조정이 필요할 수 있다.
- 앞서 언급한 바와 같이 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 요리를 준비3.2.
- 완전히 mTeSR 플러스 매체를 흡인. PBS로 한 번 잘 씻고 0.5 mL의 페이징 시약을 추가하십시오 (재료 표참조). 몇 초 동안 기다렸다가 솔루션을 흡인합니다.
- 플레이트를 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 또는 세포가 둥글게 될 때까지 배양합니다.
참고: 잠복기 시간은 다른 iPS 세포주와 합류 사이에 다를 수 있습니다. 잠복기 중 해리 시간을 결정하기 위해 현미경으로 주기적으로 확인하십시오. - mTeSR Plus 배지 1mL을 추가하고 30-60 s의 플레이트를 탭하여 식민지를 분리합니다.
- 셀 서스펜션 용액 1mL을 7mL의 신선한 mTeSR 플러스 배지와 부드럽게 혼합합니다. 5 회 이상 파이펫하지 마십시오.
- 1:8의 비율로 플레이트. 일반적으로 4.5단계에서 서스펜션 1mL을 추가하고 Y-27632(ROCK 억제제)의 5-10 μM으로 보충된 mTeSR 플러스 미디어 1mL을 추가합니다. 통로 희석 비는 iPSC 선에 따라 다릅니다.
- 셀을 5% CO2/37°C 인큐베이터에 배치합니다. 다음 날, 신선한 mTeSR 플러스 매체를 추가하여 Y-27632를 제거하십시오. 그 후, 세포가 더 높은 합류에 도달함에 따라 매일 미디어를 변경합니다.
5. 운동 뉴런으로 iPS 세포의 분화
참고: 아래의 모든 옵션(5.2, 5.3 및 5.4)은 > 90%의 효율을 갖춘 MMO를 생산합니다.
- 모터 뉴런 분화를 위한 통과 iPSC
참고: 차별화는 3D(5.2) 또는 2D(5.3) 프로토콜에서 성공적으로 수행될 수 있습니다.- 미분화 된 iPS 세포가 6 웰 플레이트에서 mTeSR 플러스 배지에서 약 80 %의 합류에 도달 할 때까지 성장하도록 허용합니다.
- 매체를 완전히 흡인합니다. 멸균 PBS로 즉시 우물을 씻고 세포에 세포 해리 용액 0.5 mL을 추가하십시오.
- 약 2-3 분 동안 인큐베이터에서 37 °C에서 플레이트를 배양하거나 세포가 분리되고 둥글게 될 때까지 웰에 부착된 상태로 유지됩니다.
- 5mL 세로지피펫을 사용하여 중간 1mL을 넣고 몇 번 위아래로 부드럽게 파이펫을 넣습니다. 세포 현탁액을 배지의 4mL로 구성된 15mL 튜브로 이송한다.
- 원심 분리기 200 x g에서 3 분 동안.
- 조심스럽게 슈퍼나탄을 흡인시키고, 펠릿을 방해받지 않고 남기고, Y-27632의 10μM로 보충된 배지의 1mL에서 세포를 재연한다.
- 혈종계를 사용하여 세포를 계산하고 5.2 (3D 분화) 또는 5.3 (2D 분화)으로 진행합니다.
- 3D 분화에서 운동 신경 스페로이드 (MNS)의 형성 ("3D 프로토콜")
참고: 완전한 중간 변화는 분화일 0-12일(그림2)부터매일 이루어집니다.- iPS 세포를 단계 5.1.7에서 96개의 U 바닥 플레이트까지 40,000μL/웰에 심은 mTeSR Plus의 100 μM으로 Y-27632의 10μM를 보충하였다.
- 다음 날, 신선한 매체의 100 μL로 각각을 잘 교체하십시오.
- 0일과 1일: 배양 배지를 흡인하고 10μM SB431542 및 100 nM LDN-193189로 보충된 KSR 배지(3.1.2)의 100 μL로 대체한다.
- 2일과 3일: 배양 배지를 흡기하고 10μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA 및 1 μM RA 및 1 μM SAG로 보충된 KSR 배지의 100 μL로 대체한다.
- 4일과 5일: KSR 배지 75%, N2 배지 25%(3.1.3)로 구성된 혼합 배지를 준비한다. 이어서, 배양 배지를 흡인하고 10μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA 및 1 μM SAG로 보충된 혼합 배지의 100 μL로 대체한다.
- 6일과 7일: KSR 배지 50% 및 N2 배지 50%로 구성된 혼합 배지를 준비한다. 이어서, 흡류 배양 배지는 5μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM 망막산 및 1 μM SAG로 보충된 혼합 매체의 100 μL로 대체한다.
- 8일과 9일: KSR 배지 25%, N2 배지 75%로 구성된 혼합 배지를 준비한다. 이어서, 흡류 배양 배지는 5μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA 및 1 μM SAG로 보충된 혼합 배지100 μL로 대체한다.
- 10일과 11일: 배지를 5μM DAPT, 5μM SU5402, 1 μM RA 및 1 μM SAG로 보충한 N2 배지 100 μl으로 교체하십시오.
- 12일: NS를 조직 배양 칩(6단계)으로 옮기거나 배지를 성숙배지(3.1.4)의 100μL로 교체하여 20ng/mL 뇌 유래 신경영양인자(BDNF)로 보충한다.
참고: MNS는 12일부터 19일까지 조직 배양 칩으로 전송할 수 있습니다. 전송되지 않은 스페로이드는 전달 될 때까지 20 ng / mL BDNF로 보충 성숙 배지에서 96 잘 U 바닥 플레이트에서 배양해야합니다.
- (대체 옵션) 2D 분화 및 3D MNS로의 전환("2D 프로토콜")
- 코팅용액을 미리 코팅된 12웰 플레이트에서 흡인합니다.
- Y-27632의 10 μM을 가진 mTeSR 플러스 배지에서 웰당 100,000 ~ 200,000개의 세포의 밀도로 단계 5.1.7에서 iPS 세포를 시드한다.
참고: 세포가 다음 단계(5.3.3)에 너무 희박한 경우 세포가 80%에 도달할 때까지 Y-27632 없이 mTeSR Plus 배지에서 미분화 된 iPS 세포를 계속 배양합니다. - 0일과 1일: 흡인 배양 배지는 10μM SB431542 및 100 nM LDN-193189로 보충된 KSR 배지(3.1.2)의 1mL로 대체한다.
- 2일과 3일: 흡류 배양 배지는 10μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA 및 1 μM SAG로 보충된 KSR 배지 1mL로 대체한다.
- 4일과 5일: KSR 배지 75%, N2 배지 25%(3.1.3)로 구성된 혼합 배지를 준비한다. 흡류 배양 배지는 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA 및 1 μM SAG로 보충된 혼합 배지 1mL로 대체한다.
- 6일과 7일: KSR 배지 50% 및 N2 배지 50%로 구성된 혼합 배지를 준비한다. 배양 배지를 흡인하고 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM 망막산 및 1 μM SAG로 보충된 혼합 배지 1mL로 대체하십시오.
- 8일과 9일: KSR 배지 25%, N2 배지 75%로 구성된 혼합 배지를 준비한다. 배양 배지를 흡인하고 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA 및 1 μM SAG로 보충된 혼합 배지의 1mL로 대체한다.
- 10일과 11일: 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA 및 1 μM SAG로 보충된 N2 배지 1mL로 배지를 교체하십시오.
- 12일: 분화 매체를 흡기하고, PBS로 한 번 빠르게 씻어내고, 세포 분리 배지의 0.5mL를 추가한다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 1-3분(예: 트립플 익스프레스를 사용하는 경우) 또는 20-30분(예: Accutase를 사용하는 경우)에 놓습니다.
- P1000 파이펫을 사용하여 세포를 부드럽게 수집하고 신선한 성숙 배지와 원심분리기를 3분 동안 200 x g로 15mL 원원형 튜브로 이송합니다. 세포가 덩어리인 경우 몇 번 위아래로 부드럽게 파이펫을 만듭니다. 이 세포에 손상을 일으킬 수 있으므로 너무 많이 파이펫하지 마십시오.
- 20 ng/mL BDNF로 보충된 성숙 배지(3.1.4)의 1mL에서 수퍼내를 흡습하고 펠릿을 재연한다.
- 혈전계를 사용하여 셀을 계산합니다. BDNF의 20 ng/ml로 보충된 성숙 배지에서 96개의 U 바닥 플레이트에서 잘 당 10,000-40,000개의 세포에 세포를 플레이트. 초기 파종 밀도는 조직 배양 칩에 도입될 때 스페로이드의 직경이 800-900 μm이 되도록 iPS 세포주 및 세포의 상태에 따라 최적화되어야 한다. 대부분의 경우 처음에는 잘 당 20,000 개의 세포에서 시작한 다음 크기에 따라 세포 수를 늘리거나 줄입니다.
- 세포가 매끄러운 가장자리를 가진 스페로이드를 형성 할 때까지 추가 3-10 일 동안 배양.
- (대체 옵션): 모터 뉴런에서 MNS 형성
참고: 상업적으로 이용 가능한 인간 iPS 세포 유래 모터 뉴런(재료표참조)은 인간 iPS 세포로부터 분화하는 대신 MMO를 생성하는 데 사용될 수 있다.- 모터 뉴런의 극저온을 해동한 후, 모터 뉴런 배지의 9mL로 세포를 신속하게 재보중단시합니다. 실온에서 5분 동안 400 x g로 회전하십시오.
- 슈퍼나티를 흡인하고 운동 뉴런 배지로 펠릿을 재차 놓습니다.
- 위와 같은 단계를 따르십시오(5.3.12- 5.3.13) MNS를 생성합니다.
6. 모터 신경 오르가노이드 (MNO) 형성을위한 조직 배양 칩의 준비
- 페트리 접시에 70% 에탄올에 1시간 이상 담그어 준비된 PDMS(2.13단계로부터)를 살균한다.
참고: 다음단계는 모두 생물안전 캐비닛에서 조작해야 합니다. - 페트리 접시에 70% 에탄올에 담그어 현미경 유리(76 x 52mm)를 살균합니다.
- 현미경 유리의 건조 과정에서, 반 젖은 현미경 유리에 PDMS 장치를 놓고 밤새 기다려서 완전히 건조하게하십시오. 완전히 건조되면 PDMS 장치는 유리를 부착해야합니다.
참고: 이 결합은 조직 수집을 위한 배양 후에 현미경 유리에서 PDMS 장치의 분리를 허용하는 영구적이지 않습니다. 산소 플라즈마에 의한 영구 결합은 PDMS와 유리 사이의 접착력을 최대화하는 데 사용될 수 있지만 칩 및 조직 수집의 분해를 금지합니다. - 채널 입구의 한쪽에 액수를 만든 다음 피펫 또는 흡입펌프(도 3A)로입구의 반대편에서 액액을 흡인시킴으로써 DMEM/F12(1:40)에서 희석된 지하 멤브레인 매트릭스의 30μL로 PDMS 장치 및 현미경 유리의 마이크로채널 표면을 코팅한다. 거품 오염을 피하기 위해 너무 많은 양의 용액을 흡입하지 마십시오.
- 이어서, PDMS 장치를 실온에서 1시간 동안 또는 이차 용기(예: 페트리 접시)에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
7. 모터 신경 오르가노이드 (MNO) 형성
- 코팅 용액을 사용하기 직전에 BDNF의 20 ng/mL로 보충된 성숙 매체의 150 μL로 코팅 용액을 교체하십시오.
- 이어서, MNS를 5.2.9 또는 5.3.13 단계로부터 넓은 보어 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 마이크로채널의 입구에 배치한다. MNS는 중력에 의해 장치의 하단에 자발적으로 정착 할 수 있습니다. MNS(도3B)를주입할 때 너무 많은 압력을 가하지 마십시오.
참고: MNS가 조직 배양 칩의 구멍 의 측벽에 붙어 있는 경우 입구의 다른 쪽에서 용액을 부드럽게 흡인합니다. - 멸균수로 작은 저수지(예: 15mL 튜브의 캡)를 채우고 중간 증발을 방지하기 위해 이차 용기에 조직 배양 칩을 가까이 배치한다. 그런 다음 5% CO2/37°C 인큐베이터에 놓습니다.
- 중간 변화를 위해, 중간 저수지의 중심으로부터 지친 배양 배지를 흡인(도3C). 모든 매체와 조직을 흡인하지 마십시오.
- 신선한 성숙 매체를 부드럽게 추가합니다(BDNF). 배지는 2-3일마다 변경되어야 합니다. 배양 시 언제든지 배양 배지를 건조하지 마십시오. 축축은 MNS에서 채널로 성장하고 자발적으로 2-3 주에 단일 번들로 조립, MNO의 형성의 결과. MNO는 장치에서 1개월 이상 배양할 수 있다.
8. MNO의 다운스트림 분석
- 전산 면역염색
- 장치 나 접시를 화학 연기 후드에 가져옵니다. 4%의 PFA의 최종 농도를 달성하기 위해 미디어에 8% 파라포름알데히드(PFA)의 약 동일한 부피를 추가하여 MNO를 수정합니다. 유리에서 PDMS 장치를 벗기고 실온에서 15-20 분 동안 배양하십시오.
- PBS로 MNO를 세척한 다음 PBS 세척을 2배 반복합니다.
- PBS에서 트리톤 X-100의 0.2%로 MNO를 퍼메아빌레화하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- PBS로 MNO를 세척한 다음 PBS 세척을 2배 반복합니다. 그런 다음 1% BSA를 포함하는 PBS로 MNO를 차단하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- PBS에서 0.1% BSA를 함유한 1차 항체를 희석시키고 4°C에서 하룻밤 사이에 1차 항체 용액으로 MNO를 배양한다. PBS로 MNO를 세 번 세척합니다.
- PBS에서 이차 항체를 0.1% BSA로 희석하고 실온에서 2시간 동안 이차 항체 용액으로 MNO를 배양한다. 그런 다음 PBS로 MNO를 세 번 씻으시면 됩니다.
- 0.2% 트리톤-X를 함유한 PBS의 Hoechst와 MNO를 염색하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- PBS로 MNO를 세 번 씻으시면 됩니다. 면역 염색된 MNO는 형광 또는 공초점 레이저 현미경으로 이미징을 위한 준비가 되어 있습니다.
- 축축물의 조직 수집 및 격리
- 10cm 페트리 접시에 HBSS 용액 10mL를 붓습니다. 그런 다음 전체 PDMS 장치를 HBSS 솔루션에 침지합니다.
- 스테레오 현미경의 밑에 현미경 유리에서 PDMS를 주의 깊게 분리합니다. 조직이 PDMS 장치에 달라붙으면 파이펫을 사용하여 구멍 상단에서 HBSS 용액 1mL을 부드럽게 적용합니다.
- 조직이 PDMS에서 나오면 현미경 유리에 HBSS 1 mL을 부드럽게 적용하여 현미경 유리에서 PDMS를 완전히 분리하십시오.
- 축 축 을 스페로이드에서 분리하려면, 현미경에서 수술 칼이나 트위저와 축축 묶음 번들을 잘라. 이동 된 세포의 오염을 방지하기 위해 스페로이드에서 약간 멀리 (> 1mm)에서 축축을 잘라.
- 절연 축축물 번들 및 스페로이드는 RT-PCR, RNA-seq 및 서부 블로팅과 같은 다양한 다운스트림 분석에 의해 추가로 분석될 수 있다.
- PDMS 배양 칩을 재사용할 수 있습니다. 배양 칩을 청소하려면 증류수 내에서 배양 칩을 15분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 1 % 세제로 보충 된 증류수로 칩을 초음파 처리합니다. 증류수로 배양 칩을 5번 세척합니다.
- 칼슘 이미징
참고: 신경 활동은 조직 배양 칩에서 조직 수집 전후(8.2에서)의 칼슘 지표로 측정할 수 있다. 프로토콜은 특정 상용 키트를 기반으로 합니다(재료 표참조). 대안적으로, 그밖 칼슘 화상 진찰 키트 또는 동등한 방법을 이용할 수 있습니다.- PBS(Ca2+ 및 Mg2+제외)로 MNO를 세 번 세척합니다.
- 37°C에서 30-60분 동안 기록 매체(20mM HEPES, 115mM NaCl, 5.4mM KCl, 0.8m MgCl2,1.8mMMM, CaCl2,13.8mMMM 포도당)에서 플루오-4AM 5 μM의 조직을 배양한다. 플루론 F-127의 0.01-0.02%를 첨가하면 플루오-4 AM을 세포로 섭취하는 데 도움이 될 수 있다.
- 그런 다음, PBS (Ca2 + 및 Mg2 +없이)로 조직을 세척하고 기록 매체로 대체하십시오.
- GFP/Cy2 필터 세트로 형광 현미경 검사를 사용하여 시간 경과 이미지를 획득합니다. 프레임당 노출 시간을 20ms 미만으로 설정합니다.
- 이미지 J를 사용하여 획득된 동영상 파일을 이미지 시퀀스로 엽니다.
- 색상 CCD 또는 CMOS 카메라를 사용하는 경우 RGB 이미지를 16비트 모노 이미지로 변환합니다. "|분석" 도구 | ROI 관리자",관심 영역을 그리며"추가"를 클릭합니다. "멀티측정"을클릭합니다. 여러 ROI의 강도 평균은 결과에 표시됩니다.
- 일반 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 신호 강도의 변화를 플롯합니다.
- 다중 전극 배열에 의한 뉴런 활성 측정
참고: 모터 뉴런의 활성은 다중 전극 어레이(MEA)에 의해 포착될 수 있다.- MNO를 만든 후, 지하 막 매트릭스 코팅 MEA 프로브에 전송. 전극에 조직을 배치합니다.
- 성숙 배지의 200 μL을 추가하고 MNO가 표면에 부착 할 수 있도록 37 ° C에서 1-2 h를 배양합니다.
- 매체를 기록 매체(8.3.2)로 바꿉니다. 선택적으로 전극과의 계약을 높이기 위해 MNO 위에 메쉬와 무게를 배치합니다.
- MEA 프로브를 레코딩 헤드 스테이지로 설정합니다. MEA 프로브와 헤드 스테이지 사이의 접촉을 70%에탄올로 닦아냅니다.
- MEA의 제조 업체의 지시에 따라 신경 활동을 기록 시작.
Representative Results
운동 뉴런은 3D 분화절차(도 4 및 도 5)에서12-14일 이내에 분화되었다. 중요한 것은, 세포의 60% 이상이 분화 중에 모터 뉴런 마커 HB9를 발현하였다. 면역히스토케는 MNS내 세포의 약 80%가 SMI32 양성 운동 뉴런이었다는 것을 밝혔다. HB9 및 SMI32는 확립된 초기 단계 모터 뉴런마커(15,16)이다. HB9 및 SMI32의 발현은 모터 뉴런의 세포 정체성을 보장하기 위해 확인되어야 하는 주요 매개 변수입니다. MNS를 배양 칩에 도입한 후 축축은 채널로 확장되고 축축묶음이 형성됩니다. 물리적 가이드역할을 하는 마이크로채널로 인해 축축은 MNS로부터 길게 문어축되어 축산작용(그림6A)에의해 번들을 형성한다. MNO의 생성을 확인하기 위해서는 현미경 관찰에 의해 축축 묶음의 형성을 확인하는 것이 필수적이다. 성공적인 MNO는 50 μm보다 넓은 축축 묶음과 채널의 번들에서 분리된 축록새가 거의 없습니다. 축축의 초기 신장은 스페로이드의 도입 후 24시간 후에 관찰될 수 있다. 다음 3-4 일 이내에 축축은 마이크로 채널의 중앙에 도달한 다음 추가 10 일 이내에 다른 쪽 끝에 도달합니다(그림 6A). 결과적으로, 축축은 칩에서 2-3주 만에 직선 및 단방향 번들을 조립하고 형성했으며, 그 후 뉴런 활동이 관찰되었다.
모터 신경 오르가노이드는 생물학적 분석을 위해 현미경 유리로부터 PDMS를 분리하여 칩으로부터 수집될 수있다(도 6B). 축삭 번들 및 세포 체는현미경(도 6B)하에서수술용 칼 또는 트위저를 사용하여 절단하여 해부및 격리될 수 있다. RNA와 단백질을 포함하는 이 생물학 물질은 RT-PCR 및 서쪽 블로팅과 같은 일반적인 생화확적인 소사에 사용될 수 있습니다. MNOs의 축축번에서 핵 또는 수지상 제조 자 단백질은 서부 블로팅(도 6C)에서검출되지 않습니다.
칼슘 표시기(Fluo-4AM)와 함께 신경 활성을 조직 배양 칩에 포획할 수 있다. 스페로이드 및 축축전의 모터 뉴런의 자발적인 활성은 MNO 내에서 관찰되었다. 또한, 신경 활동은 다중 전극 어레이 시스템을 사용하여 관찰되었다.
그림 1: PDMS 조직 배양 칩의 치수.
(A)조직 배양 칩의 포토마스크. (B)조직 배양 칩내 마이크로채널의 치수. 모터 뉴런 스페로이드를 유지하기위한 베이스 챔버의 직경은 2mm이고 챔버 위의 PDMS의 구멍은 1.5 mm입니다. 두 챔버를 연결하는 마이크로 채널의 폭과 높이는 모두 150 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 운동 뉴런 분화의 회로도 그림.
(A)분화 단계는 신경 유도, 운동 신경 혈통으로 패터닝 및 운동 뉴런의 성숙을 포함했다. (B)iPS 세포로부터 운동 뉴런 스페로이드(MNS)를 생성하는 두 가지 옵션: 3D 프로토콜, 및 모터 뉴런의 해리 단계를 가진 2D 프로토콜. 모터 신경 오르가노이드 (MNO)는 두 프로토콜에 의해 얻을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 지하 막 매트릭스 코팅 및 모터 뉴런 스페로이드 도입을 위한 단계별 프로토콜.
(A)조직 배양 칩의 채널에서 지하 막 매트릭스 코팅. (B)MNS가 칩의 구멍에 도입. (C)지친 매체의 포부에 의한 배양 배지 변화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 2D 및 3D 모터 뉴런 분화.
(A)대표 3D MNS 분화(3D 프로토콜)의 시간 과정. MNS의 크기는 시간이 지남에 따라 점차 증가했습니다. 스케일 바: 500 μm. (B) -D2, D0, D1, D6, D12(2D 프로토콜)에 2D 분화의 시간 과정. 스케일 바: 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 운동 뉴런의 특성화.
(A)(왼쪽) SMI-32 항체 및 DAPI로 염색된 MNS의 저온절. (중간) 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 표면에 보충된 MNS의 위상 대비 이미지입니다. 축 하 신장 관찰 되었다. (오른쪽) Synapsin I와 Tuj1 항체로 염색된 MNS의 축축. 스케일 바: 500 μm(왼쪽 및 중간) 및 50μm(오른쪽). (B)Tuj 및 HB9 항체로 면역염색된 2D 모터 뉴런의 대표적인 이미지. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 배양 칩에서 생성된 모터 신경 오르가노이드(MNO)의 특성화.
(A)D32에 축축및 두꺼운 축축 묶음 형성의 대표적인 이미지. 스케일 바: 500 μm. (B)SMI-32 및 DAPI에 의한 모터 신경 오르가노이드(MNO)의 면역염색. 축삭과 세포 체는 물리적으로 절단에 의해 격리될 수 있습니다. 스케일 바: 1mm.(C)축축및 세포 체로부터 단백질의 순도는 서양 블로팅에 의해 정량화된다. MAP2, 수지상 마커, 축 산 단백질에서 검출 되지 않은 반면, 축 산 마커 Tau1 축 산 단백질에 농축. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 인간 iPS 세포에서 생성된 운동 신경 스페로이드에서 확장된 축축이 있는 운동 신경 오르가노이드(MNO)의 형성을 설명합니다. 형성된 축축 묶음은 두껍고 유연하며 단방향 구조로 잘 구성됩니다. 축축묶음, 고순도 축산 단백질 및 RNA를 해부함으로써 생화학적 분석을 위해 충분히 얻을 수 있다. 신경 활동은 칼슘 화상 진찰을 가진 축산 번들 및 스페로이드에서 측정될 수 있습니다. 축 사 리자트에서 핵 및 수지상 단백질의 오염은 서양 블로팅에 의해 검출되지 않았으며, 우리의 방법은 차체및 원원에서 축축을 효율적으로 분리했다는 것을 보여줍니다.
이 프로토콜의 장점 중 하나는 모든 프로세스가 3D 프로토콜을 사용하여 4주 및 2D 프로토콜을 사용하여 5-6주 안에 수행될 수 있는 축축산 번들을 갖춘 MNO의 급속한 분화 및 생성입니다. 이것은 전형적으로 배아 줄기 세포 및 iPS 세포17에서 MN으로 분화하기 위하여 전형적으로 3-4 주가 걸리는 그밖 프로토콜에 비하여 짧고 축선 신장을 얻기 위하여 추가 2-4 주가 걸립니다. 3D 프로토콜은 일반적으로 2D 프로토콜에 비해 해리 단계 없이 분화 시간이 짧고 단계 수가 적고 기술 적 위험이 감소하기 때문에 2D 프로토콜보다 선호됩니다. 미세 유체 기반 조직 배양 칩은 MNS의 축축이 축축의 축축한 상호 작용과 축축 사이의 친화성을 유도하여 축축의 번들의 형성을 용이하게 마이크로 채널을 통해 다른 구획쪽으로 길게 할 수 있도록 방식으로 설계되었습니다. 간단한 실험 설정 으로 인해 여기에 설명 된 모든 프로토콜은 조직 배양 칩의 조작에 익숙한 생물 공학자뿐만 아니라 미세 유체 및 미세 제조 기술에 익숙하지 않은 생물학자 및 신경 과학자에 의해 수행 될 수 있습니다. 외부 제작 서비스를 사용하여 1단계와 2단계도 수행할 수 있습니다.
프로토콜을 수행하는 중요한 단계 중 하나는 배양 매체의 순차적 변화입니다. 소비된 매체의 요인이 MN 분화를 방해하지 않도록 분화 중에 각 단계에서 배양 배지를 완전히 변경하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 점은 미분화 된 iPS 세포를 좋은 품질로 유지하는 것입니다. 초기 iPS 세포 배양의 품질은 모터 뉴런 및 MNO를 얻기 위한 효율성에 크게 영향을 미칩니다. 또 다른 요점은 MNS의 직경이 칩 구멍의 크기(1.5mm)보다 작아야 한다는 것입니다. 더 큰 스페로이드는 챔버를 입력할 수 없으며 잠재적으로 중앙 부분에 심각한 저산소 괴사를 경험할 수 있습니다. MNS의 크기는 iPS 세포의 초기 시드 수(3D 프로토콜) 또는 모터 뉴런(2D 프로토콜)을 변경하여 제어될 수 있다. 세포의 파종 밀도는 각 iPS 세포주에 대해 최적화되어야 합니다.
마이크로그루브와 작은 모공 필터를 갖춘 구획화된 미세 유체 장치는 축축을 세포 몸과 모데라이트로부터 분리하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이 기술은 또한 묶인 조직에 있는 축축의 우수한 풍부와 세포 바디 및 점원에서 축축을 분리할 수 있습니다. 다른 방법에 비해, 이 방법의 한 가지 주요 한계는 두 개의 별개의 배지를 필요로 하는 두 개의 상이한 세포의 공동 배양 능력을 방해하는 조직 배양 칩의 현재 설계에서 두 개의 상이한 배양 배지를 분리할 수 없다는 것입니다. 또 다른 제한은 PDMS 칩이 조직의 크기에 미리 정해진 제한을 두었다는 것입니다. 구멍보다 큰 스페로이드는 챔버에 들어갈 수 없으며 축축산 번들은 미세 유체 채널의 너비보다 두껍게 자랄 수 없습니다.
이 방법은 다른 유형의 뉴런에 적용할 수 있습니다. 우리 그룹은 대뇌 오르가노이드 기술(18)과결합 된 수정 된 방법을 사용하여 대뇌관을 모델링 할 수있는 능력을 보여 주었다. 피질 스페로이드는 각 구획과 축축에 자발적으로 각 스페로이드쪽으로 회기길, 그리고 그 후에 자발적으로 형성된 축축물 번들로 도입되었다. 그 결과, 2개의 피질 구엽은 축축물 번들을 통해 연결될 수 있고, 조직은 1장으로 얻어질 수 있었다. 이것은 접근이 신경 세포 모형에 관계없이 축축 묶음 조직을 형성하는 것이 매우 다재다능하다는 것을 보여줍니다. 본 프로토콜에서, 인간 iPS 세포는 사용되었지만, 인간 적인 ES 세포 및 인간 신경 줄기 세포를 포함하는 다른 줄기 세포는 제시된 프로토콜에 대한 수정과 함께 사용될 수 있다. 뉴런의 3D 스페로이드는 다양한프로토콜(19,20)에의해 생성될 수 있다. 축축물 번들로 조직을 만드는 이 방법은 3D MN 스페로이드를 만들기 위한 다른 분화 프로토콜과 미래에 잠재적으로 결합될 수 있다. 또한, 축축 묶음의 두께와 길이는 단순히 향후 개발을 위해 조직 배양 칩의 마이크로 채널의 폭과 높이를 변경하여 제어될 수 있다.
우리는 이 프로토콜이 약물 검사 및 검열에 사용될 수 있고 축축근의 발달 그리고 질병의 근본적인 기계장치의 이해에 기여할 수 있다고 믿습니다.
Disclosures
이 프로토콜의 일환으로, 특허는 Jiro Kawada에 의해 설립된 직삭 생명 공학, Inc.에 허가되었습니다.
Acknowledgments
이 연구는 과학 진흥을 위한 일본 사회 (JSPS) 과학 연구를 위한 보조금 에 원조 17H05661 및 18K19903, 코어 2 코어 프로그램 및 AI 를 넘어서는 기관에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
| 6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
| Accutase | ICT | AT104 | |
| B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
| Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
| HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
| HBSS | Wako | 085-09355 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
| Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
| MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
| Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
| N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
| Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
| ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
| Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
| SAG | Sigma | SML1314 | |
| SB431542 | Wako | 192-16541 | |
| Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
| Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
| Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
| SU5402 | Sigma | SML0443 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
| TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
| Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
| Y-27632 | Wako | 030-24021 |
References
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