Summary
Questo protocollo fornisce una procedura completa per fabbricare organoide del nervo motorio derivato dalle cellule iPS umane attraverso l'assemblaggio spontaneo di un robusto fascio di assoni estesi da uno sferoide in un chip di coltura tissutale.
Abstract
Un fasccle di assoni è uno dei principali motivi strutturali osservati nel sistema nervoso. L'interruzione delle fascole di assone potrebbe causare malattie dello sviluppo e neurodegenerative. Sebbene siano stati condotti numerosi studi sugli assoni, la nostra comprensione della formazione e della disfunzione dei fasccoli assoni è ancora limitata a causa della mancanza di robusti modelli tridimensionali in vitro. Qui descriviamo un protocollo passo-passo per la rapida generazione di un organoide del nervo motorio (MNO) da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPS) in un chip di coltura tissutale a base microfluidica. In primo luogo, viene descritta la fabbricazione di chip utilizzati per il metodo. Dalle cellule iPS umane si forma uno sferoide dei motoneuroni (MNS). Successivamente, l'MNS differenziato viene trasferito nel chip. Successivamente, gli assoni crescono spontaneamente dallo sferoide e si assemblano in un fasclo all'interno di un microcanale equipaggiato nel chip, che genera un tessuto MNO che trasporta un fascio di assoni estesi dallo sferoide. Per l'analisi a valle, gli MNO possono essere prelevati dal chip per essere fissati per analisi morfologiche o sezionati per analisi biochimiche, nonché per l'imaging del calcio e registrazioni di array multi-elettrodi. Gli MNO generati con questo protocollo possono facilitare il test e lo screening dei farmaci e possono contribuire alla comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo e delle malattie dei fascicoli dell'assone.
Introduction
I motoneuroni spinali (MN) estendono gli assoni ai muscoli scheletrici per controllare il movimento del corpo. Le loro traiettorie assonali sono altamente organizzate e regolate nel processo di sviluppo. Nonostante molti studi sull'estensione e la guidadell'assone 1,i meccanismi per la formazione organizzata di fasci di assione sono ancora in fase di studio. Gli assoni dei motoneuroni sono spesso danneggiati da malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SSN)2, ma i meccanismi fisiopatologici del danno sui fascicoli dell'assone sono poco compresi. Pertanto, è necessario un modello fisiologico e patologico per ricapitolare la formazione e la regressione del fascio di assione nel campo.
Un motoneurone derivato dalle cellule staminali umane è una piattaforma promettente per comprendere lo sviluppo e malattie come la SSA3. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (cellule iPS) possono essere utilizzate per modellare le malattie utilizzando cellule derivate dal paziente. Ad oggi, sono stati riportati vari metodi di differenziazione dalle cellule staminali pluripotenti alla MN4,5,6. Tuttavia, gli assoni di neuroni in coltura bidimensionale sono orientati casualmente e non ricapitolano microambiente in vivo all'interno dei nervi in via di sviluppo in cui gli assoni sono assemblati unidirezionale attraverso dense interazioni assio-assonali7. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato una tecnica per generare un tessuto tridimensionale simile al nervo motorio dalle cellule iPS umane 8 eabbiamo chiamatoil tessuto organoide del nervo motorio (MNO). L'MNO è costituito da corpi cellulari situati in uno sferoide del motoneurone (MNS) e un fasclo assonale esteso fuori dallo sferoide. Gli assoni nel fasccolo sono orientati in modo unidirezionale, che assomiglia agli assoni nello sviluppo dei nervi motori. Pertanto, gli MNO forniscono in modo univoco un microambiente assonale fisiologico, che non è stato fatto da altri metodi di coltura neuronale precedentemente sviluppati.
In questo protocollo, descriviamo i metodi per la fabbricazione di chip di coltura tissutale, la rapida differenziazione dei motoneuroni e la formazione organoide del nervo motorio nei chip sviluppati. Il nostro chip di coltura tissutale è molto semplice e contiene solo uno scomparto per accettare uno sferoide, un microcanale per formare un fascio di assoni e uno scomparto per l'alloggiamento dei terminali degli assoni. Il dispositivo non contiene strutture complesse tra cui microgrooves o filtri micropore che vengono spesso utilizzati per separare assoni e corpi cellulari per dimensioni9,10. Quindi i nostri dispositivi possono essere facilmente fabbricati seguendo i passaggi descritti in questo protocollo se è disponibile una configurazione fotolitografica.
La rapida differenziazione delle cellule iPS umane si ottiene con una combinazione ottimizzata di fattori di induzione e patterning (SB431542, LDN-193189, acido retinoico (RA) e agonista levigato (SAG)) e fattori di accelerazione (SU5402 e DAPT). È stato riferito che la combinazione di SU5402 e DAPT accelera la differenziazione dei neuroni periferici e delle cellule della crestaneurale 11. In questo protocollo, offriamo tre diversi metodi per generare MNO, in modo che i lettori possano decidere un metodo più adatto alle loro esigenze. Si consiglia di eseguire la differenziazione delle cellule iPS umane dopo aver formato uno sferoide (il metodo 3D), poiché l'MNS differenziato può essere trasferito direttamente in un chip di coltura tissutale. In alternativa, le cellule iPS umane possono essere differenziate in motoneuroni in coltura monostrato (2D), e quindi create in sferoidi dei motoneuroni tridimensionali come abbiamoprecedentemente riportato 8. Abbiamo aggiornato il protocollo e, con il metodo di differenziazione tridimensionale descritto in questo protocollo, la transizione dal 2D al 3D può essere evitata e gli MNO possono essere ottenuti con tempi di differenziazione più brevi, meno passaggi e rischi tecnici ridotti senza la fase di dissociazione. I neuroni disponibili in commercio possono anche essere utilizzati per generare MNS per ridurre i tempi di differenziazione.
Per generare un MNO, abbiamo coltivato un MNS nel chip di coltura tissutale. Gli assoni si allungano dallo sferoide e si estendono nel microcanale in cui gli assoni si riuniscono e si allineano unidirezionali. Ciò facilita l'interazione asso-assionale e la formazione spontanea di un fascio unidirezionale strettamente assemblato di assoni nel microcanale, che è ottenuto in modo univoco da questo protocollo, mentre la formazione spontanea di fasci o l'orientamento assonale guidato da solo possono essere raggiuntida altri protocolli 12,13,14. In un esperimento tipico, poche cellule migrano dagli sferoidi al microcanale e la maggior parte delle cellule rimane negli sferoidi vicini. Questo metodo permette agli assoni di essere separati spontaneamente dagli sferoidi senza utilizzare barriere fisiche dipendenti dalle dimensioni (ad esempio, microgroovi o filtri a micropore) per separare gli assoni dai corpi cellulari.
L'MNO risultante può essere sottoposto a vari esami, tra cui analisi morfologiche, biochimiche e fisiche. Il corpo cellulare e il fascio esteso di assoni possono essere fisicamente isolati tagliando e possono essere analizzati separatamente per esperimenti a valle, ad esempio test biochimici. I materiali biologici tra cui RNA e proteine possono essere isolati da pochi fasci di assoni per test biochimici regolari tra cui RT-PCR e macchia occidentale. Qui descriviamo un protocollo per generare organoide nervoso motorio dalle cellule iPS, che offre un modello fisiologico e patologico attraente per studiare il meccanismo alla base dello sviluppo e della malattia dei fascicoli assoni.
Protocol
1. Fabbricazione di stampi SU-8 per fotolitografia
NOTA: Questa procedura riguarda sostanze chimiche pericolose. Utilizzare cappa aspirante e DPI in tutto.
- Pulire il wafer di silicio (4 pollici di diametro, spessore 1 mm, lucido) con acetone e soffiare con gas azoto. Quindi cuocere a 180 °C per 3 minuti per asciugare.
- Distribuire 3 mL di SU-8 2100 su un wafer pulito.
- Rivestire uniformemente il SU-8 sul wafer utilizzando uno spin coater a 500 giri/min per 10 s e quindi, ruotare in sequenza a 1500 giri/min per 30 s con un'accelerazione di 300 giri/s per ottenere uno strato di 150 μm di spessore di SU-8.
NOTA: Assicurarsi che il wafer di silicio sia posizionato al centro dello spin coater e correttamente fissato per vuoto. - Cuocere morbido il wafer sulla piastra calda a 50 °C per 10 minuti, a 65 °C per 7 minuti e a 95 °C per 45 min.
- Impostare la maschera fotografica (Figura 1) sull'allineatore maschera ed esporre la luce UV (365 nm) per 60 s.
NOTA: Il tempo di esposizione deve essere ottimizzato da una dose appropriata di luce UV. - Dopo l'esposizione, cuocere il wafer a 65 °C per 6 minuti e a 95 °C per 13 minuti sulla piastra calda.
- Sviluppare il wafer per 10-20 minuti nello sviluppatore SU-8 con agitazione utilizzando uno shaker orbitale, cambiando la soluzione in via di sviluppo una volta durante il processo.
NOTA: Prolungare il tempo di sviluppo quando i detriti di SU-8 rimangono. - Risciacquare il wafer in isopropanolo e asciugare delicatamente il wafer con gas azoto.
- Misurare l'altezza del SU-8 depositato da un microscopio di misura e assicurarsi che sia spesso circa 150 μm. Può essere conservato a tempo indeterminato a temperatura ambiente.
2. Fabbricazione di chip di coltura tissutale a base microfluidica PDMS
- Fissare il wafer depositato su 8 su un contenitore (ad esempio, piastra di Petri in plastica da 15 cm) con nastro laterale doppio.
- Soffiare la polvere dal wafer usando gas azoto.
- Per silanizzare, mettere il wafer depositato SU-8 in una camera a vuoto insieme a un piccolo contenitore (ad esempio, piatto da 35 mm). Far cadere 10 μL di (tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottile)-1-triclorosilano nel piccolo contenitore. Non applicare direttamente il wafer (tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottile)-1-triclorosilano al wafer SU-8.
- Chiudere saldamente la camera a vuoto e accendere una pompa per vuoto per almeno 2 ore.
- Prendere una tazza di plastica e versare l'elastomero siliconico (ad esempio, Silpot 184 o equivalentemente Sylgard 184) e l'agente polimerizzante ad un rapporto peso 10:1. Quindi, mescolare bene usando una spatola e degas nella camera a vuoto fino a quando le bolle non vengono rimosse completamente.
- Versare la miscela PDMS nel contenitore con il wafer SU-8 allo spessore desiderato (3-4 mm) e degasare di nuovo per rimuovere le bolle.
- Cuocere il PDMS in forno a 60 °C per almeno 3 ore per curare completamente il PDMS.
- Dopo il raffreddamento, tagliare il PDMS stagionato dal wafer utilizzando un bisturi o una lama di rasoio.
- Per creare le due camere del chip di coltura tissutale, perforare due fori in cui si trovano i due compartimenti utilizzando un punzone di biopsia di 1,5 mm di diametro.
- Per creare un serbatoio medio, preparare un'altra miscela PDMS (elastomero siliconico e agente polimerizzante con un rapporto peso 10:1) e versarla in una nuova piastra di Petri da 10 cm. Regolare il volume di versamento a 5 mm di spessore di PDMS.
- Cuocere il PDMS in forno a 60 °C per almeno 3 ore per curare completamente il PDMS.
- Dopo aver raffreddato il PDMS, tagliare il PDMS stagionato con un bisturi per ottenere un anello rettangolare.
- Legare lo strato inferiore con il serbatoio medio applicando PDMS non curati tra di loro e cuocendo gli strati PDMS assemblati. Questa struttura incollata si traduce nel chip di coltura tissutale PDMS.
- Pulire il chip di coltura dei tessuti PDMS con un nastro adesivo per rimuovere polvere e piccole particelle dalla superficie. I trucioli di coltura tissutale PDMS possono essere conservati a temperatura ambiente se protetti da polvere e UV.
3. Preparazione della cultura
- Mezzo di coltura
NOTA: Tutti i supporti elencati di seguito devono essere filtrati per la sterilizzazione, salvo diversa indicazione. I supporti preparati possono essere conservati a 4 °C e utilizzati entro un mese.- Per preparare mTeSR Plus medium: combinare una bottiglia da 100 mL mTeSR Plus 5x integratore con una bottiglia da 400 mL di mTeSR Plus Basal Medium.
- Per preparare 100 mL di mezzo KSR: In 85 mL di DMEM/F12, aggiungere 15 mL di sostituzione del siero knockout (KSR, 15%), 1 mL di integratore commerciale di glutammina (1%) e 1 mL di amminoacido non essenziale (NEAA, 1%).
- Per preparare 100 mL di mezzo N2: In 100 mL di mezzo neurobasale, aggiungere 1 mL di N2 (100x), 1 mL di integratore di glutammina commerciale e 1 mL di NEAA.
- Per preparare 250 mL di mezzo di maturazione: In 250 mL di mezzo neurobasale, aggiungere 5 mL di B27 (2%), 2,5 mL di integratore commerciale di glutammina (1%), e 2,5 mL di penicillina/streptomicina (1%).
- Resuspend i composti (acido retinoico (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) in DMSO di grado coltura cellulare alla concentrazione desiderata. Preparare le aliquote e conservarle a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Vengono utilizzate le seguenti soluzioni stock: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- rivestimento
NOTA: Per prevenire la polimerizzazione della matrice della membrana basale dal calore, evitare cicli ripetitivi di congelamento-disgelo. Gestire tutte le procedure di rivestimento con punte e tubi di pipetta pre-raffreddati, se possibile. La matrice della membrana basale deve essere scongelata durante la notte a 4 °C e aliquota utilizzando punte e tubi di pipetta pre-refrigerati. Le aliquote possono essere congelate a -20 °C o -80 °C.- Scongelare l'aliquota congelata a 4°C sul ghiaccio. L'aliquota deve essere mantenuta fredda durante la procedura di rivestimento. Utilizzando una punta di pipetta pre-raffreddata, diluire la matrice della membrana del seminterrato con DMEM/F12 ghiacciato con un rapporto di 1:40. La matrice di membrana basale diluita inutilizzata può essere conservata a 4 °C per 2-3 giorni dato che non si è verificata alcuna polimerizzazione.
- Aggiungere 1 mL della matrice a membrana basale/soluzione DMEM-F12 per rivestire un pozzo della piastra a 6 porri.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno un'ora o 4 °C durante la notte. Le piastre rivestite possono essere conservate a 4 °C per un massimo di una settimana.
4. Manutenzione delle celle iPS
NOTA: Le cellule iPS indifferenziate vengono mantenute in mTeSR Plus medie e sotto-coltivate quando si osserva una confluenza di ≥ 90% in una piastra a 6 pozzi in questo protocollo. Potrebbero essere necessarie piccole regolazioni per le celle iPS coltivate in altri supporti.
- Preparare piatti rivestiti a matrice di membrana basale come accennato in precedenza nel passaggio 3.2.
- Aspira completamente il mezzo mTeSR Plus. Lavare il pozzo una volta con PBS e aggiungere 0,5 mL di reagente passante (vedi Tabella dei materiali). Attendere qualche secondo e aspirare la soluzione.
- Incubare la piastra a 37 °C nell'incubatrice per 5 minuti o fino a quando le cellule non diventano rotonde.
NOTA: Il tempo di incubazione può variare tra le diverse linee cellulari iPS e la confluenza. Si prega di controllare periodicamente al microscopio per determinare il tempo di dissociazione durante l'incubazione. - Aggiungere 1 mL di mezzo mTeSR Plus e toccare la piastra per 30-60 s per staccare le colonie.
- Mescolare delicatamente 1 mL della soluzione di sospensione cellulare con 7 mL di mTeSR fresco più mezzo. Non pipettare più di 5 volte.
- Piatto con un rapporto di 1:8. In genere aggiungere 1 mL della sospensione dal passo 4.5 e aggiungere 1 mL di mTeSR più supporti integrati con 5-10 μM di Y-27632 (inibitore ROCK). Il rapporto di diluizione del passaggio dipende dalla linea iPSC.
- Posizionare la cella in un incubatore di CO2/37 °C al 5%. Il giorno successivo, rimuovere Y-27632 aggiungendo un mezzo mTeSR Plus fresco. Successivamente, cambiare media ogni due giorni inizialmente, e ogni giorno quando la cellula raggiunge una maggiore confluenza.
5. Differenziazione delle cellule iPS in motoneuroni
NOTA: Tutte le opzioni seguenti (5.2, 5.3 e 5.4) producono MNO con un> efficienza del 90%.
- Passamento iPSC per la differenziazione dei motoneuroni
NOTA: La differenziazione può essere condotta con successo in protocolli 3D (5.2) o 2D (5.3).- Lasciare crescere le cellule iPS indifferenziate fino a raggiungere una confluenza di circa l'80% in mezzo mTeSR Plus in una piastra a 6 po pompenti.
- Aspirare completamente il mezzo. Lavare immediatamente il pozzo una volta con PBS sterile e aggiungere 0,5 mL di soluzione di dissociazione cellulare alle cellule.
- Incubare la piastra a 37 °C nell'incubatrice per circa 2-3 minuti, o fino a quando le cellule non si separano e si arrotondano ma rimangono attaccate al pozzo.
- Aggiungere 1 mL di pipetta media e delicata su e giù alcune volte utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL. Trasferire la sospensione cellulare su un tubo da 15 ml costituito da 4 ml del mezzo.
- Centrifuga a 200 x g per 3 min.
- Aspirare con cura il supernatante, lasciando il pellet indisturbato, e rimescolare le cellule in 1 mL del mezzo integrato con 10 μM di Y-27632.
- Contare le cellule usando un emocitometro e procedere a 5.2 (differenziazione 3D) o 5.3 (differenziazione 2D).
- Formazione dello sferoide dei motoneuroni (MNS) nella differenziazione 3D ("protocollo 3D")
NOTA: Una variazione media completa viene effettuata giornalmente dai giorni 0-12 della differenziazione (Figura 2).- Sementire le cellule iPS dal passo 5.1.7 a una piastra inferiore a U da 96 po 'a 40.000 cellule / pozzo in 100 μL di mTeSR Plus integrato con 10 μM di Y-27632.
- Il giorno successivo, sostituire ogni bene con 100 μL del mezzo fresco.
- Nei giorni 0 e 1: Aspirare il mezzo di coltura e sostituire con 100 μL di mezzo KSR (3.1.2) integrato con 10 μM SB431542 e 100 nM LDN-193189.
- Nei giorni 2 e 3: Aspirare il mezzo di coltura e sostituire con 100 μL di mezzo KSR integrato con 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nei giorni 4 e 5: Preparare un mezzo misto composto per il 75% da KSR medio e per il 25% da N2 medium (3.1.3). Quindi, aspirare il mezzo di coltura e sostituire con 100 μL di mezzo misto integrato con 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nei giorni 6 e 7: Preparare un mezzo misto composto per il 50% da KSR medio e per il 50% da mezzo N2. Quindi, aspirare il mezzo di coltura e sostituirlo con 100 μL di mezzo misto integrato con 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM di acido retinoico e 1 μM SAG.
- Nei giorni 8 e 9: Preparare un mezzo misto composto per il 25% da KSR medio e per il 75% da mezzo N2. Quindi, aspirare il mezzo di coltura e sostituire con 100 μL di mezzo misto integrato con 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nei giorni 10 e 11: Sostituire il mezzo con 100 μl di mezzo N2 integrato con 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Il giorno 12: Procedere a trasferire le MN nel chip di coltura tissutale (Fase 6) o sostituire il mezzo con 100 μL del mezzo di maturazione (3.1.4) integrato con fattore neurotrofico derivato dal cervello 20 ng / mL (BDNF).
NOTA: L'MNS può essere trasferito sul chip di coltura tissutale a partire dal giorno 12 fino al giorno 19. Gli sferoidi che non vengono trasferiti devono essere tenuti coltivati in 96 piastre inferiori a U ben in mezzo di maturazione integrate con BDNF da 20 ng/mL fino al trasferimento.
- (opzione alternativa) differenziazione 2D e transizione a MNS 3D ("protocollo 2D")
- Aspirare la soluzione di rivestimento da una piastra pre-rivestita da 12 potte.
- Seminare le cellule iPS dal passaggio 5.1.7 ad una densità di 100.000 - 200.000 cellule per pozzo in mezzo mTeSR Plus con 10 μM di Y-27632.
NOTA: Continuare a coltivare le cellule iPS indifferenziate nel mezzo mTeSR Plus senza Y-27632 fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza se le cellule sono troppo sparse per il passaggio successivo (5.3.3). - Nei giorni 0 e 1: Aspirare il mezzo di coltura e sostituire con 1 mL di mezzo KSR (3.1.2) integrato con 10 μM SB431542 e 100 nM LDN-193189.
- Nei giorni 2 e 3: Aspirare il mezzo di coltura e sostituirlo con 1 mL di mezzo KSR integrato con 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nei giorni 4 e 5: Preparare un mezzo misto composto per il 75% da KSR medio e per il 25% da N2 medium (3.1.3). Aspirare il mezzo di coltura e sostituire con 1 mL di mezzo misto integrato con 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nei giorni 6 e 7: Preparare un mezzo misto composto per il 50% da KSR medio e per il 50% da mezzo N2. Aspirare il mezzo di coltura e sostituirlo con 1 mL di mezzo misto integrato con 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM di acido retinoico e 1 μM SAG.
- Nei giorni 8 e 9: Preparare un mezzo misto composto per il 25% da KSR medio e per il 75% da mezzo N2. Aspirare il mezzo di coltura e sostituire con 1 mL del mezzo misto integrato con 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nei giorni 10 e 11: Sostituire il mezzo con 1 mL di mezzo N2 integrato con 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Il giorno 12: Aspirare il mezzo di differenziazione, lavare rapidamente bene una volta con PBS e aggiungere 0,5 mL del mezzo di distacco cellulare. Posizionare la piastra in un incubatore di 37 °C per 1-3 min (ad esempio, se si utilizza TrypLE Express) o 20-30 min (ad esempio, se si utilizza Accutase).
- Utilizzando una pipetta P1000, raccogliere delicatamente le cellule e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 ml con mezzo di maturazione fresco e centrifuga a 200 x g per 3 min. Se le cellule sono goffi, pipettare delicatamente su e giù un paio di volte. Non pipettare troppo in quanto ciò potrebbe causare danni alle cellule.
- Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di mezzo di maturazione (3.1.4) integrato con 20 ng/mL BDNF.
- Conta la cellula usando un emocitometro. Placcare le cellule a 10.000-40.000 cellule per pozzo in una piastra inferiore a U da 96 po 'in mezzo di maturazione integrata con 20 ng / ml di BDNF. La densità iniziale di semina deve essere ottimizzata a seconda della linea cellulare iPS e delle condizioni delle cellule in modo che il diametro dello sferoide sia di 800-900 μm quando viene introdotto nel chip di coltura tissutale. Nella maggior parte dei casi, iniziare inizialmente da 20.000 cellule per pozzo, quindi aumentare o diminuire il numero di celle in base alle dimensioni.
- Coltura per ulteriori 3-10 giorni fino a quando le cellule formano uno sferoide con un bordo liscio.
- (Opzione alternativa): Formazione MNS dai motoneuroni
NOTA: I motoneuroni derivati dalle cellule iPS umani disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali) possono essere utilizzati per generare MNO invece di differenziarsi dalle cellule iPS umane.- Dopo aver scongelato il crioviale dei motoneuroni, rimorsi rapidamente le cellule con 9 mL del mezzo dei motoneuroni. Girare verso il basso a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet con il mezzo motoneurone.
- Seguire gli stessi passaggi di cui sopra (5.3.12- 5.3.13) per produrre MNS.
6. Preparazione del chip di coltura tissutale per la formazione organoide del nervo motorio (MNO)
- Sterilizzare il PDMS preparato (dal passaggio 2.13) immergendolo nel 70% di etanolo nella piastra di Petri per almeno 1 h.
NOTA: Tutti i seguenti passaggi devono essere manipolati in un armadio di biosicurezza. - Sterilizzare il vetro del microscopio (76 x 52 mm) immergendolo nel 70% di etanolo nella piastra di Petri.
- Durante il processo di asciugatura del vetro del microscopio, posizionare il dispositivo PDMS sul vetro mezzo microscopio bagnato e lasciarlo asciugare completamente aspettando durante la notte. Una volta completamente asciugato, il dispositivo PDMS dovrebbe aderire al vetro.
NOTA: Questo legame non è permanente per consentire il distacco dei dispositivi PDMS dal vetro del microscopio dopo la coltura per la raccolta dei tessuti. L'incollaggio permanente da parte del plasma di ossigeno può essere utilizzato per massimizzare l'adesione tra PDMS e vetro, ma vieterebbe lo smontaggio dei trucioli e la raccolta dei tessuti. - Rivestire la superficie del microcanale nel dispositivo PDMS e nel vetro del microscopio con 30 μL di matrice di membrana basale diluita in DMEM/F12 (1:40) facendo una goccia su un lato dell'ingresso del canale e quindi aspirare la soluzione dall'altro lato dell'ingresso con una pipetta o una pompa di aspirazione(figura 3A). Non aspirare troppo volume di soluzione per evitare la contaminazione da bolle.
- Quindi, incubare il dispositivo PDMS per 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C in un contenitore secondario (ad esempio, piastra di Petri).
7. Formazione organoide nervosa motoria (MNO)
- Sostituire la soluzione di rivestimento con 150 μL pre-riscaldato di mezzo di maturazione integrato con 20 ng/mL di BDNF poco prima dell'uso.
- Quindi, posizionare l'MNS dal passaggio 5.2.9 o 5.3.13 nell'ingresso del microcanale utilizzando una micropipetta con una punta a foro largo. MNS può stabilirsi spontaneamente nella parte inferiore del dispositivo per gravità. Non esercitare troppa pressione durante l'iniezione dell'MNS (Figura 3B).
NOTA: Se l'MNS è bloccato sulla parete laterale di un foro in un chip di coltura tissutale, aspirare delicatamente la soluzione da un altro lato dell'ingresso. - Riempire un piccolo serbatoio (ad esempio, un tappo di tubo da 15 ml) con acqua sterile e posizionarlo vicino al chip di coltura tissutale nel contenitore secondario per evitare l'evaporazione media. Quindi, posizionarlo in un incubatore di CO2/37 °C al 5%.
- Per un cambio medio, aspirare il mezzo di coltura esausto dal centro del serbatoio medio (Figura 3C). Non aspirare tutto il mezzo e il tessuto.
- Aggiungere delicatamente un mezzo di maturazione fresco (con BDNF). Il mezzo deve essere cambiato ogni 2-3 giorni. Non asciugare il terreno di coltura in qualsiasi momento durante la cultura. Gli assoni crescono da un MNS nel canale e si assemblano spontaneamente in un unico fascio in 2-3 settimane, il che si traducono nella formazione di un MNO. MNO può essere coltivato per più di 1 mese aggiuntivo nel dispositivo.
8. Analisi a valle dell'MNO
- Immunosocienza a montaggio intero
- Portare il dispositivo o i piatti in una cappa chimica. Fissare l'MNO aggiungendo un volume approssimativamente uguale all'8% di paraformaldeide (PFA) al supporto per ottenere una concentrazione finale del 4% di PFA. Staccare il dispositivo PDMS dal vetro e incubare per 15-20 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare l'MNO con PBS e quindi ripetere pbs lavaggio 2x.
- Permeabilizzare l'MNO con lo 0,2% di Tritone X-100 in PBS e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare l'MNO con PBS e quindi ripetere pbs lavaggio 2x. Quindi, bloccare l'MNO con PBS contenente 1% di BSA e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
- Diluire gli anticorpi primari in PBS contenenti lo 0,1% di BSA e incubare MNO con la soluzione di anticorpi primari durante la notte a 4 °C. Lavare l'MNO con PBS tre volte.
- Diluire gli anticorpi secondari in PBS con 0,1% di BSA e incubare MNO con la soluzione anticorpale secondaria per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi lavare l'MNO tre volte con PBS.
- Macchiare l'MNO con Hoechst in PBS contenente lo 0,2% di Tritone-X e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare l'MNO tre volte con PBS. L'MNO immunosostenibile è pronto per l'imaging con microscopi laser fluorescenti o confocali.
- Raccolta dei tessuti e isolamento del fascio di assoni
- Versare 10 mL di soluzione HBSS in una piastra di Petri di 10 cm. Quindi, immergere l'intero dispositivo PDMS nella soluzione HBSS.
- Staccare con cura il PDMS dal vetro del microscopio sotto uno stereomicroscopio. Quando i tessuti si attaccano al dispositivo PDMS, applicare delicatamente 1 mL di soluzione HBSS dalla parte superiore del foro utilizzando una pipetta.
- Una volta che il tessuto esce dal PDMS, applicare delicatamente 1 mL di HBSS sul vetro del microscopio per staccare completamente il PDMS dal vetro del microscopio.
- Per isolare un fascio di assoni da uno sferoide, tagliare il fascio di assoni con un coltello chirurgico o una pinzetta al microscopio. Tagliare il fascio di assoni leggermente lontano (> 1 mm) dallo sferoide per evitare la contaminazione delle cellule migrate.
- Fasci di assoni isolati e sferoidi possono essere ulteriormente analizzati da varie analisi a valle come RT-PCR, RNA-seq e western blotting.
- Il chip di coltura PDMS può essere riutilizzato. Per pulire il chip di coltura, sonicare il chip di coltura all'interno dell'acqua distillata per 15 minuti. Quindi, sonicare il truciolo in acqua distillata integrato con l'1% di detersivo. Lavare il chip di coltura con acqua distillata 5 volte.
- Imaging calcio
NOTA: L'attività neuronale può essere misurata con indicatore di calcio sia prima che dopo la raccolta del tessuto dal chip di coltura tissutale (da 8.2). Il protocollo si basa su uno specifico kit commerciale (vedi Tabella dei materiali). In alternativa, è possibile utilizzare altri kit di imaging calcio o metodi equivalenti.- Lavare l'MNO con PBS (senza Ca2+ e Mg2+) per tre volte.
- Incubare il tessuto con 5 μM di Fluo-4AM in mezzo di registrazione (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgCl2, 1,8 mM, CaCl2, 13,8 mM di glucosio) per 30-60 min a 37 °C. Un'aggiunta dello 0,01-0,02 % di Pluronic F-127 può aiutare l'assorbimento di Fluo-4 AM nelle cellule.
- Quindi, lavare il tessuto con PBS (senza Ca2+ e Mg2+) e sostituirlo con un supporto di registrazione.
- Acquisire immagini time-lapse utilizzando la microscopia fluorescente con un set di filtri GFP/Cy2. Impostare il tempo di esposizione inferiore a 20 ms per fotogramma.
- Aprite il file filmato acquisito come sequenza di immagini utilizzando Image J.
- Se si utilizza una fotocamera CCD o CMOS a colori, convertire le immagini RGB in immagini mono a 16 bit. Apri "Analizza | Strumenti | ROI Manager", Disegnare l'area di interesse e fare clic su "Aggiungi". Fare clic su "Multi Measure". La media di intensità in più ROI verrà visualizzata nel risultato.
- Tracciare il cambiamento dell'intensità del segnale utilizzando un software generale di analisi dei dati.
- Misurazione dell'attività neuronale mediante array multi-elettrodo
NOTA: L'attività dei motoneuroni può essere catturata da un array multi-elettrodo (MEA).- Dopo aver creato un MNO, trasferirlo su una sonda MEA rivestita a matrice di membrana basale. Posizionare il tessuto sugli elettrodi.
- Aggiungere 200 μL di mezzo di maturazione e incubare 1-2 h a 37 °C per consentire all'MNO di attaccarsi alla superficie.
- Sostituire il supporto con un supporto di registrazione (8.3.2). Facoltativamente posizionare la rete e il peso sopra un MNO per aumentare il contratto con gli elettrodi.
- Impostare la sonda MEA sul palco della testa di registrazione. Pulire il contatto tra la sonda MEA e lo stadio della testa con il 70% di etanolo.
- Inizia a registrare l'attività neuronale seguendo le istruzioni dei produttori del MEA.
Representative Results
I motoneuroni sono stati differenziati entro 12-14 giorni nelle procedure di differenziazione 3D (Figura 4 e Figura 5). È importante sottolineare che più del 60% delle cellule ha espresso il marcatore del motoneurone HB9 durante la differenziazione. L'immunoistochimica ha rivelato che circa l'80% delle cellule nell'MNS erano motoneuroni positivi all'SMI32. HB9 e SMI32 sono i marcatori dei motoneuroni in fase inizialestabiliti 15,16. L'espressione di HB9 e SMI32 sono i parametri chiave che devono essere confermati per garantire l'identità cellulare dei motoneuroni. Dopo l'introduzione di un MNS nel chip di coltura, gli assoni si estendono nel canale e si forma un fascio di assoni. A causa dei microcanali che fungono da guide fisiche, gli assoni si allungano dall'MNS e formano un fascio per interazione assio-assionale (Figura 6A). È essenziale confermare la formazione del fascio di assoni mediante osservazione microscopica per confermare la generazione di un MNO. Un MNO di successo porta un fascio di assoni più largo di 50 μm e pochi assoni isolati fuori dal fascio nel canale. L'allungamento iniziale degli assoni può essere osservato 24 ore dopo l'introduzione dello sferoide. Entro i successivi 3-4 giorni, gli assoni raggiunsero il centro del microcanale per poi raggiungere l'altra estremità entro altri 10 giorni(Figura 6A). Di conseguenza, gli assoni si assemblarono e formarono un fascio dritto e unidirezionale in 2-3 settimane in un chip, e le attività neuronali furono osservate in seguito.
Gli organoidi nervosi motori possono essere raccolti dal truciolo staccando il PDMS dal vetro del microscopio per l'analisi biologica (Figura 6B). I fasci di assone e i corpi cellulari possono essere sezionati e isolati tagliando utilizzando un coltello chirurgico o una pinzetta al microscopio (Figura 6B). Questi materiali biologici tra cui RNA e proteine possono essere utilizzati per regolari saggi biochimici come RT-PCR e western blotting. Nei fasci di axon di MNO, le proteine del produttore nucleare o dendritico non vengono rilevate nell'assorbimento occidentale (Figura 6C).
In combinazione con un indicatore di calcio (Fluo-4 AM), l'attività neuronale può essere catturata nel chip di coltura tissutale. L'attività spontanea dei motoneuroni nello sferoide e nel fascio di assoni è stata osservata all'interno dell'MNO. Inoltre, le attività neurali sono state osservate utilizzando un sistema array multi-elettrodo.
Figura 1: La dimensione del chip di coltura tissutale PDMS.
(A) Fotomaschera del chip di coltura tissutale. (B) Dimensioni del microcanale nel chip di coltura tissutale. Il diametro della camera di base per trattenere lo sferoide del motoneurone è di 2 mm e il foro del PDMS sopra la camera è di 1,5 mm. La larghezza e l'altezza di un microcanale che collega due camere sono entrambe di 150 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Illustrazione schematica della differenziazione dei motoneuroni.
(A) Le fasi di differenziazione hanno comportato l'induzione neurale, il patterning nel lignaggio dei motoneuroni e la maturazione dei motoneuroni. (B) Due opzioni per creare lo sferoide dei motoneuroni (MNS) dalle cellule iPS: il protocollo 3D e un protocollo 2D con fase di dissociazione dei motoneuroni. L'organoide del nervo motorio (MNO) può essere ottenuto da entrambi i protocolli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Protocollo passo dopo passo per il rivestimento della matrice della membrana basale e l'introduzione dello sferoide del motoneurone.
(A) Rivestimento a matrice di membrana basale nel canale del chip di coltura tissutale. (B) Introduzione MNS nel foro del truciolo. (C) Variazione media della coltura mediante aspirazione di mezzi esauriti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Differenziazione dei motoneuroni 2D e 3D.
(A) Corso di tempo di differenziazione rappresentativa 3D MNS (protocollo 3D). Le dimensioni dell'MNS sono gradualmente aumentate nel tempo. Barra di scala: 500 μm. (B) Corso di tempo della differenziazione 2D su -D2, D0, D1, D6, D12 (protocollo 2D). Barra di scala: 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Caratterizzazione dei motoneuroni.
(A) (Sinistra) Una criosezione di un MNS macchiato con anticorpo SMI-32 e DAPI. (Al centro) Immagine a contrasto di fase di MNS rilato su una superficie rivestita di matrice a membrana basale. È stato osservato l'allungamento assonale. (A destra) Assoni di MNS pentiti macchiati con anticorpi Synapsin I e Tuj1. Barra di scala: 500 μm (sinistra e centrale) e 50μm (destra). (B) Un'immagine rappresentativa dei motoneuroni 2D immunososteniati con anticorpi Tuj e HB9. Barra di scala: 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Caratterizzazione di un organoide del nervo motorio (MNO) generato in un chip di coltura.
(A) Immagini rappresentative dell'allungamento dell'assone e della formazione di fasci di assione spessi su D32. Barra di scala: 500 μm. (B) Immunostaining of motor nerve organoid (MNO) di SMI-32 e DAPI. Assoni e corpi cellulari possono essere isolati tagliando fisicamente. Barra di scala: 1 mm. (C) Purezza della proteina da assoni e corpi cellulari quantificati dall'assorbimento occidentale. MAP2, un marcatore dendritico, non è stato rilevato nella proteina assonale, mentre il marcatore assonale Tau1 è arricchito nella proteina assonale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo descrive la formazione di un organoide del nervo motorio (MNO) che ha un fascio di assoni esteso da uno sferoide del motoneurone generato da cellule iPS umane. Il fascio di assoni formato è spesso, flessibile e ben organizzato in strutture unidirezionali. Sezionando il fascio di assoni, la proteina assonale ad alta purezza e l'RNA possono essere ottenuti a sufficienza per le analisi biochimiche. L'attività neuronale può essere misurata in fasci di assioni e sferoidi con imaging del calcio. La contaminazione delle proteine nucleari e dendritiche nel lisato assonale non è stata rilevata dall'assorbimento occidentale, dimostrando che il nostro metodo separava efficacemente gli assoni dai corpi cellulari e dai dendriti.
Uno dei vantaggi di questo protocollo è la rapida differenziazione e generazione di MNO dotato di un bundle axon, in cui tutti i processi possono essere eseguiti in 4 settimane con il protocollo 3D e 5-6 settimane utilizzando il protocollo 2D. Questo è breve rispetto ad altri protocolli che in genere richiedono 3-4 settimane per differenziarsi semplicemente in MN dalle cellule staminali embrionali e dalle cellule iPS17 e ci vogliono altre 2-4 settimane per ottenere l'allungamento assonale. Il protocollo 3D è generalmente preferito rispetto al protocollo 2D a causa del tempo di differenziazione più breve, meno passaggi e rischi tecnici ridotti senza il passaggio di dissociazione rispetto al protocollo 2D. Il chip di coltura tissutale a base microfluidica è stato progettato in modo che gli assoni di MNS possano allungarsi verso l'altro compartimento attraverso il microcanale, il che facilita la formazione di un fascio di assoni inducendo interazioni asso-assonali e affinità tra assoni. A causa del semplice set-up sperimentale, tutti i protocolli qui descritti possono essere eseguiti non solo dai bioingegneri, che hanno familiarità con la manipolazione di un chip di coltura tissutale, ma anche da biologi e neuroscienziati che non hanno familiarità con le tecniche di microfluidica e microfabbricazione. Va notato che i passaggi 1 e 2 possono essere eseguiti anche utilizzando un servizio di fabbricazione esterno.
Uno dei passaggi critici per realizzare il protocollo è un cambiamento sequenziale del mezzo di coltura. Si consiglia di cambiare completamente il mezzo di coltura ad ogni fase durante la differenziazione in modo che i fattori nel mezzo speso non disturbino la differenziazione MN. Un altro punto critico di questo protocollo è mantenere le celle iPS indifferenziate in buona qualità. La qualità della coltura cellulare iPS iniziale influisce significativamente sull'efficienza per ottenere motoneuroni e MNO. Un altro punto è che il diametro di MNS dovrebbe essere inferiore alle dimensioni del foro del truciolo (1,5 mm). Gli sferoidi più grandi non possono entrare nella camera e potenzialmente sperimentano una grave necrosi ipossia nella parte centrale. La dimensione degli MNS può essere controllata modificando un numero iniziale di seeding di cellule iPS (nel protocollo 3D) o motoneuroni (nel protocollo 2D). La densità di semina delle cellule deve essere ottimizzata per ogni linea cellulare iPS.
Dispositivi microfluidici compartimentati con microgroovi e piccoli filtri porosi sono stati ampiamente utilizzati per separare gli assoni dai corpi cellulari e dai dendriti. Questa tecnica può anche separare gli assoni dai corpi cellulari e dalla dendrite, con un'abbondanza superiore di assoni nei tessuti raggruppati. Rispetto agli altri metodi, una delle principali limitazioni di questo metodo è che non può separare due diversi mezzi di coltura nell'attuale progettazione del chip di coltura tissutale, che ostacola la capacità di co-coltura di due cellule diverse che richiedono due mezzi distinti. Un'altra limitazione è che il chip PDMS ha posto restrizioni predeterminate sulle dimensioni del tessuto. Uno sferoide più grande del foro non può entrare nella camera, e il fascio di assoni non può diventare più spesso della larghezza del canale microfluidico.
Questo metodo può essere applicato ad altri tipi di neuroni. Il nostro gruppo ha dimostrato di essere in grado di modellare un tratto cerebrale utilizzando un metodo modificato combinato con le tecniche organoidicerebrali 18. Gli sferoidi corticali furono introdotti in entrambi i compartimenti e gli assoni si allungarono spontaneamente reciprocamente verso ogni sferoide, e successivamente un fascio di assoni si formò spontaneamente. Di conseguenza, due sferoidi corticali possono essere collegati attraverso un fascio di assoni, e il tessuto potrebbe essere ottenuto come un unico pezzo. Ciò dimostra che l'approccio è altamente versatile per formare tessuti a fascio di assoni indipendentemente dai tipi di cellule neuronali. In questo protocollo, le cellule iPS umane sono state utilizzate, tuttavia, altre cellule staminali tra cui cellule ES umane e cellule staminali neurali umane possono essere utilizzate con modifiche al protocollo presentato. Gli sferoidi 3D dei neuroni possono essere generati da diversiprotocolli 19,20. Questo metodo di produzione di tessuti con un fascio di assoni può potenzialmente essere combinato in futuro con gli altri protocolli di differenziazione per la produzione di sferoide MN 3D. Inoltre, lo spessore e la lunghezza del fascio di assoni possono essere controllati semplicemente cambiando la larghezza e l'altezza dei microcanali del chip di coltura tissutale per sviluppi futuri.
Riteniamo che questo protocollo possa essere utilizzato per il test e lo screening dei farmaci e possa contribuire alla comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo e delle malattie dei fascicoli degli assoni.
Disclosures
In parte di questo protocollo, un brevetto è stato concesso in licenza a Jiksak Bioengineering, Inc.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 e 18K19903, dal programma Core-2-core e dall'istituto Beyond AI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
| 6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
| Accutase | ICT | AT104 | |
| B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
| Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
| HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
| HBSS | Wako | 085-09355 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
| Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
| MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
| Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
| N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
| Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
| ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
| Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
| SAG | Sigma | SML1314 | |
| SB431542 | Wako | 192-16541 | |
| Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
| Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
| Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
| SU5402 | Sigma | SML0443 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
| TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
| Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
| Y-27632 | Wako | 030-24021 |
References
- Raper, J., Mason, C. Cellular strategies of axonal pathfinding. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).
- Ito, Y., et al. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science. 353 (6299), 603-608 (2016).
- Fujimori, K., et al. Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).
- Chen, H., et al. Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons. Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
- Imamura, K., et al. The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis. Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).
- Wang, L., Marquardt, T. What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).
- Kawada, J., et al. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. JoVE. (141), e58421 (2018).
- Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. JoVE. (147), e59250 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).
- Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions. bioRxiv. , (2020).
- Cullen, D. K., et al. Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids. iScience. 21, 57-67 (2019).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).
- Egawa, N., et al. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).
- Qu, Q., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).
- Kirihara, T., et al. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions. iScience. 14, 301-311 (2019).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).
