Summary
Y-maze 障碍任务是一种行为测试，用于检查花费精力获得奖励的动机。在这里，我们讨论测试多个经过良好验证的慢性压力，包括慢性皮质酮和社会失败压力与这种行为，以及新的慢性非歧视性社会失败压力（CNSDS），这是有效的女性。
Abstract
情绪障碍，包括严重的抑郁症，可以由慢性压力沉淀。Y-maze 障碍任务是一项与努力相关的选择测试，用于衡量花费精力和获得奖励的动机。在小鼠中，慢性压力暴露会显著影响与无压力小鼠相比，价值较低的奖励可获得更高价值奖励的动机。在这里，我们描述了慢性皮质酮管理范式，它产生了在Y-maze屏障任务中努力响应的转变。在 Y-maze 任务中，一只手臂包含 4 个食物颗粒，而另一只手臂只包含 2 粒。在小鼠学会选择高奖励手臂后，在多个测试会话中，随着高度逐渐增大的障碍被引入到高奖励臂中。不幸的是，大多数慢性应激范式（包括皮质酮和社会失败）是在雄性小鼠中发展起来的，在雌性小鼠中效果较低。因此，我们还讨论了慢性非歧视性的社会失败压力（CNSDS），这是我们开发的一种压力范式，对雄性小鼠和雌性小鼠都有效。在雄性小鼠和雌性小鼠中重复具有多个不同慢性应激因素的结果，加上增加使用翻译相关行为任务，将有助于增进对慢性应激如何沉淀情绪障碍的理解。
Introduction
情绪障碍，如抑郁和焦虑在当今社会非常普遍。几十年的工作不断寻求改进的治疗和相关啮齿动物模型，以研究这些复杂的疾病1。慢性压力是情绪障碍的一个促成因素，如抑郁症2。因此，慢性应激范式，如慢性社会失败应激（SDS）和慢性皮质酮给药（CORT）在雄性小鼠中发展，现在被广泛用于评估慢性压力暴露的神经生物学和行为效应。用于评估慢性应激影响的最广泛使用的行为测试包括与回避行为相关的任务，如升高加迷宫、开阔场和新奇的抑制喂养，或具有抗抑郁疗效，如强制游泳测试。然而，啮齿动物的这些行为可以说缺乏面子，更重要的是，预测有效性和转化相关性的人类疾病，如抑郁症。
一种流行的慢性应激范式，慢性不可预知的轻度应激（CUMS），已被广泛验证使用的行为，如蔗糖偏好3。与水相比，CUMS减少了对1%蔗糖溶液的偏好，在历史上被解释为与非同性相关的行为4,4，5。然而，这种减少蔗糖偏好没有观察到在患有严重抑郁症,6，7的人类。此外，蔗糖的偏好不允许学习努力奖励动机。
最近，一些研究已经把焦点转移到了与动机和奖励相关的其他行为上,。这些任务具有有希望的转化价值，因为在人类和啮齿动物中可以进行相对相似的行为评估。在这里，我们描述了 CORT 和 SDS 范式及其在 Y-maze 障碍行为任务中的影响，该任务衡量了为奖励而付出努力的动机。然后，我们讨论了一个新的慢性压力范式，我们开发了，慢性非歧视性的社会失败压力（CNSDS），这是有效的男性和女性小鼠。
慢性皮质酮给给（CORT）是一种模式，旨在模拟慢性压力，而不用实际压力暴露。通过压力激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，导致人类内源性释放肾上腺类固醇皮质醇10、11、1211,12和皮质酮在小鼠13、14。,14通过,成年雄性小鼠的饮用水输送皮质酮至少4周，导致在避免任务，如开放领域，高架加迷宫，和新奇抑制喂养10，11，12，13，14，15，16,14,15的不适应10,11行为反应。12,13有趣的是，CORT还影响工具任务16、17、18、19,17,18,中的奖励处理。此处描述的 CORT 范式产生的血清浓度一致低于 100 ng/mL CORT，比强迫游泳等急性应激器产生的血清浓度低五倍以上。因此，慢性 CORT 给药不太可能导致高皮质血症。虽然慢性 CORT 只对雄性小鼠 20有效，但我们最近证明，在 Y-maze 屏障任务21中，它产生了一个有力的反应。据我们所知，这是研究慢性压力对雄性小鼠21中与努力相关的选择行为的影响的首批研究之一。先前的一项研究首次证明了急性克制压力对22大鼠基于努力的决策的影响。在与努力相关的选择行为中，动物选择要么为高价值奖励而付出努力，要么接受更自由获得的价值较低的奖励。在人类中，奖励任务（EEfRT）的工作量支出是一种电脑游戏，它开发起来类似于老鼠23中的与工作量相关的选择任务。抑郁症导致EEfRT的不适应反应（为高价值奖励选择硬任务的可能性降低）。因此，啮齿动物中与努力相关的选择任务特别有趣，因为它们具有转化相关性。
慢性社会失败压力（SDS）是男性小鼠中应用最广泛的临床前应激模型之一。这是一个为期10天的协议，大型，侵略性退休饲养员CD-1雄性攻击实验鼠，通常C57BL/6J，在5分钟的每日会话24。这在实验小鼠的子集中产生一个健壮的不适应行为表型。社会相互作用测试用于将小鼠分层为受失败应力的弹性或易感人群，一些研究利用 SDS 的这一独特特性来探索压力依赖和易感性背后的分子和神经回路机制。在这里，我们描述了 CORT 范式的细节及其实现 Y-maze 障碍行为任务。我们还讨论了 Y 迷宫障碍任务中的 SDS 效果。Y-maze障碍任务是基于T-maze障碍任务，它主要用于大鼠，以衡量动机，以花费努力高或低奖励目前在迷宫,8，9，2598的两个武器。这项任务也已被实施，以研究在小鼠施用咖啡因或多巴胺拮抗剂在小鼠26的努力反应。啮齿动物可以通过攀登迷宫中一个臂的逐渐增加高度的障碍物来花费更大的精力，获得更高的奖励价值，通常为 4 个奖励颗粒，或在迷宫的另一个手臂上花费更少的精力，只获得 2 个奖励颗粒9。10天的社会失败范式在易感小鼠中产生一个健壮的不良表型，持续约30天，因此我们修改了Y-maze屏障任务，以更快速地训练和测试动物，以便在这30天的时间内完成所有实验24。因此，在这里，我们还详细介绍了Y-maze障碍行为任务协议，其中包含浓缩训练课程和单障碍测试课程，以衡量在慢性压力暴露小鼠中花费精力奖励的动机。
不幸的是，慢性皮质酮和慢性社会失败压力在雄性小鼠中发展，在雌性小鼠中效果较低。这是非常成问题的，因为女性比男性更容易被诊断出患有情绪障碍，如抑郁症1。巧妙地适应SDS已经允许在雌性小鼠使用，但需要困难的手术或乏味的尿液收集26，27。26,我们最近描述了对SDS范式的简单修改，称为慢性非歧视性社会失败压力（CNSDS）。CNSDS允许对实验雄性小鼠和雌性小鼠进行易感和弹性分层。雌性小鼠和雄性易感小鼠暴露在CNSDS显示，在高架加迷宫中，在开阔的场地和中心，在新奇抑制的喂养中，避免张开双臂的延迟增加。CNSDS 也比对 SDS 的其他修改效率更高，因为两性在失败会话中结合在一起。这导致实验鼠的产量增加，而没有相关的时间和努力增加，需要完成协议。因此，我们以最近发展起来的慢性压力范式来深入介绍本手稿。
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Protocol
这些实验是按照NIH实验室动物护理指南进行的，并经罗格斯大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 慢性皮质酮（科特）
- 随机将小鼠分配给治疗组。随机将成年雄性C57BL/6J小鼠分成车辆和皮质酮（CORT）组。
- 将车辆小鼠放在不同的笼子里，而将科特老鼠放在其他笼子里，因为他们的治疗是通过笼子的水瓶进行的。
- 将特殊的水卡贴上标签放在笼子里，通知动物护理人员水瓶中含有实验所需的溶液。
- 通过将 3.375 g 的 β-环糊精溶解到 750 mL 的自来水中，在尺寸为 1 L 的螺丝顶玻璃容器中，制定车辆解决方案。
- 用此溶液填充车辆笼式水瓶。确保瓶子不会泄漏以测量液体消耗量。
- 标记容器，并在实验室的货架上以室温存放。使用车辆溶液填充笼瓶约 1 周。
- 整星期重新灌装车辆瓶。必要时在一周内重新灌装笼瓶1x-2倍。在开始或结束时每周更换1次新鲜瓶子。
注：一周后，β-环糊精将开始覆盖水瓶内部，使溶液浑浊。 - 监测每周两次消耗的液体量并记录。称重每个瓶子并记录下来，小心不要溅出任何液体。重新填充并退回每瓶。
注：5只老鼠的笼子将在3-4天内饮用80-120mL的液体。
- 首先将 3.375 g 的 β-环糊精溶解到 750 mL 的自来水中，在尺寸为 1 L 的螺丝顶玻璃容器中，使 CORT 解决方案成为。"然后加入26.25毫克皮质酮。
- 声波皮质溶液将COR蒂溶解入水中。将容器放在超声波清洁水浴中。声波在40千赫兹约30分钟或直到皮质酮溶解和液体看起来清晰。
注：超声波均质器（尖端式）对溶解COR特也非常有效。 - 用溶液填充所有 CORT 笼的水瓶。标签容器和储存在室温在实验室的货架。CORT溶液可用于灌装笼瓶约1周。
注：使用棕色玻璃水瓶或塑料不透明瓶，因为 CORT 对光敏感。 - 监测每周两次的液体消耗量并记录。每周称量所有车辆和 CORT 小鼠，将消耗的液体与每个笼内小鼠的重量进行比较。
- 要确定消耗的液体量（mL/g/天），请使用以下公式：
（过去 3-4 天饮用的体积笼） / （笼中小鼠的平均体重） X 自车辆或 CORT 瓶重新填充以来的天数）
注：平均笼内n=5成年雄性C57BL/6J小鼠将平均消耗0.25~0.30毫克/克/天，这通常保持一致，通过广告利比图姆和食物缺乏的时间段。这些浓度导致大约剂量24毫克/千克/天β-环糊精，和9.5毫克/千克/天CORTA15，16,16。
- 声波皮质溶液将COR蒂溶解入水中。将容器放在超声波清洁水浴中。声波在40千赫兹约30分钟或直到皮质酮溶解和液体看起来清晰。
- 社会失败压力 （SDS）
- 使用标准的社会失败压力协议，如在其他地方的深度描述24，29。24,
- Y-迷宫障碍任务
- Y-maze 屏障任务的食物剥夺
- 在完成社交互动测试的第二天，称重所有对照和实验小鼠。这将是他们的自由喂养体重。
注意：在这里，我们使用"控制"和"实验"来指SDS控制和SDS实验小鼠，以及车辆和CORD管理的小鼠在各自的SDS和CORD范式。 - 要食物剥夺小鼠，只删除实验室周从C57BL/6J侧的每个笼子。
- 称重所有小鼠，以及每天给予的实验室周量，以便在整个测试过程中将体重适当保持在自由喂养重量的大约 90%。
注：每只老鼠或老鼠在家庭笼子里提供的食物量将取决于体重波动和Y-maze每天训练或测试时消耗的奖励颗粒量。 - 熟悉奖励颗粒。将一小勺20毫克的谷物食品颗粒（Bio-Serv）放入家庭笼子。这将建立熟悉颗粒，并激励小鼠在Y-maze中习惯和初始训练课时食用它们。
- 在完成社交互动测试的第二天，称重所有对照和实验小鼠。这将是他们的自由喂养体重。
- Y-maze 屏障任务的食物剥夺
- Y-maze 仪器
- 构建一个不透明的白色 3/16" 宽的 Plexiglas 的 Y 迷宫结构，三只手臂长 26 厘米，高 20 厘米，宽 7 厘米。
- 使用在 Y-maze 中的插槽之间滑动的分隔线，使研究人员能够关闭最初放置鼠标的启动框，或在选择并进入 Y 迷宫的左臂或右臂后将鼠标控制在一只手臂上。
- 为垂直侧创建多个 10、15 和 20 厘米高的 Y 迷宫屏障，并在后角侧以大约 45° 角使用 Plexiglas。这允许 C57BL/6J 小鼠抓住并爬上每个屏障的垂直铁丝网侧，然后沿着障碍物的倾斜 Plexiglas 侧移动。
- 在倾斜的一侧添加细步，以更大的牵引力。
- Y-maze 习惯
- 将所有控制和实验小鼠都用于Y-maze仪器。
- 食物匮乏后的第二天，将大量20毫克谷物食品颗粒（例如，Bio-Serv）放在50 mL离心管的盖子上，放在Y-maze的每个手臂的末端。这些大写字母作为小鼠的小食物容器，老鼠会很容易学会吃食物颗粒。
- 将每只鼠标放在 Y 迷宫的启动框中，将启动框分隔器放置到位。
- 几秒钟后，拆下分隔线，允许每只鼠标探索 Y 迷宫 15 分钟。这一时间允许鼠标充分探索迷宫的所有手臂，并建立熟悉设备。
注：有些老鼠在第一个习惯日可能不摄入任何食物颗粒。
- 第二天，使用相同的程序完成第二个 15 分钟 Y-maze 习惯。
- 注意任何没有吃过任何颗粒的小鼠。对于这些老鼠，再把一小勺颗粒倒进它们的笼子里。
- 将所有控制和实验小鼠都用于Y-maze仪器。
- Y-maze 强制选择训练
- 为每只鼠标指定高奖励 （HR） 和低奖励 （LR） 手臂。
- 随机分配小鼠在控制和实验组左臂作为高奖励 （HR） 手臂和右臂作为低奖励 （LR） 手臂， 反之亦然.因此，在左侧、HR 臂的每个试验中，将有 4 粒，右侧、LR 臂或相反部分提供 2 粒。
- 平衡控制和实验组中这些指定的 LR 和 HR 臂，使每组中大约一半的左臂作为 HR 臂，一半以右臂作为 HR 臂。
- 强制选择试验
- 经过2天的Y-maze习惯，让老鼠开始3天的10次强制选择训练的试验。
- 对于每个强制选择试验，将鼠标放在启动框中，然后移除分隔线，允许鼠标 60s 进入左臂或右臂并消耗可用的颗粒。对于每个强制选择试验块关闭相反的手臂与分隔器，迫使鼠标选择另一个手臂。对于 HR 强制选择试用，阻止访问 LR 臂，反之亦然。
- 试验后取出鼠标，补充被吃掉的颗粒。
- 在每个训练日对每只小鼠进行备用强制选择试验，使小鼠完成 5 HR 和 5 LR 强制选择试验。
注：强制选择试验训练小鼠将一只手臂与较高的奖励关联，另一只手臂与较低的奖励关联。 - 将鼠标放回其主笼中，然后运行不超过3-5个后续小鼠，以便保持每只小鼠5分钟的间隔。
- 为每只鼠标指定高奖励 （HR） 和低奖励 （LR） 手臂。
- Y-maze 自由选择培训
- 自由选择试用
- 通过 HR 和 LR 臂强制选择试用开始每个自由选择会话。因此，在开始10次自由选择试验之前，小鼠将经历被强迫进入每只手臂。
- 将每只鼠标放在启动框中并拆下分隔线。一旦鼠标选择了一只手臂，并穿过它到包含颗粒的杯子的末尾，将臂分隔器放在该侧的位置，锁定在鼠标中，直到它消耗了颗粒。
- 将鼠标取出回其主笼，并运行该周期中使用的后续 3-5 只小鼠，以便获得 5 分钟的试验间间隔。
- 记录以下数据：选择手臂的延迟、手臂选择和到达颗粒杯的延迟。
- 记录鼠标进入并完全穿过颗粒杯的臂。还要记录延迟以选择该臂并到达颗粒杯。
- 考虑任何试验，如果鼠标未能选择手臂或不消耗所有4或2粒作为省略的试验。
- 70% 自由选择标准
- 记录每天为所有 10 个自由选择试用选择的手臂。
- 在自由选择培训日（70% 标准）的 10 项试验中，有 7 项选择 HR 臂，则将鼠标移到障碍测试会话中。
注：继续自由选择培训，直到所有小鼠达到 70% HR 臂标准，以确保对 HR 臂和 LR 臂的充分歧视，并确保小鼠表现出对 HR 臂的同等偏好。
- 自由选择试用
- Y-maze 障碍测试
- 10 厘米障碍测试会话
- 将 10 厘米的屏障放在 Y 迷宫中人力资源臂的半路上。
- 从两臂的多项强制选择试验开始。耐攀爬障碍的老鼠可以提示一个长，薄的Plexiglas片。
注：根据经验，我们建议在每次课程开始时，在新的屏障高度下，对 HR 和 LR 臂进行至少 2 次强制选择试验。我们建议记录试验，其中有必要提示鼠标爬过屏障，如果有必要。老鼠通常学会爬过10厘米的屏障，这是不是那么高，他们无法忍受，看到它，在1-2试验。对于以相反手臂为指定人力资源臂的小鼠，必须将屏障放置在另一侧。 - 将每只鼠标放在启动框中，取出分隔线，让鼠标穿过迷宫，并选择一只手臂进行 10 个自由选择试验，其中包含 HR 臂中 10 厘米的屏障。
- 如果鼠标选择HR侧，它会爬过障碍，以获得更大的回报，4粒。否则，它会选择LR手臂，只需穿过迷宫的地板，获得较小的奖励，2粒。
- 记录所选臂，以及选择手臂并到达颗粒杯的所有试验的延迟。同样，每个周期旋转 4-6 只小鼠，以保持 5 分钟的试间间隔。
注：在 Y-maze 中喷洒 70% 乙醇，并在每只鼠标之间一致地擦干。
- 15 厘米障碍测试会话
- 第二天完成上述所有步骤（步骤 1.10.1），但人力资源臂有 15 厘米高的屏障。
- 20 厘米障碍测试会话
- 第二天完成上述所有步骤（步骤 1.10.1），但人力资源臂中有 20 厘米高的屏障。
注：根据经验，大多数SDS易感或CORT实验鼠（甚至几个对照小鼠）的屏障高度为20厘米，它们会转向LR手臂，因为它们没有足够的动力爬过20厘米高的屏障。此外，Plexiglas 适配器可能需要使用，以防止小鼠从这个屏障的顶部爬到 Y 迷宫壁的边缘。我们不建议建立一个更高的Y-maze，因为实验者将更难在每个杯子中重新填充颗粒，并在每次试验后取出小鼠。
- 第二天完成上述所有步骤（步骤 1.10.1），但人力资源臂中有 20 厘米高的屏障。
- 奖励歧视测试会议
- 为了确保对照和实验鼠都表现出足够和相似的奖励歧视杠杆，请进行歧视测试。
- 按照上述所有步骤（步骤 1.10.1），但在 LR 臂上放置一个 10 厘米的屏障。现在，两只手臂都含有10厘米的屏障，老鼠需要爬过去才能获得4或2粒的奖励。
- 记录所有 10 个试验的延迟和手臂选择。
注：由于小鼠必须花费同样的精力才能获得任何奖励，因此小鼠在大多数试验中应选择人力资源臂。要检查延迟以选择 HR 和 LR 臂，请计算每个单个鼠标的 HR 臂平均延迟和平均 LR 臂延迟。然后，比较延迟，使用双向混合的 ANOVA 选择两臂，SDS（控制、SDS-可影响、SDS-弹性）作为主体之间的因子，而手臂（HR 臂、LR 臂）作为主体内因子。
- 10 厘米障碍测试会话
2. 长期非歧视性的社会失败压力
- CD-1 鼠标中攻击性行为的屏幕
- 将一只雄性和一只雌性 C57BL/6J 小鼠放入每个 CD-1 的家笼中，使用 180 s，或直到 CD-1 攻击两只小鼠。这些C57BL6/J小鼠不需要天真，不会用于任何进一步的实验。在此侵略者筛选阶段，不要将 C57BL/6J 小鼠与 CD-1 小鼠合二为一。
- 记录每个 CD-1 的两个 C57BL/6J 鼠标的延迟。
- 在总共 3 次筛查中，选择在连续 60 秒内连续攻击雌性 C57BL/6J 小鼠的所有 CD-1 侵略者。其他可用于家庭笼子中的共住。
注：社会失败的一个重要警告是，由于身体攻击，造成伤害。在筛查和实验阶段的每只小鼠应检查伤口，如果存在小皮肤病变，应用氯己烷消毒剂进行治疗。任何伤口大于 1 厘米的小鼠都应从实验中去除。
- 将一只雄性和一只雌性 C57BL/6J 小鼠放入每个 CD-1 的家笼中，使用 180 s，或直到 CD-1 攻击两只小鼠。这些C57BL6/J小鼠不需要天真，不会用于任何进一步的实验。在此侵略者筛选阶段，不要将 C57BL/6J 小鼠与 CD-1 小鼠合二为一。
- 将小鼠分配给对照组和实验组。
- 收集所有天真的成年男性和女性C57BL/6J小鼠，以及筛选的退休男性CD-1育种者，以及CD-1雄性用于共同住房。
- 随机分配成年男性和女性C57BL/6J小鼠对照或实验条件。在CNSDS实验组，男性和女性将配对参加所有社交失败会议。CNSDS 控制组的男性和女性将每天轮换。
- 分配CD-1雄性用于社会失败会议或与实验男性和女性在每一个会话后合住，这将交替每对C57BL/6J男性和女性小鼠。
- 收集所有天真的成年男性和女性C57BL/6J小鼠，以及筛选的退休男性CD-1育种者，以及CD-1雄性用于共同住房。
- 慢性非歧视性社会失败压力（CNSDS）
- 将所有小鼠带到专门的社交失败室，包括所有 CD-1 雄性、CNSDS 控制男性和女性 C57BL/6J 小鼠，以及 CNSDS 实验男性和女性 C57BL/6J 小鼠。
- 将 CD-1 雄笼与 C57BL/6J 雄笼与前部 CD-1 笼和后 C57BL/6J 笼对齐。
- 使用保持架 ID 标记指示哪个鼠标被攻击，然后与哪个 CD-1 共同存放，以确保组织所有鼠标。
注：在第一天进行初始化实验后，小鼠可以旋转剩余的9个失败会话，这样每个C57BL/6J的男性和女性对每轮都向左旋转一个笼子。这允许在每个会话中与新颖的 CD-1 进行新的交互。
- CNSDS 实验组程序
- 将一只成年雄性和一只成年雌性C57BL/6J小鼠放入每个CD-1侵略者雄性的家笼中，进行5分钟的社交失败会议。
- 记录雄性和雌性实验C57BL/6J小鼠的攻击延迟和攻击频率。
- 5分钟后，取出雄性C57BL/6J小鼠，并放在合用CD-1雄性卡子的笼子里，由一个清晰、穿孔的Plexiglas屏障隔开。单独的攻击 CD-1 和女性 C57BL/6J 鼠标与类似的清晰，穿孔的 Plexiglas 屏障。交替的，无论是男性还是女性C57BL/6J鼠标都安置与侵略者CD-1每天。
注：每次5分钟互动后，每只小鼠将接受治疗的伤害和伤口（如果小于1厘米）。任何大于 1 厘米的伤口都会导致小鼠被切除并立即安乐死。因此，雄性和雌性实验鼠与CD-1侵略者同居5天，其余5天未在攻击会话中使用的新型CD-1。清晰、穿孔的 Plexiglas 屏障可防止物理交互，但允许在会话之间的 24 小时内与 CD-1 侵略者进行感官接触。阴道熔岩可以在每天失败后大约30分钟在所有雌性小鼠身上进行，如前面28日描述的那样。
- CNSDS 控制组程序
- 将一只控制雌性在一只控制公 C57BL/6J 鼠标的家用笼中放置。
- 5分钟后，将小鼠分开，在小鼠之间放置一个清晰、穿孔的Plexiglas分压器。
- 将小鼠返回殖民地房间，并放在单独的架子上，作为CNSDS实验笼。在殖民地房间，我们指定了有压力的老鼠与殖民地房间的其他小鼠分开存放的架子。此外，如果无压力小鼠目睹了侵略的发生，它们可能会看到效果，正如在替代性社会失败范式30中所看到的那样。
- 请注意每次控制交互期间的任何攻击或安装行为。
- 控制雄性小鼠和雌性小鼠将在随后的日子里被引入一个新的特异性，就像传统的社会失败压力控制组一样。完成连续10天的CNSDS控制和实验会议。
- 在完成第 10次和最后 一次控制或实验性 CNSDS 会话后，将所有小鼠合二为一，并在所有行为测试中维护此共占。每个笼子将由2只老鼠组成，它们被分离在有机玻璃分压器的两侧，以允许感官接触。对照小鼠与其他异性对照小鼠一起安置，而实验鼠则与其他异性实验鼠共同居住。
- 每个控制C57BL/6J雌性与控制C57BL/6J雄性，它在第10个会话 中相互作用，一个明确的，有机玻璃分隔器放置在笼子里，以分离两只小鼠。
- 在最后的失败会话后约24小时运行一个标准的社交互动测试，以确定CNSDS是否减少社会行为与新的CD-1鼠标相比对，并分层小鼠"弹性"或"易受"的压力24，29。,29
- 测试CNSDS控制和实验雄性及雌性小鼠的其他行为，包括Y-maze屏障任务，并分层到CNSDS-弹性和中枢DS-Susceptible组。
- 将所有小鼠带到专门的社交失败室，包括所有 CD-1 雄性、CNSDS 控制男性和女性 C57BL/6J 小鼠，以及 CNSDS 实验男性和女性 C57BL/6J 小鼠。
- 社交互动测试
- 社交交互测试的初始设置
- 在最终的CNSDS失败会议后24小时，进行社会互动测试。
- 将所有对照和实验小鼠，以及一种在CNSDS范式中未使用的新CD-1雄性小鼠，到单独的行为室运行社会互动测试。
- 在连接到专用计算机上运行的行为跟踪软件（例如 EthoVision）的摄像机下方设置一个标准的开放场室（75 厘米 x 75 厘米）。
- 设置一个新的实验，在互动容器周围设置一个24厘米x24厘米的社会互动区（小，穿孔的Plexiglas容器，测量约10厘米x10厘米x10厘米），将住房新颖的CD-1沿着开放领域的一堵墙，在连续2.5分钟的试验的第二个。因此，一个7厘米宽的相互作用区环绕一个装有新型CD-1鼠标的容器。
- 在社交交互测试中运行鼠标
- 将每只鼠标放在开放场地的远角，进行 2.5 分钟的试用，没有 CD-1 存在，然后启动录制软件程序。
注意：请记住，交互容器应放置在开放字段的一堵墙的中心，并且第一次试验不包含 CD-1 鼠标。 - 2.5分钟后，将鼠标取出回其家庭笼中。用70%乙醇清洁露天。
- 将新颖的 CD-1 雄性放入开放场地一堵墙中间的第二个穿孔 Plexiglas 立方体中。
- 再次，将鼠标放在开放字段的一角进行第二次 2.5 分钟的试用，现在 CD-1 在场，然后启动录制软件程序。
- 取出鼠标，放回其家庭笼子。取出 CD-1 并将其放回其主笼中。用70%乙醇清洁露天。
- 将每只鼠标放在开放场地的远角，进行 2.5 分钟的试用，没有 CD-1 存在，然后启动录制软件程序。
- 运行剩余的CNSDS控制和实验小鼠，并计算相互作用率。
- 与所有其他小鼠重复此程序，以量化在试验 1 和试验 2 中每个 CNSDS 控制和实验小鼠在交互区花费的时间。
- 要计算交互比率，请使用以下等式比较试验 2（CD-1 存在）中社交交互区所花费的时间与试验 1（CD-1 缺席）中花费的时间：
交互比 = （试验 2 中交互区的时间）/（试验 1 中交互区的时间）
- 将小鼠分层为"CNSDS 弹性"或"CNSDS-Susceptible"。弹性小鼠的相互作用比为 > 1.0，而易感小鼠的相互作用比为 <=1.0。
- 在后续行为测量中，如Y-maze屏障任务或其他行为测试，将CNSDS实验鼠分到这些CNSDS弹性和中枢素易感表型中。
- 因此，对于女性，CNSDS控制、CNSDS实验弹性组和中枢DS实验-易感组之间可以进行双向ANOVA，并进行后期比较，以确定各组之间的差异（如果适用）。
- 对于性别差异比较，与CNSDS（控制、弹性、易感）和性别（男性、女性）进行双向的ANOVA作为主体之间的因素。在适当时使用临时比较。
- 社交交互测试的初始设置
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Representative Results
慢性 CORT 被管理了 4 周，然后是 Y-maze 屏障训练和测试（图 1A）。在另一组，10天的SDS范式同样是 Y-maze 屏障任务（图1C）的训练和测试，以确定这些慢性压力范式对雄性小鼠与努力相关的选择行为的影响。慢性 CORT 和 SDS 与 T-测试确定的"车辆小鼠"和"SDS"控制小鼠相比，均降低了平均体重（表 1）。在整个测试过程中，这些小鼠的家用笼式实验室的消耗也较少（表1）。
在 CORT 队列中，与 CORT 混合的 ANOVA 作为受试者之间的因子和作为受试者内因子的周表示车辆和 CORT 管理的小鼠在 4 周的治疗中消耗了类似体积的液体，外加 3 周的行为测试（共 7 周）（图 1B）。在 SDS 队列中，对照和实验男性完成了 10 天的 SDS 协议，并使用社会交互测试评估了对 SDS 协议的易感性，其中与新型 CD - 1 雄互所花费的时间与在交互区的时间进行比较，而没有 CD - 1目前 24 。一种双向的 ANOVA 表明，SDS 在易感小鼠（60%）中产生不良的表型，而两种有弹性小鼠（40%）或对照小鼠未暴露在 SDS 中（图 1D）。具体来说，与SDS弹性对照小鼠相比，SDS-Susceptible小鼠在包含新型CD-1小鼠的交互区所花费的时间减少。
然后，我们在Y-maze屏障任务中训练了CORD（实验和控制小鼠）和SDS（易感和控制）队列（图2A）。我们测量了对照和实验鼠将花费努力攀登4丸奖励障碍的试验数量，而不是选择只有2粒但无障碍攀爬的Y-maze的另一只手臂。对于 SDS，采用双向混合的 ANOVA，以 SDS（控制、SDS-Susceptible、SDS-弹性）作为主体之间的因子，而手臂（HR 臂、LR 臂）作为主体内因子用于检查 Y-maze 中的努力响应。对于慢性 CORT，双向混合的 ANOVA，以 CORT 管理（车辆、CORT）为主体间因子，手臂（HR、手臂、LR 臂）作为主体内因子。当屏障高度增加到 15 厘米和 20 厘米时，慢性 CORT 和 SDS 都产生了努力响应的变化（图 2B 和图 2C）。当人力资源臂中只有 10 厘米的障碍物时， 两者均未改变响应。此外，在测试后的奖励歧视环节中，当人力资源和LR臂都设置了10厘米的屏障时，所有小鼠对HR臂的反应也类似。最后，以CORT或SDS为主体因子的双向ANOVA和作为主体内因子的HR或LR臂显示，具有15厘米屏障的HR和LR臂延迟不受CORT管理的影响，并且对于同时具有LR和HR臂的两组（图3）相似。因此，慢性 CORT 和 SDS 在雄性小鼠的 Y-maze 屏障任务中有力地转移了努力响应。
重要的是，如果慢性 CORT 或 SDS 损害 Y-maze 障碍任务的学习（图4），这些小鼠可能无法在自由选择培训课程中达到标准，从而影响随后对障碍结果的解释。因此，我们显示潜在的负面代表性结果，显示这种差异，评估使用独立的样本t-测试（图4）。
CNSDS程序在雄性和雌性C57BL/6J易感小鼠中产生强健的不良表型（图5A）。社会互动任务用于将小鼠分层为弹性（38.3%）和易感 （61.7%）人口（图5B），可以进一步按性别细分（男性：43.3%弹性，56.7%易受感染;女性：36.7%弹性，63.3%易受感染），使用CSDS控制，CNSDS实验弹性和CNSDS实验-易感组之间的双向ANOVA。虽然这种修改后的范式在回避行为28中产生了与SDS类似的不适应效应，但它尚未与翻译相关的奖励和动机相关行为测试（如Y-maze障碍任务）共同实施。对于未来的研究，评估压力源（如CNSDS）对男性和女性的Y-maze屏障任务等翻译相关行为的影响至关重要。
| 慢性皮质 | 组 | 体重 （g） | 每日食物（g） | ||
| 意味 着 | Sem | 意味 着 | Sem | ||
| 车辆 | 26.3 | 0.75 | 2.8 | 0.086 | |
| 科特 | 22.4 | 0.58 | 2.4 | 0.065 | |
| 社会失败压力 | |||||
| 控制 | 27.5 | 0.67 | 2.9 | 0.088 | |
| Sds | 23.8 | 0.66 | 2.5 | 0.074 |
表1：体重和每天提供的食物量。 车辆和 CORT 管理的小鼠，以及 Control 和 SDS 小鼠每周进行称重，并记录出食物量。在 Y-maze 测试中的平均体重 （g）， 以及给出的平均每日食物 （g） 表示。
图1：SDS诱发以较少社会互动为特征的抑郁表型。
（A） 描述 CORT 和 Y 迷宫障碍协议的时间表的示意图。（B） 显示车辆和 CORT 管理的小鼠的消耗量（mL/g/天）的代表性数据。（C） 描述 SDS 和 Y 迷宫障碍协议的时间表的示意图。（D） 在具有代表性的社会互动测试中，与SDS弹性小鼠或对照小鼠相比，SDS易感小鼠显示与新型小鼠互动的时间减少。柱线为均值 = Sem. *p < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2：CORT 和 SDS 在 Y 迷宫障碍任务中进行努力响应。
（A） CORT 和 SDS 的 Y 迷宫障碍任务的时间线。（B） 慢性 CORT 可减少 15 厘米和 20 厘米障碍高度的 HR 臂选择。这个数字已经修改了迪特里奇等人2020年21。（C） 代表性结果表明，SDS-Susceptible小鼠在15厘米和20厘米的屏障高度减少HR手臂的选择，相比之下，控制或SDS弹性小鼠。柱线为均值 = Sem. *p < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 3：Y-maze 延迟不受慢性 CORT 的影响。
慢性 CORT 不会影响延迟，以选择 Y 迷宫中的 LR 或 HR 臂。此外，车辆和 CORT 鼠标选择具有类似延迟的 LR 或 HR 臂。这个数字转载自迪特里奇等人2020年21月。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：慢性 CORT 和 SDS 损害了自由选择 HR 臂的选择。
代表性结果表明，与自由选择训练中对照小鼠相比，暴露于慢性 CORT 或 SDS 的小鼠减少了高奖励手臂选择的数量，使结果解释复杂化和/或延迟或防止过渡到障碍测试。柱线为均值 = Sem. *p < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：将中枢DS暴露的雄性小鼠和雌性小鼠分层为易感和弹性种群。
（A） CNSDS实验和控制范式图。这个数字重印自Yohn等人2019年28月。（B） CNSDS产生强健的分层的CNSDS弹性（RES）和CNSDS-易感（SUS）小鼠。这个数字重印自Yohn等人2019年28月。柱线为均值 = SEM. *p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ***p < 0.0001。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
虽然慢性 CORT 模式在饮用水中提供恒定的 CORT 剂量，但根据经验，小鼠的消费量可能会发生一些变化。此外，只能评估总笼的消费量，以及根据笼中小鼠数量进行的平均食用。此外，当称量瓶子、转移小鼠进行行为测试或更换到新鲜笼子时，可能会发生溢出。然而，跟踪车辆和COR蒂消耗仍然是可行和准确的，在数周的治疗和行为测试。我们强烈建议每周更换一次含有车辆或 CORT 的新鲜瓶子，以及保持设定的时间来称重和更换瓶子。例如，在称重和重新灌装瓶子时，可以在周一更换新鲜瓶子，然后在周四或周五再次称重和重新灌装所有瓶子。同样，最好每周在指定的日子同时称重所有小鼠。最后，必须指出，这种 CORT 范式钝化了 HPA 轴对皮质酮的内源性生产。因此，小鼠必须在整个行为测试中保持对 CORT，直到它们被牺牲。如果小鼠被从COR蒂中取走，那么它们可能会遭受急性肾上腺功能不全的艾迪森危机。替代程序已经使用了2-3周的COR蒂暴露，然后逐步摆脱COR蒂，然后一个行为测试窗口约3-4周，内源性COR蒂水平恢复正常17，1917,。
在 Y-maze 障碍任务中，在 SDS 协议（图2A）之后立即开始迷宫习惯和培训至关重要。这个实验时间表的一个潜在警告是，老鼠是经过操纵而不是事先训练，根据训练表现可以平均分配。但是，根据我们的经验培训之前和之后 CORT 管理不会显著影响工具行为16。在推进障碍测试之前，所有小鼠都经过全面训练并达到标准（>70% HR 臂选择在自由选择会话中）。老鼠应该首先适当地习惯迷宫，所以它成为一个熟悉的设备，因为我们发现这有助于在随后的训练阶段。训练每只鼠标时，保持每个鼠标的设计高和低奖励臂至关重要，因此鼠标不会穿过手臂，期待 4 粒，并找到 2 个，反之亦然。我们建议保留大型原始数据文件的纸质和数字副本，指示所有 Control 和 SDS 鼠标的平衡高和低奖励臂。
我们不相信迷宫性能有区别，因为迷宫形状的确切规格（Y-maze与T-maze），并相信研究人员可以使用任何一个与努力相关的选择行为实验。此外，我们以前曾报告，HR手臂选择在15厘米，而车辆管理小鼠21的10厘米略有增加。然而，研究人员应该期待类似或减少的人力资源手臂选择，因为屏障高度增加超过15厘米，因为由20厘米屏障小鼠很少选择HR手臂21。
此外，使用 70% 乙醇喷雾来清洁迷宫并消除每次会议后残留的气味也很重要。我们还建议以一致的方式运行小鼠，以便所有小鼠都有相对恒定的试验间间隔。我们建议一次循环大约4-6只老鼠，这应给予大约5分钟的间隔。最后，在上次自由选择会话和所有障碍测试会话中，记录延迟在所有试验中选择任一臂非常重要。此外，老鼠偶尔会设法跳到Plexiglas壁的顶部，或者更频繁地从屏障的顶部跳。如果发生这种情况，我们建议沿着迷宫两侧使用更高的 Plexiglas 壁适配器。这些可以是简单的矩形片Plexiglas（宽度20厘米，长度80厘米）。我们标记任何试验，如果鼠标未能选择手臂在60秒内或选择手臂，但没有吃的食物颗粒作为省略的试验。最后，慢性CORD和SDS都可以降低体重，从而影响21周内食物的消耗量。研究人员应定期给老鼠称体重，并调整家庭笼子里的食物量，使老鼠保持大约90%的自由喂养体重。
在这里，我们还讨论了最近开发的范式，慢性非歧视性的社会失败压力（CNSDS）（图5A），用于诱导雄性小鼠和雌性小鼠的易激和弹性人群（图5B）。CNSDS范式可用于对压力或情绪障碍感兴趣的临床前研究人员。在CNSDS范式中，实验女性每期至少受到攻击一次至关重要。在几乎所有的社会失败会话实验男性被攻击多次。在开始CNSDS协议之前，必须用雄性和雌性C57BL/6J小鼠对每个CD-1攻击者进行严格筛查，并记录每个会话中的任何攻击。虽然我们描述了在CNSDS方法的双重性控制条件，其中一个男性和女性互动，它可能适合一些包括一个额外的男性为这些控制相互作用，从而模仿两个男性和一个女性在CNSDS程序使用。这种替代控制程序不影响小鼠在回避行为28中的行为。此外，应在10天失败协议后24小时实施社会互动测试，以确保方法的有效性，并分层为有弹性或易受CNSDS24的雄性小鼠和雌性小鼠。
根据社会交互测试，使用将小鼠细分为弹性和易感种群的历史方法的一个问题，即并非所有的厌恶行为都可以使用视频跟踪软件进行精确测量。具有交互分数的"弹性"小鼠 >1 可能演示了容器周围的顺从行为，该容器包含 CD1 鼠标31。对于该领域来说，开发能够更好地跟踪此类微生物行为的软件非常重要。简单的行为分析（SimBA32）等工具，由黄金实验室开发，允许行为分类器对啮齿动物复杂的社会行为进行分类，可能证明在这方面很有用。
在 CNSDS 协议期间可能会出现某些安装。虽然我们没有观察到任何怀孕在这个范式，研究人员应该知道这种可能性。
社会失败协议的另一个限制，包括CNSDS，是据报道，有限的时间窗口，以调查压力的影响行为后，完成社会失败会议。因此，我们调整了现有的迷宫障碍协议，以适合所有习惯、培训和测试会话，并适应 30 天的时间范围。然而，这可能加速了一些小鼠的整体训练，他们可能难以达到完成自由选择课程所需的70%的高奖励手臂选择标准（图4）。此外，在没有适当规划的情况下，完成任何其他行为测试的天数有限。然而，最近的研究表明，社会失败压力可以产生更持久的影响大脑和行为。Miczek实验室的研究表明，10天的社会失败压力可以增加老鼠的自愿饮酒量，持续至少4周31，33。,33社交失败协议使用持续 5-10 分钟的失败会话。我们使用5分钟接触中枢系统，以减少实验C57BL/6J小鼠28受伤的可能性。CNSDS协议在女性身上产生的结果与纽曼及其同事开发的社会失败协议相当，其中C57BL/6J雌性小鼠与常驻瑞士韦伯小鼠接触28。与CNSDS类似，这种社会失败协议的变异使用10天的5分钟相互作用来诱导慢性应激表型。
这些方法可用于检查慢性压力如何影响小鼠的赏性处理和动机。奖励处理和女性受试者在历史上都未研究临床前情绪障碍领域。未来的研究应确定慢性压力对男性和女性奖励动机的影响，并分层弹性与易感小鼠（图5B）。了解这种分层是否对 Y-maze 障碍性能产生不同的影响（如开放场、高架加迷宫和新奇抑制喂养）中所看到的效果将是有价值的。未来的研究可以将这些方法与其他技术（如光遗传学或 DREADDS 技术）相结合，以检查神经回路中调解应激反应或奖励动机。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢托马斯格雷斯建造了Y迷宫，障碍和社会失败笼。作者要感谢JayLee、KarinaStech和PrachiSrivastava在数据收集方面提供的援助。这项工作由 NIMH 格兰特 R01 MH112861 （BAS） 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic Sheet | McMaster Carr | 8560K215 | Clear, 3/16" thick, 24" X 36" |
| Beta-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4767 | 500 mg |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 000664 | Adults age 7-8 weeks |
| Corticosterone | Sigma-Aldrich | C2505 or C27840 | 100 or 500 mg |
| Male CD-1 Mice | Charles River | 022 | "Retired Breeders" |
| PVC Acrylic Sheet | McMaster Carr | 8560K215 | White, 3/16" thick, 48" X 48" |
| Solidstate Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FS-28 | Must reach 40 kHz |
| Steel Wire Cloth | McMaster Carr | 9219T143 | 1 ft X 2 ft |
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