Summary
Denne protokollen gir en omfattende prosedyre for å fremstille menneskelig iPS celle-avledet motor nerve organoid gjennom spontan montering av en robust bunt av aksoner utvidet fra en sfæroid i en vev kultur chip.
Abstract
En fascicle av aksoner er et av de store strukturelle motivene observert i nervesystemet. Forstyrrelse av akson fascicles kan forårsake utviklings- og nevrodegenerative sykdommer. Selv om mange studier av aksoner er utført, er vår forståelse av dannelse og dysfunksjon av akson fascicles fortsatt begrenset på grunn av mangel på robuste tredimensjonale in vitro-modeller. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for rask generering av en motornerve organoid (MNO) fra humane induserte pluripotente stamceller (iPS) i en mikrofluidisk-basert vevskulturbrikke. Først er fabrikasjon av chips som brukes til metoden beskrevet. Fra menneskelige iPS-celler dannes en motorneuronspæroid (MNS). Deretter overføres den differensierte MNS til brikken. Deretter vokser aksoner spontant ut av spheroiden og monteres i en fascicle i et mikrokanals utstyrt i brikken, noe som genererer et MNO-vev som bærer en bunt av aksoner som strekker seg fra sfæroidet. For nedstrømsanalysen kan MNOer tas ut av brikken som skal fikses for morfologiske analyser eller dissekeres for biokjemiske analyser, samt kalsiumavbildning og multielektrodearrayopptak. MNOer generert med denne protokollen kan lette narkotikatesting og screening og kan bidra til forståelse av mekanismer underliggende utvikling og sykdommer i akson fascicles.
Introduction
Spinalmotornevroner (MN) utvider aksoner til skjelettmuskler for å kontrollere kroppsbevegelse. Deres aksonære baner er svært organisert og regulert i utviklingsprosessen. Til tross for mange studier på axon forlengelse ogveiledning 1, mekanismer for organisert axon bunt formasjon er fortsatt under etterforskning. Aksoner av motoriske nevroner blir ofte skadet av nevrodegenerative sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose (ALS)2, men patofysiologiske mekanismer for skaden på aksonfascikaler er dårlig forstått. Dermed er det nødvendig med en fysiologisk og patologisk modell for å rekapulere aksonbuntdannelse og regresjon i feltet.
En menneskelig stamcelleavledet motor neuron er en lovende plattform for å forstå utvikling og sykdommer som ALS3. Humane induserte pluripotente stamceller (iPS-celler) kan brukes til å modellere sykdommer ved hjelp av pasientavledede celler. Til dags dato har ulike differensieringsmetoder fra pluripotente stamceller til MN blittrapportert 4,5,6. Imidlertid er aksoner av nevroner i todimensjonal kultur tilfeldig orientert og ikke rekafulere in vivo mikromiljø i å utvikle nerver der aksoner er enveis montert gjennom tette axo-aksonale interaksjoner7. For å overvinne dette problemet har vi utviklet en teknikk for å generere et tredimensjonalt vev som ligner motornerve fra humane iPS-celler8, og kalt vevet som motornerveorganoid (MNO). MNO består av cellelegemer som ligger i en motor neuron spheroid (MNS) og en aksonal fascicle utvidet ut fra sfæroid. Aksonene i fascicleen er enveisorienterte, som ligner aksoner i utviklingen av motornerver. Derfor gir MNOer unikt et fysiologisk aksonalt mikromiljø, som ikke ble gjort av noen andre tidligere utviklede nevronale kulturmetoder.
I denne protokollen beskriver vi metoder for vevkulturchipsfabrikasjon, rask motor neuron differensiering og motornerve organoid dannelse i utviklede chips. Vår vev kultur chip er veldig enkel, og den inneholder bare et rom for å akseptere en sfæroid, en mikrokanal for å danne en axon bunt, og et rom for bolig axon terminaler. Enheten inneholder ikke komplekse strukturer, inkludert mikrogropoer eller mikroporefiltre som ofte brukes til å skille aksoner og cellelegemer etterstørrelse 9,10. Derfor kan våre enheter enkelt fremstilles ved å følge trinnene som er beskrevet i denne protokollen hvis et fotolitografioppsett er tilgjengelig.
Rask differensiering av humane iPS-celler oppnås med en optimalisert kombinasjon av induserende og mønsterfaktorer (SB431542, LDN-193189, retinsyre (RA) og glattet agonist (SAG)) og akselerasjonsfaktorer (SU5402 og DAPT). Det har blitt rapportert at kombinasjonen av SU5402 og DAPT akselererer differensieringen av perifere nevroner og nevrale crest celler11. I denne protokollen tilbyr vi tre forskjellige metoder for å generere MNOer, slik at leserne kan bestemme en metode som passer best til deres behov. Vi anbefaler at du utfører differensiering av humane iPS-celler etter å ha dannet en sfæroid (3D-metoden), siden differensierte MNS kan overføres direkte til en vevskulturbrikke. Alternativt kan menneskelige iPS-celler differensieres til motoriske nevroner i monolayer (2D) kultur, og deretter opprettet i tredimensjonale motor neuron sfæroider som vi tidligere rapporterte8. Vi har oppdatert protokollen, og med den tredimensjonale differensieringsmetoden som er beskrevet i denne protokollen, kan overgangen fra 2D til 3D unngås og MNOer kan oppnås med kortere differensieringstid, færre trinn og redusert teknisk risiko uten dissosiasjonstrinnet. Kommersielt tilgjengelige nevroner kan også brukes til å generere MNS for å redusere tiden for differensiering.
For å generere en MNO, dyrket vi en MNS i vevskulturbrikken. Aksonene strekker seg fra spheroiden og strekker seg inn i mikrokanal der aksoner samler og justerer seg enveis. Dette forenkler axo-aksonær interaksjon og spontan dannelse av et tett montert enveis buntvev av aksoner i mikrokanal, som er unikt oppnådd ved denne protokollen, mens enten spontan buntdannelse eller veiledet aksonær orientering alene kan oppnås ved andreprotokoller 12,13,14. I et typisk eksperiment migrerer få celler ut fra sfæroider til mikrokanal, og de fleste celler forblir nærliggende sfæroider. Denne metoden gjør at aksoner spontant skilles ut fra sfæroidene uten å bruke størrelsesavhengige fysiske barrierer (f.eks. mikrogropor eller mikroporefiltre) for å skille aksoner fra cellelegemer.
Den resulterende MNO kan bli utsatt for ulike undersøkelser, inkludert morfologiske, biokjemiske og fysiske analyser. Cellekroppen og utvidet aksonbunt kan isoleres fysisk ved å kutte og kan analyseres separat for nedstrøms eksperimenter, for eksempel biokjemiske analyser. Biologiske materialer, inkludert RNA og protein, kan isoleres fra bare noen få axonbunter for vanlige biokjemiske analyser, inkludert RT-PCR og vestlig blotting. Her beskriver vi en protokoll for generering av motornerveorganoid fra iPS-celler, som tilbyr en attraktiv fysiologisk og patologisk modell for å studere mekanismen underliggende utvikling og sykdom av aksonfascicles.
Protocol
1. SU-8 mold fabrikasjon av fotolitografi
MERK: Denne prosedyren innebærer farlige kjemikalier. Bruk røykhette og PPE i hele.
- Rengjør silisiumwaferen (4-tommers i diameter, 1 mm tykkelse, polert) med aceton og blås med nitrogengass. Stek deretter ved 180 °C i 3 min for å tørke.
- Dispenser 3 ml SU-8 2100 på en rengjort wafer.
- Coat SU-8 jevnt på wafer ved hjelp av en spin coater på 500 rpm for 10 s og deretter, sekvensielt spinn på 1500 rpm for 30 s med en akselerasjon på 300 rpm / s for å få en 150 μm tykt lag av SU-8.
MERK: Pass på at silisiumwaferen er plassert midt på spin-coateren og riktig festet med vakuum. - Myk bake wafer på kokeplaten ved 50 °C i 10 min, ved 65 °C i 7 min, og ved 95 °C i 45 min.
- Sett fotomasken (figur 1) på maske aligner og utsett UV-lys (365 nm) i 60 s.
MERK: Eksponeringstiden må optimaliseres med en passende dose UV-lys. - Etter eksponering, bake wafer ved 65 °C i 6 min, og ved 95 °C i 13 min på kokeplaten.
- Utvikle wafer i 10-20 min i SU-8 utvikler med agitasjon ved hjelp av en orbital shaker, endre utviklingsløsningen en gang under prosessen.
MERK: Utvid utviklingstiden når rusk av SU-8 gjenstår. - Skyll wafer i isopropanol og tørk forsiktig waferen med nitrogengass.
- Mål høyden på den avseponerte SU-8 med et målemikroskop og sørg for at den er ca. 150 μm tykk. Den kan lagres på ubestemt tid ved romtemperatur.
2. PDMS mikrofluidisk-basert vev kultur chip fabrikasjon
- Fest SU-8-deponert wafer til en beholder (f.eks. 15 cm plast Petriskål) med dobbelt sidetape.
- Blås støvet av wafer ved hjelp av nitrogengass.
- For å silanisere, legg SU-8-deponert wafer i et vakuumkammer sammen med en liten beholder (f.eks. 35 mm fat). Slipp 10 μL (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triklorosilan i den lille beholderen. Ikke påfør (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triklorosilan til SU-8 wafer.
- Lukk vakuumkammeret tett og slå på en vakuumpumpe i minst 2 timer.
- Ta en plastkopp og hell silikonelekastomeren (f.eks. Silpot 184 eller tilsvarende Sylgard 184) og herdingsmiddelet med et vektforhold på 10:1. Bland deretter godt ved hjelp av en slikkepott og degas i vakuumkammeret til bobler fjernes helt.
- Hell PDMS-blandingen i beholderen med SU-8 wafer til ønsket tykkelse (3-4 mm) og degas igjen for å fjerne bobler.
- Stek PDMS i en ovn ved 60 °C i minst 3 timer for å fullstendig kurere PDMS.
- Etter avkjøling, kutt av de herdede PDMS fra wafer ved hjelp av en skalpell eller et barberblad.
- For å lage de to kamrene i vevskulturbrikken, slå to hull hvor de to rommene er plassert ved hjelp av en 1,5 mm diameter biopsipunch.
- For å lage et medium reservoar, lag en annen PDMS-blanding (silikoneeastomer og herdingsmiddelet ved et vektforhold på 10:1) og hell den i en ny 10 cm petriskål. Juster hellevolumet til 5 mm tykkelse på PDMS.
- Stek PDMS i en ovn ved 60 °C i minst 3 timer for å fullstendig kurere PDMS.
- Etter kjøling av PDMS, kutt av de herdede PDMS med en skalpell for å få en rektangulær ring.
- Bind bunnlaget med mellomreservoaret ved å bruke usikrede PDMS mellom dem og bake de monterte PDMS-lagene. Denne limte strukturen resulterer i PDMS vev kultur chip.
- Rengjør PDMS vevkulturbrikken med en scotch tape for å fjerne støv og små partikler fra overflaten. PDMS vev kultur chips kan lagres ved romtemperatur hvis beskyttet mot støv og UV.
3. Utarbeidelse av kultur
- Kultur medium
MERK: Alle medier som er oppført nedenfor, skal filtreres for sterilisering med mindre annet er oppgitt. Klargjorte medier kan oppbevares ved 4 °C og brukes innen en måned.- For å forberede mTeSR Plus medium: kombiner en flaske 100 ml mTeSR Plus 5x supplement med en flaske 400 ml mTeSR Plus Basal Medium.
- For å forberede 100 ml KSR medium: I 85 ml DMEM /F12, tilsett 15 ml Knockout serumerstatning (KSR, 15%), 1 ml kommersiell glutamin supplement (1%) og 1 ml ikke-essensiell aminosyre (NEAA, 1 %).
- For å forberede 100 ml N2 medium: I 100 ml neurobasal medium, tilsett 1 ml N2 (100x), 1 ml kommersiell glutamintilskudd og 1 ml NEAA.
- For å forberede 250 ml modningsmedium: I 250 ml neurobasal medium, tilsett 5 ml B27 (2%), 2,5 ml kommersielt glutamintilskudd (1%), og 2,5 ml Penicillin / Streptomycin (1%).
- Resuspend forbindelsene (retinsyre (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) i celle-kultur-grade DMSO til ønsket konsentrasjon. Forbered aliquots og lagre dem ved -20 °C i opptil 6 måneder. Følgende lagerløsninger brukes: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Belegg
MERK: For å forhindre polymerisering av kjellermembranmatrise ved varme, unngå repeterende fryse-tine sykluser. Håndter alle beleggprosedyrer med forhåndskjølte pipettespisser og rør om mulig. Kjellermembranmatrisen skal tines over natten ved 4 °C og aliquoted ved hjelp av forhåndskjølte pipettespisser og rør. Aliquots kan fryses ved -20 °C eller -80 °C.- Tin den frosne aliquot på 4 ° C på is. Aliquot bør holdes kaldt under beleggprosedyren. Bruk en forhåndskjølt pipettespiss til å fortynne kjellermembranmatrisen med iskald DMEM/F12 i forholdet 1:40. Ubrukt fortynnet kjellermembranmatrise kan oppbevares ved 4 °C i 2-3 dager, gitt at det ikke oppstod noen polymerisering.
- Tilsett 1 ml kjellermembranmatrise/DMEM-F12-oppløsning for å belegge en brønn av 6-brønnplaten.
- Inkuber platen ved romtemperatur i minst en time, eller 4 °C over natten. Belagte plater kan oppbevares ved 4 °C i maksimalt en uke.
4. Vedlikehold av iPS-celler
MERK: Udifferensierte iPS-celler opprettholdes i mTeSR Plus medium og subkulturert når samløpet på ≥ 90% observeres i en 6-brønnplate i denne protokollen. Mindre justeringer kan være nødvendig for iPS-celler dyrket i andre medier.
- Forbered kjellermembranmatrisebelagte retter som tidligere nevnt i trinn 3.2.
- Aspirer mTeSR Plus-mediet helt. Vask brønnen én gang med PBS og tilsett 0,5 ml passaging reagens (se Materialse tabell). Vent noen sekunder og aspirer løsningen.
- Inkuber platen ved 37 °C i inkubatoren i 5 min eller til cellene blir runde.
MERK: Inkubasjonstiden kan variere mellom ulike iPS-cellelinjer og samløpet. Kontroller regelmessig under mikroskopet for å bestemme dissosiasjonstiden under inkubasjonen. - Tilsett 1 ml mTeSR Plus medium og bank platen i 30-60 s for å løsne koloniene.
- Bland forsiktig 1 ml cellefjæringsoppløsning med 7 ml frisk mTeSR pluss medium. Ikke pipette mer enn 5 ganger.
- Plate i forholdet 1:8. Tilsett vanligvis 1 ml suspensjon fra trinn 4,5 og tilsett 1 ml mTeSR pluss medier supplert med 5-10 μM Y-27632 (ROCK-hemmer). Passasjefortynningsforholdet avhenger av iPSC-linjen.
- Plasser cellen i en 5 % CO2/37 °C inkubator. På neste dag fjerner du Y-27632 ved å legge til nytt mTeSR Plus-medium. Deretter endrer du media annenhver dag i utgangspunktet, og hver dag når cellen når høyere samløpet.
5. Differensiering av iPS-celler i motoriske nevroner
MERK: Alle alternativene nedenfor (5,2, 5,3 og 5,4) produserer MNOer med > 90 % effektivitet.
- Passaging iPSC for motor neuron differensiering
MERK: Differensiering kan utføres i enten 3D-protokoller (5.2) eller 2D (5.3).- La udifferensierte iPS-celler vokse til den når samløpet på ca. 80 % i mTeSR Plus medium i en 6-brønnplate.
- Aspirer mediet helt. Vask umiddelbart brønnen én gang med steril PBS og tilsett 0,5 ml celledissosiasjonsløsning til cellene.
- Inkuber platen ved 37 °C i inkubatoren i ca. 2-3 min, eller til cellene blir separert og runde, men forblir festet til brønnen.
- Tilsett 1 ml medium og pipette forsiktig opp og ned noen ganger ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette. Overfør cellefjæringen til et 15 ml rør bestående av 4 ml av mediet.
- Sentrifuge ved 200 x g i 3 min.
- Aspirer forsiktig overnamentet, slik at pelleten ikke er uforstyrret, og resuspend cellene i 1 ml av mediet supplert med 10 μM Y-27632.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og fortsett til enten 5,2 (3D differensiering) eller 5,3 (2D-differensiering).
- Dannelse av motorneuron spheroid (MNS) i 3D differensiering ("3D-protokoll")
MERK: En fullstendig middels endring gjøres daglig fra dag 0-12 av differensiering (figur 2).- Seed iPS-cellene fra trinn 5.1.7 til en 96 brønn U bunnplate ved 40.000 celler / godt i 100 μL av mTeSR Plus supplert med 10 μM Y-27632.
- På neste dag erstatter du hver brønn med 100 μL av det friske mediet.
- På dag 0 og 1: Aspirer kulturmediet og erstatt med 100 μL KSR medium (3.1.2) supplert med 10 μM SB431542 og 100 nM LDN-193189.
- På dag 2 og 3: Aspirer kulturmediet og erstatt med 100 μL KSR medium supplert med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 4 og 5: Forbered et blandet medium bestående av 75% KSR medium og 25% N2 medium (3.1.3). Deretter aspirerer kulturmediet og erstattes med 100 μL blandet medium supplert med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 6 og 7: Forbered et blandet medium bestående av 50% KSR medium og 50% N2 medium. Deretter aspirerer kulturmedium og erstatter det med 100 μL blandet medium supplert med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinosyre og 1 μM SAG.
- På dag 8 og 9: Forbered et blandet medium bestående av 25% KSR medium og 75% N2 medium. Deretter aspirerer kulturmedium og erstattes med 100 μL blandet medium supplert med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 10 og 11: Erstatt medium med 100 μl N2 medium supplert med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 12: Fortsett å overføre MNene til vevskulturbrikken (trinn 6) eller erstatt medium med 100 μL av modningsmediet (3.1.4) supplert med 20 ng / ml hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF).
MERK: MNS kan overføres til vevskulturbrikken fra dag 12 til dag 19. Sfæroider som ikke overføres bør holdes dyrket i 96 brønn U bunnplater i Modningsmediet supplert med 20 ng / ml BDNF til overføring.
- (Alternativ alternativ) 2D differensiering og overgang til 3D MNS ("2D-protokoll")
- Aspirer beleggoppløsningen fra en forhåndsbelagt 12 brønnplate.
- Seed iPS-cellene fra trinn 5.1.7 med en tetthet på 100.000 - 200.000 celler per brønn i mTeSR Plus medium med 10 μM Y-27632.
MERK: Fortsett å kultere de udifferensierte iPS-cellene i mTeSR Plus-medium uten Y-27632 til cellene når 80 % samløpet hvis cellene er for sparsomme for neste trinn (5.3.3). - På dag 0 og 1: Aspirer kulturmedium og erstatt med 1 ml KSR medium (3.1.2) supplert med 10 μM SB431542 og 100 nM LDN-193189.
- På dag 2 og 3: Aspirer kulturmedium og erstatt det med 1 ml KSR-medium supplert med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 4 og 5: Forbered et blandet medium bestående av 75% KSR medium og 25% N2 medium (3.1.3). Aspirer kulturmedium og erstatt med 1 ml blandet medium supplert med 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 6 og 7: Forbered et blandet medium bestående av 50% KSR medium og 50% N2 medium. Aspirer kulturmediet og erstatt det med 1 ml blandet medium supplert med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM retinsyre og 1 μM SAG.
- På dag 8 og 9: Forbered et blandet medium bestående av 25% KSR medium og 75% N2 medium. Aspirer kulturmediet og erstatt med 1 ml av det blandede mediet supplert med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 10 og 11: Erstatt medium med 1 ml N2 medium supplert med 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA og 1 μM SAG.
- På dag 12: Aspirer differensieringsmediet, vask raskt godt en gang med PBS og tilsett 0,5 ml celleavløsningsmedium. Plasser platen i en 37 °C inkubator i 1-3 min (f.eks. hvis du bruker TrypLE Express) eller 20-30 min (f.eks. hvis du bruker Accutase).
- Bruk en P1000 pipette, forsiktig samle cellene og overføre cellene til en 15 ml konisk rør med frisk Modning medium og sentrifuge på 200 x g i 3 min. Hvis cellene er klumpete, pipette forsiktig opp og ned et par ganger. Ikke pipetten for mye, da dette kan forårsake skade på cellene.
- Aspirer den overnaturante og resuspend pellet i 1 ml modningsmedium (3.1.4) supplert med 20 ng / ml BDNF.
- Tell cellen ved hjelp av et hemocytometer. Plate cellene på 10,000-40,000 celler per brønn i en 96 brønn U bunnplate i Modningsmedium supplert med 20 ng / ml BDNF. Innledende såetetthet bør optimaliseres avhengig av iPS-cellelinje og tilstanden til celler, slik at diameteren på sfæroidet er 800-900 μm når den introduseres i vevskulturbrikken. I de fleste tilfeller starter du på 20.000 celler per brønn i utgangspunktet, og deretter øker eller reduserer antall celler i henhold til størrelsen.
- Kultur i ytterligere 3-10 dager til cellene danner en sfæroid med en jevn kant.
- (Alternativ Alternativ): MNS dannelse fra motornevroner
MERK: Kommersielt tilgjengelige menneskelige iPS-celleavledede motornevroner (se Materialtabell)kan brukes til å generere MNOer i stedet for å differensiere fra menneskelige iPS-celler.- Etter tining av kryovial av motoriske nevroner, raskt resuspend cellene med 9 ml av motornevroner medium. Spinn ned på 400 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Aspirer den overnaturlige og resuspend pellet med motor neuron medium.
- Følg de samme trinnene som ovenfor (5.3.12- 5.3.13) for å produsere MNSs.
6. Utarbeidelse av vevskulturbrikken for motornerveorganoid (MNO) dannelse
- Steriliser den tilberedte PDMS (fra trinn 2.13) ved å senke den i 70 % etanol i petriskålen i minst 1 time.
MERK: Alle følgende trinn skal manipuleres i et biosikkerhetsskap. - Steriliser mikroskopglasset (76 x 52 mm) ved å senke det ned i 70 % etanol i petriskålen.
- Under tørkeprosessen av mikroskopglasset plasserer du PDMS-enheten på det halve våtmikroskopglasset og lar det tørke helt ved å vente over natten. Når den er helt tørket, bør PDMS-enheten holde seg til glasset.
MERK: Denne bindingen er ikke permanent for å tillate løsrivelse av PDMS-enhetene fra mikroskopglasset etter kulturen for vevssamling. Permanent binding av oksygenplasma kan brukes til å maksimere vedheft mellom PDMS og glass, men det ville forby demontering av chips og vevsamling. - Coat overflaten av mikrokanal i PDMS enhet og mikroskop glass med 30 μL fortynnet kjeller membran matrise i DMEM / F12 (1:40) ved å lage en dråpe på den ene siden av innløpet av kanalen og deretter aspirere løsningen fra den andre siden av innløpet med en pipette eller sugepumpe (Figur 3A). Ikke aspirer for mye volum av oppløsning for å unngå bobleforurensning.
- Deretter inkubere PDMS-enheten i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C i en sekundær beholder (f.eks. petriskål).
7. Motor nerve organoid (MNO) dannelse
- Bytt beleggoppløsningen med forvarmet 150 μL modningsmedium supplert med 20 ng/ml BDNF like før bruk.
- Plasser deretter MNS fra trinn 5.2.9 eller 5.3.13 i innløpet av mikrokanal ved hjelp av en mikropipette med en bredspiss. MNS kan spontant slå seg ned på bunnen av enheten ved tyngdekraften. Ikke bruk for mye trykk når du injiserer MNS (figur 3B).
MERK: Hvis MNS sitter fast på sideveggen av et hull i en vevskulturbrikke, aspirerer du forsiktig løsningen fra en annen side av innløpet. - Fyll et lite reservoar (f.eks. en hette på 15 ml rør) med sterilt vann og plasser den i nærheten av vevskulturbrikken i den sekundære beholderen for å forhindre middels fordampning. Deretter plasserer du den i en 5 % CO2/37 °C inkubator.
- For en middels endring, aspirere utmattet kultur medium fra midten av medium reservoaret (Figur 3C). Ikke aspirer hele mediet og vevet.
- Tilsett forsiktig friskt modningsmedium (med BDNF). Mediet bør endres hver 2-3 dager. Ikke tørk kulturmediet når som helst under kulturen. Axons vokser fra en MNS inn i kanalen og spontant monteres i en enkelt bunt i 2-3 uker, noe som resulterer i dannelsen av en MNO. MNO kan dyrkes i mer enn ytterligere 1 måned i enheten.
8. Nedstrøms analyse av MNO
- Full-mount immunstaining
- Ta enheten eller rettene til en kjemisk røykhette. Fiks MNO ved å legge til omtrent likt volum på 8 % paraformaldehyd (PFA) til media for å oppnå en endelig konsentrasjon på 4 % PFA. Fjern PDMS-enheten fra glasset og inkuber i 15-20 min ved romtemperatur.
- Vask MNO med PBS og gjenta deretter PBS vask 2x.
- Gjennomsyre MNO med 0,2% av Triton X-100 i PBS og inkubere i 5 min ved romtemperatur.
- Vask MNO med PBS og gjenta deretter PBS vask 2x. Deretter blokkerer MNO med PBS som inneholder 1% BSA og inkubere i 1 time ved romtemperatur.
- Fortynn primære antistoffer i PBS som inneholder 0,1 % BSA og inkuber MNO med den primære antistoffoppløsningen over natten ved 4 °C. Vask MNO med PBS tre ganger.
- Fortynn sekundære antistoffer i PBS med 0,1 % BSA og inkuber MNO med den sekundære antistoffløsningen i 2 timer ved romtemperatur. Vask deretter MNO tre ganger med PBS.
- Beis MNO med Hoechst i PBS som inneholder 0,2 % Triton-X og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
- Vask MNO tre ganger med PBS. Immunostained MNO er klar for avbildning med fluorescerende eller konfokale lasermikroskop.
- Vevsamling og isolering av aksonbunt
- Hell 10 ml HBSS-oppløsning i en 10 cm petriskål. Deretter senker du hele PDMS-enheten i HBSS-løsningen.
- Ta forsiktig PDMS fra mikroskopglasset under et stereomikroskop. Når vevet holder seg til PDMS-enheten, må du forsiktig bruke 1 ml HBSS-løsning fra toppen av hullet ved hjelp av en pipette.
- Når vevet kommer av fra PDMS, påfør forsiktig 1 ml HBSS på mikroskopglasset for å løsne PDMS helt fra mikroskopglasset.
- For å isolere en axon bunt fra en sfæroid, kutt axon bunt med en kirurgisk kniv eller pinsett under mikroskopet. Skjær aksonbunten litt langt unna (> 1 mm) fra sfæroidet for å unngå kontaminering av migrerte celler.
- Isolerte axon bunter og sfæroider kan analyseres videre av ulike nedstrøms analyser som RT-PCR, RNA-seq, og vestlige blotting.
- PDMS-kulturbrikken kan gjenbrukes. For å rengjøre kulturbrikken, soniker kulturbrikken i destillert vann i 15 min. Deretter sonikerer brikken i destillert vann supplert med 1% vaskemiddel. Vask kulturbrikken med destillert vann 5 ganger.
- Avbildning av kalsium
MERK: Neuronal aktivitet kan måles med kalsiumindikator både før og etter innsamling av vev fra vevskulturbrikken (fra 8.2). Protokollen er basert på et bestemt kommersielt sett (se Materials tabell). Alternativt kan andre kalsiumavbildningssett eller tilsvarende metoder brukes.- Vask MNO med PBS (uten Ca2+ og Mg2+) i tre ganger.
- Inkuber vevet med 5 μM Fluo-4AM i opptaksmedium (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgCl2,1,8 mM, CaCl2,13,8 mM glukose) i 30-60 min ved 37 °C. Et tillegg på 0,01-0,02 % av Pluronic F-127 kan hjelpe opptak av Fluo-4 AM inn i cellene.
- Vask deretter vevet med PBS (uten Ca2+ og Mg2+) og bytt det ut med opptaksmedium.
- Skaff deg tidsforløpsbilder ved hjelp av fluorescerende mikroskopi med et GFP/Cy2-filtersett. Angi eksponeringstiden som er mindre enn 20 ms per ramme.
- Åpne den kjøpte filmfilen som en bildesekvens ved hjelp av Bilde J.
- Hvis du bruker et FARGE-CCD- eller CMOS-kamera, konverterer du RGB-bilder til 16-biters monobilder. Åpne "Analyser | Verktøy | ROI Manager", Tegn interesseområdet og klikk " Leggtil". Klikk "Multi Measure". Intensitetsgraden i flere avkastninger vises i resultatet.
- Plott endringen av signalintensitet ved hjelp av generell dataanalyseprogramvare.
- Måling av nevronal aktivitet etter multielektrodearray
MERK: Aktiviteten til motornevroner kan fanges opp av en multielektrodearray (MEA).- Etter å ha opprettet en MNO, overføre den til en kjeller membran matrise belagt MEA sonde. Plasser vevet på elektroder.
- Tilsett 200 μL modningsmedium og inkuber 1-2 t ved 37 °C slik at MNO kan festes til overflaten.
- Bytt medium med opptaksmedium (8.3.2). Eventuelt plassere mesh og vekt på toppen av en MNO for å øke kontrakten med elektrodene.
- Sett MEA-sonden på opptakshodestadiet. Tørk kontakten mellom MEA-sonden og hodestadiet med 70% etanol.
- Begynn å registrere nevronal aktivitet ved å følge instruksjonene fra produsentene av MEA.
Representative Results
Motornevroner ble differensiert innen 12-14 dager i 3D differensieringsprosedyrer (figur 4 og figur 5). Viktigere, mer enn 60% av cellene uttryktmotor neuron markør HB9 under differensiering. Immunohistochemistry viste at ca 80% av cellene i MNS var SMI32-positive motornevroner. HB9 og SMI32 er de etablerte tidlig stadium motor neuron markører15,16. Uttrykket hb9 og SMI32 er de viktigste parametrene som må bekreftes for å sikre cellulær identitet av motornevroner. Etter innføringen av en MNS i kulturbrikken, strekker aksoner seg inn i kanalen og en axonbunt dannes. På grunn av mikrokanaler som fungerer som fysiske guider, forlenger aksoner fra MNS og danner en bunt ved axo-aksonær interaksjon (figur 6A). Det er viktig å bekrefte dannelsen av axonbunten ved mikroskopisk observasjon for å bekrefte genereringen av en MNO. En vellykket MNO bærer en akson bunt bredere enn 50 μm og få isolerte aksoner ut av bunten i kanalen. Første forlengelse av aksoner kan observeres 24 timer etter innføringen av sfæroid. I løpet av de neste 3-4 dagene nådde aksonene til midten av mikrokanal og når deretter til den andre enden innen ytterligere 10 dager (figur 6A). Følgelig samlet aksonene og dannet en rett og enveis bunt i 2-3 uker i en chip, og nevronale aktiviteter ble observert deretter.
Motor nerve organoider kan samles inn fra brikken ved å løsne PDMS fra mikroskopglasset for biologisk analyse (Figur 6B). Axon bunter og cellelegemer kan dissekeres og isoleres ved å kutte ved hjelp av en kirurgisk kniv eller pinsett under et mikroskop (Figur 6B). Disse biologiske materialene, inkludert RNA og protein, kan brukes til regelmessige biokjemiske analyser som RT-PCR og vestlig blotting. I axon bunter av MNOer, kjernefysiske eller dendrittiske maker proteiner er ikke påvist i vestlig blotting (Figur 6C).
I kombinasjon med en kalsiumindikator (Fluo-4 AM) kan nevronal aktivitet fanges i vevskulturbrikken. Spontan aktivitet av motorneuroner i sfæroidet og aksonbunten ble observert i MNO. Også nevrale aktiviteter ble observert ved hjelp av et multi-elektrode array system.
Figur 1: Dimensjonen av PDMS vev kultur chip.
(A) Fotomaske av vev kultur chip. (B)Dimensjoner av mikrokanal i vev kultur chip. Diameteren på basiskammeret for å holde motor neuron spheroid er 2 mm og hullet av PDMS over kammeret er 1, 5 mm. Bredden og høyden på en mikrokanal bro to kamre er begge 150 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av motorneurondilatering.
(A)Differensieringstrinnene involverte nevrale induksjon, mønster i motor neuron avstamning, og modning av motoriske nevroner. (B)To alternativer for å lage motor neuron sfæroid (MNS) fra iPS-celler: 3D-protokoll, og en 2D-protokoll med dissosiasjonstrinn av motornevroner. Motor nerve organoid (MNO) kan oppnås ved begge protokollene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Trinnvis protokoll for kjellermembranmatrisebelegg og motorneuron sfæroid introduksjon.
(A)Kjeller membran matrise belegg i kanalen av vev kultur chip. (B) MNS introduksjon i hullet på brikken. (C) Kultur medium endring ved aspirasjon av utmattet medium. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: 2D og 3D motor neuron differensiering.
(A) Tidsforløpet for representativ 3D MNS differensiering (3D-protokoll). Størrelsen på MNS økte gradvis over tid. Vekt bar: 500 μm. (B) Tidsforløpet for 2D-differensiering på -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-protokoll). Vekt bar: 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Karakterisering av motoriske nevroner.
(A) (Venstre) En kryoseksjon av en MNS farget med SMI-32 antistoff og DAPI. (Midten) Et fasekontrastbilde av replated MNS på en kjellermembranmatrisebelagt overflate. Aksonal forlengelse ble observert. (Høyre) Axons av replated MNS farget med Synapsin I og Tuj1 antistoffer. Vektstangen: 500 μm (venstre og midten) og 50μm (høyre). (B)Et representativt bilde av 2D motorneuroner immunostained med Tuj og HB9 antistoffer. Vektstangen: 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Karakterisering av en motornerveorganoid (MNO) generert i en kulturbrikke.
(A)Representative bilder av akson forlengelse og tykk axon bunt dannelse på D32. Vekt bar: 500 μm. (B)Immunstaining av motornerve organoid (MNO) ved SMI-32 og DAPI. Aksoner og cellelegemer kan isoleres ved fysisk skjæring. Vektstangen: 1 mm. (C) Renhet av proteinet fra aksoner og cellelegemer kvantifisert ved vestlig blotting. MAP2, en dendrittisk markør, ble ikke påvist i aksonalt protein, mens aksonalmarkør Tau1 er beriket i aksonalt protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen beskriver dannelsen av en motor nerve organoid (MNO) som har en axon bunt utvidet fra en motor neuron sfæroid generert fra menneskelige iPS-celler. Den dannede axonbunten er tykk, fleksibel og godt organisert i enveisstrukturer. Ved å dissekere aksonbunten kan aksonprotein med høy renhet oppnås tilstrekkelig til biokjemiske analyser. Neuronal aktivitet kan måles i akson bunter og sfæroider med kalsium imaging. Kontaminering av kjernefysiske og dendrittiske proteiner i aksonalt lysat ble ikke oppdaget ved vestlig blotting, noe som viser at vår metode effektivt separerte aksoner fra cellelegemer og dendritter.
En av fordelene med denne protokollen er den raske differensieringen og genereringen av MNO utstyrt med en axon-bunt, der alle prosesser kan gjøres i 4 uker med 3D-protokollen og 5-6 uker ved hjelp av 2D-protokollen. Dette er kort sammenlignet med andre protokoller som vanligvis tar 3-4 uker å bare differensiere til MN fra embryonale stamceller og iPS-celler17, og det tar ytterligere 2-4 uker å oppnå aksonal forlengelse. 3D-protokollen foretrekkes vanligvis over 2D-protokollen på grunn av kortere differensieringstid, færre trinn og redusert teknisk risiko uten dissosiasjonstrinnet sammenlignet med 2D-protokollen. Den mikrofluidiske-baserte vevskulturbrikken ble designet på en måte slik at aksonene til MNS kan forlenge mot det andre rommet gjennom mikrokanal, noe som letter dannelsen av en bunt av aksoner ved å indusere aksonære interaksjoner og affinitet mellom aksoner. På grunn av det enkle eksperimentelle oppsettet kan alle protokollene som er beskrevet her ikke bare utføres av bioingeniører, som er kjent med manipulering av en vevskulturbrikke, men også biologer og nevrologer som ikke er kjent med mikrofluidiker og mikrofabrikasjonsteknikker. Det bør bemerkes at trinn 1 og 2 også kan utføres ved hjelp av en ekstern fabrikasjonstjeneste.
Et av de kritiske trinnene for å oppnå protokollen er en sekvensiell endring av kulturmedium. Det anbefales å fullstendig endre kulturmediet på hvert trinn under differensieringen, slik at faktorer i det brukte mediet ikke forstyrrer MN-differensieringen. Et annet kritisk punkt i denne protokollen er å opprettholde udifferensierte iPS-celler i god kvalitet. Kvaliteten på den første iPS cellekulturen påvirker effektiviteten betydelig for å oppnå motornevroner og MNO. Et annet poeng er at diameteren på MNS skal være mindre enn størrelsen på hullet på brikken (1,5 mm). Større sfæroider kan ikke komme inn i kammeret, og potensielt oppleve alvorlig hypoksisk nekrose i midtdelen. Størrelsen på MNSs kan kontrolleres ved å endre et innledende såing antall iPS-celler (i 3D-protokoll) eller motornevroner (i 2D-protokoll). Såetettheten av celler bør optimaliseres for hver iPS-cellelinje.
Kompartaliserte mikrofluidiske enheter med mikrogropotter og små porefiltre har blitt mye brukt til å skille aksoner fra cellelegemer og dendritter. Denne teknikken kan også skille aksoner fra cellelegemer og dendritt, med overlegen overflod av aksoner i buntet vev. Sammenlignet med de andre metodene, er en stor begrensning av denne metoden at den ikke kan skille to forskjellige kulturmedier i den nåværende utformingen av vevskulturbrikken, noe som hindrer evnen til co-kultur av to forskjellige celler som krever to forskjellige medier. En annen begrensning er at PDMS-brikken satte forhåndsbestemt begrensning på størrelsen på vevet. En sfæroid større enn hullet kan ikke komme inn i kammeret, og axon bunten kan ikke vokse tykkere enn bredden på mikrofluidisk kanal.
Denne metoden kan brukes på andre typer nevroner. Vår gruppe har vist evne til å modellere en cerebral kanal ved hjelp av en modifisert metode kombinert med cerebral organoidteknikker 18. Kortikale sfæroider ble introdusert i begge rom og aksonene spontant langstrakte gjensidig mot hver sfæroid, og deretter en akson bunt dannet spontant. Som et resultat kan to kortikale sfæroider kobles til gjennom en aksonbunt, og vevet kan oppnås som ett stykke. Dette viser at tilnærmingen er svært allsidig for å danne axon bunt vev uavhengig av nevronale celletyper. I denne protokollen ble humane iPS-celler brukt, men andre stamceller, inkludert menneskelige ES-celler og humane nevrale stamceller, kan brukes med endringer i den presenterte protokollen. 3D-sfæroider av nevroner kan genereres av ulike protokoller19,20. Denne metoden for å lage vev med en axon bunt kan potensielt kombineres i fremtiden med de andre differensieringsprotokoller for å lage 3D MN sfæroid. I tillegg kan tykkelsen og lengden på axonbunten styres ved ganske enkelt å endre bredden og høyden på mikrokanaler av vevskulturbrikken for fremtidige utviklinger.
Vi tror at denne protokollen kan brukes til narkotikatesting og screening og kan bidra til forståelsen av mekanismer som ligger til grunn for utvikling og sykdommer i akson fascicles.
Disclosures
I en del av denne protokollen har et patent blitt lisensiert til Jiksak Bioengineering, Inc. som ble grunnlagt av Jiro Kawada.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 og 18K19903, Core-2-core program, og Beyond AI institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
| 6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
| Accutase | ICT | AT104 | |
| B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
| Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
| HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
| HBSS | Wako | 085-09355 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
| Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
| MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
| Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
| N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
| Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
| ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
| Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
| SAG | Sigma | SML1314 | |
| SB431542 | Wako | 192-16541 | |
| Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
| Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
| Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
| SU5402 | Sigma | SML0443 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
| TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
| Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
| Y-27632 | Wako | 030-24021 |
References
- Raper, J., Mason, C. Cellular strategies of axonal pathfinding. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).
- Ito, Y., et al. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science. 353 (6299), 603-608 (2016).
- Fujimori, K., et al. Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).
- Chen, H., et al. Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons. Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
- Imamura, K., et al. The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis. Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).
- Wang, L., Marquardt, T. What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).
- Kawada, J., et al. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. JoVE. (141), e58421 (2018).
- Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. JoVE. (147), e59250 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).
- Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions. bioRxiv. , (2020).
- Cullen, D. K., et al. Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids. iScience. 21, 57-67 (2019).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).
- Egawa, N., et al. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).
- Qu, Q., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).
- Kirihara, T., et al. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions. iScience. 14, 301-311 (2019).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).
