Summary
Detta protokoll ger ett omfattande förfarande för att fabricera mänskliga iPS cell-härledda motor nerv organoid genom spontan montering av en robust bunt axons utvidgas från en sfäroid i en vävnad kultur chip.
Abstract
En fascicle av axlar är ett av de viktigaste strukturella motiven som observeras i nervsystemet. Störningar av axon fascicles kan orsaka utvecklingsmässiga och neurodegenerativa sjukdomar. Även om många studier av axoner har utförts, är vår förståelse av bildandet och dysfunktionen av axon fascicles fortfarande begränsad på grund av bristen på robusta tredimensionella in vitro-modeller. Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för snabbgenerering av en motorisk nervorganoid (MNO) från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPS) i ett mikrofluidiskt baserat vävnadskulturchip. För det första beskrivs tillverkning av chips som används för metoden. Från mänskliga iPS-celler bildas en motorisk neuronsfäroid (MNS). Därefter överförs den differentierade MNS till chippet. Därefter växer axoner spontant ut ur sfäroiden och monteras i en fascicle inom en mikrokanal utrustad i chipet, vilket genererar en MNO-vävnad som bär en bunt axoner som förlängs från sfäroiden. För nedströmsanalysen kan MNOs tas ut ur chipet som ska fixeras för morfologiska analyser eller dissekeras för biokemiska analyser, liksom kalciumavbildning och multielektrodmatrisinspelningar. MNOs som genereras med detta protokoll kan underlätta drogtester och screening och kan bidra till förståelse för mekanismer som ligger till grund för utveckling och sjukdomar hos axonfascicles.
Introduction
Spinal motor nervceller (MN) utvidgar axlar till skelettmuskler för att kontrollera kroppens rörelse. Deras axonalbanor är mycket organiserade och reglerade i utvecklingsprocessen. Trots många studier om axon förlängning och vägledning1, mekanismer för organiserad axon bunt bildas är fortfarande under utredning. Axons av motoriska nervceller skadas ofta av neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS)2, men patofysiologiska mekanismer för skador på axon fascicles är dåligt förstådda. Således krävs en fysiologisk och patologisk modell för att rekapitulera axon bunt bildas och regression i fältet.
En mänsklig stamcellsbaserad motorisk neuron är en lovande plattform för att förstå utveckling och sjukdomar som ALS3. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) kan användas för att modellera sjukdomar med hjälp av patientbaserade celler. Hittills har olika differentieringsmetoder från pluripotenta stamceller till MN rapporterats4,5,6. Axons av nervceller i tvådimensionell kultur är dock slumpmässigt orienterade och rekapitulerar inte in vivo mikromiljö inom utveckla nerver där axoner är enkelriktade monterade genom täta axo-axonal interaktioner7. För att övervinna denna fråga har vi utvecklat en teknik för att generera en tredimensionell vävnad som liknar motornerv från mänskliga iPS-celler8, och namngav vävnaden som motorisk nervorganoid (MNO). MNO består av cellkroppar belägna i en motorisk neuronsfäroid (MNS) och en axonal fascicle utsträckt från sfäroiden. Axonerna i fascicle är enkelriktade orienterade, vilket liknar axoner i att utveckla motoriska nerver. Därför ger MNOs unikt en fysiologisk axonal mikromiljö, vilket inte gjordes av några andra tidigare utvecklade neuronal kulturmetoder.
I detta protokoll beskriver vi metoder för vävnad kultur chips tillverkning, snabb motor neuron differentiering och motor nerv organoid bildas i utvecklade chips. Vårt mjukpapperskulturchip är mycket enkelt, och det innehåller bara ett fack för att acceptera en sfäroid, en mikrokanal för att bilda ett axonpaket och ett fack för att inhysa axonterminaler. Enheten innehåller inte komplexa strukturer inklusive mikrogroover eller mikroporfilter som ofta används för att separera axoner och cellkroppar efter storlek9,10. Därför kan våra enheter enkelt tillverkas genom att följa stegen som beskrivs i detta protokoll om en fotolitografiinställning är tillgänglig.
Snabb differentiering av mänskliga iPS-celler uppnås med en optimerad kombination av inducerande och mönstringsfaktorer (SB431542, LDN-193189, retinsyra (RA) och utjämnade agonist (SAG)) och accelerationsfaktorer (SU5402 och DAPT). Det har rapporterats att kombinationen av SU5402 och DAPT påskyndar differentiering av perifera nervceller och neurala vapenceller11. I det här protokollet erbjuder vi tre olika metoder för att generera MNOs, så att läsarna kan bestämma en metod som är mest anpassad till deras behov. Vi rekommenderar att du utför differentiering av mänskliga iPS-celler efter att ha bildat en sfäroid (3D-metoden), eftersom den differentierade MNS kan överföras direkt till ett vävnadskulturchip. Alternativt kan mänskliga iPS-celler differentieras till motoriska nervceller i monolayer (2D) kultur, och sedan skapas till tredimensionella motoriska neuron sfäroider som vi tidigare rapporterat8. Vi har uppdaterat protokollet, och med den tredimensionella differentieringsmetod som beskrivs i detta protokoll kan övergången från 2D till 3D undvikas och MNOs kan erhållas med kortare differentieringstid, färre steg och minskade tekniska risker utan dissociationssteget. Kommersiellt tillgängliga nervceller kan också användas för att generera MNS för att minska tiden för differentiering.
För att generera en MNO odlade vi en MNS i vävnadskulturchipet. Axonerna sträcker sig från sfäroiden och sträcker sig in i mikrokanal där axoner samlas och justerar enkelriktat. Detta underlättar axo-axonal interaktion och spontan bildning av en tätt sammansatt enkelriktad bunt vävnad av axoner i mikrokanal, vilket uppnås unikt genom detta protokoll, medan antingen spontan buntbildning eller guidad axonal orientering ensam kan uppnås genom andra protokoll12,13,14. I ett typiskt experiment migrerar få celler ut från sfäroider till mikrokanal och de flesta celler stannar i närheten av sfäroider. Denna metod gör det möjligt att spontant separera axoner från sfäroiderna utan att använda storleksberoende fysiska barriärer (t.ex. mikrogroover eller mikroporfilter) för att separera axoner från cellkroppar.
Den resulterande MNO kan genomgå olika undersökningar, inklusive morfologiska, biokemiska och fysiska analyser. Cellkroppen och den förlängda axonbunten kan isoleras fysiskt genom skärning och kan analyseras separat för nedströmsexperiment, t.ex. biokemiska analyser. Biologiska material inklusive RNA och protein kan isoleras från bara några axon buntar för regelbundna biokemiska analyser inklusive RT-PCR och western blotting. Här beskriver vi ett protokoll för att generera motorisk nervorganoid från iPS-celler, som erbjuder en attraktiv fysiologisk och patologisk modell för att studera den mekanism som ligger till grund för utveckling och sjukdom hos axonfascicles.
Protocol
1. SU-8 mögeltillverkning genom fotolitografi
OBS: Denna procedur omfattar farliga kemikalier. Använd rökhuv och personlig skyddsutrustning i hela.
- Rengör kiselskivan (4 tum i diameter, 1 mm tjocklek, polerad) med aceton och blås med kvävegas. Grädda sedan vid 180 °C i 3 min för att torka.
- Dela ut 3 ml SU-8 2100 på en rengjord skiva.
- Täck SU-8 jämnt på skivan med en spincoater vid 500 varv/min i 10 s och snurra sedan sekventiellt vid 1500 varv/min i 30 varv/min med en acceleration på 300 varv/min för att erhålla ett 150 μm tjockt lager SU-8.
OBS: Se till att kiselskivan är placerad i mitten av spincoatern och korrekt fastsatt med vakuum. - Grädda skivan på värmeplattan vid 50 °C i 10 min, vid 65 °C i 7 min och vid 95 °C i 45 min.
- Ställ in fotomasken (bild 1) på maskjusteraren och exponera UV-ljus (365 nm) i 60 s.
OBS: Exponeringstiden måste optimeras med en lämplig dos UV-ljus. - Efter exponering, grädda skivan vid 65 °C i 6 min och vid 95 °C i 13 minuter på värmeplattan.
- Utveckla skivan i 10-20 min hos SU-8-utvecklare med agitation med hjälp av en orbital shaker och ändra utvecklingslösningen en gång under processen.
OBS: Förläng utvecklingstiden när skräpet från SU-8 finns kvar. - Skölj skivan i isopropanol och torka försiktigt skivan med kvävegas.
- Mät höjden på den deponerade SU-8 med ett mätmikroskop och se till att den är cirka 150 μm tjock. Den kan förvaras på obestämd tid vid rumstemperatur.
2. PDMS mikrofluidisk-baserad vävnad kultur chip tillverkning
- Fäst SU-8-deponerade skivan på en behållare (t.ex. 15 cm petriskål i plast) med dubbelsidig tejp.
- Blås bort dammet från skivan med hjälp av kvävegas.
- För att silanisera, lägg SU-8-deponerade skivan i en vakuumkammare tillsammans med en liten behållare (t.ex. 35 mm skål). Släpp 10 μL (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triklorosilan i den lilla behållaren. Applicera inte direkt (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triklorosilan på SU-8-skivan.
- Stäng vakuumkammaren ordentligt och slå på en vakuumpump i minst 2 timmar.
- Ta en plastkopp och häll silikon elastomer (t.ex. Silpot 184 eller motsvarande Sylgard 184) och härdningsmedel med ett viktförhållande på 10:1. Blanda sedan väl med en spatel och degas i vakuumkammaren tills bubblorna avlägsnas helt.
- Häll PDMS-blandningen i behållaren med SU-8-skivan till önskad tjocklek (3-4 mm) och avgasa igen för att ta bort bubblor.
- Grädda PDMS i en ugn vid 60 °C i minst 3 timmar för att helt härda PDMS.
- Efter kylning, skär av det härdade PDMS från skivan med hjälp av en skalpell eller ett rakblad.
- För att skapa de två kamrarna i vävnadskulturchipet, stansa två hål där de två facken ligger med hjälp av en biopsi stans med diametern 1,5 mm.
- För att skapa en medelstor reservoar, förbered en annan PDMS-blandning (silikon elastomer och härdningsmedel vid ett viktförhållande på 10:1) och häll den i en ny 10 cm Petri-skål. Justera hällvolymen till 5 mm tjocklek på PDMS.
- Grädda PDMS i en ugn vid 60 °C i minst 3 timmar för att helt härda PDMS.
- Efter kylning av PDMS, skär av det härdade PDMS med en skalpell för att få en rektangulär ring.
- Bind det nedre lagret med medelbehållaren genom att applicera ocured PDMS mellan dem och baka de monterade PDMS-lagren. Denna bundna struktur resulterar i PDMS vävnad kultur chip.
- Rengör PDMS vävnadskulturchip med en scotch tejp för att ta bort damm och små partiklar från ytan. PDMS vävnadskulturchips kan förvaras i rumstemperatur om de skyddas mot damm och UV.
3. Förberedelse av kultur
- Kulturmedium
OBS: Alla medier som anges nedan bör filtreras för sterilisering om inget annat anges. Beredda medier får förvaras vid 4 °C och användas inom en månad.- För att förbereda mTeSR Plus medium: kombinera en flaska 100 mL mTeSR Plus 5x tillägg med en flaska 400 mL mTeSR Plus Basal Medium.
- För att förbereda 100 ml KSR-medium: I 85 ml DMEM/F12, tillsätt 15 ml Knockout serum ersättning (KSR, 15%), 1 ml kommersiellt glutamintillskott (1%) och 1 ml icke-essentiell aminosyra (NEAA, 1%).
- För att förbereda 100 ml N2 medium: I 100 ml neurobasalt medium, tillsätt 1 ml N2 (100x), 1 ml kommersiellt glutamintillskott och 1 ml NEAA.
- För att förbereda 250 ml mognadsmedium: I 250 ml neurobasalt medium, tillsätt 5 ml B27 (2%), 2,5 ml kommersiellt glutamintillskott (1%), och 2,5 ml Penicillin/Streptomycin (1%).
- Återanvänd föreningarna (retinsyra (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) i cellkulturell DMSO till önskad koncentration. Förbered alikvoter och förvara dem vid -20 °C i upp till 6 månader. Följande lagerlösningar används: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Beläggning
OBS: För att förhindra polymerisation av källarmembranmatris genom värme, undvik repetitiva frys-tina cykler. Hantera alla beläggningsförfaranden med förkylda pipettspetsar och rör om möjligt. Källarmembranmatrisen ska tinas över natten vid 4 °C och alikvoteras med förkylda pipettspetsar och rör. Alikvoterna kan frysas vid -20 °C eller -80 °C.- Tina den frusna alikvoten vid 4°C på is. Alikvoten ska hållas kall under beläggningsproceduren. Använd en förkyld pipettspets och späd källarmembranmatrisen med iskallt DMEM/F12 vid ett förhållande av 1:40. Oanvänd utspädd källarmembranmatris kan lagras vid 4 °C i 2-3 dagar med tanke på att ingen polymerisation inträffade.
- Tillsätt 1 ml källarmembranmatris/DMEM-F12-lösning för att täcka en brunn på 6 brunnsplattan.
- Inkubera plattan vid rumstemperatur i minst en timme eller 4 °C över natten. Belagda plattor kan förvaras vid 4 °C i högst en vecka.
4. Underhåll av iPS-celler
OBS: Odifferentierade iPS-celler hålls i mTeSR Plus medium och subkulturellt när confluency av ≥ 90% observeras i en 6 brunnsplatta i detta protokoll. Mindre justeringar kan krävas för iPS-celler som odlas i andra medier.
- Förbered matrisbelagda diskar i källarmembran som tidigare nämnts i steg 3.2.
- Aspirera helt mTeSR Plus-mediet. Tvätta brunnen en gång med PBS och tillsätt 0,5 ml passaging reagens (se Materialförteckning ). Vänta några sekunder och aspirera lösningen.
- Inkubera plattan vid 37 °C i inkubatorn i 5 minuter eller tills cellerna blir runda.
Inkubationstiden kan variera mellan olika iPS-cellinjer och sammanflödet. Kontrollera regelbundet under mikroskopet för att bestämma dissociationstiden under inkubationen. - Tillsätt 1 ml mTeSR Plus medium och knacka på plattan i 30-60 s för att lossa kolonierna.
- Blanda försiktigt 1 ml av cellfjädringslösningen med 7 ml färsk mTeSR plus medium. Pipetten är inte mer än 5 gånger.
- Plattan vid ett förhållande av 1:8. Tillsätt vanligtvis 1 ml fjädring från steg 4,5 och tillsätt 1 ml mTeSR plus media kompletterat med 5-10 μM Y-27632 (ROCK-hämmare). Passage utspädning förhållandet beror på iPSC linje.
- Placera cellen i en 5% CO2/37 °C inkubator. Nästa dag tar du bort Y-27632 genom att lägga till färskt mTeSR Plus-medium. Därefter ändrar du media varannan dag inledningsvis, och varje dag när cellen når högre konfluens.
5. Differentiering av iPS-celler till motoriska nervceller
OBS: Alla alternativ nedan (5,2, 5,3 och 5,4) ger MNOs med > 90% effektivitet.
- Passaging iPSC för motorisk neuron differentiering
OBS: Differentiering kan utföras framgångsrikt i antingen 3D-protokoll (5.2) eller 2D-protokoll (5.3).- Låt odifferentierade iPS-celler växa tills det når en sammanflöde av cirka 80% i mTeSR Plus medium i en 6-brunnsplatta.
- Aspirera helt mediet. Tvätta omedelbart brunnen en gång med steril PBS och tillsätt 0,5 ml celldisociationslösning till cellerna.
- Inkubera plattan vid 37 °C i inkubatorn i cirka 2-3 min, eller tills cellerna separeras och rundas men förblir fästa vid brunnen.
- Tillsätt 1 ml medium och försiktigt pipett upp och ner några gånger med en 5 ml serologisk pipett. Överför cellfjädringen till ett 15 ml-rör bestående av 4 ml av mediet.
- Centrifugera vid 200 x g i 3 min.
- Aspirera försiktigt supernatanten, lämna pelleten ostörd och återanvänd cellerna i 1 ml av mediet kompletterat med 10 μM Y-27632.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och fortsätt till antingen 5,2 (3D-differentiering) eller 5,3 (2D-differentiering).
- Bildandet av motorisk neuronsfäroid (MNS) vid 3D-differentiering ("3D-protokoll")
OBS: En fullständig medium förändring görs dagligen från dag 0-12 av differentiering (Figur 2).- Så iPS-cellerna från steg 5,1,7 till en 96 brunn U bottenplatta vid 40 000 celler/brunn i 100 μL mTeSR Plus kompletterad med 10 μM Y-27632.
- Byt ut varje brunn mot 100 μL av det färska mediet nästa dag.
- Dag 0 och 1: Aspirera odlingsmediet och ersätt med 100 μL KSR-medium (3.1.2) kompletterat med 10 μM SB431542 och 100 nM LDN-193189.
- Dag 2 och 3: Aspirera odlingsmediet och ersätt med 100 μL KSR-medium kompletterat med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA och 1 μM SAG.
- Dag 4 och 5: Förbered ett blandat medium bestående av 75 % KSR-medium och 25 % N2-medium (3,1,3). Aspirera sedan odlingsmediet och ersätt med 100 μL blandat medium kompletterat med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA och 1 μM SAG.
- Dag 6 och 7: Förbered ett blandat medium bestående av 50% KSR medium och 50% N2 medium. Aspirera sedan odlingsmediet och ersätt det med 100 μL blandat medium kompletterat med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinsyra och 1 μM SAG.
- Dag 8 och 9: Förbered ett blandat medium bestående av 25% KSR medium och 75% N2 medium. Aspirera sedan odlingsmediet och ersätt med 100 μL blandat medium kompletterat med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA och 1 μM SAG.
- Dag 10 och 11: Ersätt medium med 100 μl N2-medium kompletterat med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA och 1 μM SAG.
- Dag 12: Fortsätt att överföra MNs till vävnadskulturchipet (steg 6) eller ersätt medium med 100 μL av mognadsmediet (3.1.4) kompletterat med 20 ng/mL hjärnan-härledd neurotrofisk faktor (BDNF).
OBS: MNS kan överföras till vävnadskulturchipet från dag 12 till dag 19. Sfäroider som inte överförs bör hållas odlade i 96 väl U bottenplattor i mognadsmedium kompletterat med 20 ng/ml BDNF tills överföringen.
- (Alternativt alternativ) 2D-differentiering och övergång till 3D MNS ("2D-protokoll")
- Aspirera beläggningslösningen från en förbelagd 12 brunnsplatta.
- Kärna ur iPS-cellerna från steg 5.1.7 med en densitet på 100 000 – 200 000 celler per brunn i mTeSR Plus medium med 10 μM Y-27632.
OBS: Fortsätt att odla de odifferentierade iPS-cellerna i mTeSR Plus medium utan Y-27632 tills cellerna når 80% beredskap om cellerna är för glesa för nästa steg (5.3.3). - Dag 0 och 1: Aspirera odlingsmedium och ersätt med 1 ml KSR-medium (3.1.2) kompletterat med 10 μM SB431542 och 100 nM LDN-193189.
- Dag 2 och 3: Aspirera odlingsmedium och ersätt det med 1 ml KSR-medium kompletterat med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA och 1 μM SAG.
- Dag 4 och 5: Förbered ett blandat medium bestående av 75 % KSR-medium och 25 % N2-medium (3,1,3). Aspirera odlingsmedium och ersätt med 1 ml blandat medium kompletterat med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA och 1 μM SAG.
- Dag 6 och 7: Förbered ett blandat medium bestående av 50% KSR medium och 50% N2 medium. Aspirera odlingsmediet och ersätt det med 1 ml blandat medium kompletterat med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinsyra och 1 μM SAG.
- Dag 8 och 9: Förbered ett blandat medium bestående av 25% KSR medium och 75% N2 medium. Aspirera odlingsmediet och ersätt med 1 ml av det blandade mediet kompletterat med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA och 1 μM SAG.
- Dag 10 och 11: Ersätt medium med 1 ml N2-medium kompletterat med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA och 1 μM SAG.
- Dag 12: Aspirera differentieringsmediet, tvätta snabbt väl en gång med PBS och tillsätt 0,5 ml av cellavlossningsmediet. Placera plattan i en inkubator på 37 °C i 1-3 min (t.ex. om trypLE Express används) eller 20-30 min (t.ex. vid användning av Accutase).
- Använd en P1000-pipett, samla försiktigt cellerna och överför cellerna till ett 15 ml koniskt rör med färskt mognadsmedium och centrifugera vid 200 x g i 3 min. Om cellerna är klumpiga, försiktigt pipett upp och ner några gånger. Pipetten får inte vara för mycket eftersom det kan skada cellerna.
- Aspirera supernatanten och återanvänd pelleten i 1 ml mognadsmedium (3.1.4) kompletterat med 20 ng/mL BDNF.
- Räkna cellen med hjälp av en hemocytometer. Plätera cellerna på 10 000-40 000 celler per brunn i en 96 brunn U bottenplatta i mognadsmedium kompletterad med 20 ng/ml BDNF. Initial såddtäthet bör optimeras beroende på iPS-cellinje och cellernas tillstånd så att sfäroidens diameter är 800-900 μm när den förs in i vävnadskulturchipet. I de flesta fall börjar du på 20 000 celler per brunn initialt och ökar eller minskar sedan antalet celler beroende på storlek.
- Kultur i ytterligare 3-10 dagar tills cellerna bildar en sfäroid med en slät kant.
- (Alternativt alternativ): MNS-bildning från motoriska nervceller
OBS: Kommersiellt tillgängliga mänskliga iPS-cellbaserade motoriska nervceller (se Materialförteckning)kan användas för att generera MNOs istället för att differentiera från mänskliga iPS-celler.- Efter upptining av cryovial av motoriska nervceller, snabbt återanvänd cellerna med 9 ml av motor neurons medium. Snurra ner vid 400 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Aspirera supernaten och återanvänd pelleten med motorneuronmediet.
- Följ samma steg som ovan (5.3.12- 5.3.13) för att producera MNSs.
6. Förberedelse av vävnadskulturchipet för motorisk nervorganoid (MNO) bildning
- Sterilisera det beredda PDMS (från steg 2.13) genom att doppa det i 70% etanol i petriskålen i minst 1 timme.
OBS: Alla följande steg ska manipuleras i ett biosäkerhetsskåp. - Sterilisera mikroskopglaset (76 x 52 mm) genom att doppa det i 70% etanol i Petri-skålen.
- Under torkningsprocessen av mikroskopglaset, placera PDMS-enheten på det halv våta mikroskopglaset och låt det torka helt genom att vänta över natten. När den är helt torkad ska PDMS-enheten fästa på glaset.
OBS: Denna bindning är inte permanent för att möjliggöra lossning av PDMS-enheterna från mikroskopglaset efter odlingen för vävnadsinsamling. Permanent bindning med syreplasma kan användas för att maximera vidhäftningen mellan PDMS och glas, men det skulle förbjuda demontering av chips och vävnadsuppsamling. - Täck mikrokanalytan i PDMS-anordning och mikroskopglas med 30 μL utspädd källarmembranmatris i DMEM/F12 (1:40) genom att göra en droppe på ena sidan av kanalens inlopp och aspirera sedan lösningen från andra sidan av inloppet med en pipett eller sugpump (Figur 3A). Aspirera inte för mycket lösningsvolym för att undvika bubbelförorening.
- Inkubera sedan PDMS-enheten i 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C i en sekundär behållare (t.ex. petriskål).
7. Motorisk nervorganoid (MNO) formation
- Byt ut beläggningslösningen mot förvärmda 150 μL mognadsmedium kompletterat med 20 ng/ml BDNF strax före användning.
- Placera sedan MNS från steg 5.2.9 eller 5.3.13 i inloppet av mikrokanal med hjälp av en mikropipett med en bredborrspets. MNS kan spontant slå sig ner i botten av enheten genom gravitation. Tryck inte för mycket när du injicerar MNS (figur 3B).
OBS: Om MNS sitter fast på sidoväggen på ett hål i ett vävnadskulturchip, aspirera försiktigt lösningen från en annan sida av inloppet. - Fyll en liten behållare (t.ex. ett lock på 15 ml rör) med sterilt vatten och placera det i närheten av vävnadskulturchipet i sekundärbehållaren för att förhindra medium avdunstning. Placera den sedan i en 5% CO2/37 °C inkubator.
- För en medelförändring, aspirera det utmattade odlingsmediet från mitten av medelbehållaren (Figur 3C). Aspirera inte allt medium och vävnaden.
- Tillsätt försiktigt färskt mognadsmedium (med BDNF). Mediet bör bytas var 2-3 dagar. Torka inte kulturmediet när som helst under kulturen. Axons växer från en MNS in i kanalen och monteras spontant i ett enda paket på 2-3 veckor, vilket resulterar i bildandet av en MNO. MNO kan odlas i mer än ytterligare 1 månad i enheten.
8. Nedströmsanalys av MNO
- Fullmonterad immunostaining
- Ta enheten eller disken till en kemisk rökhuv. Fix MNO genom att tillsätta ungefär lika stor volym på 8% paraformaldehyd (PFA) till mediet för att uppnå en slutlig koncentration på 4% PFA. Skala av PDMS-enheten från glaset och inkubera i 15-20 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta MNO med PBS och upprepa sedan PBS-tvättning 2x.
- Permeabilisera MNO med 0,2% av Triton X-100 i PBS och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Tvätta MNO med PBS och upprepa sedan PBS-tvättning 2x. Blockera sedan MNO med PBS som innehåller 1% BSA och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Späd primära antikroppar i PBS som innehåller 0, 1% BSA och inkubera MNO med den primära antikroppslösningen över natten vid 4 °C. Tvätta MNO med PBS tre gånger.
- Späd sekundära antikroppar i PBS med 0,1% BSA och inkubera MNO med den sekundära antikroppslösningen i 2 timmar vid rumstemperatur. Tvätta sedan MNO tre gånger med PBS.
- Färga MNO med Hoechst i PBS som innehåller 0,2% Triton-X och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Tvätta MNO tre gånger med PBS. Den immunostained MNO är klar för avbildning med fluorescerande eller konfokala lasermikroskop.
- Vävnadsinsamling och isolering av axonbunt
- Häll 10 ml HBSS-lösning i en 10 cm Petri-skål. Sänk sedan ner hela PDMS-enheten i HBSS-lösningen.
- Lossa försiktigt PDMS från mikroskopglaset under ett stereomikroskop. När vävnaderna fastnar på PDMS-enheten, applicera försiktigt 1 ml HBSS-lösning från toppen av hålet med hjälp av en pipett.
- När vävnaden lossnat från PDMS, applicera försiktigt 1 ml HBSS på mikroskopglaset för att helt lossa PDMS från mikroskopglaset.
- För att isolera en axon bunt från en sfäroid, skär axon bunten med en kirurgisk kniv eller pincett under mikroskopet. Skär axonbunten något långt bort (> 1 mm) från sfäroiden för att undvika förorening av migrerade celler.
- Isolerade axon buntar och sfäroider kan analyseras ytterligare av olika nedströms analyser såsom RT-PCR, RNA-seq och western blotting.
- PDMS-odlingschipet kan återanvändas. För att rengöra odlingschipet, sonicate kulturchipet i destillerat vatten i 15 min. Sonikera sedan chipet i destillerat vatten kompletterat med 1% tvättmedel. Tvätta odlingschipet med destillerat vatten 5 gånger.
- Kalciumavbildning
OBS: Neuronal aktivitet kan mätas med kalciumindikator både före och efter insamling av vävnad från vävnadskulturchipet (från 8,2). Protokollet är baserat på ett specifikt kommersiellt kit (se Materialförteckning ). Alternativt kan andra kalciumavbildningssatser eller motsvarande metoder användas.- Tvätta MNO med PBS (utan Ca2+ och Mg2+) i tre gånger.
- Inkubera vävnaden med 5 μM Fluo-4AM i inspelningsmedium (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgCl2,1,8 mM, CaCl2,13,8 mM glukos) i 30-60 min vid 37 °C. Ett tillägg på 0,01-0,02 % av Pluronic F-127 kan hjälpa till att ta upp Fluo-4 AM i cellerna.
- Tvätta sedan vävnaden med PBS (utan Ca2+ och Mg2 +) och ersätt den med inspelningsmedium.
- Skaffa timelapse-bilder med hjälp av fluorescerande mikroskopi med en GFP/Cy2-filteruppsättning. Ställ in exponeringstiden mindre än 20 ms per bildruta.
- Öppna den förvärvade filmfilen som en bildsekvens med bild J.
- Om du använder en färg-CCD- eller CMOS-kamera konverterar du RGB-bilder till 16-bitars monobilder. Öppna "Analysera | Verktyg | ROI Manager", Rita intresseområdet och klicka på "Lägg till". Klicka på "Multi Measure". Medelvärdet av intensitet i flera ROI visas i resultatet.
- Rita signalintensiteten med hjälp av allmän dataanalysprogramvara.
- Mätning av neuronal aktivitet med multielektrodmatris
OBS: Aktiviteten hos motoriska nervceller kan fångas av en multielektrodmatris (MEA).- Efter att ha skapat en MNO, överför den till en källarmembranmatrisbelagd MEA-sond. Placera vävnaden på elektroder.
- Tillsätt 200 μL mognadsmedium och inkubera 1-2 h vid 37 °C så att MNO kan fästas på ytan.
- Ersätt mediet med inspelningsmedium (8.3.2). Placera eventuellt nät och vikt ovanpå en MNO för att öka kontrakten med elektroderna.
- Ställ in MEA-sonden på inspelningshuvudet. Torka av kontakten mellan MEA-sonden och huvudsteget med 70% etanol.
- Börja registrera neuronal aktivitet genom att följa instruktioner från tillverkarna av MEA.
Representative Results
Motoriska nervceller differentierades inom 12-14 dagar i 3D-differentieringsförfaranden(figur 4 och figur 5). Viktigt, mer än 60% av cellerna uttryckte motor neuron markör HB9 under differentiering. Immunohistokemi visade att cirka 80% av cellerna i MNS var SMI32-positiva motoriska nervceller. HB9 och SMI32 är de etablerade tidiga motoriska neuronmarkörerna15,16. Uttrycket av HB9 och SMI32 är de viktigaste parametrarna som måste bekräftas för att säkerställa cellulär identitet hos motoriska nervceller. Efter införandet av en MNS i kulturchipet sträcker sig axoner in i kanalen och ett axonpaket bildas. På grund av mikrokanaler som fungerar som fysiska guider förtärs axoner från MNS och bildar ett paket med axo-axonal interaktion (Figur 6A). Det är viktigt att bekräfta bildandet av axon-bunten genom mikroskopisk observation för att bekräfta genereringen av en MNO. En framgångsrik MNO bär en axonbunt bredare än 50 μm och få isolerade axoner ur bunten i kanalen. Inledande förlängning av axoner kan observeras 24 timmar efter införandet av sfäroiden. Inom de närmaste 3-4 dagarna nådde axonerna till mitten av mikrokanal och når sedan till andra änden inom ytterligare 10 dagar (figur 6A). Följaktligen monterade axons och bildade en rak och enkelriktad bunt i 2-3 veckor i ett chip, och neuronal verksamhet observerades därefter.
Motoriska nervorganoider kan samlas in från chippet genom att pdms lossas från mikroskopglaset för biologisk analys (Figur 6B). Axon-buntar och cellkroppar kan dissekeras och isoleras genom att skära med en kirurgisk kniv eller pincett under ett mikroskop(figur 6B). Dessa biologiska material inklusive RNA och protein kan användas för regelbundna biokemiska analyser som RT-PCR och western blotting. I axonbuntar av MNOs detekteras inte nukleära eller dendritiska makerproteiner i västra blotting(figur 6C).
I kombination med en kalciumindikator (Fluo-4 AM) kan neuronal aktivitet fångas i vävnadskulturchipet. Spontan aktivitet av motoriska nervceller i sfäroiden och axon bunt observerades inom MNO. De neurala aktiviteterna observerades också med hjälp av ett multielektrodmatsystem.
Figur 1: Dimensionen av PDMS vävnadskulturchip.
(A) Fotomask av vävnadskulturchipet. B)Mått på mikrokanal i vävnadskulturchipet. Baskammarens diameter för att hålla motorisk neuronsfäroid är 2 mm och hålet i PDMS ovanför kammaren är 1,5 mm. Bredden och höjden på en mikrokanal som överbryggar två kammare är båda 150 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Schematisk illustration av motorisk neuron differentiering.
(A) Differentiering steg involverade neural induktion, mönstring i motor neuron härstamning och mognad av motoriska nervceller. (B) Två alternativ för att skapa motorisk neuron sfäroid (MNS) från iPS celler: 3D protokoll och ett 2D protokoll med dissociation steg av motoriska nervceller. Motorisk nervorganoid (MNO) kan erhållas genom båda protokollen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Steg för steg protokoll för källaren membran matris beläggning och motor neuron sfäroid introduktion.
(A)Källarmembranmatrisbeläggning i vävnadskulturchipets kanal. B)MNS förs in i chippets hål. C)Förändring av kulturmediet genom strävan efter uttömt medium. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: 2D- och 3D-motorisk neurondistans.
A)Tidskurs för representativ 3D MNS-differentiering (3D-protokoll). Storleken på MNS ökade gradvis med tiden. Skalstång: 500 μm. B) Tidskurs för 2D-differentiering på -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-protokoll). Skalstång: 500 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Karakterisering av motoriska nervceller.
(A)(vänster) En cryosection av en MNS färgas med SMI-32 antikroppar och DAPI. - Jag har inte tid med det här. En fas-kontrast bild av replated MNS på en källare membran matrisbelagd yta. Axonal förlängning observerades. -Jag har inte tid med det här. Axons av replated MNS färgas med Synapsin I och Tuj1 antikroppar. Skalstång: 500 μm (vänster och mitten) och 50 μm (höger). (B) En representativ bild av 2D motor neuroner immunostained med Tuj och HB9 antikroppar. Skalstång: 200 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Karakterisering av en motorisk nervorganoid (MNO) som genereras i ett odlingschip.
A)Representativa bilder av axonförlängning och tjock axonbuntbildning på D32. Skalstång: 500 μm. B)Immunostaining av motorisk nervorganoid (MNO) med SMI-32 och DAPI. Axoner och cellkroppar kan isoleras genom fysisk skärning. Skalstång: 1 mm. ( C )Proteintsrenhet från axoner och cellkroppar kvantifierade genom western blotting. MAP2, en dendritisk markör, upptäcktes inte i axonal protein, medan axonal markör Tau1 berikas i axonal protein. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Detta protokoll beskriver bildandet av en motorisk nerv organoid (MNO) som har en axon bunt utvidgas från en motor neuron sfäroid genereras från mänskliga iPS celler. Det bildade axonpaketet är tjockt, flexibelt och välorganiserat i enkelriktade strukturer. Genom att dissekera axonbunten kan axonalt protein med hög renhet och RNA erhållas tillräckligt för biokemiska analyser. Neuronal aktivitet kan mätas i axon buntar och sfäroider med kalcium imaging. Förorening av nukleära och dendritiska proteiner i axonal lysat upptäcktes inte av västra blotting, vilket visar att vår metod effektivt separerade axoner från cellkroppar och dendriter.
En av fördelarna med detta protokoll är den snabba differentiering och generering av MNO utrustad med ett axon-paket, där alla processer kan göras på 4 veckor med 3D-protokollet och 5-6 veckor med 2D-protokollet. Detta är kort jämfört med andra protokoll som vanligtvis tar 3-4 veckor att helt enkelt skilja i MN från embryonala stamceller och iPS-celler17 och det tar ytterligare 2-4 veckor att få axonal förlängning. 3D-protokollet föredras i allmänhet framför 2D-protokollet på grund av kortare differentieringstid, färre steg och minskade tekniska risker utan dissociationssteget jämfört med 2D-protokollet. Det mikrofluidiska vävnadskulturchipet utformades på ett sätt så att MNS axoner kan förlängas mot det andra facket genom mikrokanal, vilket underlättar bildandet av en bunt axoner genom att inducera axo-axonal interaktioner och affinitet mellan axoner. På grund av den enkla experimentella uppsättningen kan alla protokoll som beskrivs här inte bara utföras av bioengineers, som är bekanta med manipulering av ett vävnadskulturchip, utan också biologer och neuroforskare som inte är bekanta med mikrofluidik och mikrotillverkningstekniker. Det bör noteras att steg 1 och 2 också kan utföras med hjälp av en extern tillverkningstjänst.
Ett av de kritiska stegen för att utföra protokollet är en sekventiell förändring av kulturmediet. Det rekommenderas att helt ändra kulturmediet vid varje steg under differentiering så att faktorer i det använda mediet inte stör MN-differentiering. En annan kritisk punkt i detta protokoll är att upprätthålla odifferentierade iPS-celler i god kvalitet. Kvaliteten på den ursprungliga iPS-cellkulturen påverkar avsevärt effektiviteten för att erhålla motoriska nervceller och MNO. En annan punkt är att diametern på MNS ska vara mindre än storleken på chipets hål (1,5 mm). Större sfäroider kan inte komma in i kammaren, och potentiellt uppleva allvarlig hypoxisk nekros i mitten delen. Storleken på MNSs kan styras genom att ändra ett initialt såddnummer av iPS-celler (i 3D-protokoll) eller motoriska nervceller (i 2D-protokoll). Cellernas såddtäthet bör optimeras för varje iPS-cellinje.
Compartmentalized mikrofluidic enheter med mikrogrooves och små por filter har använts i stor utsträckning för att separera axoner från cellkroppar och dendriter. Denna teknik kan också skilja axoner från cellkroppar och dendrit, med överlägsen överflöd av axoner i buntade vävnader. Jämfört med de andra metoderna är en viktig begränsning av denna metod att den inte kan separera två olika odlingsmedier i den nuvarande utformningen av vävnadskulturchipet, vilket hindrar förmågan att samkultur av två olika celler som kräver två distinkta medier. En annan begränsning är att PDMS-chippet satte förutbestämda begränsningar för vävnadens storlek. En sfäroid som är större än hålet kan inte komma in i kammaren, och axon-bunten kan inte bli tjockare än bredden på mikrofluidkanalen.
Denna metod kan tillämpas på andra typer av nervceller. Vår grupp har visat förmåga att modellera ett cerebralt område med hjälp av en modifierad metod i kombination med cerebrala organoid tekniker18. När sfäroider infördes i båda facken och axons spontant långsträckta ömsesidigt mot varje sfäroid, och därefter en axon bunt bildas spontant. Som ett resultat kan två när sfäroider anslutas genom en axon bunt, och vävnaden kan erhållas som en bit. Detta visar att tillvägagångssättet är mycket mångsidigt för att bilda axon bunt vävnader oavsett neuronala celltyper. I detta protokoll användes mänskliga iPS-celler, men andra stamceller inklusive mänskliga ES-celler och mänskliga neurala stamceller kan användas med modifieringar av det presenterade protokollet. 3D-sfäroider av nervceller kan genereras av olika protokoll19,20. Denna metod för att göra vävnader med ett axon-paket kan potentiellt kombineras i framtiden med de andra differentieringsprotokollen för att göra 3D MN-sfäroid. Dessutom kan axonpaketets tjocklek och längd styras genom att helt enkelt ändra bredden och höjden på mikrokanalerna i vävnadskulturchipet för framtida utveckling.
Vi tror att detta protokoll kan användas för drogtester och screening och kan bidra till förståelsen av mekanismer som ligger till grund för utvecklingen och sjukdomarna hos axonfascicles.
Disclosures
I en del av detta protokoll har ett patent licensierats till Jiksak Bioengineering, Inc. som grundades av Jiro Kawada.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 och 18K19903, Core-2-core program och Beyond AI institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
| 6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
| Accutase | ICT | AT104 | |
| B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
| Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
| HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
| HBSS | Wako | 085-09355 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
| Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
| MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
| Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
| N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
| Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
| ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
| Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
| SAG | Sigma | SML1314 | |
| SB431542 | Wako | 192-16541 | |
| Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
| Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
| Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
| SU5402 | Sigma | SML0443 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
| TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
| Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
| Y-27632 | Wako | 030-24021 |
References
- Raper, J., Mason, C. Cellular strategies of axonal pathfinding. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).
- Ito, Y., et al. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science. 353 (6299), 603-608 (2016).
- Fujimori, K., et al. Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).
- Chen, H., et al. Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons. Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
- Imamura, K., et al. The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis. Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).
- Wang, L., Marquardt, T. What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).
- Kawada, J., et al. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. JoVE. (141), e58421 (2018).
- Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. JoVE. (147), e59250 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).
- Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions. bioRxiv. , (2020).
- Cullen, D. K., et al. Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids. iScience. 21, 57-67 (2019).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).
- Egawa, N., et al. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).
- Qu, Q., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).
- Kirihara, T., et al. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions. iScience. 14, 301-311 (2019).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).
