Summary
Y迷路バリアタスクは、報酬のために努力を費やす動機を調べる行動テストです。ここでは、この行動を伴う慢性コルチコステロンや社会的敗北ストレスを含む複数の十分に検証された慢性ストレッサーの検査と、女性に有効な新しい慢性非差別的社会的敗北ストレス(CNSDS)について議論する。
Abstract
気分障害, 大うつ病性障害を含む, 慢性的なストレスによって沈殿することができます。.Y迷路バリアタスクは、努力を費やして報酬を得るための動機を測定する努力関連の選択テストです。マウスでは、慢性的なストレス暴露は、ストレスのないマウスと比較して、より価値の低い報酬が自由に利用できる場合、より高い値の報酬のために働く動機に大きな影響を与えます。ここでは、Y迷路バリアタスクにおける努力的な対応の変化を生み出す慢性コルチコステロン投与パラダイムについて説明する。Y迷路タスクでは、片方の腕には4つの食品ペレットが含まれ、もう片方の腕には2つのペレットしか含み合いません。マウスが高報酬アームを選択することを学んだ後、徐々に高さの高さの障壁が複数のテストセッションにわたって高報酬アームに導入されます。残念ながら、ほとんどの慢性ストレスパラダイム(コルチコステロンおよび社会的敗北を含む)は雄マウスで開発され、雌マウスでは効果が低い。そこで、我々は、男性と女性の両方のマウスに有効であるストレスパラダイムである慢性非差別的社会的敗北ストレス(CNSDS)についても議論する。男性マウスと雌マウスの複数の異なる慢性ストレッサーと翻訳関連行動タスクの使用の増加を組み合わせた結果を繰り返し、慢性ストレスがどのように気分障害を引き起こすかについての理解を深めるのに役立ちます。
Introduction
今日の社会では、うつ病や不安などの気分障害が非常に蔓延しています。何十年もの作業は、これらの複雑な障害を研究するために改善された治療法と関連するげっ歯類モデルを継続的に探し求めてきました 1.慢性ストレスはうつ病のような気分障害の要因である2.そのため、慢性社会的敗北ストレス(SDS)や慢性コルチコステロン投与(CORT)などの慢性ストレスパラダイムは、雄マウスで開発され、慢性ストレス暴露の神経生物学的および行動効果を評価するために広く使用されています。慢性的なストレス効果を評価するための最も広く使用されている行動テストには、上昇プラス迷路、オープンフィールド、および新規性抑制された摂食、または強制水泳テストなどの抗うつ薬の有効性などの回避行動に関連するタスクが含まれます。しかし、げっ歯類におけるこれらの行動は間違いなく顔を欠き、さらに重要なことに、うつ病などの人間の障害に対する予測的妥当性と翻訳的関連性を欠いている。
一般的な慢性ストレスパラダイム、慢性予測不可能軽度ストレス(CUMS)は、ショ糖好み3などの行動を用いて広範囲に検証されている。CUMS は水と比較して 1% スクロース溶液の好みを減らし、歴史的にアンヘドニア関連の行動4,,5として解釈されます。しかし、このショ糖好みの低下は、大うつ病性障害66,77を有するヒトでは認められない。さらに、スクロースの好みは、努力的な報酬動機の研究を可能にしません。
最近、いくつかの研究は、モチベーションと報酬88、99に関連する他の行動に焦点を移しています。人間とげっ歯類の両方で比較的類似した行動評価を行うことができるため、これらのタスクは有望な翻訳価値を有する。ここでは、報酬のための努力を行うための動機を測定するY迷路バリア行動タスクにおけるCORTとSDSパラダイムとその効果について説明します。次に、雄マウスと雌マウスの両方に有効な慢性非差別的社会的敗北ストレス(CNSDS)を開発した新しい慢性ストレスパラダイムについて議論する。
慢性コルチコステロン投与(CORT)は、実際のストレス暴露なしに慢性的なストレスを模倣するように設計されたパラダイムです。ストレスによる視床下部下垂体副腎軸の活性化は,、マウス13,14におけるヒト1410、11、1211,12およびコルチコステロンにおける副10腎ステロイドコルチゾールの内因性放出をもたらす。少なくとも4週間の成人雄マウスの飲料水を介したコルチコステロンの送達は、オープンフィールド、上昇プラス迷路、および新規性抑制された摂,食10、11、12、13、14、15、16,11,12,などの回避タスクにおいて不適応な行動応答をもたらす。13,1415,16興味深いことに、CORTは、インストゥルメンタル,タスク16、17、18、19,17の報酬処理にも影響を与,18えます。ここで説明するCORTパラダイムは、強制泳ぎ15などの急性ストレッサーによって生成されたものより5倍以上少ない100 ng/mL CORT未満の一貫した血清濃度を生成する。したがって、慢性CORT投与は高コルチゾール血症を引き起こす可能性は低い。慢性CORTは雄マウス20にしか有効ではないが、最近はY迷路バリアタスク21における手間の強い応答の変化を生み出していることを実証した。我々の知る限りでは、これは、慢性ストレスが雄マウス21における努力関連選択行動に及ぼす影響を調べる最初の研究の一つであった。ある以前の研究は、ラット22の努力ベースの意思決定に対する急性抑制ストレスの影響を最初に実証した。努力関連の選択行動では、動物は価値の高い報酬のために努力するか、より自由に利用できる価値の低い報酬を受け入れることを選択します。ヒトにおいて、報酬タスク(EEfRT)に対する労力支出は、マウス23における努力関連選択タスクに類似するように開発されたコンピュータゲームである。うつ病は、EEfRTで不適応な応答をもたらす(価値の高い報酬のためのハードタスクを選択する可能性が低下)。したがって、げっ歯類の作業に関連する選択タスクは、その翻訳の関連性のために特に興味深いものです。
慢性社会的敗北ストレス(SDS)は、雄マウスでより広く使用されている前臨床ストレスモデルの1つです。これは、大規模で積極的な引退したブリーダーCD-1雄が実験マウス(典型的にはC57BL/6J)を5分の毎日のセッション24で攻撃する10日間のプロトコルです。これは、実験マウスのサブセットにおける強い不適応行動表現型を生成する。社会的相互作用テストは、マウスを敗北ストレスの回復力のある集団または影響を受けやすい集団に成層するために使用され、いくつかの研究は、ストレスの依存と感受性の根底にある分子および神経回路メカニズムを調査するためにSDSのこのユニークな特性を使用しています。ここでは、Cort パラダイムの詳細と、Y迷路バリア行動タスクの実装について説明します。また、Y迷路バリアタスクにおけるSDS効果についても説明します。Y迷路バリアタスクは、主にラットで使用されるT迷路バリアタスクに基づいており、迷路88、9、259,25の2つの腕に存在する高い報酬または低い報酬に対する努力を費やす動機を測定するために主に使用される。この作業は、マウス26においてカフェインまたはドーパミンアンタゴニストを投与したマウスにおける手間の反応を研究するためにも実施されている。げっ歯類は、より高い報酬値のために迷路の片腕の高さを徐々に増加させる障壁を登ることによってより大きな努力を費やすことができるか、典型的には4つの報酬ペレット、または迷路の他の腕にわずか2報酬ペレットを受け取るために大幅に少ない労力を費やします9.10日間の社会的敗北パラダイムは、約30日間続く影響を受けやすいマウスに堅牢な不適応表現型を生成するので、この30日間の期間内のすべての実験を完了するために、Y迷路バリアタスクをより迅速に訓練および試験する動物に変更しました。そこで、慢性ストレスにさらされたマウスの報酬に対する努力を費やす動機を測定するために、凝縮されたトレーニングセッションと単一のバリアテストセッションを含むY迷路バリア行動タスクプロトコルについても詳しく説明します。
残念ながら、慢性コルチコステロンと慢性的な社会的敗北ストレスの両方が雄マウスで発症し、雌マウスでは効果が低い。これは、女性がうつ病などの気分障害と診断される可能性が男性よりも高いとして、非常に問題です 1.SDSへの巧妙な適応は雌マウスの使用を許可しているが困難な手術または退屈な尿の収集26、27,27を必要としている。我々は最近、慢性的な非差別的社会的敗北ストレス(CNSDS)と呼ばれるSDSパラダイムへの簡単な変更について説明した。CNSDSは、実験的な雄マウスと雌マウス28の両方の感受性および弾力性のある階層化を可能にする。CNSDSにさらされた雌と雄の両方の影響を受けやすいマウスは、上昇プラス迷路とオープンフィールドの中心におけるオープンアームの回避の増加を示し、新規性抑制された給餌で食べるために遅延の増加を示す。CNSDSはまた、両方の男女が敗北セッションで組み合わされるため、SDSへの他の変更よりも効率的です。これは、プロトコルを完了するために必要な時間と労力の関連する増加なしに実験マウスの収量を増加させます。したがって、この原稿は、最近開発された慢性ストレスパラダイムの詳細なプレゼンテーションで結論付けます。
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Protocol
これらの実験は、NIHの実験動物ケアガイドラインに従って実施され、ラトガース大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 慢性コルチコステロン (コルト)
- マウスを無作為に治療グループに割り当てます。雄の雄C57BL/6Jマウスを無作為に車両群とコルチコステロン(CORT)群に分ける。
- 彼らの治療はケージの水筒を介して送達されるように、別のケージ内の車両マウス、および他のCORTマウス。
- ケージに置く特別なウォーターカードにラベルを付け、実験に必要なソリューションが含まれていることを動物のケアスタッフに通知します。
- 3.375 gのβ-シクロデキストリンを750 mLの水道水に溶解して、サイズ1 Lスクリュートップガラス容器に入れ、車両ソリューションを作ります。
- このソリューションで車両ケージの水のボトルを充填します。ボトルが漏れないようにして、液体の消費量を測定します。
- 容器にラベルを付け、実験室の棚の室温で保管します。約1週間ケージボトルを充填するために車両ソリューションを使用してください。
- 一週間を通して車両ボトルを補充します。必要に応じて、週の間にケージボトル1x-2xを補充します。週の初めまたは終わりに週に1倍の新鮮なボトルに変更します。
注:1週間後、β-シクロデキストリンは水筒の内側をコーティングし始め、溶液を曇らせます。 - 週2回の液体消費量を監視し、記録します。それぞれのボトルと記録の重量を量り、液体をこぼさないで注意してください。ボトルを補充して返却してください。
注:5匹のマウスのケージは、3〜4日間で80〜120mLの液体を飲みます。
- まず、β-シクロデキストリンの3.375 gを、サイズ1 L スクリュートップガラス容器に750 mLの水道水に溶解して、CORT溶液を作ります。その後、コルチコステロンの26.25mgを追加します。
- コルト溶液を水に溶解するソニッケートコルト溶液。容器を超音波洗浄水浴に入れます。約30分間、またはコルチコステロンが溶解し、液体が透明になるまで40 kHzで超音波処理します。
注:超音波ホモジナイザー(チップスタイル)もCORTを溶解するために有効です。 - すべてのCORTケージの水筒を溶液で満たします。ラベルコンテナとラボの棚の室温で保存します。CORT溶液は、約1週間のケージボトルを充填するために使用することができます。
注: CORT は光に敏感であるため、茶色のガラスの水ボトルまたはプラスチック製の不透明なボトルを使用します。 - 週に2回の液体消費量を監視し、記録します。各ケージ内のマウスの重量に消費された液体を比較するために毎週すべての車両およびCORTマウスの重量を量る。
- 消費される液体の量(mL/g/日)を決定するには、次の式を使用します。
(過去3〜4日間に飲んだボリュームケージ)/(ケージ内のマウスの平均体重)車両またはCORTボトルが再充填されてからX日数)
注:n =5成人雄C57BL/ 6Jマウスの平均ケージは平均0.25〜0.30mg / g /日で消費しますが、これは通常、アドリビタムと食物を奪われた期間を通じて一貫しています。これらの濃度は、およそ24mg /kg/日β-シクロデキストリン、および9.5mg /kg/日CORT15、16,16の概算用量をもたらす。
- コルト溶液を水に溶解するソニッケートコルト溶液。容器を超音波洗浄水浴に入れます。約30分間、またはコルチコステロンが溶解し、液体が透明になるまで40 kHzで超音波処理します。
- 社会的敗北ストレス(SDS)
- 他の場所で詳細に説明されているように、標準的な社会的敗北応力プロトコルを使用します24,,29.
- Y迷路バリアタスク
- Y迷路バリアタスクのための食糧不足
- 社会的相互作用テストを完了した翌日、すべてのコントロールマウスと実験マウスの重さを量る。これは彼らの自由な摂食体重になります。
注:本明細書では、SDSコントロールとSDS実験マウスの両方を指す「制御」と「実験」を使用し、それぞれのSDSおよびCORTパラダイムにおける車両およびCORT投与マウスを指します。 - マウスを奪う食物には、各ケージのC57BL/6J側からラボチャウのみを取り除く。
- すべてのマウスの重量を量る, だけでなく、毎日与えられるラボチャウの量, 適切にテストを通じて自由な摂食体重の約90%で体重を維持するために.
注:各マウスまたはマウスのホームケージで提供される食物の量は、体重の変動とY迷路でのトレーニングまたはテストの各日に消費される報酬ペレットの量に依存します。 - 報酬ペレットに精通を確立します。20mgの穀物ベースの食品ペレット(Bio-Serv)の小さなスクープをホームケージにダンプします。これはペレットに精通して確立し、習慣的かつ最初のトレーニングセッションでY迷路でそれらを消費するマウスを動機づけます。
- 社会的相互作用テストを完了した翌日、すべてのコントロールマウスと実験マウスの重さを量る。これは彼らの自由な摂食体重になります。
- Y迷路バリアタスクのための食糧不足
- Y迷路装置
- 3本の腕が長さ26cm、高さ20cm、幅7cmの不透明な白3/16インチのプレキシグラスのY迷路構造を構築します。
- Y迷路のスロット間をスライドする仕切り線を使用して、研究者がマウスを最初に配置したスタートボックスを閉じたり、Y迷路の左または右の腕を選択して入力するとマウスをいずれかの腕に封じ込めたりすることができます。
- 垂直側のワイヤメッシュから、および後角の側に約45°の角度でプレキシグラスで、複数の10、15、および20 cmの高さのY迷路バリアを作成します。これにより、C57BL/6Jマウスは、各バリアの垂直ワイヤメッシュ側を掴んで登り、その後、バリアの角度付きプレキシグラス側を横断することができます。
- 角度が付いた側に細いステップを追加して、より大きなトラクションを可能にします。
- Y迷路の習慣化
- すべてのコントロールマウスと実験マウスをY迷路装置に習慣化します。
- 食物欠乏の翌日、50 mL遠心分離管のキャップに20mgの穀物ベースの食品ペレット(例えば、バイオサーヴ)を多数入れ、Y迷路の各アームの端に置く。これらのキャップは、マウスのための小さな食品レセプタクルとして機能し、マウスは容易に食品ペレットを食べることを学びます。
- Y迷路のスタートボックスにマウスを配置し、スタートボックスの仕切り位置を整えます。
- 数秒後、仕切りから取り外し、各マウスがY迷路を15分間探索できるようにします。この時間の量は、マウスが迷路のすべての腕を十分に探索し、装置に精通を確立することができます。
注:一部のマウスは、この最初の習慣化の日に食物ペレットを消費しない場合があります。
- 翌日、同じ手順を使用して2回目の15分Y迷路の習慣を完了します。
- ペレットを食べていないマウスに注意してください。これらのマウスの場合は、別の小さなペレットを自宅のケージに捨ててください。
- すべてのコントロールマウスと実験マウスをY迷路装置に習慣化します。
- Y迷路強制選択訓練
- 各マウスに高い報酬(HR)と低報酬(LR)アームを指定します。
- コントロールと実験の両方でマウスを、左腕を高報酬(HR)アーム、右腕を低報酬(LR)アームとしてランダムに割り当てます。したがって、4つのペレットは、左、HRアーム、および右、LRアーム、または反対で利用可能な2ペレットの各試験で利用可能になります。
- コントロールと実験グループの両方でこれらの指定されたLRとHRアームのバランスを取り、各グループの約半数がHRアームとして左腕を持ち、半分はHRアームとして右腕を持っていました。
- 強制選択試験
- Y迷路慣例の2日間に続いて、マウスは強制選択訓練の10回の試験の3日間を開始する。
- 強制選択試行のたびに、マウスをスタートボックスに入れて、仕切りを取り外し、マウス 60 s が左右のアームに入り、利用可能なペレットを消費できるようにします。各強制選択トライアルは、分割線で反対側の腕をブロックし、マウスが他の腕を選択することを余儀なくされます。HR 強制選択試行の場合は、LR アームへのアクセスをブロックするか、またはその逆を行います。
- 試用後にマウスを取り出し、食べたペレットを補給します。
- 各トレーニング日に各マウスの代替強制選択試験, マウスが完了するように 5 HR と 5 LR 強制選択試験.
注:強制選択試験は、一方の腕を高い報酬に関連付け、もう一方の腕を低い報酬に関連付けるためにマウスを訓練します。 - マウスをホームケージに戻し、その後3〜5匹以下のマウスを実行して、各マウスの5分間の公判間間隔を維持します。
- 各マウスに高い報酬(HR)と低報酬(LR)アームを指定します。
- Y迷路フリー選択トレーニング
- 無料選択トライアル
- HRとLRアームの強制選択トライアルで、各自由選択セッションを開始します。したがって、マウスは10回の自由選択試験を開始する前に各腕に強制されることを経験しているであろう。
- 開始ボックスにマウスを置き、仕切りを外します。マウスが腕を選択し、ペレットを含むカップが配置されている端まで通過したら、その側にアームディバイダーを配置し、ペレットを消費するまでマウスにロックします。
- マウスをホームケージに戻し、そのサイクルで使用される後続の3〜5匹のマウスを実行して、5分の試験間間隔を可能にします。
- 次のデータを記録する:腕を選択する待ち時間、腕の選択、およびペレットカップに到達するための待ち時間。
- マウスが入り、ペレットカップに完全にトラバースする腕を記録します。また、その腕を選択し、ペレットカップに到達するためのレイテンシを記録します。
- マウスが腕を選択できなかったり、省略された試行として 4 または 2 のペレットをすべて消費しない試みについて考えてみましょう。
- 70% 自由選択基準
- 10回のフリーチョイストライアルで毎日どのアームが選択されているかを記録します。
- マウスが自由選択トレーニング日(70%基準)で10回のトライアルのうち7回にHRアームを選択したら、マウスをバリアテストセッションに移動します。
注:すべてのマウスが70%HRアーム基準に達するまで自由選択トレーニングを続け、HRアームとLRアームの両方の適切な差別を確実にし、マウスがHRアームに対して同等の好みを示すようにします。
- 無料選択トライアル
- Y迷路バリア試験
- 10 cmバリアテストセッション
- 10cmのバリアをY迷路のHRアームの途中に置きます。
- 両腕に対する複数の強制選択試験から始めます。障壁を登るのに抵抗力があるマウスは長い、薄いプレキシグラスの部分によって促すことができる。
注:経験から、我々は新しい障壁の高さで各セッションの開始時に、両方のHRとLRアームのための少なくとも2つの強制選択試験をお勧めします。必要になった場合は、マウスにバリアを乗り越えるプロンプトが必要な場合は、試行を記録することをお勧めします。マウスは一般的に、1-2の試験の中で、それほど高くはない10cmの障壁を乗り越えることを学びます。バリアは、反対側のアームを指定されたHRアームにしたマウスの反対側に配置する必要があります。 - スタートボックスに各マウスを置き、仕切りから取り外し、マウスが迷路を横断し、HRアームに10cmバリアを含む10自由選択試験のためにアームを選択できるようにします。
- マウスがHR側を選択した場合、より大きな報酬、4ペレットを得るために障壁を乗り越えます。それ以外の場合は、LRアームを選択し、単に少ない報酬、2ペレットのために迷路の床を横断します。
- 選択したアームと、腕を選択してすべてのトライアル用ペレットカップに到達するための待ち時間を記録します。同様に、サイクル当たり合計マウスを4〜6個回転させ、5分の試験間間隔を維持した。
注:Y迷路に70%エタノールをスプレーし、一貫して、各マウスの間に乾燥を拭きます。
- 15 cmバリアテストセッション
- 次の日に上記のように記載されているすべてのステップを完了します (ステップ 1.10.1), HR アームの 15 cm の高い障壁を持ちます.
- 20 cm バリアテストセッション
- 次の日に上記のように記載されているすべてのステップを完了します (ステップ 1.10.1), しかし、20 cm の高さの障壁をHRアームで.
注:経験から、20cmのバリア高さによって、SDSの感受性またはCORT実験マウス(およびいくつかのコントロールマウス)の大部分は、彼らが高い20cmの障壁を乗り越えるのに十分な動機を持っていないため、LRアームに応答をシフトします。また、マウスがこの障壁の上からY迷路の壁の端に登るのを防ぐためにプレキシグラスアダプターを使用する必要があります。実験者が各カップのペレットを補充し、各試験後にマウスを取り除くのが難しくなるので、より高いY迷路を構築することはお勧めしません。
- 次の日に上記のように記載されているすべてのステップを完了します (ステップ 1.10.1), しかし、20 cm の高さの障壁をHRアームで.
- 報酬差別テストセッション
- コントロールマウスと実験マウスの両方が報酬差別の適切かつ類似したレバーを表示することを保証するために、差別テストセッションを実施する。
- 上記の手順(ステップ1.10.1)に従いますが、LRアームに10cmのバリアを配置します。今、両腕は10cmの障壁を含み、マウスは4または2ペレット報酬を得るためにどちらかを乗り越える必要があります。
- 10 回のトライアルすべてで、レイテンシと腕の選択を記録します。
注:マウスはどちらかの報酬を得るために同じ労力を費やす必要がありますので、マウスはほとんどの試験でHRアームを選択する必要があります。HR アームと LR アームを選択するための待ち時間を調べるには、各マウスの平均 HR アーム遅延時間と平均 LR アーム遅延を計算します。次に、遅延を比較して、SDS(制御、SDS感受性、SDS-弾力性)を被験者間因子として、アーム(HRアーム、LRアーム)を被験者内因子として、双方向混合ANOVAを使用して両腕を選択します。
- 10 cmバリアテストセッション
2. 慢性的な非差別的社会的敗北ストレス(CNSDS)
- CD-1マウスにおける攻撃的行動の画面
- 180 s の各 CD-1 のホーム ケージに 1 つの雄と 1 つの女性 C57BL/6J マウスを配置するか、CD-1 が両方のマウスを攻撃するまで.これらのC57BL6/Jマウスはナイーブである必要はないし、それ以上の実験では使用されない。このアグレッサースクリーニング段階では、C57BL/6JマウスをCD-1マウスでコハウスしないでください。
- 各 CD-1 の両方の C57BL/6J マウスを攻撃する記録の待ち時間。
- 合計3回のスクリーニングセッションのうち、連続セッションで60秒以内にオスとメスの両方のC57BL/6Jマウスを攻撃するすべてのCD-1アグレッサーを選択します。他の人は、ホームケージの共同住宅に使用することができます。
注:社会的敗北の重要な注意点は、物理的な侵略の結果としての傷害の存在です。スクリーニングおよび実験段階の各マウスは、創傷を検査し、小さな皮膚病変が存在する場合はクロロヘキサン消毒剤で治療するべきである。1cmを超える傷を有するマウスは、実験から取り除く必要があります。
- 180 s の各 CD-1 のホーム ケージに 1 つの雄と 1 つの女性 C57BL/6J マウスを配置するか、CD-1 が両方のマウスを攻撃するまで.これらのC57BL6/Jマウスはナイーブである必要はないし、それ以上の実験では使用されない。このアグレッサースクリーニング段階では、C57BL/6JマウスをCD-1マウスでコハウスしないでください。
- マウスをコントロールグループと実験グループに割り当てます。
- すべての素朴な成人男性と女性のC57BL / 6Jマウスだけでなく、共同住宅で使用されるCD-1男性だけでなく、スクリーニングされた引退した男性CD-1ブリーダーを収集します。
- 無作為に制御または実験条件に成人の雄および雌C57BL/6Jマウスを割り当てる。各男性と女性は、CNSDS実験グループのすべての社会的敗北セッションのためにペアになります。CNSDSコントロールグループの男性と女性は毎日回転します。
- 社会的敗北セッションで使用されるCD-1雄を割り当てるか、各セッションの後に実験的な男性と女性と共存させ、C57BL/ 6Jの雄マウスと雌マウスのペアごとに毎日交互に行われます。
- すべての素朴な成人男性と女性のC57BL / 6Jマウスだけでなく、共同住宅で使用されるCD-1男性だけでなく、スクリーニングされた引退した男性CD-1ブリーダーを収集します。
- 慢性的な非差別的社会的敗北ストレス(CNSDS)
- すべてのCD-1雄、CNSDSコントロールの雄と女性のC57BL / 6Jマウス、およびCNSDS実験的な雄と女性のC57BL / 6Jマウスを含む、すべてのマウスを専用の社会的敗北室に持ち込みます。
- 前面にCD-1ケージ、後ろのC57BL /6Jケージを持つC57BL / 6J男性と女性とCD-1男性の4-6ケージを整列します。
- どのマウスが攻撃されているかをケージIDタグで示し、どのCD-1と共存してすべてのマウスを組織化するかを示します。
注:初日に実験を初期化した後、マウスは、各C57BL / 6Jの男性と女性のペアが各セッションの左に1ケージ回転するように、残りの9敗のセッションのために回転させることができます。これにより、すべてのセッションで新しいCD-1との新しい相互作用が可能になります。
- CNSDS実験群の手順
- 大人の男性1人と成人女性C57BL/6Jマウスを各CD-1侵略者男性のホームケージに入れ、5分間の社会的敗北セッションを行います。
- 雄と雌の両方の実験C57BL/6Jマウスの攻撃遅延と攻撃頻度を記録します。
- 5分後、雄のC57BL / 6Jマウスを取り外し、透明な穿刺プレキシグラスバリアで分離された共収容CD-1オスのケージに入れます。CD-1とメスのC57BL/6Jマウスを別々に攻撃し、同様の透明な、穿取プレキシグラスバリアを有する。男性または女性のC57BL / 6Jマウスが毎日侵略者CD-1で収容されているかどうか代替。
注:各毎日5分の相互作用に続いて、各マウスは1cm未満の場合に治療された傷害および創傷について評価されます。1cmより大きい傷は、マウスの除去および即時安楽死をもたらす。したがって、雄と雌の両方の実験マウスは、CD-1アグレッサーと5日間共同収容され、新しいCD-1は、残りの5日間の攻撃セッションで使用されていない。明確な、穿分されたプレキシグラス障壁は物理的な相互作用を防ぐが、セッション間の24時間のCD-1の侵略者との感覚的接触を可能にする。膣洗浄は、前述の28のように、敗北後約30分毎日すべての雌マウスに対して行うことができる。
- CNSDS 制御グループの手順
- 1つのコントロールオスC57BL / 6Jマウスのホームケージに1つのコントロールメスを置きます。
- 5分後、マウスを分離し、マウス間に透明で穿穿プレキシグラスの分周器を配置する。
- マウスをコロニールームに戻し、CNSDS実験ケージとして別の棚に置きます。コロニールームでは、ストレスを受けたマウスがコロニールームの他のマウスとは別に収容されている棚を指定しています。さらに、恐ろしい社会的敗北パラダイム30に見られるように、侵略が起こっているのを目撃した場合、ストレスを受けないマウスに効果が見られる可能性があります。
- 各コントロールの操作中に攻撃やマウントの動作をメモします。
- コントロール雄マウスと雌マウスは、伝統的な社会的敗北ストレスコントロールグループで行われているように、その後の日に新しい特異性に導入されます。CNSDS制御および実験セッションの連続10日間を完了します。
- 10回目 の最終制御または実験的なCNSDSセッションを完了した後、すべてのマウスを共同収容し、すべての行動テストを通じてこの共同住宅を維持します。各ケージは、感覚暴露を可能にするためにプレキシガラスの両側に分離された2匹のマウスで構成されます。対照マウスは他の異性対照マウスと共に収容され、実験マウスは異性実験的マウスと共存している。
- 各コントロールC57BL/6Jメスは、10回目 のセッションで相互作用したControl C57BL/6J雄と共に収容され、2匹のマウスを分離するためにケージに入れられた透明なプレキシガラスの仕切りが付けられています。
- 最終的な敗北セッションの約24時間後に、CNSDSが対照と比較して新しいCD-1マウスで社会的行動を低下させるかどうかを判断し、マウスをストレス24,29,29に「弾力性」または「感受性」に階層化させる標準的な社会的相互作用テストを実行する。
- Y迷路バリアタスクを含む他の行動におけるCNSDSコントロールおよび実験的な雄および雌マウスをテストし、CNSDSグループをCNSDS耐性およびCNSDS感受性グループに階層化する。
- すべてのCD-1雄、CNSDSコントロールの雄と女性のC57BL / 6Jマウス、およびCNSDS実験的な雄と女性のC57BL / 6Jマウスを含む、すべてのマウスを専用の社会的敗北室に持ち込みます。
- ソーシャルインタラクションテスト
- ソーシャルインタラクションテストの初期セットアップ
- 最後のCNSDS敗北セッションの24時間後に、社会的相互作用テストを実施します。
- すべてのペア収容コントロールマウスと実験マウス、ならびにCNSDSパラダイムで使用されていない新しいCD-1オスを別の行動室に持って行き、ソーシャルインタラクションテストを実行します。
- 専用のコンピュータで動作追跡ソフトウェア(EthoVisionなど)に接続された記録カメラの下に、標準のオープンフィールドチャンバー(75 cm x 75 cm)を設置します。
- 2回連続2.5分試験の第2に、オープンフィールドの1つの壁に沿って新しいCD-1を収容する相互作用コンテナ(約10cm x 10cm x 10 cmの小さな穿孔プレキシグラスコンテナ)を取り囲む24cm x 24cmの社会的相互作用ゾーンで新しい実験を設定します。これにより、相互作用ゾーン幅7cmは、新規CD-1マウスを収容する容器を囲む。
- ソーシャルインタラクションテストでマウスを実行する
- CD-1が存在しない2.5分間のトライアルのために、開いたフィールドの隅に各マウスを置き、記録ソフトウェアプログラムを開始します。
注: この最初の試行では、操作コンテナは開いたフィールドの 1 つの壁の中央に配置し、CD-1 マウスを含めないようにしてください。 - 2.5分後、マウスをホームケージに戻します。70%エタノールで開場を清掃してください。
- 新しいCD-1オスを、オープンフィールドの1つの壁の真ん中に沿って2番目の穿パープレキシグラスキューブに置きます。
- もう一度、2回目の2.5分のトライアルのためにオープンフィールドの隅にマウスを置き、今CD-1が存在し、記録ソフトウェアプログラムを開始します。
- マウスを取り外し、ホームケージに戻します。CD-1を取り出し、ホームケージに戻します。70%エタノールで開場を清掃してください。
- CD-1が存在しない2.5分間のトライアルのために、開いたフィールドの隅に各マウスを置き、記録ソフトウェアプログラムを開始します。
- 残りのCNSDSコントロールと実験マウスを実行し、相互作用率を計算します。
- CNSDSコントロールおよび実験マウスの試験1および試験2の両方で相互作用ゾーンに費やされた時間を定量化するために、他のすべてのマウスとこの手順を繰り返します。
- 相互作用率を計算するには、次の式を使用して、トライアル 2 (CD-1 現在) とトライアル 1 (CD-1 不在) でソーシャルインタラクションゾーンで費やした時間を比較します。
交互作用率 = (試行中のインタラクションゾーンの時間 2)/(試行1のインタラクションゾーンの時間)
- マウスを「CNSDS耐性」または「CNSDS感受性」として層化する。回復力のあるマウスの相互作用比は > 1.0 ですが、影響を受けやすいマウスの相互作用比は <=1.0 です。
- Y迷路バリアタスクやその他の行動テストなどのその後の行動尺度では、CNSDS実験マウスをこれらのCNSDS耐性およびCNSDS感受性表現型に細分化する。
- したがって、女性の場合、CNSDS制御、CNSDS実験的耐性、およびCNSDS実験感受性グループの間で一方向のANOVAsを行い、適宜グループ間の違いを決定するポストホック比較を行うことができる。
- 性差の比較については、CNSDS(対照、弾力性、感受性)と性別(男性、女性)を被験者間の要因として双方向のANOVAを行う。必要に応じて、ポストホック比較を使用します。
- ソーシャルインタラクションテストの初期セットアップ
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Representative Results
慢性CORTは4週間投与され、その後Y迷路バリアトレーニングおよびテストが行われた(図1A)。別のコホートでは、10日間のSDSパラダイムに続いて、Y迷路バリアタスク(図1C)でのトレーニングとテストを行い、これらの慢性ストレスパラダイムが雄マウスの努力関連選択行動に及ぼす影響を決定した。慢性CORTとSDSは共に、t-tests(表1)で決定したビークルマウスおよびSDSコントロールマウスと比較して平均体重を減少させた。これらのマウスはまた、テストを通してより少ない平均ホームケージラボチャウを消費した(表1)。
CORTコホートでは、被験者間因子と被験者内因子としてのCORT因子と週の混合ANOVAは、4週間の治療と3週間の行動検査(合計7週間)にわたって同様の量の液体を消費したことを示している(図1B)。SDSコホートでは、制御および実験用男性がSDSプロトコルの10日間を完了し、新規のCD−1雄との相互作用に費やした時間をCD-1現在24のない相互作用ゾーンでの時間と比較したソーシャルインタラクションテストを用いてSDSプロトコルに対する感受性を評価した。一方向のANOVAは、SDSがいずれかの弾力性のあるマウス(40%)と比較して、影響を受けやすいマウス(60%)で不適応表現型を産生することを示したまたはコントロールマウスがSDSに露出していない(図1D)。具体的には、SDS-感受性マウスは、SDS-弾力性マウスおよび対照マウスと比較して、新規CD-1マウスを含む相互作用領域に費やされた時間の減少を示す。
その後、Y迷路バリアタスクでCORT(実験マウスと制御マウス)とSDS(影響を受けやすく制御)コホートの両方を訓練しました(図2A)。我々は、コントロールマウスと実験マウスが4ペレット報酬の障壁を登る努力を費やす試験の数を測定し、2つのペレットしか含まれていないが登る障壁を特色にしなかったY迷路の他の腕を選択した。SDSの場合、SDS(制御、SDS感受性、SDS弾性)を被験者間因子とする双方向混合ANOVA、および被験者内因子としての腕(HRアーム、LRアーム)を使用して、Y迷路での努力的な反応を調べた。慢性CORTの場合、二方向混合ANOVA、CORT投与(車両、CORT)を被験者間因子、および対象内因子として腕(HR、腕、LRアーム)を有する。慢性CORTとSDSの両方がバリア高さが15cmおよび20cmに増加した場合の努力的な応答のシフトを生じた(図2B および 図2C)。どちらも、HRアームに10cmの障壁しかなかったときの応答をシフトしなかった。さらに、試験後の報酬差別セッションでは、HRアームとLRアームの両方に10cmのバリアが配置されたときに、すべてのマウスがHRアームに対して同様に反応した。最後に、被験者間因子としてCORTまたはSDSを有する双方向ANOVAおよび被験者内因子としてのHRまたはLRアームは、15cmバリアを有するHRおよびLRアーム遅延がCORT投与の影響を受けないことを明らかにし、LRとHRアームの両方を有する両方のグループに類似していた(図3)。従って、慢性CORTおよびSDSは雄マウスにおけるY迷路バリアタスクにおける努力的な応答を強くシフトする。
重要なのは、慢性CORTまたはSDSがY迷路バリアタスクの学習を損なう場合(図4)、これらのマウスは自由選択トレーニングセッションで基準に達できず、その後のバリア結果の解釈に影響を与える可能性がある。したがって、この差を示す潜在的に否定的な代表結果を示し、個別の独立したサンプルt-検定を使用して評価した(図4)。
CNSDS手順は、雄と雌の両方のC57BL/6J感受性マウスに強い不適応表現型を産生する(図5A)。社会的相互作用タスクは、マウスを弾力性に階層化するために使用されます (38.3%)および影響を受けやすい (61.7%)CNSDSコントロール、CNSDS実験耐性、CNSDS実験感受性群の間の片道ANOVAを使用して、性別によってさらに細分化することができる(男性:43.3%弾力性、56.7%の感受性;女性:36.7%の弾力性、63.3%の感受性の高い)この変更されたパラダイムは、回避行動28におけるSDSと同様の不適応効果を生み出すが、Y迷路バリアタスクのような翻訳的に関連する報酬および動機付け関連の行動テストと組み合わせてまだ実施されていない。将来の研究では、CNSDSなどのストレッサーが男性と女性の両方でY迷路バリアタスクなどの翻訳的に関連する行動に及ぼす影響を評価することが不可欠です。
慢性皮質 | グループ | 体重 (g) | デイリーフードギブン (g) | ||
意味 | Sem | 意味 | Sem | ||
車両 | 26.3 | 0.75 | 2.8 | 0.086 | |
コート | 22.4 | 0.58 | 2.4 | 0.065 | |
社会的敗北ストレス | |||||
コントロール | 27.5 | 0.67 | 2.9 | 0.088 | |
Sds | 23.8 | 0.66 | 2.5 | 0.074 |
表1:毎日提供される体重と食物量。 車両およびCORT投与マウス、ならびに対照およびSDSマウスを毎週計量し、与えられた食物の量を記録した。Y迷路試験全体の平均体重(g)、および与えられた平均毎日の食べ物(g)が示されている。
図1:SDSは、社会的相互作用が少ないことを特徴とするうつ病表現型を誘導する。
(A) CORT および Y 迷路バリア プロトコルのタイムラインを示す回路図。(B)車両およびCORT投与マウスで消費された容積(mL/g/日)を示す代表的なデータ。(C) SDS および Y 迷路バリア プロトコルのタイムラインを示す回路図。(D) 代表的なソーシャルインタラクションテストにおいて、SDSの影響を受けやすいマウスは、SDS弾力性マウスまたはコントロールマウスと比較して、新しいマウスとの相互作用に費やす時間を短縮した。バーは平均値 ± SEM. *p < 0.05 です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CortとSDSは、Y迷路バリアタスクでの手間の高い応答をシフトする。
(A) Cort と SDS の Y 迷路バリア タスクのタイムライン(B)慢性CORTは15cmおよび20cmの障壁の高さでHR腕の選択を減らす。この図は、ディーテリッチら 202021から変更されています。(C)代表的な結果は、SDS感受性マウスが制御マウスまたはSDS-弾力性マウスと比較して、15cmおよび20cmのバリア高さでHRアームの選択を減少させることを実証した。バーは平均値 ± SEM. *p < 0.05 です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: Y迷路の遅延は、慢性 CORT の影響を受けないようにします。
慢性 CORT は、Y 迷路で LR または HR アームを選択する待ち時間に影響を与えません。また、車両と CORT の両方のマウスは、同様の待ち時間を持つ LR または HR アームを選択します。この図は、ディーテリッチら 202021から転載されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:慢性CORTおよびSDSは自由選択HRアームの選択を損なう。
慢性CORTまたはSDSのいずれかを暴露したマウスが、自由選択訓練における対照マウスと比較して高報酬アームの選択数を減らし、結果の解釈を複雑にしたり、バリア検査への移行を遅らせたり妨げたりすることを示す代表的な結果。バーは平均値 ± SEM. *p < 0.05 です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: CNSDS曝露された雄マウスと雌マウスを、感受性および弾力性のある集団に成層した。
(A) CNSDS実験と制御パラダイムの概略この図は、2019年28日のYohnらから転載されています。(B) CNSDSは、CNSDS耐性(RES)およびCNSDS感受性(SUS)マウスの堅牢な階層化を生じる。この図は、2019年28日のYohnらから転載されています。バーは平均値 ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
慢性CORTパラダイムは飲料水中に一定のCORT用量を提供するが、経験からマウスが消費する量に多少のばらつきがある。また、総ケージに対してのみ消費を評価することができ、また、ケージ内のマウスの数に基づいて平均を取る。さらに、ボトルの重量を量ったり、行動検査のためにマウスを移管したり、新鮮なケージに変更したりする場合に、こぼれが起こる可能性があります。しかし、車両とCORTの消費を追跡することは、治療と行動テストの数週間にわたって実現可能かつ正確です。週に1回、車両またはCORTのいずれかを含む新鮮なボトルに変更するとともに、ボトルの重量を量り、交換するための設定された時間を維持することを強くお勧めします。例えば、ボトルの計量と補充時に新鮮なボトルに変更し、月曜日に行い、木曜日または金曜日に再び行われるすべてのボトルの計量と補充を行うことができます。同様に、毎週指定された日にすべてのマウスを同時に計量することをお勧めします。最後に、このCORTパラダイムはHPA軸によるコルチコステロンの内因性産生を鈍らせるということを指摘することが重要である。したがって、マウスは、犠牲になるまで行動検査を通じてCORTに留まらなければなりません。マウスがCORTから取り除かれた場合、急性副腎不全のアジソニアン危機に苦しむ可能性があります。代替手順は、2-3週間のCORT曝露を使用し、続いてCORTを段階的に離離し、内因性CORTレベルが正常17、19,19に戻るにつれて約3〜4週間の行動検査ウィンドウを使用した。
Y迷路バリアタスクでは、SDSプロトコルの直後に迷路の慣れとトレーニングを開始することが重要です(図2A)。この実験的なタイムラインの潜在的な注意点は、マウスが事前ではなく操作に従って訓練され、トレーニングのパフォーマンスに基づいて均等に分割できることです。しかし、私たちの経験訓練では、CORT投与前と後の経験トレーニングは、器械の行動16に大きな影響を与えません。すべてのマウスは、バリアテストに進む前に、十分に訓練され、基準(自由選択セッションでの70%のHRアーム選択)に到達します。マウスはまず迷路に適切に慣れている必要があるため、その後のトレーニング段階でこれが役立つことがわかったので、慣れ親しんだ装置になります。各マウスをトレーニングする場合、個々のマウスに対して設計された高い報酬アームと低い報酬アームを維持することが重要であるため、マウスは4ペレットを期待して2を見つけるアームを横断しません。すべてのControlマウスとSDSマウスに対して、バランスの取れた高低報酬アームを示す大きな生データファイルの紙とデジタルの両方のコピーを保持することをお勧めします。
迷路形状の正確な仕様(Y迷路対T迷路)による迷路性能の違いはないと考えており、研究者は努力関連の選択行動実験でどちらかを使用できると考えています。また、これまで、車両投与マウス21の10cmと比較して15cmのHRアーム選択のわずかな増加を報告しました。しかし、研究者は、20cmのバリアマウスがHRアーム21をほとんど選択しなかからず、バリア高さが15cmを超えて増加するので、同様または低下したHRアームの選択を期待すべきである。
また、70%のエタノールスプレーを使用して迷路を洗浄し、セッションごとに残りの臭いを除去することが重要です。また、すべてのマウスに比較的一定の試行間間隔が存在するように、マウスを一貫した方法で実行することをお勧めします。一度に約4〜6匹のマウスをサイクリングすることをお勧めします。最後の自由選択セッションとすべてのバリア テスト セッションでは、すべてのトライアルでいずれかの腕を選択する待機時間を記録することが重要です。また、マウスは時折プレキシグラス壁の上部にジャンプしたり、バリアの上部からより頻繁にジャンプしたりします。これが発生した場合は、迷路の側面に沿って背の高いプレキシグラスの壁アダプターをお勧めします。これらは、単にプレキシグラスの長方形の部分(幅20センチ、80cmの長さ)することができます。私たちは、マウスが60秒以内に腕を選択しなかったり、腕を選択したが、省略された試験として食品ペレットを食べない場合に、任意の試験をマークします。最後に、慢性CORTとSDSの両方が、試験21の数週間にわたって消費される食物の量に影響を与える体重を減少させることができます。研究者は定期的にマウスの重量を量り、自宅のケージに与えられる食物の量を調整して、マウスを自由に摂食する体重の約90%に維持する必要があります。
また、最近開発されたパラダイム、慢性的な非差別的社会的敗北ストレス(CNSDS)(図5A)を論じ、男性マウスと女性マウスのストレスの影響を受けやすく、弾力性のある集団を誘導する(図5B)。CNSDSパラダイムは、ストレスや気分障害に興味を持つ前臨床研究者によって使用することができます.CNSDSパラダイムでは、実験女性がセッションごとに少なくとも1回攻撃されるのが重要です。ほぼすべての社会的敗北セッションでは、実験的な男性が複数回攻撃されます。各CD-1アグレッサーは、CNSDSプロトコルを開始する前に、雄と女性の両方のC57BL/ 6Jマウスで厳格にスクリーニングされ、各セッションですべての攻撃を記録する必要があります。我々は、1人の男性と1人の女性が相互作用するCNSDS方法論で二重性調節状態を記述するが、これらの対照相互作用のために追加の男性を含む人がいるのが適切であり、したがってCNSDS手順で使用される2人の男性と1人の女性を模倣する。この代替制御手順は、回避行動28におけるマウスの挙動には影響しない。さらに、社会的相互作用テストは、方法の有効性を確保し、かつCNSDS 24の影響を受けやすいいずれかの雄と雌マウスを階層化するために、10日間の敗北プロトコルの24時間後に実施されるべきである。
社会的相互作用テストに基づいてマウスを弾力性および影響を受けやすい集団に細分化するという歴史的アプローチを使用する際の1つの問題は、ビデオトラッキングソフトウェアを使用してすべての嫌悪行動を正確に測定できるわけではないということです。相互作用スコア >1 を持つ「弾力性」マウスは、CD1 マウス31を収容するコンテナの周囲で従順な動作を示している可能性があります。このようなマイクロビヘイビアをよりよく追跡するソフトウェアを開発することは、現場にとって重要です。げっ歯類の複雑な社会的行動のための行動分類器を可能にするためにゴールデンラボによって開発された単純な行動分析(SimBA32)のようなツールは、この点で有用であることが証明されるかもしれない。
CNSDS プロトコルの間に、いくつかのマウントが発生する場合があります。このパラダイムでは妊娠は観察されていませんが、研究者はこの可能性を認識する必要があります。
CNSDSを含む社会的敗北プロトコルのもう一つの制限は、社会的敗北セッションを完了した後の行動へのストレスの影響を調査するための限られた時間枠です。このように、我々は30日間の時間枠にすべての習慣、トレーニング、およびテストセッションに合わせて既存の迷路バリアプロトコルを適応させました。しかし、これは、フリーチョイスセッションを完了するために必要な高報酬アーム選択の70%基準に達するのに苦労するかもしれない一部のマウスの全体的なトレーニングを急ぐかもしれません(図4)。また、適切な計画を立てずに他の動作テストを完了できる日数は限られています。しかし、最近の研究は、社会的敗北ストレスが脳や行動により永続的な影響を与える可能性があることを示しています。Miczekの研究室からの研究は、社会的敗北ストレスの10日間が少なくとも4週間31、33を持続するマウスの自発的なアルコール消費量を増加させることができることを示しています。社会的敗北プロトコルは、5〜10分の任意の場所で続く敗北セッションを使用します。実験C57BL/6Jマウス28における傷害の可能性を減少させるためにCNSDSのための5分の露出を使用する。CNSDSプロトコルは、ニューマンと同僚が開発した社会的敗北プロトコルに匹敵する結果を産生し、C57BL/6J雌マウスが居住するスイスのウェーバーマウス28にさらされる。CNSDSと同様に、社会的敗北プロトコルのこの変動は、慢性ストレス表現型を誘発するために5分相互作用の10日間を使用する。
これらの方法は、慢性的なストレスがマウスの報酬処理と動機付けにどのような影響を与えるかを調べるために使用することができます。報酬処理と女性被験者の両方が、歴史的に前臨床気分障害分野で研究されている。今後の研究では、慢性的なストレスが男性と女性の報酬動機に及ぼす影響を判断し、弾力性と影響を受けやすいマウスを階層化する必要があります(図5B)。この階層化が、オープンフィールド、上昇プラス迷路、ノベルティ抑制供給などの回避行動に見られるように、Y迷路バリア性能に異なる影響を与えるかどうかを知るのは貴重です。今後の研究では、これらの方法論を光遺伝学やDREADDS技術などの他の技術と組み合わせて、ストレス応答や報酬動機を媒介する神経回路を調べることができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、Y迷路、障壁、社会的敗北ケージを構築してくれたトーマス・グレースに感謝したいと考えています。著者らは、ジェイ・リー、カリーナ・ステック、プラチ・スリヴァスタヴァのデータ収集に対する支援に感謝したいと考えています。この作品は、NIMHグラントR01 MH112861(BAS)によって資金提供されました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acrylic Sheet | McMaster Carr | 8560K215 | Clear, 3/16" thick, 24" X 36" |
Beta-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4767 | 500 mg |
C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 000664 | Adults age 7-8 weeks |
Corticosterone | Sigma-Aldrich | C2505 or C27840 | 100 or 500 mg |
Male CD-1 Mice | Charles River | 022 | "Retired Breeders" |
PVC Acrylic Sheet | McMaster Carr | 8560K215 | White, 3/16" thick, 48" X 48" |
Solidstate Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FS-28 | Must reach 40 kHz |
Steel Wire Cloth | McMaster Carr | 9219T143 | 1 ft X 2 ft |
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