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Neuroscience

त्रि-आयामी मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड जनरेशन

Published: September 24, 2020 doi: 10.3791/61544
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,3, 4, 1, 1,2
1Institute of Industrial Science, The University of Tokyo, 2Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, The University of Tokyo, 3Faculty of Science and Engineering, Tecnologico de Monterrey, 4Jiksak Bioengineering, Inc.

Summary

यह प्रोटोकॉल एक ऊतक संस्कृति चिप में एक गोलाकार से विस्तारित एक्सोन के एक मजबूत बंडल की सहज असेंबली के माध्यम से मानव आईपीएस सेल-व्युत्पन्न मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड बनाने के लिए एक व्यापक प्रक्रिया प्रदान करता है।

Abstract

एक्सॉन का एक फासिकल तंत्रिका तंत्र में देखे जाने वाले प्रमुख संरचनात्मक रूपांकनों में से एक है। एक्सोन फासिक्स के व्यवधान से विकासात्मक और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियां हो सकती हैं। यद्यपि एक्सॉन के कई अध्ययन किए गए हैं, लेकिन एक्सॉन फैक्स के गठन और शिथिलता की हमारी समझ अभी भी मजबूत त्रि-आयामी इन विट्रो मॉडल की कमी के कारण सीमित है। यहां, हम माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित ऊतक संस्कृति चिप में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं से एक मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड (MNO) की तेजी से उत्पादन के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, विधि के लिए उपयोग किए जाने वाले चिप्स के निर्माण का वर्णन किया गया है। मानव आईपीएस कोशिकाओं से, एक मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड (एमएनएस) बनता है। इसके बाद, विभेदित एमएनएस को चिप में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इसके बाद, एक्सॉन अनायास स्पेरोइड से बाहर निकलते हैं और चिप में सुसज्जित माइक्रोचैनल के भीतर एक फैक्सल में इकट्ठा होते हैं, जो स्पफेरोइड से विस्तारित एक्सॉन के बंडल को ले जाने वाले MNO ऊतक उत्पन्न करता है। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए, एमएनएनओ को चिप से बाहर निकाला जा सकता है, जो जैव रासायनिक विश्लेषणों के साथ-साथ कैल्शियम इमेजिंग और मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग के लिए रूपात्मक विश्लेषणों के लिए तय किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न एमएनओ दवा परीक्षण और स्क्रीनिंग की सुविधा दे सकते हैं और अक्षों के फैक्स के विकास और रोगों में अंतर्निहित तंत्र की समझ में योगदान कर सकते हैं।

Introduction

स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स (एमएन) शरीर की गति को नियंत्रित करने के लिए कंकाल की मांसपेशियों को एक्सोन का विस्तार करता है। उनके अक्षीय प्रक्षेप पथ विकास प्रक्रिया में अत्यधिक संगठित और विनियमित होते हैं । अक्षत विस्तार और मार्गदर्शन1पर कई अध्ययनों के बावजूद, संगठित अक्षतंश बंडल गठन के लिए तंत्र अभी भी जांच के अधीन हैं। मोटर न्यूरॉन्स के एक्सॉन अक्सर न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) 2 से क्षतिग्रस्तहोतेहैं, लेकिन एक्सॉन फासिकल्स पर नुकसान के रोगविज्ञानी तंत्र खराब समझ जाते हैं। इस प्रकार, क्षेत्र में एक्सॉन बंडल गठन और प्रतिगमन को फिर से शुरू करने के लिए एक शारीरिक और रोग मॉडल की आवश्यकता होती है।

एक मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन एएलएस3जैसे विकास और बीमारियों को समझने के लिए एक आशाजनक मंच है। मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस कोशिकाओं) रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग कर रोगों मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आज तक, बहुलपके स्टेम कोशिकाओं से एमएन में विभिन्न विभेदन विधियों की सूचना दी गई है4,5,6। हालांकि, दो आयामी संस्कृति में न्यूरॉन्स के अक्षों बेतरतीब ढंग से उन्मुख होते हैं और विकासशील नसों के भीतर वीवो माइक्रोएनवायरमेंट में पुनः रीकैपिटल नहीं होते हैं जिसमें अक्षों को एकदिशात्मक रूप से घने अक्षीय रूप से इकट्ठा किया जाता है7। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, हमने मानव आईपीएस कोशिकाओं8से मोटर तंत्रिका जैसी त्रि-आयामी ऊतक उत्पन्न करने के लिए एक तकनीक विकसित की है, और ऊतक को मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड (MNO) के रूप में नामित किया है। MNO सेल एक मोटर न्यूरॉन स्पेरोइड (एमएनएस) में स्थित निकायों और एक अक्षीय fascicle स्फेरॉइड से बाहर बढ़ाया होते हैं । फेसिकल में एक्सॉन एकदिशात्मक रूप से उन्मुख होते हैं, जो मोटर नसों के विकास में अक्षों जैसा दिखता है। इसलिए, एमएनओ विशिष्ट रूप से एक शारीरिक अक्षीय माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करते हैं, जो किसी अन्य पहले विकसित न्यूरोनल संस्कृति विधियों द्वारा नहीं किया गया था।

इस प्रोटोकॉल में, हम विकसित चिप्स में ऊतक संस्कृति चिप्स निर्माण, रैपिड मोटर न्यूरॉन भेदभाव, और मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड गठन के तरीकों का वर्णन करते हैं। हमारे ऊतक संस्कृति चिप बहुत सरल है, और यह केवल एक गोलाकार, एक अक्षतंश बनाने के लिए एक माइक्रोचैनल, और आवास अक्षतंप टर्मिनलों के लिए एक डिब्बे को स्वीकार करने के लिए एक डिब्बे शामिल हैं । इस उपकरण में माइक्रोग्रोव या माइक्रोपोर फिल्टर सहित जटिल संरचनाएं नहीं हैं जिनका उपयोग अक्सर9,10के आकार के अक्षों और कोशिका निकायों को अलग करने के लिए किया जाता है । इसलिए हमारे उपकरणों को आसानी से इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों का पालन करके गढ़ा जा सकता है अगर एक फोटोलिथोग्राफी सेटअप उपलब्ध है ।

मानव आईपीएस कोशिकाओं का तेजी से भेदभाव उत्प्रेरण और पैटर्निंग कारकों (SB431542, एलडीएन-193189, रेटिनोइक एसिड (आरए), और चिकनी एगोनिस्ट (एसएजी)) और त्वरण कारकों (SU5402 और DAPT) के अनुकूलित संयोजन के साथ हासिल किया जाता है। यह सूचित किया गया है कि SU5402 और DAPT के संयोजन से परिधीय न्यूरॉन्स और तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं के भेदभाव में तेजी आती है11. इस प्रोटोकॉल में, हम एमएनओ उत्पन्न करने के लिए तीन अलग-अलग तरीके प्रदान करते हैं, ताकि पाठक अपनी आवश्यकताओं के लिए सबसे उपयुक्त विधि पर निर्णय ले सकें। हम एक स्फेरॉइड (3डी विधि) बनाने के बाद मानव आईपीएस कोशिकाओं के भेदभाव को करने की सलाह देते हैं, क्योंकि विभेदित एमएनएस को सीधे ऊतक संस्कृति चिप में स्थानांतरित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, मानव आईपीएस कोशिकाओं को मोनोलेयर (2D) संस्कृति में मोटर न्यूरॉन्स में विभेदित किया जा सकता है, और फिर त्रि-आयामी मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड में बनाया जा सकता है जैसा कि हमने पहले8रिपोर्ट की थी। हमने प्रोटोकॉल को अपडेट किया है, और इस प्रोटोकॉल में वर्णित त्रि-आयामी भेदभाव विधि के साथ, 2D से 3 डी तक संक्रमण से बचा जा सकता है और एमएनओ को कम भेदभाव समय, कम कदमों और कम तकनीकी जोखिमों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध न्यूरॉन्स भी भेदभाव के लिए समय को कम करने के लिए MNS उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एक MNO उत्पन्न करने के लिए, हम ऊतक संस्कृति चिप में एक एमएनएस सुसंस्कृत। एक्सोन स्पेरोइड से बढ़ जाते हैं और माइक्रोचैनल में विस्तारित होते हैं जिसमें अक्षों को इकट्ठा किया जाता है और एकदिशात्मक रूप से संरेखित किया जाता है। यह सूक्ष्मचैनल में एक्सोन के कसकर इकट्ठे किए गए एकिश्शियन बंडल ऊतक के एक्सो-एक्सोनल इंटरैक्शन और सहज गठन की सुविधा प्रदान करता है, जो इस प्रोटोकॉल द्वारा विशिष्ट रूप से प्राप्त किया जाता है, जबकि या तो सहज बंडल गठन या निर्देशित अक्षीय अभिविन्यास अकेले अन्य प्रोटोकॉल12,13,14द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। एक विशिष्ट प्रयोग में, कुछ कोशिकाएं गोलाकार से माइक्रोचैनल में माइग्रेट होती हैं और अधिकांश कोशिकाएं पास के स्फेरॉइड रहती हैं। यह विधि कोशिका निकायों से एक्सोन को अलग करने के लिए आकार-निर्भर शारीरिक बाधाओं (जैसे, माइक्रोग्रूव्स या माइक्रोपोर फिल्टर) का उपयोग किए बिना एक्सोन को अनायास स्फेरॉइड से अलग करने की अनुमति देती है।

परिणामी MNO को विभिन्न परीक्षाओं के अधीन किया जा सकता है, जिसमें रूपात्मक, जैव रासायनिक और शारीरिक विश्लेषण शामिल हैं। सेल शरीर और विस्तारित एक्सॉन बंडल को काटने से शारीरिक रूप से अलग किया जा सकता है और डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए अलग से विश्लेषण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, जैव रासायनिक परख। आरएनए और प्रोटीन सहित जैविक सामग्रियों को आरटी-पीसीआर और पश्चिमी ब्लॉटिंग सहित नियमित जैव रासायनिक परख के लिए कुछ एक्सॉन बंडलों से अलग किया जा सकता है। यहां, हम आईपीएस कोशिकाओं से मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो एक्सॉन फैक्स के अंतर्निहित विकास और रोग का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक शारीरिक और रोग मॉडल प्रदान करता है।

Protocol

1. फोटोलिथोग्राफी द्वारा एसयू-8 मोल्ड निर्माण

नोट: इस प्रक्रिया में खतरनाक रसायन शामिल हैं। भर में धूम हुड और पीपीई का उपयोग करें।

  1. सिलिकॉन वेफर (व्यास में 4 इंच, 1-मिमी मोटाई, पॉलिश) को एसीटोन के साथ साफ करें और नाइट्रोजन गैस के साथ उड़ा दें। फिर सूखने के लिए 3 मिनट के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना।
  2. एक साफ वेफर पर एसयू-8 २१०० के 3 एमएल बांटना ।
  3. कोट-8 समान रूप से वेफर पर 10 एस के लिए ५०० आरपीएम पर एक स्पिन कोटर का उपयोग कर और फिर, क्रमिक रूप से 300 आरपीएम के त्वरण के साथ 30 s के लिए १५०० आरपीएम पर स्पिन एस एस एस एस एस की एक १५० μm मोटी परत प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सिलिकॉन वेफर स्पिन कोटर के केंद्र में तैनात है और सही ढंग से वैक्यूम द्वारा तय किया गया है।
  4. सॉफ्ट बेक गर्म प्लेट पर 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर, 7 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर, और 45 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. फोटोमास्क(चित्रा 1)को मास्क एलाइनर में सेट करें और 60 एस के लिए यूवी लाइट (365 एनएम) का पर्दाफाश करें।
    नोट: एक्सपोजर समय को यूवी लाइट की उचित खुराक द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
  6. एक्सपोजर के बाद, वेफर को 6 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें, और गर्म प्लेट पर 13 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर।
  7. एक कक्षीय शेखर का उपयोग कर आंदोलन के साथ एसयू-8 डेवलपर में 10-20 मिनट के लिए वेफर विकसित करना, प्रक्रिया के दौरान एक बार विकासशील समाधान बदल रहा है।
    नोट: विकासशील समय का विस्तार जब एसयू-8 का मलबा रहता है ।
  8. आइसोप्रोपैनॉल में वेफर कुल्ला करें और नाइट्रोजन गैस के साथ वेफर को धीरे-धीरे सुखा लें।
  9. एक मापने माइक्रोस्कोप द्वारा जमा एसयू-8 की ऊंचाई को मापने और सुनिश्चित करें कि यह लगभग १५० μm मोटी है । इसे कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

2. पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक आधारित ऊतक संस्कृति चिप निर्माण

  1. डबल साइड टेप द्वारा एसयू-8-जमा वेफर को एक कंटेनर (जैसे, 15 सेमी प्लास्टिक पेट्री डिश) को ठीक करें।
  2. नाइट्रोजन गैस का उपयोग कर वेफर से धूल उड़ा।
  3. सीलनाइज करने के लिए, एसयू-8-जमा वेफर को एक छोटे कंटेनर (जैसे, 35 मिमी डिश) के साथ एक वैक्यूम चैंबर में डाल दें। छोटे कंटेनर में (ट्राइडेफल्लोरो-1, 1, 2,2-टेट्राहाइड्रोक्टिल) के 10 माइक्रोन ड्रॉप करें। सीधे (ट्राइडेकैफ्लोरो-1,1,2,2-टेट्राहाइड्रोक्टिल) )) को सीधे लागू न करें- 1- ट्राइक्लोरोसिलेन को एसयू-8 वेफर पर।
  4. वैक्यूम चैंबर को कसकर बंद करें और कम से कम 2 घंटे के लिए वैक्यूम पंप चालू करें।
  5. एक प्लास्टिक कप लें और सिलिकॉन इलास्टोमर (उदाहरण के लिए, सिलपॉट 184 या समान रूप से सिल्गार्ड 184) और 10:1 वजन अनुपात में इलाज एजेंट डालें। फिर, वैक्यूम कक्ष में एक स्पैटुला और डेगास का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं जब तक कि बुलबुले पूरी तरह से हटा न जाएं।
  6. पीडीएमएस मिश्रण को एसयू-8 वेफर के साथ कंटेनर में वांछित मोटाई (3-4 मिमी) और बुलबुले को हटाने के लिए फिर से डेगास डालें।
  7. पीडीएमएस को पूरी तरह से ठीक करने के लिए कम से कम 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में बेक करें।
  8. ठंडा होने के बाद ठीक पीडीएमएस को स्केलपेल या रेजर ब्लेड का इस्तेमाल कर वेफर से काट लें।
  9. ऊतक संस्कृति चिप के दो कक्षों बनाने के लिए, पंच दो छेद जहां दो डिब्बों एक १.५ मिमी व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग करके स्थित हैं ।
  10. एक मध्यम जलाशय बनाने के लिए, एक और पीडीएमएस मिश्रण (सिलिकॉन इलास्टोमर और इलाज एजेंट को 10:1 वजन अनुपात पर तैयार करें) और इसे एक नए 10 सेमी पेट्री डिश में डालें। पीडीएमएस की मोटाई के 5 मिमी तक डालने की मात्रा को समायोजित करें।
  11. पीडीएमएस को पूरी तरह से ठीक करने के लिए कम से कम 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में बेक करें।
  12. पीडीएमएस को ठंडा करने के बाद आयताकार अंगूठी पाने के लिए ठीक पीडीएमएस को स्केलपेल से काट लें।
  13. उन दोनों के बीच ठीक पीडीएमएस लागू करने और इकट्ठे पीडीएमएस परतों पाक द्वारा मध्यम जलाशय के साथ नीचे परत बांड । इस बंधुआ संरचना का परिणाम पीडीएमएस टिश्यू कल्चर चिप में होता है।
  14. सतह से धूल और छोटे कणों को हटाने के लिए स्कॉच टेप द्वारा पीडीएमएस टिश्यू कल्चर चिप को साफ करें। धूल और यूवी से संरक्षित होने पर पीडीएमएस टिश्यू कल्चर चिप्स को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. संस्कृति की तैयारी

  1. संस्कृति माध्यम
    नोट: नीचे सूचीबद्ध सभी मीडिया को नसबंदी के लिए फ़िल्टर किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया हो। तैयार मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और एक महीने के भीतर उपयोग किया जा सकता है।
    1. mTeSR प्लस माध्यम तैयार करने के लिए: mTeSR प्लस बेसल माध्यम की 400 एमएल की एक बोतल के साथ 100 एमएल mTeSR प्लस 5x पूरक की एक बोतल गठबंधन।
    2. केएसआर माध्यम की 100 एमएल तैयार करने के लिए: डीएमईएम/एफ 12 के 85 एमएल में नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (केएसआर, 15%), 1 एमएल कमर्शियल ग्लूटामाइन सप्लीमेंट (1%) और गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए, 1%) का 1 एमसीए।
    3. एन 2 माध्यम के 100 एमएल तैयार करने के लिए: न्यूरोबेसल माध्यम के 100 एमएल में, एन 2 (100x) के 1 एमएल, वाणिज्यिक ग्लूटामाइन पूरक के 1 एमएल और एनईएए के 1 एमएल जोड़ें।
    4. परिपक्वता माध्यम के 250 एमएल तैयार करने के लिए: न्यूरोबेसल माध्यम के 250 एमएल में, बी 27 (2%), वाणिज्यिक ग्लूटामाइन पूरक (1%), और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) की 2.5 एमएल की 5 एमएल जोड़ें।
    5. कोशिका-संस्कृति ग्रेड डीएमएसओ में यौगिकों (रेटिनोइक एसिड (आरए), SB431542, एलडीएन-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) को वांछित एकाग्रता के लिए फिर से खर्च करें। एलिकोट तैयार करें और उन्हें 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। निम्नलिखित स्टॉक समाधानों का उपयोग किया जाता है: 1 mM आरए, 10 m SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
  2. आवरण
    नोट: गर्मी से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के बहुलीकरण को रोकने के लिए, दोहराव फ्रीज-गल चक्र से बचें। यदि संभव हो तो प्री-कूल्ड पिपेट टिप्स और ट्यूब के साथ सभी कोटिंग प्रक्रियाओं को संभालें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गल जाना चाहिए और पूर्व-ठंडा पिपेट टिप्स और ट्यूबों का उपयोग करके अलीकोट किया जाना चाहिए। एलिकोट्स को -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जा सकता है।
    1. बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए एलिकोट को पिघला दें। कोटिंग प्रक्रिया के दौरान एलिकोट को ठंडा रखा जाना चाहिए। एक पूर्व ठंडा पिपेट टिप का उपयोग करना, 1:40 के अनुपात में बर्फ ठंडा DMEM/F12 के साथ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पतला । अप्रयुक्त पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को 2-3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है कि कोई बहुलीकरण नहीं हुआ।
    2. 6 अच्छी तरह से प्लेट के एक अच्छी तरह से कोट करने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स/DMEM-F12 समाधान के 1 ml जोड़ें ।
    3. कमरे के तापमान पर थाली को कम से कम एक घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए इनक्यूबेट करें। लेपित प्लेटों को अधिकतम एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. आईपीएस कोशिकाओं का रखरखाव

नोट: इस प्रोटोकॉल में 6 अच्छी प्लेट में 90% ≥ की उदारता देखी जाने पर एमटीएसआर प्लस माध्यम और उप-संस्कारी में अविभेदित आईपीएस कोशिकाओं को बनाए रखा जाता है। अन्य मीडिया में सुसंस्कृत आईपीएस कोशिकाओं के लिए मामूली समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित व्यंजन तैयार करें जैसा कि पहले चरण 3.2 में उल्लेख किया गया था।
  2. पूरी तरह से mTeSR प्लस माध्यम आकांक्षी। पीबीएस के साथ एक बार अच्छी तरह से धोएं और पासेजिंग रिएजेंट के 0.5 एमएल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)। कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें और समाधान को एएस्पेट करें।
  3. 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें या जब तक कोशिकाएं गोल न हो जाएं।
    नोट: इनक्यूबेशन समय विभिन्न आईपीएस सेल लाइनों और संकुचन के बीच भिन्न हो सकता है। इनक्यूबेशन के दौरान वियोजन समय निर्धारित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे समय-समय पर जांच करें।
  4. 1 एमएल एमटीएसआर प्लस मीडियम डालें और कॉलोनियों को अलग करने के लिए 30-60 एस के लिए प्लेट टैप करें।
  5. सेल सस्पेंशन सॉल्यूशन के 1 एमएल को फ्रेश एमटीएसआर प्लस मीडियम के 7 एमएल के साथ धीरे-धीरे मिलाएं। 5 से अधिक बार पिपेट न करें।
  6. 1:8 के अनुपात में प्लेट। आमतौर पर चरण 4.5 से निलंबन का 1 मिलियन जोड़ें और वाई-27632 (रॉक अवरोधक) के 5-10 माइक्रोन के साथ 1 मिलियन mTeSR प्लस मीडिया पूरक जोड़ें। पैसेज कमजोर पड़ने का अनुपात आईपीएससी लाइन पर निर्भर करता है।
  7. सेल को 5% CO2/37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। अगले दिन नए सिरे से एमटीईएसआर प्लस मीडियम डालकर वाई-27632 निकालें। इसके बाद, शुरू में हर दूसरे दिन मीडिया बदलें, और हर दिन के रूप में सेल उच्च योग्यता तक पहुंचता है ।

5. मोटर न्यूरॉन्स में आईपीएस कोशिकाओं का भेदभाव

नोट: नीचे दिए गए सभी विकल्प (5.2, 5.3, और 5.4) 90% दक्षता के साथ एमएनओ का उत्पादन करते हैं।

  1. मोटर न्यूरॉन भेदभाव के लिए पासेजिंग आईपीएससी
    नोट: भेदभाव या तो 3D (5.2) या 2D (5.3) प्रोटोकॉल में सफलतापूर्वक आयोजित किया जा सकता है।
    1. अविभेदित आईपीएस कोशिकाओं को तब तक बढ़ने दें जब तक कि यह 6 अच्छी प्लेट में एमटीएसआर प्लस माध्यम में लगभग 80% की मजबूती तक न पहुंच जाए।
    2. माध्यम को पूरी तरह से आकांक्षी करें। बाँझ पीबीएस के साथ एक बार अच्छी तरह से धोएं और कोशिकाओं में सेल वियोजन समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें।
    3. लगभग 2-3 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें, या जब तक कोशिकाएं अलग और गोल न हो जाएं लेकिन कुएं से जुड़ी रहें।
    4. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके मध्यम और धीरे-धीरे 1 एमएल जोड़ें और कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। कोशिका निलंबन को माध्यम के 4 एमएल से मिलकर 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    6. सावधानी से सुपरनैंट को एस्पिरेट करें, जिससे गोली अव्यवस्थित हो जाती है, और वाई-27632 के 10 माइक्रोन के साथ पूरक माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च किया जाता है।
    7. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और या तो 5.2 (3D भेदभाव), या 5.3 (2D भेदभाव) पर आगे बढ़ें।
  2. 3 डी भेदभाव ("3डी प्रोटोकॉल") में मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड (एमएनएस) का गठन
    नोट: एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन भेदभाव के दिन 0-12 से दैनिक किया जाता है(चित्रा 2)।
    1. चरण 5.1.7 से आईपीएस कोशिकाओं को 40,000 कोशिकाओं पर 96 अच्छी तरह से यू बॉटम प्लेट/
    2. अगले दिन, प्रत्येक कुएं को ताजा माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ बदलें।
    3. 0 और 1 दिन: संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और 10 μM SB431542 और 100 एनएम एलडीएन-193189 के साथ पूरक केएसआर माध्यम (3.1.2) के 100 माइक्रोन के साथ प्रतिस्थापित करें।
    4. 2 और 3 दिन: संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और 10 माइक्रोन एसबीएचआर एसबी431542, 100 एनएम एलडीएन-193189, 5 माइक्रोन ईएम डीएपीटी, 5 माइक्रोन एसयू5402, 1 टीएम आरएएम और 1 माइक्रोन एसएजी के साथ पूरक के 100 माइक्रोल के साथ प्रतिस्थापित करें।
    5. 4 और 5 दिनों पर: 75% केएसआर माध्यम और 25% N2 मध्यम (3.1.3) से मिलकर एक मिश्रित माध्यम तैयार करें। फिर, संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और मिश्रित माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ प्रतिस्थापित करें 10 μM SB431542, 100 एनएम एलडीएन-193189, 5 माइक्रोन डीएपीटी, 5 माइक्रोन एसयू 5402, 1 माइक्रोन आरए, और 1 μm SAG के साथ पूरक।
    6. 6 और 7 दिनों पर: 50% केएसआर माध्यम और 50% N2 माध्यम से मिलकर एक मिश्रित माध्यम तैयार करें। फिर, संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे 5 माइक्रोन डीएपीटी, 5 माइक्रोन सु5402, 1 माइक्रोन रेटिनोइक एसिड और 1 माइक्रोन एसएजी के साथ मिश्रित माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ प्रतिस्थापित करें।
    7. 8 और 9 दिनों पर: एक मिश्रित माध्यम तैयार करें जिसमें 25% केएसआर माध्यम और 75% एन2 माध्यम शामिल हैं। फिर, संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और 5 माइक्रोन डीएपीटी, 5 माइक्रोन सु5402, 1 माइक्रोएम आरए और 1 माइक्रोन एसएजी के साथ मिश्रित माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ प्रतिस्थापित करें।
    8. 10 और 11 दिनों में: 5 माइक्रोन डीएपीटी, 5 माइक्रोन एसयू5402, 1 माइक्रोन आरए और 1 माइक्रोन एसएजी के साथ पूरक N2 माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ मध्यम की जगह।
    9. 12 दिन: ऊतक संस्कृति चिप (चरण 6) में एमएन स्थानांतरित करने के लिए आगे बढ़ें या 20 एनजी/एमएल मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (BDNF) के साथ पूरक परिपक्वता माध्यम (३.१.४) के १०० μL के साथ माध्यम की जगह ।
      नोट: एमएनएस ऊतक संस्कृति चिप को स्थानांतरित किया जा सकता है 12 दिन से शुरू 19 दिन तक । स्थानांतरित नहीं कर रहे हैं कि Spheroids 96 अच्छी तरह से यू नीचे प्लेटों में Maturation मध्यम 20 एनजी के साथ पूरक में सुसंस्कृत रखा जाना चाहिए/
  3. (वैकल्पिक विकल्प) 2D भेदभाव और 3D MNS के लिए संक्रमण ("2D प्रोटोकॉल")
    1. कोटिंग समाधान को पूर्व-लेपित 12 अच्छी प्लेट से हटा दें।
    2. वाई-27632 के 10 माइक्रोन के साथ एमटीएसआर प्लस माध्यम में 100,000 - 200,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से चरण 5.1.7 से आईपीएस कोशिकाओं को बीज दें।
      नोट: वाई-27632 के बिना mTeSR प्लस माध्यम में अविभेदित आईपीएस कोशिकाओं को तैयार करना जारी रखें जब तक कि कोशिकाएं 80% तक न पहुंच जाएं यदि कोशिकाएं अगले चरण (5.3.3) के लिए बहुत विरल हैं।
    3. दिन 0 और 1 पर: केएसआर माध्यम (3.1.2) के 1 एमसीएल के साथ 1 मिलियन एसबी431542 और 100 एनएम एलडीएन-193189 के साथ प्रतिस्थापित करें।
    4. 2 और 3 दिन: एस्पिरेट कल्चर मीडियम और इसे 10 μM SB431542, 100 एनएम एलडीएन-193189, 5 माइक्रोन 1m DAPT, 5 माइक्रोन SU5402, 1 μm RA और 1 μM SAG के साथ पूरक के 1 mL के साथ बदलें ।
    5. 4 और 5 दिनों पर: 75% केएसआर माध्यम और 25% N2 मध्यम (3.1.3) से मिलकर एक मिश्रित माध्यम तैयार करें। एस्पिरेट कल्चर मीडियम और 10 μM SB431542, 100 एनएम एलडीएन-193189, 5 माइक्रोन डीएपीटी, 5 माइक्रोन एसयू5402, 1 माइक्रोन आरए, और 1 माइक्रोन एसएजी के साथ मिश्रित माध्यम के 1 मिलीएल के साथ प्रतिस्थापित करें।
    6. 6 और 7 दिनों पर: 50% केएसआर माध्यम और 50% N2 माध्यम से मिलकर एक मिश्रित माध्यम तैयार करें। संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे 5 माइक्रोन डीएपीटी, 5 माइक्रोन एसयू5402, 1 माइक्रोन रेटिनोइक एसिड और 1 माइक्रोन एसएजी के साथ पूरक मिश्रित माध्यम के 1 मिलियन के साथ प्रतिस्थापित करें।
    7. 8 और 9 दिनों पर: एक मिश्रित माध्यम तैयार करें जिसमें 25% केएसआर माध्यम और 75% एन2 माध्यम शामिल हैं। संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और मिश्रित माध्यम के 1 एमसीएल के साथ प्रतिस्थापित करें 5 माइक्रोन डीएपीटी, 5 माइक्रोन SU5402, 1 माइक्रोन आरए और 1 माइक्रोन एसएजी के साथ पूरक।
    8. 10 और 11 दिनों पर: 5 माइक्रोन डीएपीटी, 5 माइक्रोन एसयू5402, 1 माइक्रोएम आरए और 1 माइक्रोन एसएजी के साथ पूरक N2 माध्यम के 1 एमसीएल के साथ मध्यम की जगहें।
    9. 12 दिन: भेदभाव माध्यम को एस्पिरेट करें, पीबीएस के साथ एक बार अच्छी तरह से धोएं और सेल टुकड़ी माध्यम का 0.5 एमएल जोड़ें। प्लेट को 1-3 मिनट (उदाहरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें, यदि ट्रिप्ले एक्सप्रेस का उपयोग करते हैं) या 20-30 मिनट (उदाहरण के लिए, यदि Accutase का उपयोग कर रहे हैं)।
    10. एक P1000 पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे कोशिकाओं को इकट्ठा करें और कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर ताजा परिपक्वता माध्यम और अपकेंद्रित्र के साथ 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। यदि कोशिकाएं झुरमुट हैं, तो धीरे-धीरे कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। बहुत ज्यादा पिपेट न करें क्योंकि इससे कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है।
    11. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और 20 एनजी/एमएल बीडीएनएफ के साथ पूरक परिपक्वता माध्यम (3.1.4) के 1 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें।
    12. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल की गणना करें। 10,000-40,000 कोशिकाओं पर कोशिकाओं की थाली एक ९६ अच्छी तरह से अच्छी तरह से यू नीचे की थाली में Maturation मध्यम में 20 एनजी के साथ पूरक/ प्रारंभिक सीडिंग घनत्व को आईपीएस सेल लाइन और कोशिकाओं की स्थिति के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि ऊतक संस्कृति चिप में पेश किए जाने पर स्फेरॉइड का व्यास 800-900 माइक्रोन हो। ज्यादातर मामलों में, शुरू में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से 20,000 कोशिकाओं पर शुरू करें, और फिर आकार के अनुसार कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि या कमी करें।
    13. अतिरिक्त 3-10 दिनों के लिए संस्कृति जब तक कोशिकाओं को एक चिकनी बढ़त के साथ एक गोलाकार फार्म ।
  4. (वैकल्पिक विकल्प): मोटर न्यूरॉन्स से एमएनएस गठन
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव आईपीएस सेल-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग मानव आईपीएस कोशिकाओं से अंतर करने के बजाय एमएनओ उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।
    1. मोटर न्यूरॉन्स के क्रायोवियल को विगलन करने के बाद, मोटर न्यूरॉन्स माध्यम के 9 एमएल के साथ कोशिकाओं को जल्दी से पुनर्निर् फिर से ढूँढें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें।
    2. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और मोटर न्यूरॉन माध्यम से गोली को फिर से खर्च करें।
    3. एमएनएस का उत्पादन करने के लिए ऊपर (5.3.12-5.3.13) के समान चरणों का पालन करें।

6. मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड (MNO) गठन के लिए ऊतक संस्कृति चिप की तैयारी

  1. तैयार पीडीएमएस (चरण 2.13 से) को कम से कम 1 घंटे के लिए पेट्री डिश में 70% इथेनॉल में विसर्जित करके स्टरलाइज करें।
    नोट: सभी निम्नलिखित चरणों को जैव शिक्षा कैबिनेट में हेरफेर किया जाना चाहिए।
  2. माइक्रोस्कोप ग्लास (76 x 52 मिमी) को पेट्री डिश में 70% इथेनॉल में डुबोकर स्टरलाइज करें।
  3. माइक्रोस्कोप ग्लास की सुखाने की प्रक्रिया के दौरान, पीडीएमएस डिवाइस को आधे गीले-माइक्रोस्कोप ग्लास पर रखें और रात भर इंतजार करके इसे पूरी तरह से सूखने दें। एक बार जब यह पूरी तरह से सूख जाता है, तो पीडीएमएस डिवाइस को ग्लास का पालन करना चाहिए।
    नोट: यह संबंध ऊतक संग्रह के लिए संस्कृति के बाद माइक्रोस्कोप ग्लास से पीडीएमएस उपकरणों की अलग होने की अनुमति देने के लिए स्थायी नहीं है। ऑक्सीजन प्लाज्मा द्वारा स्थायी संबंध का उपयोग पीडीएमएस और ग्लास के बीच आसंजन को अधिकतम करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन यह चिप्स और ऊतक संग्रह के विघटन को प्रतिबंधित करेगा।
  4. पीडीएमएस डिवाइस और माइक्रोस्कोप ग्लास में माइक्रोचैनल की सतह को डीएमईएम/एफ 12 (1:40) में पतला बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 30 माइक्रोल के साथ चैनल के इनलेट के एक तरफ बूंद बनाकर कोट करें और फिर एक पिपेट या सक्शन पंप(चित्रा 3A)के साथ इनलेट के दूसरी तरफ से समाधान को एस्पिरेट करें। बुलबुला संदूषण से बचने के लिए समाधान की बहुत अधिक मात्रा को एस्पिरेट न करें।
  5. फिर, एक माध्यमिक कंटेनर (जैसे, पेट्री डिश) में कमरे के तापमान पर 1 घंटे या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर पीडीएमएस डिवाइस को इनक्यूबेट करें।

7. मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड (MNO) गठन

  1. उपयोग से ठीक पहले बीडीएनएफ के 20 एनजी/एमएल के साथ पूरक परिपक्वता माध्यम के पूर्व-गरम 150 माइक्रोन के साथ कोटिंग समाधान को बदलें।
  2. फिर, एमएनएस को एक विस्तृत बोर टिप के साथ माइक्रोपिपेट का उपयोग करके माइक्रोचैनल के इनलेट में चरण 5.2.9 या 5.3.13 से रखें। एमएनएस अनायास गुरुत्वाकर्षण द्वारा डिवाइस के तल पर बस सकता है । एमएनएस(चित्रा 3बी)को इंजेक्शन लगाते समय बहुत अधिक दबाव न लगाएं।
    नोट: यदि एमएनएस एक ऊतक संस्कृति चिप में एक छेद की साइडवॉल पर अटक गया है, धीरे इनलेट के दूसरे पक्ष से समाधान aspirate ।
  3. बाँझ पानी के साथ एक छोटे जलाशय (जैसे, 15 एमएल ट्यूब की एक टोपी) भरें और मध्यम वाष्पीकरण को रोकने के लिए इसे माध्यमिक कंटेनर में ऊतक संस्कृति चिप के पास रखें। इसके बाद इसे 5% सीओ2/37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  4. एक मध्यम परिवर्तन के लिए, मध्यम जलाशय(चित्रा 3C)के केंद्र से थक संस्कृति माध्यम आकांक्षी । सभी माध्यम और ऊतक को आकांक्षी न करें।
  5. धीरे-धीरे ताजा परिपक्वता माध्यम (बीडीएनएफ के साथ) जोड़ें। हर 2-3 दिन में माध्यम बदल देना चाहिए। संस्कृति के दौरान किसी भी समय संस्कृति माध्यम को सुखाएं नहीं। एक्सॉन एक एमएनएस से चैनल में बढ़ते हैं और अनायास 2-3 हफ्तों में एक बंडल में इकट्ठा होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप MNO का गठन होता है। MNO डिवाइस में अतिरिक्त 1 महीने से अधिक के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है ।

8. MNO के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण

  1. पूरे माउंट इम्यूनोदाता
    1. डिवाइस या व्यंजन को रासायनिक धूम हुड में लाएं। 4% पीएफए की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मीडिया में 8% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) की लगभग बराबर मात्रा जोड़कर MNO को ठीक करें। कांच से पीडीएस डिवाइस को छीलें और कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. MNO को पीबीएस से धोएं और फिर पीबीएस को 2x धोने दोहराएं।
    3. पीबीएस में ट्राइटन एक्स-100 के 0.2% के साथ MNO को पार करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. MNO को पीबीएस से धोएं और फिर पीबीएस को 2x धोने दोहराएं। फिर, 1% बीएसए वाले पीबीएस के साथ MNO ब्लॉक करें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें जिसमें 0.1% बीएसए और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ MNO को इनक्यूबेट किया जाता है। पीएबी के साथ एमएमएन को तीन बार धोएं।
    6. 0.1% बीएसए के साथ पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ MNO incubate। इसके बाद पीबीएस के साथ तीन बार MNO धोएं।
    7. 0.2% ट्राइटन-एक्स वाले पीबीएस में होचस्ट के साथ MNO को दाग दें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. पीबीएस के साथ तीन बार MNO धोएं। इम्यूनो दाग MNO फ्लोरोसेंट या कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग के लिए तैयार है।
  2. ऊतक संग्रह और अक्षतंश बंडल का अलगाव
    1. 10 सेमी पेट्री डिश में एचबीबीएस सॉल्यूशन का 10 एमएल डालें। इसके बाद पूरे पीडीएमएस डिवाइस को एचबीएसएस सॉल्यूशन में विसर्जित करें।
    2. ध्यान से एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे माइक्रोस्कोप ग्लास से पीडीएमएस अलग। जब ऊतक पीडीएमएस डिवाइस से चिपके रहते हैं, तो धीरे-धीरे एक पिपेट का उपयोग करके छेद के ऊपर से एचबीबीएस समाधान के 1 एमएल लागू करें।
    3. एक बार जब ऊतक पीडीएमएस से उतर जाता है, तो माइक्रोस्कोप ग्लास पर एचबीबीएस के 1 एमएल को धीरे-धीरे लगाएं ताकि माइक्रोस्कोप ग्लास से पीडीएमएस को पूरी तरह से अलग किया जा सके।
    4. एक एक्सोन बंडल को स्फेरॉइड से अलग करने के लिए, एक्सोन बंडल को माइक्रोस्कोप के नीचे सर्जिकल चाकू या चिमटी से काट लें। माइग्रेट कोशिकाओं के प्रदूषण से बचने के लिए एक्सोन बंडल को स्पेरोइड से थोड़ा दूर (> 1 मिमी) काट लें।
    5. अलग-थलग बंडलों और स्फेरॉइड को आरटी-पीसीआर, आरएनए-सेक और वेस्टर्न ब्लॉटिंग जैसे विभिन्न डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों द्वारा आगे विश्लेषण किया जा सकता है।
    6. पीडीएमएस कल्चर चिप का दोबारा इस् तेम किया जा सकता है। कल्चर चिप को साफ करने के लिए, 15 मिनट के लिए आसुत पानी के भीतर संस्कृति चिप को सोनिकेट करें। फिर, 1% डिटर्जेंट के साथ पूरक आसुत पानी में चिप को सोनिकेट करें। कल्चर चिप को डिस्टिल्ड वॉटर से 5 बार धोएं।
  3. कैल्शियम इमेजिंग
    नोट: न्यूरोनल गतिविधि को ऊतक संस्कृति चिप (8.2 से) से ऊतक के संग्रह से पहले और बाद में कैल्शियम संकेतक के साथ मापा जा सकता है। प्रोटोकॉल एक विशिष्ट वाणिज्यिक किट (सामग्री की तालिकादेखें) पर आधारित है। वैकल्पिक रूप से, अन्य कैल्शियम इमेजिंग किट या समकक्ष तरीकों का उपयोग किया जा सकता है।
    1. पीएबी (सीए2+ और एमजी 2+)के बिना तीन बार के लिए MNO धोएं।
    2. रिकॉर्डिंग माध्यम (20 एमएम एचईपीई, 115 एमएम एनएसीएल, 5.4 एमएम केसीएल, 0.8 एमएम एमजीसीएल2,1.8 एमएम, सीएसीएल2,13.8 एमएम ग्लूकोज) में 30-60 मिनट के लिए 37 सी डिग्री पर फ्लूओ-4AM के 5 माइक्रोएम के साथ टिश्यू को इनक्यूबेट करें। प्लूरोनिक एफ-127 के 0.01-0.02% का एक अतिरिक्त कोशिकाओं में फ्लू-4 AM के तेज की सहायता कर सकता है।
    3. फिर, ऊतक को पीबीएस (सीए2+ और एमजी2 +के बिना) से धोएं और इसे रिकॉर्डिंग माध्यम से बदलें।
    4. जीएफपी/Cy2 फिल्टर सेट के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समय-चूक छवियों को प्राप्त करें। प्रति फ्रेम 20 एमएस से कम एक्सपोजर समय निर्धारित करें।
    5. इमेज जे का उपयोग करके अधिग्रहीत फिल्म फ़ाइल को इमेज सीक्वेंस के रूप में खोलें।
    6. यदि एक रंग सीसीडी या सीएमओएस कैमरे का उपयोग कर रहे हैं, तो आरजीबी छवियों को 16-बिट मोनो छवियों में परिवर्तित करें। ओपन"विश्लेषण | उपकरण | आरओआई प्रबंधक",ब्याज के क्षेत्र को आकर्षित करें और"जोड़ें"पर क्लिक करें। क्लिक करें'मल्टी माजरा'। परिणाम में कई आरओआई में तीव्रता का मतलब दिखाया जाएगा।
    7. सामान्य डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सिग्नल तीव्रता के परिवर्तन की साजिश करें।
  4. मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी द्वारा न्यूरोनल गतिविधि का मापन
    नोट: मोटर न्यूरॉन्स की गतिविधि एक बहु इलेक्ट्रोड सरणी (विदेश मंत्रालय) द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है ।
    1. एक MNO बनाने के बाद, यह एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित विदेश मंत्रालय की जांच पर स्थानांतरित करें । इलेक्ट्रोड पर ऊतक की स्थिति।
    2. MNO को सतह से जोड़ने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर परिपक्वता माध्यम और 1-2 घंटे के 200 माइक्रोन जोड़ें।
    3. रिकॉर्डिंग माध्यम (8.3.2) के साथ माध्यम की जगह। इलेक्ट्रोड के साथ अनुबंध बढ़ाने के लिए वैकल्पिक रूप से एक MNO के शीर्ष पर जाल और वजन रखें।
    4. रिकॉर्डिंग हेड स्टेज पर विदेश मंत्रालय की जांच सेट करें । विदेश मंत्रालय की जांच और 70% इथेनॉल के साथ सिर चरण के बीच संपर्क मिटा दें।
    5. विदेश मंत्रालय के निर्माताओं के निर्देशों का पालन करके न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्डिंग शुरू करें।

Representative Results

मोटर न्यूरॉन्स 3 डी भेदभाव प्रक्रियाओं (चित्रा 4 और चित्रा 5)में12-14 दिनों के भीतर विभेदित किया गया । महत्वपूर्ण बात, कोशिकाओं के ६०% से अधिक भेदभाव के दौरान मोटर न्यूरॉन मार्कर HB9 व्यक्त की । इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से पता चला कि एमएनएस में लगभग 80% कोशिकाएं SMI32-पॉजिटिव मोटर न्यूरॉन्स थीं। एचबी9 और SMI32 स्थापित प्रारंभिक चरण मोटर न्यूरॉन मार्कर15,16हैं । एचबी9 और SMI32 की अभिव्यक्ति प्रमुख पैरामीटर हैं जिन्हें मोटर न्यूरॉन्स की सेलुलर पहचान सुनिश्चित करने के लिए पुष्टि करने की आवश्यकता है। संस्कृति चिप में एक एमएनएस की शुरूआत के बाद, अक्षतंप चैनल और एक अक्षतंप बंडल रूपों में विस्तार । भौतिक गाइड के रूप में सेवारत माइक्रोचैनल के कारण, एमसीएन एमएनएस से बढ़कर एक्सो-एक्सोनल इंटरैक्शन(चित्रा 6A)द्वारा एक बंडल बनाते हैं। MNO की पीढ़ी की पुष्टि करने के लिए सूक्ष्म अवलोकन द्वारा अक्षतंप बंडल के गठन की पुष्टि करना आवश्यक है। एक सफल MNO चैनल में बंडल से बाहर ५० μm और कुछ अलग अक्षों से व्यापक एक अक्षतंतरी बंडल भालू । एक्सोन की प्रारंभिक विस्तार स्फेरॉइड की शुरुआत के 24 घंटे बाद देखा जा सकता है। अगले 3-4 दिनों के भीतर, अक्षतंवर माइक्रोचैनल के केंद्र तक पहुंच गया और फिर एक अतिरिक्त 10 दिनों(चित्रा 6A)के भीतर दूसरे छोर तक पहुंचता है। नतीजतन, अक्षतंप इकट्ठे हुए और एक चिप में 2-3 सप्ताह में एक सीधे और एकदिशात्मक बंडल का गठन किया, और उसके बाद न्यूरोनल गतिविधियों को देखा गया।

मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड को जैविक विश्लेषण(चित्रा 6B)के लिए माइक्रोस्कोप ग्लास से पीडीएमएस को अलग करके चिप से एकत्र किया जा सकता है। एक्सोन बंडलों और सेल निकायों को माइक्रोस्कोप(चित्रा 6B)के नीचे सर्जिकल चाकू या चिमटी का उपयोग करके काटकर अलग किया जा सकता है। आरएनए और प्रोटीन सहित इन जैविक सामग्रियों का उपयोग नियमित जैव रासायनिक परख जैसे आरटी-पीसीआर और पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए किया जा सकता है। एमएनओ के अक्षतंशों में वेस्टर्न ब्लॉटिंग(चित्रा 6सी)में न्यूक्लियर या डेंड्रिटिक मेकर प्रोटीन का पता नहीं लगाया जाता है।

कैल्शियम इंडिकेटर (फ्लू-4 एएम) के संयोजन में, टिश्यू कल्चर चिप में न्यूरोनल गतिविधि को कैप्चर किया जा सकता है। स्पेरोइड और एक्सोन बंडल में मोटर न्यूरॉन्स की सहज गतिविधि MNO के भीतर देखी गई। इसके अलावा, बहु-इलेक्ट्रोड सरणी प्रणाली का उपयोग करके तंत्रिका गतिविधियों को देखा गया।

Figure 1
चित्रा 1: पीडीएमएस ऊतक संस्कृति चिप का आयाम।
}टिश्यू कल्चर चिप का फोटोमास्क। (ख)टिश्यू कल्चर चिप में माइक्रोचैनल के आयाम। मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड रखने के लिए बेस चैंबर का व्यास 2 मिमी है और चैंबर के ऊपर पीडीएमएस का छेद 1.5 मिमी है। दो कक्षों को पाटने वाले माइक्रोचैनल की चौड़ाई और ऊंचाई दोनों 150 माइक्रोन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मोटर न्यूरॉन भेदभाव का योजनाबद्ध चित्रण।
(क)विभेदन चरणों में तंत्रिका प्रेरण, मोटर न्यूरॉन वंश में पैटर्निंग और मोटर न्यूरॉन्स की परिपक्वता शामिल थी । (ख)आईपीएस कोशिकाओं से मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड (एमएनएस) बनाने के लिए दो विकल्प: 3डी प्रोटोकॉल, और मोटर न्यूरॉन्स के वियोजन चरण के साथ एक 2डी प्रोटोकॉल। मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड (MNO) दोनों प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग और मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड परिचय के लिए कदम से कदम प्रोटोकॉल।
(A)टिश्यू कल्चर चिप के चैनल में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग। (ख)एमएनएस चिप के छेद में परिचय । (ग)समाप्त माध्यम की आकांक्षा से संस्कृति माध्यम परिवर्तन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: 2D और 3D मोटर न्यूरॉन भेदभाव।
(A)प्रतिनिधि 3डी एमएनएस विभेदन (3 डी प्रोटोकॉल) का समय पाठ्यक्रम। समय के साथ मनसे का आकार धीरे-धीरे बढ़ता गया। स्केल बार: 500 माइक्रोन। (ख) -D2, D0, D1, D6, D12 (2D प्रोटोकॉल) पर 2डी भेदभाव का समय पाठ्यक्रम। स्केल बार: 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: मोटर न्यूरॉन्स का लक्षण वर्णन।
(A)(बाएं) एसएमआई-३२ एंटीबॉडी और DAPI के साथ दाग एक एमएनएस का एक क्रायोसेक्शन । (मध्य) एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित सतह पर replated MNS की एक चरण के विपरीत छवि । एक्सोनल एल्गेशन मनाया गया। (दाएं) सिनैपसिन I और Tuj1 एंटीबॉडी के साथ दाग वाले एमएनएस के एक्सॉन। स्केल बार: 500 माइक्रोन (बाएं और मध्य) और 50μm (दाएं)। (ख)2डी मोटर न्यूरॉन्स की एक प्रतिनिधि छवि तुज और एचबी9 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोडांग । स्केल बार: 200 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: संस्कृति चिप में उत्पन्न मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड (MNO) का लक्षण वर्णन।
(A)D32 पर अक्षत विस्तार और मोटी अक्षतंपन बंडल गठन की प्रतिनिधि छवियां । स्केल बार: 500 माइक्रोन। (ख)स्मिया-32 और डीएपीआई द्वारा मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड (एमएनओ) का इम्यूनोस्टेटिंग। एक्सॉन और सेल निकायों को शारीरिक रूप से काटने से अलग किया जा सकता है। स्केल बार: 1 मिमी(C)एक्सोन और सेल निकायों से प्रोटीन की शुद्धता पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा निर्धारित। MAP2, एक डेंड्रिटिक मार्कर, अक्षीय प्रोटीन में पता नहीं चला था, जबकि अक्षीय मार्कर Tau1 अक्षीय प्रोटीन में समृद्ध है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल एक मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड (MNO) के गठन का वर्णन करता है जिसमें मानव आईपीएस कोशिकाओं से उत्पन्न मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड से विस्तारित एक एक्सॉन बंडल होता है। गठित अक्षतंप बंडल एकदिशात्मक संरचनाओं में मोटी, लचीला और अच्छी तरह से संगठित है। अक्षतंश को विच्छेदन करके, उच्च शुद्धता वाले अक्षीय प्रोटीन और आरएनए को जैव रासायनिक विश्लेषणों के लिए पर्याप्त रूप से प्राप्त किया जा सकता है। न्यूरोनल गतिविधि को कैल्शियम इमेजिंग के साथ अक्षतंखों और गोलाकार में मापा जा सकता है। एक्सोनल लैसेट में परमाणु और डेंड्रिटिक प्रोटीन के संदूषण का पता पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा नहीं लगाया गया था, यह प्रदर्शित करता है कि हमारी विधि कुशलतापूर्वक कोशिका निकायों और डेंड्रिट्स से अक्षों को अलग करती है।

इस प्रोटोकॉल के फायदों में से एक एक्सॉन बंडल से लैस एमनो का तेजी से भेदभाव और उत्पादन है, जिसमें सभी प्रक्रियाओं को 3डी प्रोटोकॉल और 2डी प्रोटोकॉल का उपयोग करके 5-6 सप्ताह के साथ 4 सप्ताह में किया जा सकता है। यह अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में कम है जो आम तौर पर भ्रूणस्टेम कोशिकाओं और आईपीएस कोशिकाओं 17 से एमएन में अंतर करने के लिए3-4 सप्ताह लगते हैं और अक्षीय विस्तार प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त 2-4 सप्ताह लगते हैं। 2डी प्रोटोकॉल की तुलना में कम भेदभाव समय, कम चरणों और कम तकनीकी जोखिमों के कारण 3डी प्रोटोकॉल को आम तौर पर 2डी प्रोटोकॉल पर पसंद किया जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित ऊतक संस्कृति चिप को इस तरीके से डिजाइन किया गया था ताकि एमएनएस के अक्षों को माइक्रोचैनल के माध्यम से दूसरे डिब्बे की ओर बढ़ाया जा सके, जो एक्सो-एक्सोनल इंटरैक्शन और एक्सॉन के बीच आत्मीयता को प्रेरित करके एक्सोन के बंडल के गठन की सुविधा प्रदान करता है। सरल प्रयोगात्मक सेट-अप के कारण, यहां वर्णित सभी प्रोटोकॉल न केवल बायोइंजीनर्स द्वारा किए जा सकते हैं, जो ऊतक संस्कृति चिप के हेरफेर से परिचित हैं, बल्कि जीवविज्ञानी और न्यूरोसाइंटिस्ट भी हैं जो माइक्रोफ्लुइडिक्स और माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों से परिचित नहीं हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बाहरी निर्माण सेवा का उपयोग करके चरण 1 और 2 भी किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक संस्कृति माध्यम का अनुक्रमिक परिवर्तन है । यह सलाह दी जाती है कि भेदभाव के दौरान प्रत्येक चरण में संस्कृति माध्यम को पूरी तरह से बदल दिया जाए ताकि खर्च किए गए माध्यम के कारक एमएन भेदभाव को परेशान न करें। इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण बिंदु अच्छी गुणवत्ता में अविभेदित आईपीएस कोशिकाओं को बनाए रखना है। प्रारंभिक आईपीएस सेल संस्कृति की गुणवत्ता मोटर न्यूरॉन्स और MNO प्राप्त करने के लिए दक्षता को काफी प्रभावित करती है। एक और बात यह है कि एमएनएस का व्यास चिप (1.5 मिमी) के छेद के आकार से छोटा होना चाहिए। बड़े स्फेरॉइड कक्ष में प्रवेश नहीं कर सकते हैं, और संभावित रूप से केंद्र भाग में गंभीर हाइपोक्सिक नेक्रोसिस का अनुभव करते हैं। एमएनएस के आकार को आईपीएस कोशिकाओं (3डी प्रोटोकॉल में) या मोटर न्यूरॉन्स (2डी प्रोटोकॉल में) की प्रारंभिक सीडिंग संख्या को बदलकर नियंत्रित किया जा सकता है। कोशिकाओं के सीडिंग घनत्व प्रत्येक आईपीएस सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

माइक्रोग्रूव्स और छोटे पोर फिल्टर के साथ कंपार्टमेंटलाइज्ड माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का व्यापक रूप से सेल निकायों और डेंड्राइट्स से एक्सोन को अलग करने के लिए उपयोग किया गया है। यह तकनीक बंडल ऊतकों में एक्सॉन की बेहतर बहुतायत के साथ सेल निकायों और डेंड्राइट से एक्सॉन को भी अलग कर सकती है। अन्य तरीकों की तुलना में, इस विधि की एक प्रमुख सीमा यह है कि यह ऊतक संस्कृति चिप के वर्तमान डिजाइन में दो अलग-अलग संस्कृति मीडिया को अलग नहीं कर सकता है, जो दो अलग-अलग कोशिकाओं की सह-संस्कृति की क्षमता में बाधा डालता है जिसके लिए दो अलग-अलग मीडिया की आवश्यकता होती है। एक और सीमा यह है कि पीडीएमएस चिप ऊतक के आकार पर पूर्व निर्धारित प्रतिबंध डाल दिया । छेद से बड़ा एक गोलाकार कक्ष में प्रवेश नहीं कर सकता है, और अक्षतंप बंडल माइक्रोफ्लुइडिक चैनल की चौड़ाई से मोटा नहीं हो सकता है।

इस विधि को अन्य प्रकार के न्यूरॉन्स पर लागू किया जा सकता है। हमारे समूह ने सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड तकनीकों के साथ संयुक्त विधि का उपयोग करके सेरेब्रल ट्रैक्ट को मॉडल करने की क्षमता दिखाई है18 कॉर्टिकल स्फेरॉइड दोनों डिब्बों में पेश किए गए थे और एक्सोन अनायास प्रत्येक स्फेरॉइड की ओर पारस्परिक रूप से विस्तारित होते थे, और बाद में एक अक्षतंप बंडल अनायास ही बनता था। नतीजतन, दो कॉर्टिकल गोलाकार एक एक्सॉन बंडल के माध्यम से जोड़ा जा सकता है, और ऊतक को एक टुकड़े के रूप में प्राप्त किया जा सकता है। यह दर्शाता है कि दृष्टिकोण न्यूरोनल सेल प्रकारों की परवाह किए बिना एक्सोन बंडल ऊतकों को बनाने के लिए अत्यधिक बहुमुखी है। इस प्रोटोकॉल में, मानव आईपीएस कोशिकाओं का उपयोग किया गया था, हालांकि, मानव ईएस कोशिकाओं और मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं सहित अन्य स्टेम कोशिकाओं का उपयोग प्रस्तुत प्रोटोकॉल में संशोधनों के साथ किया जा सकता है। न्यूरॉन्स के 3डी गोलाकार विविध प्रोटोकॉल19,20द्वारा उत्पन्न किए जा सकते हैं । एक्सॉन बंडल के साथ ऊतकों को बनाने की इस विधि को भविष्य में 3डी एमएन स्फेरॉइड बनाने के लिए अन्य भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, एक्सॉन बंडल की मोटाई और लंबाई को भविष्य के विकास के लिए ऊतक संस्कृति चिप के माइक्रोचैनल की चौड़ाई और ऊंचाई को बदलकर नियंत्रित किया जा सकता है।

हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग दवा परीक्षण और स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है और यह अक्षों के फैक्स के विकास और रोगों में अंतर्निहित तंत्र की समझ में योगदान दे सकता है ।

Disclosures

इस प्रोटोकॉल के हिस्से में, एक पेटेंट को जिक्साक बायोइंजीनियरिंग, इंक को लाइसेंस दिया गया है जिसकी स्थापना जिरो कावाड़ा द्वारा की गई थी।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च 17H05661 और 18K19903, कोर-2-कोर प्रोग्राम और बियॉन्ड एआई इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane Sigma 440302
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710
200µl Wide Bore Pipet Tips BMBio BMT-200WRS
6-well plates Violamo 2-8588-01
Accutase ICT AT104
B-27 Supplement (50X) Gibco 17504044
Bovine serum albumin Sigma A6003
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Wako 020-12913
CO2 incubator Panasonic MCO-18AIC
Cryostor CS10 Stem Cell Technologies 07959
DAPT Sigma D5942
DMEM/F12 Sigma D8437
Fluo-4 AM Dojindo Laboratories CS22
GlutaMAX Supplement Gibco 35050-061
Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) Corning 354230
HB9 Antibody Santa Cruz sc-22542
HBSS Wako 085-09355
Hoechst 33342 Sigma 14533
iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) Cellular Dynamics R1051
Isopropyl alcohol (IPA) Wako 166-04836
Knock Out Serum Replacement Gibco 10828028
LDN193189 Sigma SML0559
MEA probe Alpha MED Scientific inc MED-P5004A
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) Sigma M7145
Microscope Glass Matsunami S9111
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 05825
N2 supplement Wako 141-08941
Neurobasal medium Gibco 21103049
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Photoresist SU-8 2100 Microchem #SU-8 2100
Prime surface 96U Sumitomo Bakelite MS-9096U
ReLeSR (passaging reagent) Stem Cell Technologies 05872
Retinoic acid Wako 186-01114
SAG Sigma SML1314
SB431542 Wako 192-16541
Silicon wafer SUMCO PW-100-100
Silpot 184 w/c kit Dow Toray Silpot 184 w/c kit
Smi32 Antibody Biolegend 801701
SU5402 Sigma SML0443
SU-8 Developer Microchem Y020100
Synapsin I Antibody Millipore Ab1543
TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) Gibco 12604-021
Tuj1 Antibody Biolegend 801202
Y-27632 Wako 030-24021

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 163 मोटर न्यूरॉन ऑर्गेनॉइड ऑर्गन-ऑन-ए-चिप माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग
त्रि-आयामी मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड जनरेशन
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Osaki, T., Chow, S. Y. A.,… More

Osaki, T., Chow, S. Y. A., Nakanishi, Y., Hernández, J., Kawada, J., Fujii, T., Ikeuchi, Y. Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation. J. Vis. Exp. (163), e61544, doi:10.3791/61544 (2020).

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