Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Визуализация субклеточных структур в живых клетках сверхвысокого разрешения

Published: January 13, 2021 doi: 10.3791/61563
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, The Johns Hopkins University

Summary

Здесь представлен протокол для визуализации живых клеток сверхвысокого разрешения в интактной ткани. Мы стандартизировали условия для визуализации высокочувствительной популяции взрослых стволовых клеток в ее родной тканевой среде. Этот метод включает в себя балансировку временного и пространственного разрешения, чтобы обеспечить непосредственное наблюдение за биологическими явлениями в живой ткани.

Abstract

Уже давно существует важный компромисс между пространственным и временным разрешением в изображениях. Визуализация за пределами дифракционного предела света традиционно ограничивалась использованием только на фиксированных образцах или живых клетках вне ткани, помеченной сильным флуоресцентным сигналом. Современные методы визуализации живых клеток со сверхвысоким разрешением требуют использования специальных флуоресцентных зондов, высокой освещенности, многократного получения изображений с обработкой после получения или часто комбинации этих процессов. Эти предпосылки значительно ограничивают биологические образцы и контексты, к которым может быть применен этот метод.

Здесь мы описываем метод выполнения флуоресцентной визуализации живых клеток со сверхвысоким разрешением (~ 140 нм XY) in situ. Этот метод также совместим с низкой интенсивностью флуоресцентной связи, например, EGFP или mCherry эндогенно помечены в низко экспрессированных генах. В качестве доказательства принципа мы использовали этот метод для визуализации нескольких субклеточных структур в яичках Drosophila. Во время подготовки ткани в рассеченном яичках сохраняется как клеточная структура, так и морфология ткани. Здесь мы используем этот метод для изображения динамики микротрубочек, взаимодействий между микротрубочками и ядерной мембраной, а также прикрепления микротрубочек к центромерам.

Этот метод требует специальных процедур по подготовке образцов, монтажу образцов и иммобилизации образцов. Кроме того, образцы должны поддерживаться в течение нескольких часов после рассечения без ущерба для клеточной функции и активности. Хотя мы оптимизировали условия для визуализации живого сверхвысокого разрешения, особенно в стволовых клетках зародышевой линии (GSC) и половых клетках-прародителях в рассеченной ткани яичка, этот метод широко применим к различным типам клеток. Способность наблюдать за клетками в их физиологических условиях без ущерба для пространственного или временного разрешения будет служить бесценным инструментом для исследователей, стремящихся решить важнейшие вопросы клеточной биологии.

Introduction

Визуализация субклеточных структур и динамики белка в живых клетках с разрешением, выходящим за предел дифракционного предела света, обычно очень сложна1-3. В то время как были разработаны многочисленные методы сверхвысокого разрешения, такие как стохастическая-оптическая-реконструкционная-микроскопия (STORM), фотоактивированная локализация-микроскопия (PALM) и стимуляция-эмиссия-истощение (STED)4,5,6, осложнения в подготовке образцов, а также необходимость поддержания жизнеспособности и активности ex vivo ограничивают использование обычной микроскопии сверхвысокого разрешения для визуализации живых образцов. Обычная конфокальная микроскопия не может достичь пространственного разрешения выше ~ 230 нм XY-разрешения и часто недостаточна для наблюдения сложных клеточных подструктур5,6. Однако недавняя разработка в конфокальной микроскопии, Airyscan super-resolution imaging, способна достигать примерно 140 нм (XY-разрешение)7,8 и имеет относительно простую пробоподготовку, совместимую с живой визуализацией. Поскольку эта система обнаружения изображений требует длительного времени сбора, ее высокое пространственное разрешение происходит за счет временного разрешения9. Поэтому необходим метод, гарантируя, что визуализация живых клеток расширена с высоким пространственным разрешением.

Здесь мы разработали метод наблюдения живых клеток в интактной ткани с оптимальным разрешением для расшифровки субклеточных структур с подробной пространственной информацией. Этот метод разработан таким образом, что образцы могут быть установлены стабильно в течение длительного периода времени (~ 10 ч) без перемещения или вырождения. Живые клеточные среды, используемые в этой технике, могут поддерживать клеточную функцию и избегать фотоотбеливания в течение 10 часов под микроскопом сверхвысокого разрешения. Наконец, этот протокол минимизирует большинство стрессов, вызванных постоянным освещением лазеров в течение длительных периодов времени, таких как гипоксия, изменения влажности и температуры, а также истощение питательных веществ.

Используя этот протокол для изображения стволовых клеток зародышевой линии (GSC) дрозофилы, мы смогли наблюдать, как асимметричная активность микротрубочек позволяет предпочтительно взаимодействовать с эпигенетически отличными сестринскими хроматидами10,11,12,13. Эти типы клеточных событий очень динамичны и их очень трудно визуализировать в живых клетках с использованием других методов визуализации со сверхвысоким разрешением, таких как STORM, PALM или STED. Мы ожидаем, что этот метод станет очень полезным для клеточных биологов, поскольку они стремятся понять динамические субклеточные структуры живых клеток, проживающих в тканях. Существует множество областей, в которых этот метод может быть применен, например, изучение динамики белков; понимание движения клеток; и процессы отслеживания родословной и клеточной дифференцировки, среди других возможных применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление коктейля для визуализации живых клеток (живые клеточные среды)

  1. Дополните среду Drosophila Schneider 15% фетальной бычим сывороткой (FBS) и 0,6x пенициллином / стрептомицином. Отрегулируйте pH примерно до 7,0.
  2. Непосредственно перед использованием среды добавьте инсулин до конечной концентрации 200 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда имеет решающее значение для поддержания нормального деления клеток и развития яичка Drosophila во время покадровой визуализации10,14.

2. Приготовление стеклянной чашки для культуры клеток

  1. Используйте поли L-лизиновое покрытие стеклянной чашки для культуры клеток диаметром 35 мм для яичка Drosophila. Внутренний колодец блюда имеет стеклянное дно диаметром 23 мм и сторону с возвышением 1 мм(рисунок 1А-а).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите тарелку со стеклянным дном, которая обеспечивает более короткое рабочее расстояние, большую числовую диафрагму и более высокий объектив увеличения; эти функции имеют решающее значение для получения изображения со сверхвысоким разрешением.
  2. Используйте диализную мембрану (MWCO: 12–14kD), которая обеспечивает газообмен. Разрежьте мембрану на мелкие кусочки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кусочки мембраны должны быть меньше, чем площадь стекла тарелки, но достаточно большими, чтобы покрыть образец.
  3. Замочите мембрану со 100 мкл живой клеточной среды в течение ~5 мин. Не используйте сухую мембрану на образце, так как это может повредить его. Мембрана помогает предотвратить гипоксический стресс.
  4. Подготовьте 2-3 легких стеклянных или пластиковых кусочка для накладываем на мембрану, чтобы ткань не плавала. Для этого сначала берут наружное кольцо трубки центрифуги 50 мл и разрезают его на мелкие кусочки. Затем стерилизуйте кусочки 70% этанолом перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг гарантирует, что образец остается на поверхности во время визуализации и не плавает, что имеет решающее значение для получения оптимальных результатов.
  5. Приготовьте кольцо диаметром ~25 мм и поместите его на приподнятую сторону блюда. Положите на него крышку, чтобы создать две камеры. Нижняя камера будет содержать образец, в то время как верхняя камера будет служить камерой влажности, чтобы предотвратить высыхание образца.
    1. Чтобы сделать это кольцо, отрежьте наружное кольцо от 50 мл центрифужной трубки, что позволит ему надежно поместиться на приподнятой стороне 35-миллиметровой тарелки. Подобное кольцо может быть изготовлено другими способами, например, с помощью резиновой ленты или пластиковой закручивающейся стяжки, чтобы поместиться на приподнятой стороне тарелки, чтобы правильно удерживать крышку, не мешая образцу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, особенно для образцов, чувствительных к стрессам, таким как гипоксические условия и изменения температуры и влажности.

3. Рассечение яичек от самцов мух и крепление

  1. Возьмите ~ 10 молодых самцов мух (2-3 дня) и рассекните яички в среде живых клеток, чтобы получить ~ 10 пар взрослых яичек Drosophila.
    1. Рассекте мух под рассеченным микроскопом в диссекционной чашке с помощью тонких щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм Drosophila melanogaster (плодовая муха) несет трансген UAS-α-Tubulin-GFP, приводимый в действие ранним драйвером зародышевых клеток nanos-Gal4.
    2. Генерируйте следующие штаммы Drosophila melanogaster с использованием технологии CRISPR-Cas9: Lamin-mCherry (метка C-терминала) и CENP-A-Dendra2-CENP-A [метка на внутреннем участке (между 118-м и 119-м кодоном)].
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя для каждого эксперимента требуется только одно яиче отличного качества, установка достаточного количества тканей (15-20) или клеток гарантирует, что будет по крайней мере один здоровый образец с отличными флуоресцентными сигналами для покадровой визуализации.
  2. Дважды вымойте яички в живых клеточных средах в тарелке для рассечения.
    1. Используйте пипетку для добавления носителя с последующим удалением носителя живых клеток в качестве шага промывки.
    2. Удалите лишнюю ткань с помощью щипцов. Любая дополнительная ткань будет мешать визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) для промывки, так как это может повлиять на динамику некоторых клеточных компонентов.
  3. Добавьте в блюдо 100–150 мкл живой клеточной среды (приготовленной на этапе 2.1) и налейте ее на стеклянную поверхность с помощью наконечника пипетки. Распространение среды на поверхность позволит ткани правильно прилипнуть к блюду.
  4. Переложите яички на блюдо с помощью мелких щипцов и поднесите их к центру блюда(рисунок 1А-б).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте переноса мусора, потому что это будет мешать визуализации и может снизить качество изображения.
  5. Удалите излишки живых клеток (оставьте примерно 10 мкл среды), чтобы ткань сплющились и прилипли должным образом к блюду. Выполните этот шаг быстро, чтобы избежать высыхания образца.
  6. Поместите предварительно влажную мембрану (подготовленную на этапах 2.2 и 2.3) поверх яичек(рис. 1А-с).
  7. Поместите 2–3 небольших пластиковых веса (подготовленных на этапе 2.4) на мембрану так, чтобы образец не плавал, и быстро добавьте 100–150 мкл среды живых клеток(рисунок 1A-d).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрое и мягкое добавление среды гарантирует, что образец не высохнет и не будет смещен.
  8. Поместите пластиковое кольцо (подготовленное на этапе 2.5) на приподнятую сторону блюда(рис. 1В-а).
  9. Поместите крышку 22 мм x 22 мм поверх кольца(рисунок 1B-b). Это создает две камеры.
  10. Возьмите кусок папиросной бумаги, смочите его водой, затем закрутите его и положите на крышку, чтобы создать влажную камеру(рисунок 1B-c). Закройте крышку чашки(рисунок 1B-d)и начните визуализацию живых клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец светочувствительный, выполните раздел 3 в темноте.

4. Визуализация живых клеток стволовых клеток зародышевой линии (GSC) in situ

  1. Поместите блюдо под микроскоп сверхвысокого разрешения и закрепите его сценическими зажимами.
    1. Откройте программное обеспечение для визуализации, включите проходящий свет и используйте объектив 63x, чтобы сфокусироваться на ткани яичка с помощью ручки фокусировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть трудности с поиском образца с объективом 63x, то сначала используйте объектив 40x или 20x, прежде чем переключаться на 63x.
    2. Включите лазеры, нажмите Liveи найдите GSC с оптимальным положением и состоянием. Избегайте яичек, которые имеют низкий флуоресцентный сигнал или имеют концентратор (нишу) вдали от поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В яичках дрозофилы ГСК прикреплены к концентратору.
  2. Отрегулируйте фокусировку для GSC и определите правильные настройки для образца, включая мощность лазера, коэффициент усиления электрон-умножения (EM), усреднение и масштабирование для режима Airyscan. Используйте следующие настройки в качестве примера для яичек дрозофилы, экспрессирующих EGFP с тегами α-тубулин в половых клетках на ранней стадии.
    1. Установите размер кадра между 512 x 512 пикселями и 1024 x 1024 пикселями, щелкнув Frame Size (Размер кадра).
    2. Установите среднее значение кадра в 1 или 2, щелкнув Усреднение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение размера кадра (>1024 x 1024 пикселей) и выполнение большего усреднения (т. Е. Более 2) может привести к фотоотбеливанию или фототоксичности.
    3. Установите мощность лазера на 1%–2%, щелкнув Лазеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение мощности лазера может также привести к фотоотбеливанию или фототоксичности.
    4. Установите коэффициент усиления EM ниже рекомендуемого уровня (< 800), щелкнув Master Gain.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокий коэффициент усиления ЭМ может генерировать артефакты.
    5. Увеличьте масштаб до интересующей области или ячейки, чтобы сократить время получения изображения и уменьшить фотоотбеливание. Это также позволяет образцу выживать в течение более длительного времени.
  3. Запустите покадровый захват изображения в режиме Airyscan, щелкнув Начать эксперимент.
    1. Прежде чем щелкнуть Начать эксперимент,убедитесь, что получение настроено оптимально.
    2. Если отображается предупреждение с уведомлением «Сбор Данных Airyscan настроен не оптимально», нажмите «Оптимальный» в разделе «Оптимальный» в разделе «Оптимальный» в разделе «Оптимальный» и нажмите «Оптимальный для области сканирования» (для изображения со сверхвысоким разрешением требуется не менее 1,3 масштаба).
  4. Оптимизируйте временной интервал, количество z-срезов и продолжительность покадровой визуализации в соответствии с экспериментальной конструкцией и типом образца, чтобы качество изображения не было скомпрометировано и клетки не были остановлены на определенных этапах клеточного цикла.
    1. В качестве примера, параметры для покадровой визуализации яичек Drosophila, экспрессирующих EGFP-помеченный α-тубулин в ранней зародышевой линии, показаны на следующих шагах.
    2. Для получения покадровой съемки более 5 часов изображение с интервалом 10 минут с мощностью лазера 1% и получение до 30 z-срезов в каждой точке времени.
    3. Для высокодинамических клеточных процессов, таких как динамика микротрубочек, установите 2-минутный интервал между временными точками, выполните покадровую визуализацию 1-2 ч при мощности лазера 1% и возьмите до 30 z-срезов в каждый момент времени.
    4. Для редких клеточных событий, таких как анафаза к ранней телофазной динамике хроматина (2-3 мин события), установите визуализацию живых клеток с интервалом 1 мин между временными точками, выполните 30-минутную покадровую визуализацию при мощности лазера 1% и возьмите до 30 z-срезов в каждой точке времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут варьироваться для разных образцов, поэтому для оптимального использования конкретного образца потребуется изменение.
  5. Выполняйте либо покадровую съемку, либо визуализацию в реальном времени, в зависимости от чувствительности образца и экспериментального проекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Короткометражный фильм длится 15–30 минут, а длинный фильм — более 5 ч.
  6. Если образец очень чувствителен и не может быть изучен с помощью покадровой визуализации с помощью микроскопа со сверхвысоким разрешением, как это часто бывает с дрозофилами мужского ГСК, выполните снимок образца с супер-разрешением (SRLS) на разных стадиях клеточного цикла (как показано на рисунке 2, рисунок 3, рисунок 4).
    1. Если улавливается редкое клеточное биологическое событие или интересуящный белок имеет низкий уровень экспрессии, то выполните СРЯЛ.
    2. Для SRLS найдите клетку на определенной стадии клеточного цикла, которая вас интересует. Например, если сосредоточиться на связывании микротрубочек с кинетохорами, то используют клетку при прометафазе или метафазе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это поможет гарантировать, что вы получите высококачественное изображение интересующей клетки в нужное время, не рискуя фототоксичностью к образцу или отбеливанием флуорофоров, которое может произойти во время более длительного фильма.
    3. При использовании SRLS изобразите различные этапы клеточного цикла, представляющие интерес, в нескольких ячейках и расположите эти изображения в хронологическом порядке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть использовано для построения временного порядка событий при максимизации сигнала и здоровья тканей, чтобы получить отличное временное разрешение события для особо чувствительных образцов или образцов с низким сигналом.

5. Обработка изображений живых клеток Airyscan

  1. После получения изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений выберите Обработка,щелкните Пакетная обработка,а затем выберите Обработка Airyscan.
    1. Выберите изображения для обработки и нажмите кнопку Выполнить/Обработать, чтобы получить изображения со сверхвысоким разрешением.
    2. Выполните обработку с использованием параметра по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка Airyscan будет работать только в том случае, если настройки изображения правильно установлены для визуализации Airyscan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Визуализация живых клеток за пределами дифракционного предела в ткани дрозофилы, особенно для ГСК, дает возможность исследовать динамику субклеточных событий в контексте прогрессирования клеточного цикла. Недавно исследование, использующее этот протокол, показало, что активность микротрубочек в материнской центросоме по сравнению с дочерней центросомой временно асимметрична в GSC10. Материнская центросома излучает микротрубочки примерно за 4 часа до митотического входа, тогда как дочерняя центросома излучает микротрубочки только в начале митоза. Высокоактивные микротрубочки из материнской центросомы взаимодействуют с ядерной мембраной и индуцируют поляризованное разрушаемое разрушаемое ядерное огибательное опротекивание (NEBD). Локальный NEBD находится проксимально к концентратору и позволяет микротрубочкостям из материнской центросомы входить в ядро и предпочтительно присоединяться к более сильной сестринской кинетохоре и сестринской центромере, чтобы гарантировать, что они отделяются от будущей стволовой клетки. Эти наблюдения показывают, что существует асимметричная митотическая ось, в которой микротрубочки, ядерная мембрана, кинетохора и центромеры взаимодействуют пространственно-временным контролируемым образом, чтобы обеспечить надлежащую неслучайную сегрегацию хромосом в конечномитоге 10,11,12.

Каждый из этих результатов был поддержан с использованием подхода SRLS, описанного здесь. Выполняя визуализацию живых клеток яичек Drosophila, экспрессирующих α-тубулин-GFP в половых клетках на ранней стадии, мы смогли идентифицировать временную асимметрию в активности микротрубочек в GSC(рисунок 2). Мы также смогли увидеть асимметричную интенсивность сигналов GFP в двух центросомах как более яркий сигнал в материнской центросоме и относительно более слабый сигнал на стороне дочерней центросомы с помощью конфокального микроскопа вращающегося диска(рисунок 2A). Разница в яркости, вероятно, отражается временной асимметрией зародышек микротрубочек, но детальная морфология и количество микротрубочек не могут быть решены с помощью конфокальной микроскопии вращающегося диска(рисунок 2A). Напротив, визуализация живых клеток сверхвысокого разрешения позволила нам визуализировать морфологию и количественно оценить количество микротрубочек(рисунок 2B). Его улучшенное разрешение выявило закономерности асимметричного зародышка микротрубочек, удлинения и повышенного взаимодействия с ядерной мембраной(рисунок 2B). В качестве примеров, покадровые фильмы α-тубулин-GFP-экспрессирующих GSC были опубликованы в первичной исследовательской работе (Videos S3 и Video S5)10.

Затем мы выполнили визуализацию живых клеток на яичках Drosophila, совместно экспрессируя либо α-Tubulin-GFP с Lamin-mCherry, либо α-Tubulin-mCherry с Lamin-GFP в зародышевых клетках на ранней стадии. Наши результаты показывают, что асимметричная активность микротрубочек совпала с асимметричной NEBD в GSC(рисунок 3). Используя конфокальный микроскоп со спиннинговым диском, мы могли бы визуализировать асимметричную инвагинацию ядерной мембраны, но не отдельные микротрубочки, которые непосредственно вошли в ядро(рисунок 3A). Напротив, этот метод сверхвысокого разрешения живых клеток позволил нам непосредственно наблюдать эти события, одновременно визуализируя как микротрубочки, так и ядернуюпластинку (рисунок 3B).

Затем мы выполнили визуализацию живых клеток на яичках дрозофилы, экспрессирующих α-Тубулин-мЧерри и CENP-A-Dendra2 или CENP-A-GFP (Centromere Protein A) в половых клетках на ранней стадии. Чтобы лучше визуализировать микротрубочки и центромеры, мы вживую изобразили их при более низкой температуре (~ 18 ° C), чтобы стабилизировать их прикрепление. При необходимости образец можно кратковременно охладить льдом или ледяной живой клеточной средой в течение 4-5 минут, чтобы стабилизировать прикрепление микротрубочек-центромер и деполимеризации любых неприсоединенных микротрубочек. Наши результаты показывают, что микротрубочки, исходящие от ранней активной материнской центросомы, преимущественно прикрепляются к более сильной сестринской центромере(рисунок 4). Используя конфокальный микроскоп со спиннинговым диском, сигналы α-Тубулин-мЧерри отображали асимметричную яркость вблизи двух центросом. Мы также могли обнаружить обе сестринские центромеры как один сигнал, как показано на рисунке 4A (метафаза), но не смогли визуализировать прикрепление микротрубочек-центромер(рисунок 4A, метафаза). Напротив, живое изображение сверхвысокого разрешения позволило нам визуализировать прикрепление микротрубочек-центромер(рисунок 4B). Наши результаты показывают, что материнские центросомы-излучающие микротрубочки прикрепляются к центромере до дочерних центросомно-излучающих микротрубочек(рисунок 4B,ранняя профаза).

Figure 1
Рисунок 1: Схема приготовления и монтажа дрозофилы яичка. (A) Вид сверху: стеклянно-нижняя чашка для культивирования клеток (A-a), перенос яичка Drosophila к центру чашки (A-b), поместите диализную мембрану в верхней части яичка (A-c), поместите три пластиковых веса на мембрану диализа (A-d). (B) Боковой вид: поместите пластиковое кольцо на приподнятую сторону тарелки (B-a), поместите 22 мм × 22 мм крышки на пластиковое кольцо (B-b), положите вихревую и влажную папиросную бумагу на крышку (B-c), закройте тарелку крышкой (B-d). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Покадровая визуализация динамики микротрубочек со сверхвысоким разрешением в ткани дрозофилы (яичках), экспрессирующую α-тубулин-GFP (A)Обычная конфокальная микроскопия изображения живых клеток, показывающая динамику микротрубочек в середине фазы G2 до метафазы. (B) Изображение живых клеток микроскопа Airyscan, показывающее асимметричные микротрубочки, исходящие от матери и дочерних центросом в середине фазы G2 до метафазы, с подробной структурной информацией. Мультфильм изображает мужскую зародышевую клетку Drosophila. Шкала стержней: 5 мкм; звездочка: хаб (ниша); зеленая стрелка: материнская центросома (сторона стволовых клеток [M]); красная стрелка: дочерняя центросома (дифференцирующая сторона дочерней клетки [D]); желтая стрелка: центросома в клетке сперматогонии (прародитель несылочной зародышевой клетки); пурпурная стрелка: микротрубочки, тыкающие в ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Покадровая визуализация сверхвысокого разрешения активности тыкания микротрубочек и асимметричного разрушения ядерной оболочки в ткани дрозофилы (яичках), совместно экспрессирующей Ламин-мЧерри и α-Тубулин-GFP. (A) Обычная конфокальная микроскопия изображения живых клеток, показывающая динамику микротрубочек от фазы G2-M до митоза. Изображение, показывающее более высокую интенсивность α-тубулина-GFP со стороны стволовых клеток и ее взаимодействие с ядерной мембраной. (B) Изображение живых клеток микроскопа Airyscan, показывающее микротрубочки и асимметричный NEBD на стороне стволовых клеток. Шкала стержней: 5 мкм; звездочка: хаб (ниша); оранжевая стрелка: место тыкания микротрубочек в ядерную мембрану; пурпурная стрелка: микротрубочки, которые тыкают в сторону стволовых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Покадровая визуализация микротрубочек и центромер в ткани дрозофилы (яичках) со сверхвысоким разрешением, экспрессирующая α-Тубулин-мЧерри и CENP-A-Dendra2. (A) Обычная конфокальная микроскопия изображения живых клеток, показывающая взаимодействие микротрубочек и центромер от ранней профазы к метафазе. Изображение, показывающее более высокую интенсивность α-тубулин-мВичерри на стороне стволовых клеток и сигнал CENP-A-GFP. (B)Изображение живых клеток микроскопа Airyscan, показывающее микротрубочки, исходящие из материнской центросомы и прикрепленные к более сильным центромерам в ранней профазе. На метафазе центромеры прикрепляются к противоположному полюсу (биориентация). Шкала стержней: 5 мкм; звездочка: хаб (ниша); пурпурная стрелка: кинетохорное волокно или К-волокно (микротрубочки, прикрепленные к центромере). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы микроскопии со сверхвысоким разрешением обеспечивают пространственное разрешение до 10 нанометров4,5,6. Методы микроскопии STORM и PALM позволяют разрешать до 20-50 нм (XY-разрешение), в то время как STED-микроскопия предлагает разрешение от 20 до 100 нм (XY-разрешение). Пространственное разрешение SIM-микроскопии ограничено от 100 до 130 нм15. Однако из-за высокой плотности фотонов и длительного времени сбора чрезвычайно сложно использовать эти методы для визуализации живых клеток.

Визуализация субклеточных структур, таких как цитоскелет, хромосомы и органеллы в живых клетках в тканях, требует, чтобы метод был как сверхчувствительным, так и неинвазивным, сохраняя при этом высокое пространственное разрешение. Представленная здесь техника сверхвысокого разрешения Airyscan сочетает в себе конфокальную визуализацию с точечным отверстием 0,2 Airy Unit, а также переназначение пикселей и деконволюцию. Этот метод может достичь в 1,7 раза более высокого разрешения, чем у обычной конфокальной микроскопии7. Разрешение ~ 220-230 нм обычной конфокальной микроскопии ограничено дифракционным пределом света, но этот метод визуализации способен достичь примерно 140 нм XY-разрешения, что сопоставимо с другими широко используемыми методами сверхразрешения, такими как SIM (разрешение при 110-120 нм)16.

Адаптивность и универсальность конфокальной микроскопии Airyscan позволит этому протоколу быть применимым к различным другим типам тканей и клеток для изучения разнообразного числа процессов клеточной биологии7,16. Используя этот метод, исследователи могут получать покадровые изображения на уровне сверхвысокого разрешения для визуализации клеточной динамики с беспрецедентной пространственно-временной детализацией.

Критическим этапом в этом методе является установка образца на тарелку, чтобы он не двигался и не плавал во время покадровой визуализации. Хранение образца близко или прилипало к поверхности изображения (т.е. стеклянному дну тарелки) имеет решающее значение для получения изображений сверхвысокого разрешения и поддержания оптимального микроокружения для образца. Это гарантирует, что образец не будет напряжен из-за таких условий, как гипоксия и изменения температуры или влажности.

Несмотря на полезность этого протокола, есть несколько предостережений. Покадровая визуализация в режиме Airyscan является относительно медленным процессом по сравнению с обычной визуализацией в конфокальном микроскопе. Поэтому даже малейшее физическое смещение образца может привести к плохому разрешению. Эту ситуацию можно предотвратить, используя метод иммобилизации для приклеивания образцов к поверхности визуализации (например, поли L-лизиновое покрытие или другое покрытие, совместимое с образцом). Кроме того, размещение мембраны диализа поверх ткани и добавление нескольких небольших весов, как описано в этом протоколе, помогает предотвратить движение или плавание тканей, а также обеспечивает газообмен. Покадровая визуализация клеток, которые расположены глубоко в ткани с режимом сверхвысокого разрешения, требует высокой освещенности и может вызвать фотоотбеливание. Это можно свести к минимуму, регулируя количество z-срезов, мощность освещения и алгоритм усреднения для достижения оптимальных настроек для образца. Если клетка или ткань чувствительны к лазерной токсичности, гипоксии или любому другому стрессу во время визуализации, то может произойти остановка клеточного цикла. Кроме того, если белок имеет чрезвычайно низкую экспрессию, короткий период полураспада или низкий флуоресцентный сигнал, то может произойти фотоотбеливание, которое приведет к изображению с плохим качеством. Этого можно избежать, взяв SRLS, сняв короткометражный фильм или сняв с длинными интервалами между последовательными точками времени. Кроме того, настройка микроскопа и параметр покадровой визуализации (как описано в этом протоколе) должны быть оптимизированы для соответствия образцу.

Поскольку важно, чтобы образец не двигался и не вырождался во время процесса, длительная покадровая визуализация, длящаяся ночь или более суток без ущерба для разрешения изображения, может быть сложной задачей.

Существующие методы в основном направлены на оптимизацию параметров микроскопии сверхвысокого разрешения и покадровой визуализации отдельно1,9. Однако эти методы не предоставляют подробностей относительно параметров подготовки или монтажа образца, которые имеют решающее значение для обеспечения жизнеспособности образца и адаптивности микроскопа для достижения желаемого сверхразрешения во время покадровой визуализации. В этом методе мы оптимизировали параметры визуализации, параметры подготовки образцов и монтажа, так что покадровая визуализация может быть выполнена в течение длительного периода времени для получения изображений со сверхвысоким разрешением без риска как дегенерации образца, так и разрешения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить integrated Imaging Core в Университете Джона Хопкинса за микроскопы и программное обеспечение для анализа данных. Мы благодарим J. Snedeker и Q. E. Yu за корректуру и предложения, а также членов лаборатории X.C. за полезные обсуждения и предложения. При поддержке NIGMS/NIH R35GM127075, Медицинского института Говарда Хьюза, Фонда Дэвида и Люсиль Паккард и стартап-фондов Университета Джона Хопкинса (X.C.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software) Adobe N/A
Dialysis membrane Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane Cat No. 08-67121
FBS Thermo Fisher Scientific Cat. no. 26140079 15% (V/V)
Fiji (analysis software) NIH N/A Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) World Precision Instrument, Inc. FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software) Bitplane N/A 3D image reconstruction
Imerssion oil Zeiss Immersol 518F/30 °C
Insulin Sigma Cat. No. 15550 200 µg/ml
Penicillin/streptomycin Invitrogen Cat No. - 15140-122 0.6x
Schneider Drosophila media Invitrogen Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope Zeiss N/A equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper Kimwipe N/A Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module Zeiss N/A equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software) Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).
  2. Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).
  3. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  4. Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).
  5. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).
  6. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  7. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
  8. Huff, J., et al. The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan. Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).
  9. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging. Photonics. 4 (4), 41 (2017).
  10. Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).
  11. Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).
  12. Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells. Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).
  13. Wooten, M., et al. Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).
  14. Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
  15. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  16. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).

Tags

Биология выпуск 167 суперразрешение дифракционный предел покадровая визуализация визуализация живой ткани стволовые клетки микротрубочки центромеры ядерная мембрана асимметричное деление клеток митоз
Визуализация субклеточных структур в живых клетках сверхвысокого разрешения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ranjan, R., Chen, X.… More

Ranjan, R., Chen, X. Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures. J. Vis. Exp. (167), e61563, doi:10.3791/61563 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter