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Immunology and Infection

म्यूरीन बी सेल विकास के प्रवाह Cytometric लक्षण वर्णन

Published: January 22, 2021 doi: 10.3791/61565
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Regeneron Tech Centers, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 2Regeneron Therapeutic Proteins, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 3Immunology and Inflammation, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

हम यहां प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पेरिटोनियम, प्लीहा और अस्थि मज्जा ऊतकों में मुरीन प्रतिरक्षा बी सेल डिब्बे की विषमता के एक सरल विश्लेषण का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है और अन्य माउस ऊतकों तक बढ़ाया जा सकता है।

Abstract

व्यापक अध्ययनों ने माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में मुरीन बी कोशिकाओं के विकास और भेदभाव की विशेषता की है। बी कोशिकाओं द्वारा स्रावित एंटीबॉडी को अलग किया गया है और अच्छी तरह से स्थापित चिकित्सीय में विकसित किया गया है। ऑटोइम्यून प्रवण चूहों के संदर्भ में, या संशोधित प्रतिरक्षा प्रणाली वाले चूहों में, मुरीन बी सेल विकास का सत्यापन, चूहों में चिकित्सीय एजेंटों को विकसित करने या परीक्षण करने का एक महत्वपूर्ण घटक है और प्रवाह साइटोमेट्री का एक उपयुक्त उपयोग है। अच्छी तरह से स्थापित बी सेल प्रवाह साइटोमेट्रिक मापदंडों का उपयोग मुरीन पेरिटोनियम, अस्थि मज्जा और प्लीहा में बी सेल विकास का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन कई सर्वोत्तम प्रथाओं का पालन किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बी सेल डिब्बों के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण को बी सेल विकास के अतिरिक्त रीडआउट को भी पूरक करना चाहिए। इस तकनीक का उपयोग करके उत्पन्न डेटा जंगली प्रकार, ऑटोइम्यून प्रोन माउस मॉडल के साथ-साथ मानवीकृत चूहों की हमारी समझ को आगे बढ़ा सकता है जिसका उपयोग एंटीबॉडी या एंटीबॉडी जैसे अणुओं को चिकित्सीय के रूप में उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी तेजी से कई मानव बीमारियों के लिए विकल्प चिकित्सा बन गए हैं क्योंकि वे मुख्यधारा की दवा 1,2 का हिस्सा बन जाते हैं। हमने पहले आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों का वर्णन किया है जो माउस IgH स्थिरांक 3,4 के साथ पूरी तरह से मानव चर क्षेत्रों को आश्रय देने वाले एंटीबॉडी का कुशलतापूर्वक उत्पादन करते हैं। हाल ही में, हमने आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों का वर्णन किया है जो एंटीबॉडी जैसे अणुओं का उत्पादन करते हैं जिनमें अलग-अलग एंटीजन-बाइंडिंग 5 होता है। एंटीबॉडी बी कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं और अनुकूली ह्यूमरस प्रतिरक्षा का आधार बनाते हैं। दो अलग-अलग प्रकार के बी कोशिकाएं हैं, बी -1 और बी -2। स्तनधारियों में, बी -1 कोशिकाएं भ्रूण के जिगर में उत्पन्न होती हैं और जन्म के बाद म्यूकोसल ऊतकों और फुफ्फुस और पेरिटोनियल गुहाओं में समृद्ध होती हैं, जबकि बी -2 कोशिकाएं जन्म से पहले भ्रूण के जिगर में उत्पन्न होती हैं और उसके बाद अस्थि मज्जा (बीएम) में होती हैं। बी -2 कोशिकाओं को प्लीहा और रक्त 6,7,8 सहित माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में समृद्ध किया जाता है। बीएम में, बी -2 हेमटोपोइएटिक पूर्वज आईजी म्यू हेवी चेन पुनर्व्यवस्था 9,10 की दीक्षा पर प्रो-बी कोशिकाओं में अंतर करना शुरू करते हैं। Ig भारी श्रृंखला की सफल पुनर्व्यवस्था और पूर्व-बी सेल रिसेप्टर (पूर्व-बीसीआर) में इसकी असेंबली, सिग्नलिंग और प्रोलिफेरेटिव विस्तार के साथ, पूर्व-बी कोशिकाओं के लिए भेदभाव की ओर जाता है। प्री-बी कोशिकाओं के बाद अपने आईजी कप्पा (आईजी) को पुनर्व्यवस्थित करते हैं, या यदि अनुत्पादक, आईजी लैम्ब्डा (आईजी) प्रकाश श्रृंखलाएं, वे μ भारी श्रृंखला के साथ जोड़ी बनाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सतह आईजीएम बीसीआर अभिव्यक्ति होती है। यह इंगित करना महत्वपूर्ण है कि IgM सतह अभिव्यक्ति को autoreactivity की शर्तों के तहत कम करने के लिए जाना जाता है, इस प्रकार कार्यात्मक रूप से अनुत्तरदायी या एनार्जिक बी कोशिकाओं में आत्म सहिष्णुता में योगदान देता है11,12। अपरिपक्व बी कोशिकाएं तब एक संक्रमणकालीन चरण में प्रवेश करती हैं, जहां वे आईजीडी को सह-व्यक्त करना शुरू कर देती हैं और बीएम से प्लीहा में स्थानांतरित होती हैं। प्लीहा में, आईजीडी अभिव्यक्ति और बढ़ जाती है और कोशिकाएं संक्रमणकालीन बी कोशिकाओं के दूसरे चरण में परिपक्व होती हैं, इसके बाद उनकी परिपक्वता स्थिति और विकास को या तो सीमांत क्षेत्र (एमजेड) या कूपिक (फोलिकुलर) कोशिकाओं में पूरा किया जाता है13,14,15। वयस्क चूहों में, एक गैर-रोगग्रस्त सेटिंग में, बीएम में दैनिक रूप से उत्पन्न होने वाली 10-20 मिलियन अपरिपक्व बी कोशिकाओं के बावजूद परिपक्व बी कोशिकाओं की संख्या स्थिर रहती है। इनमें से, केवल तीन प्रतिशत परिपक्व बी कोशिकाओं के पूल में प्रवेश करते हैं। परिधीय बी सेल डिब्बे का आकार सेल की मृत्यु से विवश होता है, जो आत्म-प्रतिक्रियाशीलता और अपूर्ण परिपक्वता 16,17,18 सहित कई कारकों के कारण होता है। फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग मनुष्यों और चूहों में कई प्रतिरक्षा कोशिका उप-डिब्बों को चिह्नित करने और गणना करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। जबकि मानव और मुरीन बी सेल डिब्बों के बीच कुछ समानताएं हैं, यह प्रोटोकॉल केवल मुरीन बी कोशिकाओं के विश्लेषण पर लागू होता है। इस प्रोटोकॉल को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों को फेनोटाइपिंग के उद्देश्य से विकसित किया गया था, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या आनुवंशिक हेरफेर बी सेल विकास को बदल देगा। फ्लो साइटोमेट्री कई अतिरिक्त अनुप्रयोगों में भी बेहद लोकप्रिय रहा है, जिसमें सेल सक्रियण, कार्य, प्रसार, चक्र विश्लेषण, डीएनए सामग्री विश्लेषण, एपोप्टोसिस और सेल सॉर्टिंग 19,20 को मापना शामिल है।

फ्लो साइटोमेट्री चूहों और मनुष्यों में विभिन्न लिम्फोसाइट डिब्बों को चिह्नित करने के लिए पसंद का उपकरण है, जिसमें प्लीहा, बीएम और रक्त जैसे जटिल अंग शामिल हैं। प्रवाह साइटोमेट्री के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध माउस-विशिष्ट एंटीबॉडी अभिकर्मकों के कारण, इस तकनीक का उपयोग न केवल सेल सतह प्रोटीन बल्कि इंट्रासेल्युलर फॉस्फोप्रोटीन और साइटोकिन्स, साथ ही साथ कार्यात्मक रीडआउट 21 की जांच करने के लिए किया जा सकता है। इसमें हम प्रदर्शित करते हैं कि कैसे प्रवाह साइटोमेट्री अभिकर्मकों का उपयोग बी कोशिकाओं के सबसेट की पहचान करने के लिए किया जा सकता है क्योंकि वे माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में परिपक्व और अंतर करते हैं। धुंधला स्थितियों के अनुकूलन के बाद, नमूना हैंडलिंग, सही साधन सेट अप और डेटा अधिग्रहण, और अंत में डेटा विश्लेषण, चूहों में बी सेल डिब्बे के व्यापक प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। इस तरह के व्यापक विश्लेषण हार्डी और सहयोगियों द्वारा तैयार किए गए दशकों पुराने नामकरण पर आधारित है, जहां बीएम बी -2 कोशिकाओं को विकसित करने को बी 220, सीडी 43, बीपी -1, सीडी 24, आईजीएम और आईजीडी 22 की अभिव्यक्ति के आधार पर विभिन्न अंशों (अंश) में विभाजित किया जा सकता है। हार्डी एट अल. से पता चला है कि B220 + CD43 BM B कोशिकाओं को BP-1 और CD24 (30F1) अभिव्यक्ति के आधार पर चार सबसेट (अंश A-C') में विभाजित किया जा सकता है, जबकि B220+ CD43-(dim to neg) BM B कोशिकाओं को IgD और सतह IgM23 की विभेदक अभिव्यक्ति के आधार पर तीन सबसेट (भिन्न D-F) में हल किया जा सकता है। भिन्न A (पूर्व-प्रो-बी कोशिकाओं) को BP-1- CD24 (30F1)-, भिन्न B (प्रारंभिक प्रो-B कोशिकाओं) को BP-1- CD24 (30F1)+, भिन्न C (देर से प्रो-B कोशिकाओं) को BP-1+ CD24 (30F1)+ के रूप में परिभाषित किया गया है, और अंश C '(प्रारंभिक पूर्व-B कोशिकाओं) को BP-1+ और CD24high के रूप में परिभाषित किया गया है। इसके अलावा, भिन्न डी (पूर्व-बी कोशिकाओं) को B220 + CD43- IgM- B कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है, और अंश E (नव उत्पन्न B कोशिकाओं, अपरिपक्व और संक्रमणकालीन का संयोजन) को B220 + CD43- IgM + B कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है और अंश F (परिपक्व, recirculting B कोशिकाओं) को B220high CD43- IgM + B कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है। इसके विपरीत, प्लीहा में पाए जाने वाले भोले बी कोशिकाओं के बहुमत को परिपक्व (B220+ CD93-) बी कोशिकाओं और संक्रमणकालीन (T1, T2, T3) कोशिकाओं में विभाजित किया जा सकता है, जो CD93, CD23 और IgM की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। परिपक्व बी कोशिकाओं को IgM और CD21/CD35 की अभिव्यक्ति के आधार पर सीमांत क्षेत्र और कूपिक उपसमुच्चय में हल किया जा सकता है, और कूपिक उपसमुच्चय को उनके IgM और IgD सतह अभिव्यक्ति 24 के स्तर के आधार पर परिपक्व कूपिक प्रकार I और कूपिक प्रकार II B सेल सबसेट में विभाजित किया जा सकता है। ये स्प्लेनिक बी सेल आबादी मुख्य रूप से Igπ प्रकाश श्रृंखला को व्यक्त करती है। अंत में, बी -1 बी सेल आबादी, जो भ्रूण के जिगर में उत्पन्न होती है और मुख्य रूप से वयस्क चूहों के पेरिटोनियल और फुफ्फुस गुहाओं में पाई जाती है, को साहित्य में वर्णित किया गया है। इन पेरिटोनियल बी कोशिकाओं को CD23 अभिव्यक्ति की कमी से पहले वर्णित B-2 B कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है। फिर उन्हें बी -1 ए या बी -1 बी आबादी में विभाजित किया जाता है, जिसमें पूर्व को सीडी 5 की उपस्थिति से परिभाषित किया जाता है और बाद में इसकी अनुपस्थिति 25 द्वारा परिभाषित किया जाता है। बी -1 सेल पूर्वज भ्रूण के जिगर में प्रचुर मात्रा में होते हैं, लेकिन वयस्क बीएम में नहीं पाए जाते हैं। जबकि बी -1 ए और बी -1 बी कोशिकाएं विभिन्न पूर्वजों से उत्पन्न होती हैं, वे दोनों पेरिटोनियल और फुफ्फुस गुहाओं को बीज देते हैं24। बी -2 कोशिकाओं के विपरीत, बी -1 कोशिकाएं आत्म-नवीकरण में विशिष्ट रूप से सक्षम हैं और प्राकृतिक आईजीएम एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं।

बी सेल विकास में दोष कई उदाहरणों में उत्पन्न हो सकते हैं, जिसमें BCR26,27 के घटकों में कमियां, सिग्नलिंग अणुओं की गड़बड़ी जो BCR सिग्नलिंग ताकत को प्रभावित करती है14,28,29, या साइटोकिन्स का विघटन जो बी सेल उत्तरजीविता को संशोधित करता है30,31 . लिम्फोइड डिब्बों के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने इन चूहों और कई अन्य लोगों में बी सेल विकास ब्लॉकों के लक्षण वर्णन में योगदान दिया है। लिम्फोइड डिब्बों के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण का एक लाभ यह है कि यह जीवित विघटित ऊतक से प्राप्त व्यक्तिगत कोशिकाओं पर माप करने की क्षमता प्रदान करता है। फ्लोरोफोरस की एक कभी-विस्तारित रेंज में अभिकर्मकों की उपलब्धता कई मापदंडों के एक साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देती है और बी सेल विषमता के मूल्यांकन को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा बी कोशिकाओं की गणना अन्य प्रतिरक्षाविज्ञानी assays जैसे immunohistochemistry विधियों को पूरक करती है जो लिम्फोइड अंगों के भीतर सेल स्थानीयकरण की कल्पना करती है, ह्यूमरस प्रतिरक्षा के उपाय के रूप में परिसंचारी एंटीबॉडी के स्तर का पता लगाती है, साथ ही साथ वास्तविक स्थान और टाइम 32 में बी सेल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी।

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Protocol

सभी माउस अध्ययनों की देखरेख और अनुमोदन रेजेनरॉन की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा किया गया था। प्रयोग जैक्सन प्रयोगशालाओं से तीन C57BL / 6J मादा चूहों (17 सप्ताह की उम्र) के ऊतकों पर आयोजित किया गया था। आदर्श एकाग्रता निर्धारित करने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले सभी एंटीबॉडी को टाइटरेट करें। एकल-रंग मुआवजे के लिए मुआवजे के मोतियों का उपयोग करते समय, सुनिश्चित करें कि वे आपके नमूनों की तुलना में उज्ज्वल या उज्ज्वल के रूप में दागते हैं। सभी बफर, एंटीबॉडी और कोशिकाओं को बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। व्यवहार्यता डाई के अलावा के बाद, या तो कम प्रकाश या अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी चरणों और ऊष्मायन प्रदर्शन।

1. पेरिटोनियल सेल फसल और एकल सेल अलगाव

  1. CO2 का उपयोग करके या अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार माउस को Euthanize करें।
  2. माउस को अपनी पीठ पर रखें, 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें, और कैंची के साथ बाहरी पेट की त्वचा में कटौती करें, पेरिटोनियम को काटने के लिए सावधान न रहें।
  3. 3 मिलीलीटर बर्फ-कोल्ड वॉश बफर (डीपीबीएस [वॉल्यूम / वॉल्यूम] में 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) ) को पेरिटोनियल गुहा में 3 एमएल इंजेक्ट करें, जिसमें 25 गेज सुई के साथ 3 एमएल सिरिंज फिट किया गया है।
  4. धीरे से उंगलियों के साथ peritoneum मालिश.
  5. चरण 1.3 और 1.4 को दोहराएँ।
  6. पेरिटोनियम के माध्यम से 18 जी सुई के साथ फिट एक 3 एमएल सिरिंज डालें, अंगों और वसा से बचने के लिए सावधान रहें।
  7. धोने बफर निकालें, अब पेरिटोनियल कोशिकाओं युक्त, और बर्फ पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण।
  8. चरण 1.3 और 1.4 को दोहराएँ।
  9. चिमटी के साथ पकड़ते समय पेरिटोनियम में एक छोटा सा छेद काटें।
  10. छेद में एक डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट डालें और शेष धोने बफर को इकट्ठा करें, एक बार फिर वसा और अंगों से बचें।
  11. एकत्र शेष पेरिटोनियल कोशिकाओं को बर्फ पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: यदि रक्त संदूषण स्पष्ट है, तो नमूना छोड़ें।
  12. प्लीहा और हड्डी निष्कर्षण पूरा होने तक बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। Supernatant aspirate.
  14. धोने बफर के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend.
  15. बर्फ पर एक साफ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 70 μM सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।
  16. सेल काउंटर इंस्ट्रूमेंट या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता निर्धारित करें।

2. प्लीहा फसल और एकल सेल अलगाव

  1. माउस को अपने पेट पर रखें और साफ कैंची का उपयोग करके बाईं पीठ पर पेरिटोनियम के माध्यम से काटें। प्लीहा को काट लें, वसा और संयोजी ऊतक को हटा दें।
  2. प्लीहा को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें बर्फ पर वॉश बफर का 1 एमएल होता है।
  3. बर्फ पर तिल्ली को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि हड्डी निष्कर्षण पूरा न हो जाए।
  4. लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 5 mL के साथ स्वचालित पृथक्करण ट्यूब के लिए तिल्ली ले जाएँ। ऊतक पृथक्करण उपकरण पर ट्यूब रखें और एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए 60 सेकंड के लिए अलग करें।
    नोट: एकल-सेल प्लीहा निलंबन प्राप्त करने के अन्य नियमित तरीकों का उपयोग करने की भी अनुमति है जैसे कि वॉश बफ़र में ठंढ वाले ग्लास स्लाइड के बीच मुंहतोड़। यदि पृथक्करण की एक अन्य विधि का उपयोग किया जाता है, तो सेंट्रीफ्यूजेशन, आकांक्षा के साथ पृथक्करण का पालन करें, और फिर चरण 2.5 को जारी रखने से पहले लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 5 मिलीलीटर में पुन: निलंबन का पालन करें।
  5. 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. 2mM EDTA युक्त 4 °C धोने बफर के 10 mL जोड़ें.
  7. एक साफ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। Supernatant aspirate.
  9. 4 डिग्री सेल्सियस धोने बफर के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend.
  10. बर्फ पर एक साफ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 70 μM सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।
  11. सेल काउंटर इंस्ट्रूमेंट या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता निर्धारित करें।

3. बीएम फसल और एकल सेल अलगाव

  1. माउस शरीर के निचले आधे हिस्से से त्वचा को हटा दें। पैर से अतिरिक्त मांसपेशी ट्रिम करें। कैंची के साथ पूरे पैर को हटा दें, फीमर को काटने के लिए सावधान रहें। शेष मांसपेशियों, वसा और पैरों को हटाकर फीमर और टिबिया को साफ करें।
  2. हड्डियों को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें बर्फ पर वॉश बफर का 1 एमएल होता है।
  3. एक 0.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के नीचे छिद्रित करें, जिससे पैर की हड्डियों के लिए पर्याप्त छेद छोटा हो जाता है। एक साफ 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 0.5 mL ट्यूब डालें। घुटने के लिए फीमर और टिबिया समीपस्थ के अंत से स्निप करें और कटे हुए सिरों को 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में नीचे की ओर मुंह करके रखें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 6,780 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के अतिरिक्त 3 एमएल युक्त 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  7. 2mM EDTA युक्त 4 °C धोने बफर के 10 mL जोड़ें.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। Supernatant aspirate.
  9. 4 डिग्री सेल्सियस धोने बफर के 3 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend.
  10. बर्फ पर एक साफ 15 मिली शंक्वाकार ट्यूब में एक 70 μM सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर कोशिकाओं।
  11. सेल काउंटर इंस्ट्रूमेंट या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता निर्धारित करें।

4. स्टेन कोशिकाओं और मुआवजा तैयार

  1. प्रत्येक जानवर से प्रत्येक सेल प्रकार की 106 कोशिकाओं को 96 अच्छी तरह से यू बॉटम प्लेट में एलीकोट करें।
    1. सभी नमूनों और नियंत्रणों के लिए पर्याप्त कुओं को शामिल करना सुनिश्चित करें, जिसमें पूर्ण दाग, प्रतिदीप्ति-माइनस-वन (एफएमओ), अनसनेटेड, और अंत में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए वैकल्पिक एकल-रंग मुआवजा शामिल है।
    2. बीएम परिपक्वता पैनल और प्लीहा परिपक्वता पैनल के लिए, प्रत्येक पूर्ण दाग नमूने के लिए 2 कुओं में एलीकोट कोशिकाएं, प्रति अच्छी तरह से 106 कोशिकाएं। एकल-रंग क्षतिपूर्ति व्यवहार्यता नियंत्रण के लिए, प्रत्येक कक्ष प्रकार के 2 x 106 कक्षों को अलग-अलग कुओं में जोड़ें.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 845 x g पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। जल्दी से उलटा और एक सिंक पर प्लेट flicking द्वारा supernatant decant, पार कुओं को दूषित नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है.
  3. DPBS के 200 μL (BSA या FBS के बिना) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। यह कदम अमाइन-प्रतिक्रियाशील व्यवहार्यता डाई के साथ धुंधला होने से पहले प्रोटीन को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. चरण 4.2 और 4.3 को दोहराएँ।
  5. चरण 4.2 को दोहराएँ।
  6. DPBS में 100 μL व्यवहार्यता डाई पतला 1:1,000 में कोशिकाओं resuspend.
    नोट:: यदि एकल-रंग क्षतिपूर्ति के लिए कक्षों का उपयोग कर रहे हैं, तो उन कुओं के लिए व्यवहार्यता डाई न जोड़ें।
    1. प्रत्येक दाग सेट के लिए, एक पूरी तरह से unstained नमूने और किसी भी अन्य नियंत्रण आप की आवश्यकता हो सकती है के लिए कई unstained कुओं छोड़ दें।
    2. प्रत्येक दाग सेट के लिए, व्यवहार्यता FMO नियंत्रण के लिए एक अतिरिक्त unstained अच्छी तरह से छोड़ दें।
    3. एकल-रंग व्यवहार्यता क्षतिपूर्ति नियंत्रण के लिए: 2 x 106 कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया, चरण 4.1 में, पतला व्यवहार्यता डाई के 200 μL में। कोशिकाओं के 100 μL को 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, 65 °C पर 5 मिनट के लिए गर्मी कोशिकाएं, और 100 μL शेष जीवित कोशिकाओं के साथ मूल कुएं पर वापस 100 μL कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, 30 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 845 x g पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। जल्दी से उलटा और एक सिंक पर प्लेट flicking द्वारा supernatant decant, पार कुओं को दूषित नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है.
  9. DPBS के 200 μL (BSA या FBS के बिना) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  10. चरण 4.8 और 4.9 को दोहराएँ।
  11. चरण 4.8 को दोहराएँ।
  12. Fc ब्लॉक के 50 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करना 1: 50 (अंतिम एकाग्रता = 10 μg / mL) दाग बफर में पतला (DPBS [vol / vol]) में 0.5% BSA)।
    1. पेरिटोनियल कोशिकाओं के लिए - गैर-विशिष्ट धुंधला को कम करने के लिए मोनोसाइट ब्लॉकर के 5 μL भी जोड़ें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, जो 15 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित है।
  14. 106 कोशिकाओं प्रति 100 μl की एक अंतिम मात्रा के लिए दाग बफर में पूर्ण दाग मास्टर mixes और FMOs तैयार करें। एंटीबॉडी सूचियों के लिए तालिका 1-तालिका 4 देखें।
    नोट: FMOs एक को छोड़कर एक दाग सेट में सभी एंटीबॉडी को शामिल करके किए जाते हैं। एक दाग सेट में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एक एफएमओ तैयार करें। जब एक दाग सेट में कई शानदार रंजक होते हैं, तो प्रति नमूना दाग बफर के लिए शानदार दाग बफर के 50 μL को प्रतिस्थापित करें
  15. एफसी ब्लॉक को हटाने के बिना, चयनित कुओं में पूर्ण दाग मिश्रण और एफएमओ के 100 μL जोड़ें।
  16. एक दाग सेट में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एकल-रंग मुआवजा नियंत्रण तैयार करें।
    1. यदि मुआवजे के मोतियों का उपयोग कर उपयोग के लिए निर्माण के निर्देशों का पालन करें।
    2. यदि कोशिकाओं का उपयोग कर रहे हैं, तो 106 कोशिकाओं में टिट्रेटेड एंटीबॉडी जोड़ें, जो पहले से 100 μL दाग बफर में व्यवहार्यता डाई के बिना चरण 4.6.1 में आरक्षित था। यदि नमूने में सभी कोशिकाएं किसी विशेष मार्कर के लिए सकारात्मक हैं, तो प्रवाह साइटोमीटर पर मुआवजा डेटा प्राप्त करते समय उपयोग किए जाने वाले बिना दाग वाली कोशिकाओं को अलग रखें।
  17. कोशिकाओं और मोतियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित, 30 मिनट के लिए।
  18. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 845 x g पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। जल्दी से उलटा और एक सिंक पर प्लेट flicking द्वारा supernatant decant, पार कुओं को दूषित नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है.
  19. धब्बे बफर के 200 μL में कोशिकाओं और मोतियों को फिर से निलंबित कर दिया।
  20. चरण 4.18 और 4.19 को दो बार दोहराएं।
  21. चरण 4.18 को दोहराएँ।
  22. 48 ज के भीतर विश्लेषण के लिए नमूनों को ठीक करने के लिए, DPBS में 2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 200 μL में कोशिकाओं और मोतियों को फिर से निलंबित कर दिया।
    सावधानी: पैराफोमल्डिहाइड एक गंभीर स्वास्थ्य खतरा और ज्वलनशील है। उपयोग करने से पहले Safty डेटा पत्रक देखें.
  23. कोशिकाओं और मोतियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित, 30 मिनट के लिए।
  24. चरण 4.18 और 4.19 को दो बार दोहराएं।
  25. एक साफ 96 अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेट पर एक फिल्टर प्लेट रखें। एक बहु-पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक नमूने को फ़िल्टर प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें।
  26. 4 °C पर 2 मिनट के लिए 845 x g पर फ़िल्टर प्लेट-96 अच्छी तरह से U-बॉटम प्लेट सेटअप को सेंट्रीफ्यूज करें। फिल्टर प्लेट को निकालें और जल्दी से उलटा और एक सिंक पर प्लेट flicking द्वारा supernatant decant, पार कुओं को दूषित नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है.
  27. बीएम और प्लीहा परिपक्वता पैनलों के लिए दाग बफर के 100 μL में पूरी तरह से दाग कोशिकाओं resuspend. प्रत्येक जानवर के लिए 2 कुओं को 1 अच्छी तरह से मिलाएं। शेष पैनलों, FMOs, और दाग बफर के 200 μL में नियंत्रण resuspend.
  28. 4 डिग्री सेल्सियस पर निश्चित कोशिकाओं और मोतियों को इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित, रात भर।

5. प्रवाह cytometric डेटा अधिग्रहण

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रवाह साइटोमीटर को आरंभ और क्यूसी करें।
  2. प्रत्येक पैनल के लिए विशिष्ट टेम्पलेट लोड करें.
  3. डेटा रिकॉर्ड करने से पहले, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूने के लिए सभी घटनाएं पैमाने पर हैं और डॉट प्लॉट्स पर दिखाई दे रही हैं।
  4. चरण 4.16 में तैयार किए गए एकल दाग मुआवजे का उपयोग करके प्रत्येक दाग पैनल के लिए रिकॉर्ड मुआवजा नियंत्रण। प्रत्येक नमूने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक द्वार सेट करें। सॉफ्टवेयर मुआवजा मैट्रिक्स की गणना है.
  5. पहला नमूना प्राप्त करना शुरू करें, और सुनिश्चित करें कि गेट उचित रूप से सेट किए गए हैं।
  6. पेरिटोनियल बी सेल पैनल और प्लीहा आईजी और आईजी पैनल के लिए कम से कम 50,000 बी सेल ईवेंट रिकॉर्ड करने के लिए मशीन सेट करें; बीएम परिपक्वता पैनल के लिए 150,000 बी सेल ईवेंट; और प्लीहा परिपक्वता पैनल के लिए 300,000 बी सेल घटनाओं.
  7. प्रत्येक दाग पैनल के लिए, प्रत्येक जानवर, एक unstained नमूना, और FMOs के लिए पूरी तरह से दाग नमूने चलाने और रिकॉर्ड करें।

6. डेटा का विश्लेषण

  1. प्रवाह cytometry विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें। चित्र 1, चित्रा 2, चित्र 3, चित्रा 4 में उल्लिखित गेटिंग रणनीतियों का पालन करें। 

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Representative Results

यहां हम माउस पेरिटोनियम, बीएम और प्लीहा में बी सेल विकास की विशेषता के लिए गेटिंग रणनीति पेश करते हैं। विश्लेषण का आधार व्यवहार्यता डाई के साथ धुंधला होने की अवधारणा के आसपास बनता है, फिर फॉरवर्ड-स्कैटर-एरिया (एफएससी-ए) और फॉरवर्ड-स्कैटर-हाइट (एफएससी-एच) के आधार पर डबल्स को बाहर निकालता है, और अंत में उनके एफएससी-ए और साइड-स्कैटर-एरिया (एसएससी-ए) विशेषताओं के अनुसार कोशिकाओं का चयन करके मलबे को बाहर निकालता है, जिसे यहां आकार गेट के रूप में संदर्भित किया जाता है, जो सापेक्ष सेल आकार और सेल ग्रैन्युलैरिटी के प्रतिबिंबित होते हैं, जो सापेक्ष सेल आकार और सेल ग्रैन्युलैरिटी के प्रतिबिंबित होते हैं, ब्याज की आबादी पर गेटिंग से पहले।

पेरिटोनियल बी कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण से व्यवहार्य पेरिटोनियल कोशिकाओं, कुल बी कोशिकाओं, बी -1 और बी -2 सबसेट, साथ ही साथ सी 57 बी / 6 जे चूहों (चित्रा 1) में बी -1 ए और बी -1 बी कोशिकाओं की आवृत्तियों को दिखाया गया है, तालिका 1 में उल्लिखित एक धुंधला पैनल का उपयोग करके। इन आवृत्तियों की औसत निरपेक्ष सेल संख्या तालिका 5 में दिखाई गई है। बी -1 कोशिकाओं में गड़बड़ी को सेल सबसेट के वितरण द्वारा चित्रित किया जा सकता है, या तो सेल आवृत्ति या प्रति माउस निरपेक्ष कोशिकाओं की संख्या द्वारा।

बीएम बी कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण व्यवहार्य बीएम कोशिकाओं, कुल बी कोशिकाओं, अंश ए (पूर्व-प्रो-बी कोशिकाओं और दूषित लिम्फोसाइटों), पूर्व-समर्थक-बी कोशिकाओं, अंश बी, अंश सी, अंश सी, अंश डी, अपरिपक्व (अंश ई में सबसेट), संक्रमणकालीन (अंश ई में सबसेट), और C57BL / 6J चूहों (चित्रा 2) में अंश एफ बी कोशिकाओं की आवृत्तियों को दर्शाता है, तालिका 2 में उल्लिखित एक धुंधला पैनल का उपयोग करके। इन आवृत्तियों की औसत निरपेक्ष सेल संख्या तालिका 6 में दिखाई गई है। बीएम बी कोशिकाओं में गड़बड़ी को सेल सबसेट के वितरण द्वारा चित्रित किया जा सकता है, या तो सेल आवृत्ति या प्रति पैर निरपेक्ष कोशिकाओं की संख्या द्वारा।

प्लीहा बी कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण से व्यवहार्य प्लीहा कोशिकाओं, कुल बी कोशिकाओं, संक्रमणकालीन बी कोशिकाओं, टी 1, टी 2, टी 3 कोशिकाओं, परिपक्व बी कोशिकाओं, कूपिक I कोशिकाओं (फोलिकुलर I), कूपिक II (Fol II) कोशिकाओं, सीमांत क्षेत्र (MZ) अग्रदूत कोशिकाओं, परिपक्व MZ कोशिकाओं, और B-1 कोशिकाओं की आवृत्तियों को C57BL/ इन आवृत्तियों की औसत निरपेक्ष सेल संख्या तालिका 7 में दिखाई गई है। स्प्लेनिक बी कोशिकाओं में गड़बड़ी को सेल सबसेट के वितरण द्वारा चित्रित किया जा सकता है, या तो सेल आवृत्ति या प्रति प्लीहा निरपेक्ष कोशिकाओं की संख्या द्वारा।

इसी प्रकार, प्लीहा का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण C57BL/6J चूहों (चित्रा 4) में Igπ+ और Igπ+ B कोशिकाओं की आवृत्तियों को दर्शाता है, जो तालिका 4 में उल्लिखित एक धुंधला पैनल का उपयोग करता है। इन आवृत्तियों की औसत निरपेक्ष सेल संख्या तालिका 8 में दिखाई गई है। Igπ+ और Igπ + Bcells में गड़बड़ी को सेल सबसेट के वितरण द्वारा चित्रित किया जा सकता है, या तो सेल आवृत्ति या प्रति प्लीहा निरपेक्ष कोशिकाओं की संख्या द्वारा।

रोग-प्रतिकारक फ्लोरोफोर क्लोन
CD19 APC-H7 1D3
B220 APC RA3-6B2
IgM PeCy7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD43 FITC S7
CD23 BUV395 B3B4
CD11b BV711 M1/70
CD5 BV605 53-7.3

तालिका 1: पेरिटोनियल बी सेल पैनल

रोग-प्रतिकारक फ्लोरोफोर क्लोन
CD19 APC-H7 1D3
B220 APC RA3-6B2
IgM PeCy7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD43 FITC 1B11
CD24 (HSA) पीई 30-F1
सी-किट BUV395 2B8
BP-1 BV786 BP-1
CD93 BV711 AA4.1
डंप चैनल
CD3 AF700 17-A2
CD11b AF700 M1/70
GR1 (Ly6C/6G) AF700 RB6-8C5
Ter119 AF700 TER-119

तालिका 2: अस्थि मज्जा परिपक्वता पैनल

रोग-प्रतिकारक फ्लोरोफोर क्लोन
CD19 APC-H7 1D3
B220 APC RA3-6B2
IgM PeCy7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD43 FITC S7
CD23 BUV395 B3B4
CD21/35 BV421 7G6
CD11b AF700 M1/70
CD5 BV605 53-7.3
CD93 पीई AA4.1

तालिका 3: प्लीहा परिपक्वता पैनल

रोग-प्रतिकारक फ्लोरोफोर क्लोन
CD19 APC-H7 1D3
B220 APC RA3-6B2
IgM PeCy7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD3 पंजाब 17-A2
कापा FITC 187.1
लैम्ब्डा पीई RML-42

तालिका 4: प्लीहा Igπ और Igπ पैनल

Figure 1
चित्रा 1: पेरिटोनियम में बी सेल आबादी का लक्षण वर्णन। व्यवहार्य, एकल सेल, आकार गेटेड पेरिटोनियल बी कोशिकाओं को पहले आईजीएम + कोशिकाओं पर गेटिंग करके दूषित कोशिकाओं से अलग किया जाता है। बी -1 और बी -2 कोशिकाओं को तब अनुपस्थिति (बी -1) या सीडी 23 (बी -2) की उपस्थिति से एक दूसरे से अलग किया जाता है। अगले CD5 व्यंजक का उपयोग B-1b कोशिकाओं (CD5-) से B-1a कोशिकाओं (CD5+) को चित्रित करने के लिए किया जाता है। एफएमओ का उपयोग अनुभवजन्य रूप से यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि गेट कहां खींचना है। संख्याएं एक ही घनत्व भूखंड के भीतर प्रत्येक आबादी के प्रतिशत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बीएम में बी सेल सबसेट का लक्षण वर्णन। व्यवहार्य, एकल सेल, आकार गेटेड बीएम बी कोशिकाओं को बी 220 + डंप पर गेटिंग करके गैर-बी कोशिकाओं से अलग किया जाता है - (जहां डंप सीडी 3 / जीआर -1 / सीडी 11 बी / टीईआर 11 9 को संदर्भित करता है) कोशिकाओं। CD43 और B220 अभिव्यक्ति आगे हार्डी अंश A-C' (CD43+ B220+) और हार्डी अंश D-F (CD43low/neg B220+/++) को परिभाषित करती है। अंश A-C को BP-1 और CD24 की अभिव्यक्ति द्वारा अलग किया जाता है। अंश ए (बीपी -1- सीडी 24-) दूषित कोशिकाओं के साथ-साथ पूर्व-प्रो-बी कोशिकाओं से मेल खाता है। अंश ए में दूषित कोशिकाओं से पूर्व-प्रो-बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए, सीडी 93 की अभिव्यक्ति और सीडी 1 9 की अनुपस्थिति का उपयोग किया जाता है। अंश बी (BP-1- CD24int) और अंश C (BP-1+ CD24int) क्रमशः प्रारंभिक और देर से प्रो-बी कोशिकाओं के अनुरूप हैं, और अंश C ' (BP-1+/- CD24+) प्रारंभिक पूर्व-B कोशिकाओं से मेल खाता है। भिन्न D-F को अलग करने के लिए, IgM और IgD की अभिव्यक्ति का उपयोग किया जाता है। अंश डी देर से पूर्व-बी कोशिकाओं (IgM-/ अंश ई (नीला गेट, IgMint / उच्च IgD-) दोनों अपरिपक्व (Imm, IgMint IgD-) और संक्रमणकालीन (ट्रान, IgMhigh IgD-) बी कोशिकाओं के लिए; और अंश एफ (IgMint / उच्च IgD +) परिपक्व बी कोशिकाओं recirculating करने के लिए। एफएमओ का उपयोग अनुभवजन्य रूप से यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि गेट कहां खींचना है। संख्याएं एक ही घनत्व भूखंड के भीतर प्रत्येक आबादी के प्रतिशत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: स्प्लेनिक बी सेल परिपक्वता का लक्षण वर्णन। व्यवहार्य, एकल सेल, आकार गेटेड प्लीहा बी कोशिकाओं को बी 220 + कोशिकाओं पर गेटिंग करके गैर-बी कोशिकाओं से अलग किया जाता है। बी -1 सबसेट की पहचान करने के लिए, CD23- CD19+ कोशिकाओं को CD43 की अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना और परिभाषित किया जाता है। बी -2 आबादी को वर्गीकृत करने के लिए, CD19+ कोशिकाओं को संक्रमणकालीन (CD93+ B220+) और परिपक्व (CD93- B220+) B कोशिकाओं में विभाजित किया जाता है। संक्रमणकालीन (CD93+ B220+) कोशिकाओं को आगे T1 (IgM+ CD23-), T2 (IgM+ CD23+), और T3 (IgMint CD23+) आबादी में विभाजित किया जाता है। परिपक्व (CD93- B220+) कोशिकाओं को सीमांत क्षेत्र (CD21/35+ IgM+) और कूपिक (CD21/35int IgMint/+) B कोशिकाओं में विभाजित किया जाता है। CD23 की अभिव्यक्ति का उपयोग MZ अग्रदूत (CD23+ B220+) कोशिकाओं को अधिक परिपक्व MZ (CD23- B220+) कोशिकाओं से अलग करने के लिए किया जाता है। Follicular आबादी को तब Fol I (IgD + IgMint) और Fol II (IgD + IgM +) कोशिकाओं में चित्रित किया जाता है। एफएमओ का उपयोग अनुभवजन्य रूप से यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि गेट कहां खींचना है। संख्याएं एक ही घनत्व प्लॉट के भीतर प्रत्येक आबादी के प्रतिशत हैं कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्लीहा बी कोशिकाओं के Igπ और Igπ अभिव्यक्ति. व्यवहार्य, एकल सेल, आकार गेटेड प्लीहा बी-कोशिकाओं को बी 220 + सीडी 3- कोशिकाओं पर गेटिंग करके गैर-बी-कोशिकाओं से अलग किया जाता है। बी कोशिकाओं को तब Igπ और Igπ की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जाता है। संख्याएं एक ही घनत्व भूखंड के भीतर प्रत्येक आबादी के प्रतिशत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

निरपेक्ष कक्ष संख्या
पशु संख्या व्यवहार्य पेरिटोनियल कोशिकाएं B कोशिकाएँ B-1a कोशिकाएं B-1b कोशिकाएं B-2 कोशिकाएं
1 1.02E+07 4.67E+06 1.28E+06 8.95E+05 2.35E+06
2 9.92E+06 4.52E+06 1.49E+06 9.60E+05 1.91E+06
3 1.15E+07 4.56E+06 1.71E+06 9.19E+05 1.78E+06
औसत 1.05E+07 4.58E+06 1.49E+06 9.25E+05 2.01E+06

तालिका 5: पेरिटोनियल बी सेल सबसेट की निरपेक्ष सेल संख्या

निरपेक्ष कक्ष संख्या
पशु संख्या व्यवहार्य अस्थि मज्जा कोशिकाएं B कोशिकाएँ भिन्न A पूर्व समर्थक भिन्न B भिन्न C भिन्न C' भिन्न D अपरिपक्व परिवर्ती भिन्न F
1 5.05E+07 9.70E+06 1.13E+06 1.95E+05 2.22E+05 9.14E+04 6.31E+05 1.59E+06 4.56E+05 7.81E+05 4.03E+06
2 5.39E+07 1.03E+07 1.14E+06 2.29E+05 2.89E+05 1.22E+05 8.40E+05 2.11E+06 5.39E+05 8.07E+05 3.67E+06
3 5.93E+07 1.01E+07 1.10E+06 2.12E+05 2.84E+05 1.05E+05 9.02E+05 2.72E+06 5.94E+05 7.62E+05 2.59E+06
औसत 5.46E+07 1.00E+07 1.12E+06 2.12E+05 2.65E+05 1.06E+05 7.91E+05 2.14E+06 5.29E+05 7.83E+05 3.43E+06

तालिका 6: अस्थि मज्जा बी सेल सबसेट की निरपेक्ष सेल संख्या

निरपेक्ष कक्ष संख्या
पशु संख्या व्यवहार्य प्लीहा कोशिकाएं B कोशिकाएँ संक्रमणकालीन बी कोशिकाएं T1 कोशिकाएँ T2 कोशिकाएं T3 कोशिकाएँ परिपक्व बी कोशिकाओं कूपिक I कोशिकाएं कूपिक द्वितीय कोशिकाएं अग्रदूत सीमांत क्षेत्र कोशिकाएं परिपक्व सीमांत क्षेत्र कोशिकाएं B-1 कोशिकाएँ
1 9.16E+07 4.61E+07 3.66E+06 1.55E+06 1.10E+06 7.16E+05 4.06E+07 2.39E+07 5.27E+06 2.17E+06 3.98E+06 8.83E+05
2 9.97E+07 5.18E+07 4.88E+06 1.97E+06 1.57E+06 1.00E+06 4.49E+07 2.68E+07 7.33E+06 3.42E+06 3.84E+06 8.15E+05
3 1.02E+08 5.34E+07 4.64E+06 1.98E+06 1.41E+06 8.54E+05 4.62E+07 2.81E+07 5.84E+06 3.58E+06 4.02E+06 1.01E+06
औसत 9.77E+07 5.04E+07 4.39E+06 1.83E+06 1.36E+06 8.58E+05 4.39E+07 2.63E+07 6.15E+06 3.06E+06 3.94E+06 9.02E+05

तालिका 7: पूर्ण सेल संख्याप्लेनिक बी सेल सबसेट की

निरपेक्ष कक्ष संख्या
पशु संख्या व्यवहार्य प्लीहा कोशिकाएं B कोशिकाएँ Igπ+ B कोशिकाएँ Igπ+ B कोशिकाएँ
1 9.16E+07 4.97E+07 4.51E+07 2.46E+06
2 9.97E+07 5.63E+07 5.08E+07 3.16E+06
3 1.02E+08 5.91E+07 5.33E+07 3.24E+06
औसत 9.77E+07 5.50E+07 4.97E+07 2.95E+06

तालिका 8: Igπ और Igπ B सेल उपसमुच्चय की निरपेक्ष कक्ष संख्याएँ

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Discussion

लिम्फोइड और गैर-लिम्फोइड ऊतकों के फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण ने 1980 के दशक के बाद से चूहों और मनुष्यों में बी सेल उप-आबादी की एक साथ पहचान और गणना को सक्षम किया है। इसका उपयोग ह्यूमरस प्रतिरक्षा के उपाय के रूप में किया गया है और बी सेल कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए आगे लागू किया जा सकता है। यह विधि चूहों और मनुष्यों में बी सेल परिपक्वता के विभिन्न चरणों का आकलन करने के लिए अभिकर्मक उपलब्धता का लाभ उठाती है, यहां तक कि दुर्लभ आबादी में भी बी सेल विषमता के मूल्यांकन को सक्षम करने वाले कई मापदंडों के एक साथ विश्लेषण के माध्यम से। यदि जटिल विषम नमूनों को मापने के लिए उपयोग किया जाता है, तो यह व्यक्तिगत कोशिकाओं पर मिनटों के भीतर उप-आबादी का पता लगा सकता है33। अनुक्रमिक गेटिंग विश्लेषण रणनीति, जो अक्सर प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण पर लागू होती है, सरल और सहज हो सकती है जब एक विशिष्ट आबादी की पहचान की जानी चाहिए। अंत में, प्रवाह साइटोमेट्री का एक और लाभ यह है कि यह अधिकांश अकादमिक प्रयोगशालाओं में आसानी से अनुकूलनीय है, जबकि अनुभवी उपयोगकर्ताओं के मार्गदर्शन में। हमारा प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक पेरिटोनियम, बीएम, और चूहों के प्लीहा में बी सेल आबादी के मूल्यांकन का वर्णन करता है, बी -1 आबादी का वर्णन और गणना करके और बी -2 प्रो-बी कोशिकाओं, पूर्व-बी कोशिकाओं, अपरिपक्व, संक्रमणकालीन और परिपक्व बी कोशिकाओं के विकास में तल्लीन होकर, साथ ही साथ आईजी या आईजी प्रकाश श्रृंखलाओं की उनकी सतह की अभिव्यक्ति। फ्लो साइटोमेट्री सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, और चूहों में बी सेल विकास की जांच करते समय लागू करने का सबसे आसान तरीका है।

जबकि फ्लो साइटोमेट्री अमूल्य डेटा उत्पन्न करता है, इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं जब प्रतिरक्षा बी सेल डिब्बे की विषमता की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है। विशाल डेटा सेट भारी हो सकते हैं क्योंकि 10 रंग धुंधला 1,024 से अधिक विभिन्न सेल आबादी 34 की पहचान की अनुमति देता है। किसी को यह ध्यान में रखना चाहिए कि कुछ आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले लिम्फोइड सेल मार्कर मूल रूप से सोचा से कम विशिष्ट साबित हुए हैं। यह वांछित आबादी पर गेटिंग का पता लगाने के लिए सेल सतह मार्करों की एक भीड़ को नियोजित करके हल किया जा सकता है। जबकि फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण सरल और सहज ज्ञान युक्त हो सकता है, साइटोमेट्रिक विश्लेषण को प्रवाहित करने के लिए एक और बाधा यह है कि यह आमतौर पर एक समय में केवल दो मापदंडों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, हालांकि टी-एसएनई जैसे डेटा विज़ुअलाइज़ेशन टूल का उपयोग उच्च पैरामीटर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करते समय सेल आबादी को अधिक कुशलता से क्लस्टर करने के लिए किया जा सकता है। एक और महत्वपूर्ण सीमा यह है कि अधिग्रहण और विश्लेषण दोनों के दौरान उपयोग किए जाने वाले द्वार कभी-कभी ऑपरेटर की व्यक्तिपरकता पर निर्भर होते हैं।

इस प्रोटोकॉल के सफल अनुकूलन या प्रतिकृति के लिए, कई महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए35। सावधानीपूर्वक विचार पैनल डिजाइन और fluorochrome चयन में लिया जाना चाहिए. चमकीले फ्लोरोक्रोम के साथ मंद या महत्वपूर्ण एंटीजन को जोड़ना आवश्यक है। एंटीबॉडी अनुमापन को गैर-विशेष रूप से कोशिकाओं के लिए अतिरिक्त एंटीबॉडी बाध्यकारी से बचने के लिए किया जाना चाहिए, संभावित रूप से पृष्ठभूमि धुंधला और घटते हुए रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाना। एंटीबॉडी अनुमापन एंटीबॉडी की घटती सांद्रता के साथ कोशिकाओं की एक ज्ञात संख्या को धुंधला करके किया जाता है, ताकि सबसे अच्छा पृथक्करण सूचकांक निर्धारित किया जा सके 36। यह एंटीबॉडी के हर बहुत के लिए दोहराया जाना चाहिए। नमूना तैयारी और धुंधला के दौरान, Ca ++ और Mg ++ से बचकर एकल सेल निलंबन को आश्वस्त करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, ईडीटीए के अलावा सेल एकत्रीकरण और एंजाइमेटिक गतिविधि को रोकने में मदद कर सकता है जो एंटीबॉडी-मध्यस्थता स्टिमिल्यूलेशन और लेबल मार्करों के आंतरिककरण का कारण बन सकता है। डेटा अधिग्रहण से पहले, नमूनों को ठीक से निलंबित, फ़िल्टर किया जाना चाहिए और समुच्चय से मुक्त होना चाहिए। एक पैरामीटर से दूसरे पैरामीटर के लिए सिग्नल का स्पिलओवर मुआवजा नियंत्रण का उपयोग करके हल किया जाता है, एकल दाग कोशिकाओं या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्षतिपूर्ति मोतियों के रूप में। एक और महत्वपूर्ण विचार प्रत्येक प्रयोग में उचित नियंत्रण रखना है। बिना दाग वाली कोशिकाएं ऑटोफ्लोरेसेंस की आधार रेखा स्थापित करती हैं। आइसोटाइप नियंत्रण अब गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के कारण गेटिंग के लिए उपयुक्त नियंत्रण नहीं माना जाता है। सटीक गेट बनाने में मदद करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम एफएमओ नियंत्रण का उपयोग है। एक एफएमओ नियंत्रण में, सभी संयुग्मित एंटीबॉडी दाग में मौजूद होते हैं सिवाय इसके कि एक के लिए नियंत्रित किया जा रहा है। एफएमओ नियंत्रण लापता चैनल में सभी फ्लोरोफोर के प्रसार के माप को सक्षम करते हैं और इसलिए तदनुसार गेट स्थापित करने की अनुमति देते हैं। यह महत्वपूर्ण है कि अतिरिक्त सटीकता के लिए पर्याप्त कोशिकाओं का अधिग्रहण किया जाता है। अंगूठे के नियम के रूप में, ब्याज की आबादी की कम से कम 2,000 घटनाओं को एकत्र किया जाना चाहिए। अंत में, मुआवजा नियंत्रण, चाहे मोती या कोशिकाएं, का उपयोग किए जा रहे फ्लोरोक्रोम से बिल्कुल मेल खाना चाहिए और नियंत्रण कम से कम प्रयोगात्मक नमूनों के रूप में उज्ज्वल होना चाहिए।

कुल मिलाकर, बी सेल डिब्बों के कम साइटोमेट्रिक विश्लेषण का व्यापक रूप से प्रतिरक्षा विज्ञान क्षेत्र में उपयोग किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों दोनों में ह्यूमरस प्रतिरक्षा में गड़बड़ी की जांच करने के लिए किया जा सकता है, गैर-रोग राज्यों के तहत और प्रतिरक्षाविज्ञानी चुनौती पर।

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Disclosures

सभी लेखक Regeneron Pharmaceuticals, Inc के कर्मचारी और शेयरधारक हैं।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए मैथ्यू स्लीमैन को धन्यवाद देते हैं। हम इस शोध का समर्थन करने के लिए Regeneron में Vivarium Operations और Flow Cytometry Core विभागों को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes Eppendorf  22363611 0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes  Eppendorf  22364111 1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes  Corning  352097 15 mL conical tube
18 gauge needle BD 305196
25 gauge needle BD  305124
3 mL syringe BD 309657
70 mM MACS SmartStrainer  Miltenyi Biotec  130-110-916  70 mM cell strainer
96 well U bottom plate  VWR 10861-564
ACK lysis buffer  GIBCO  A1049201 red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate Pall Corporation 8027 filter plate
B220 eBiosciences 17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ BD 552843 compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ BD 552844 compensation beads
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A8577 BSA
BP-1 BD 740882
Brilliant Stain Buffer BD 566349 brilliant stain buffer
C-Kit BD 564011
CD11b BD 563168
CD11b BioLegend 101222
CD19 BD 560143
CD21/35 BD 562756
CD23  BD 740216
CD24 (HSA) BioLegend 138504
CD3 BD 561388
CD3 BioLegend 100214
CD43 BD 553270
CD43 BioLegend 121206
CD5 BD 563194
CD93 BD 740750
CD93 BioLegend 136504
DPBS (1x) ThermoFisher 14190-144 DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 ThermoFisher 65-0866-14 viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette Samco 233 disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer BD custom order flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) BD 553142 Fc block
FlowJo Flowjo flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes  Miltenyi Biotec  130-096-334 automated dissociation tube 
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters  Miltenyi Biotec  130-095-937 tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G) BioLegend 108422
IgD BioLegend 405710
IgM eBiosciences 25-5790-82
Kappa BD 550003
Lambda BioLegend 407308
paraformaldehyde, 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714
Ter119 BioLegend 116220
True-Stain Monocyte Blocker BioLegend 426103 monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575038 EDTA
Vi-CELL XR Beckman Coulter 731050 cell counter instrument 

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References

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Harris, F. M., Meagher, K. A., Zhong, M., Daniel, B. J., Eckersdorff, M., Green, J. A., Voronina, V., Guo, C., Limnander, A., Macdonald, L. E. Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development. J. Vis. Exp. (167), e61565, doi:10.3791/61565 (2021).

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