Summary
Мы описываем здесь простой анализ гетерогенности компартмента иммунных В-клеток мышей в тканях брюшины, селезенки и костного мозга с помощью проточной цитометрии. Протокол может быть адаптирован и распространен на другие ткани мыши.
Abstract
Обширные исследования характеризуют развитие и дифференцировку мышиных В-клеток во вторичных лимфоидных органах. Антитела, секретируемые В-клетками, были выделены и развиты в хорошо зарекомендовавшие себя терапевтические средства. Валидация развития В-клеток мышей в контексте аутоиммунных склонных мышей или у мышей с модифицированной иммунной системой является важнейшим компонентом разработки или тестирования терапевтических агентов на мышах и является надлежащим использованием проточной цитометрии. Хорошо зарекомендовавшие себя цитометрические параметры потока В-клеток могут быть использованы для оценки развития В-клеток в брюшине мышей, костном мозге и селезенке, но необходимо придерживаться ряда лучших практик. Кроме того, проточный цитометрический анализ компартментов В-клеток должен также дополнять дополнительные показания развития В-клеток. Данные, полученные с помощью этого метода, могут способствовать нашему пониманию моделей мышей дикого типа, склонных к аутоиммунным заболеваниям, а также гуманизированных мышей, которые могут быть использованы для генерации антител или молекул, подобных антителам, в качестве терапевтических средств.
Introduction
Моноклональные антитела все чаще становятся предпочтительной терапией для многих заболеваний человека, поскольку они становятся частью основной медицины1,2. Ранее мы описали генетически модифицированных мышей, которые эффективно вырабатывают антитела, скрывающие полностью переменные области человека с константами IgH мыши3,4. Совсем недавно мы описали генетически модифицированных мышей, которые продуцируют антителоподобные молекулы, которые имеют отчетливое связывание антигенов5. Антитела секретируются В-клетками и составляют основу адаптивного гуморального иммунитета. Существует два различных типа В-клеток, B-1 и B-2. У млекопитающих клетки B-1 возникают в печени плода и обогащаются тканями слизистой оболочки и плевральной и брюшной полостями после рождения, в то время как клетки B-2 возникают в печени плода до рождения, а затем в костном мозге (БМ). Клетки B-2 обогащаются вторичными лимфоидными органами, включая селезенку и кровь6,7,8. В БМ гемопоэтические предшественники B-2 начинают дифференцироваться в про-В-клетки после инициирования перестройки тяжелой цепи Ig mu9,10. Успешная перестройка тяжелой цепи Ig и ее сборка в пре-В-клеточный рецептор (пре-BCR), наряду с сигнальной и пролиферативной экспансией, приводит к дифференцировке в пре-В-клетки. После того, как пре-В-клетки перестраивают свои легкие цепи Ig kappa (Igκ) или, если это непродуктивно, легкие цепи Ig lambda (Igλ), они соединяются с μ тяжелой цепи, что приводит к поверхностной экспрессии IgM BCR. Важно отметить, что поверхностная экспрессия IgM, как известно, снижается в условиях аутореактивности, что способствует самотолерантности в функционально невосприимчивых или анергических В-клетках11,12. Незрелые В-клетки затем вступают в переходную стадию, где они начинают совместно экспрессировать IgD и мигрируют из БМ в селезенку. В селезенке экспрессия IgD еще больше увеличивается, и клетки созревают во вторую стадию переходных В-клеток, за которой следует завершение их статуса созревания и развитие либо в клетки маргинальной зоны (MZ), либо в фолликулярные (Fol) клетки13,14,15. У взрослых мышей, в неболеющих условиях, количество зрелых В-клеток остается постоянным, несмотря на то, что ежедневно в БМ генерируется 10-20 миллионов незрелых В-клеток. Из них только три процента попадают в пул зрелых В-клеток. Размер периферического В-клеточного компартмента ограничен гибелью клеток, отчасти из-за нескольких факторов, включая самореактивность и неполное созревание16,17,18. Проточный цитометрический анализ широко использовался для характеристики и перечисления многих субкомпонентов иммунных клеток у людей и мышей. Хотя существует некоторое сходство между человеческими и мышиными В-клеточными компартментами, этот протокол применяется только к анализу мышиных В-клеток. Этот протокол был разработан с целью фенотипирования генетически модифицированных мышей, чтобы определить, изменят ли генетические манипуляции развитие В-клеток. Проточная цитометрия также была чрезвычайно популярна во многих дополнительных приложениях, в том числе при измерении активации клеток, функции, пролиферации, анализа циклов, анализа содержания ДНК, апоптоза и сортировки клеток 19,20.
Проточная цитометрия является предпочтительным инструментом для характеристики различных лимфоцитарных компартментов у мышей и людей, в том числе в сложных органах, таких как селезенка, БМ и кровь. Благодаря широко доступным мышино-специфическим реагентам антител для проточной цитометрии, этот метод может быть использован для исследования не только белков клеточной поверхности, но и внутриклеточных фосфопротеинов и цитокинов, а также функциональных показаний21. Здесь мы демонстрируем, как реагенты проточной цитометрии могут быть использованы для идентификации подмножеств В-клеток по мере их созревания и дифференцировки во вторичных лимфоидных органах. После оптимизации условий окрашивания, обработки образцов, правильной настройки прибора и сбора данных и, наконец, анализа данных можно использовать протокол комплексного проточного цитометрического анализа компартмента В-клеток у мышей. Такой комплексный анализ основан на десятилетней номенклатуре, разработанной Харди и его коллегами, где развивающиеся клетки BM B-2 могут быть разделены на различные фракции (Fraction) в зависимости от их экспрессии B220, CD43, BP-1, CD24, IgM и IgD22. Hardy et al., показали, что B220+ CD43 BM B-клетки могут быть подразделены на четыре подмножества (фракция A-C') на основе экспрессии BP-1 и CD24 (30F1), в то время как B220+ CD43-(тусклые до отрицательных) BM B-клетки могут быть разрешены на три подмножества (фракция D-F) на основе дифференциальной экспрессии IgD и поверхностного IgM23. Фракция A (пре-про-В клетки) определяется как BP-1-CD24 (30F1)-, фракция B (ранние про-В-клетки) определяется как BP-1-CD24 (30F1)+, фракция C (поздние про-В-клетки) определяется как BP-1+ CD24 (30F1)+, а фракция C' (ранние клетки пре-В) определяется как BP-1+ и CD24high. Кроме того, фракция D (пре-В-клетки) определяется как B220+ CD43-IgM-В-клетки, а фракция E (вновь генерируемые В-клетки, комбинация незрелых и переходных) определяется как B220+ CD43-IgM+ В-клетки, а фракция F (зрелые, рециркулирующие В-клетки) определяется как B220-высокие CD43-IgM+ В-клетки. Напротив, большинство наивных В-клеток, обнаруженных в селезенке, можно разделить на зрелые (B220 + CD93-) В-клетки и переходные (T1, T2, T3) клетки в зависимости от экспрессии CD93, CD23 и IgM. Зрелые В-клетки могут быть разрешены на маргинальные зоны и фолликулярные подмножества на основе экспрессии IgM и CD21/CD35, а фолликулярные подмножества могут быть дополнительно разделены на зрелые фолликулярные подмножества клеток типа I и фолликулярные подмножества В-клеток типа II в зависимости от уровня их поверхностной экспрессии IgM и IgD24. Эти селезеночные популяции В-клеток экспрессируют преимущественно Igκ легкую цепь. Наконец, популяции В-клеток B-1, которые происходят из печени плода и в основном находятся в брюшной и плевральной полостях взрослых мышей, были описаны в литературе. Эти перитонеальные В-клетки можно отличить от ранее описанных В-2 В-клеток по отсутствию экспрессии CD23. Затем они далее подразделяются на популяции B-1a или B-1b, причем первые определяются присутствием CD5, а вторые - его отсутствием25. Предшественники клеток B-1 в изобилии присутствуют в печени плода, но не обнаруживаются во взрослом БМ. Хотя клетки B-1a и B-1b происходят от разных предшественников, они оба засеивают брюшную и плевральную полости24. В отличие от клеток B-2, клетки B-1 уникально способны к самообновлению и отвечают за выработку естественных антител IgM.
Дефекты в развитии В-клеток могут возникать во многих случаях, включая недостатки в компонентах BCR26,27, возмущения сигнальных молекул, которые влияют на силу передачи сигналов BCR14,28,29, или нарушение цитокинов, которые модулируют выживание В-клеток30,31 . Анализ проточной цитометрии лимфоидных компартментов способствовал характеристике блоков развития В-клеток у этих мышей и многих других. Одним из преимуществ проточного цитометрического анализа лимфоидных компартментов является то, что он предлагает возможность проводить измерения на отдельных клетках, полученных из живой диссоциированной ткани. Наличие реагентов в постоянно расширяющемся диапазоне флуорофоров позволяет проводить одновременный анализ нескольких параметров и позволяет оценивать гетерогенность В-клеток. Кроме того, перечисление В-клеток методом проточного цитометрического анализа дополняет другие иммунологические анализы, такие как методы иммуногистохимии, которые визуализируют локализацию клеток в лимфоидных органах, обнаружение уровней циркулирующих антител в качестве меры гуморального иммунитета, а также две фотонные микроскопии для измерения реакций В-клеток в реальном пространстве и времени32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на мышах контролировались и утверждались Комитетом по уходу и использованию животных Regeneron (IACUC). Эксперимент проводился на тканях трех самок мышей C57BL/6J (17-недельного возраста) из Jackson Laboratories. Титруйте все антитела перед началом эксперимента, чтобы определить идеальную концентрацию. При использовании компенсационных бусин для одноцветной компенсации убедитесь, что они окрашиваются так же ярко или ярче, чем ваши образцы. Храните все буферы, антитела и клетки на льду или при 4 °C. После добавления красителя жизнеспособности выполните все этапы и инкубации при 4°C при слабом освещении или в темноте.
1. Сбор перитонеальных клеток и изоляция одиночных клеток
- Усыпление мыши с использованием CO2 или в соответствии с утвержденным протоколом.
- Уложите мышь на спину, опрыскивайте 70% этанолом и ножницами разрезайте наружную кожу живота, стараясь не разрезать брюшину.
- Введите 3 мл ледяного буфера промывки (0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в DPBS [vol/vol]) в брюшинную полость с помощью шприца 3 мл, оснащенного иглой 25 калибра.
- Нежно массируйте брюшину кончиками пальцев.
- Повторите шаги 1.3 и 1.4.
- Вставьте шприц объемом 3 мл, снабженный иглой 18 г, через брюшину, стараясь избегать органов и жира.
- Извлеките промывочный буфер, теперь содержащий перитонеальные клетки, и переведите на льду коническую трубку объемом 15 мл.
- Повторите шаги 1.3 и 1.4.
- Вырежьте небольшое отверстие в брюшине, держась пинцетом.
- Вставьте в отверстие одноразовую переносную пипетку и соберите оставшийся буфер для стирки, еще раз избегая жира и органов.
- Перенесите собранные оставшиеся перитонеальные клетки в коническую трубку объемом 15 мл на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбросьте образец, если загрязнение крови очевидно. - Инкубируйте клетки на льду до тех пор, пока не будет завершено извлечение селезенки и кости.
- Центрифугировать ячейки при 300 х г в течение 8 мин при 4 °C. Аспирировать супернатанта.
- Повторно суспендировать ячейку гранулы в 1 мл промывочного буфера.
- Отфильтруйте клетки через клеточный сетчатый фильтр 70 мкМ в чистую коническую трубку объемом 15 мл на льду.
- Определите концентрацию клеток с помощью прибора счетчика клеток или гемоцитометра.
2. Сбор урожая селезенки и изоляция одиночных клеток
- Положите мышь на живот и прорежьте брюшину с левой задней стороны с помощью чистых ножниц. Вырежьте селезенку, удалив жир и соединительную ткань.
- Перенесите селезенку в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл промывочного буфера на льду.
- Инкубируйте селезенку на льду до тех пор, пока не будет завершено извлечение кости.
- Переместите селезенку в автоматизированную диссоциационную трубку с 5 мл буфера лизиса эритроцитов. Поместите трубку на инструмент диссоциатора тканей и диссоциируйте в течение 60 с, чтобы создать одноклеточную суспензию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также допустимо использовать другие рутинные методы получения одноклеточных суспензий селезенки, такие как разбивание между горками матового стекла в буфере для стирки. Если используется другой метод диссоциации, проследите диссоциацию центрифугированием, аспирацией, а затем повторной суспензией в 5 мл буфера лизиса эритроцитов, прежде чем продолжить этап 2,5. - Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Добавьте 10 мл промывочного буфера 4 °C, содержащего 2 мМ ЭДТА.
- Переложить в чистую коническую трубку объемом 15 мл.
- Центрифугировать ячейки при 300 х г в течение 8 мин при 4 °C. Аспирировать супернатанта.
- Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 5 мл 4 °C промывочного буфера.
- Отфильтруйте клетки через клеточный сетчатый фильтр 70 мкМ в чистую коническую трубку объемом 15 мл на льду.
- Определите концентрацию клеток с помощью прибора счетчика клеток или гемоцитометра.
3. Сбор BM и изоляция одной клетки
- Удалите кожу с нижней половины тела мыши. Обрежьте лишнюю мышцу с ноги. Удалите всю ногу ножницами, стараясь не порезать бедренную кость. Очистите бедренную и большеберцовую кости, удалив оставшиеся мышцы, жир и ноги.
- Переложите кости в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл промывочного буфера на льду.
- Перфорировать дно трубки микроцентрифуги объемом 0,5 мл, оставив отверстие, достаточно маленькое, чтобы кости ног не выступали. Вставьте трубку объемом 0,5 мл в чистую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Отрежьте конец бедренной и большеберцовой костей проксимально к колену и поместите срезанные концы лицом вниз в трубку объемом 0,5 мл.
- Центрифугирование ячеек при 6,780 х г в течение 2 мин при 4 °C.
- Повторно суспендировать клеточную гранулу в 1 мл буфера лизиса эритроцитов и перенести в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую дополнительные 3 мл буфера лизиса эритроцитов.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Добавьте 10 мл промывочного буфера 4 °C, содержащего 2 мМ ЭДТА.
- Центрифугировать ячейки при 300 х г в течение 8 мин при 4 °C. Аспирировать супернатанта.
- Повторно суспендировать ячейку гранулы в 3 мл промывочного буфера 4 °C.
- Фильтруйте ячейки через клеточный сетчатый фильтр 70 мкМ в чистую коническую трубку объемом 15 мл на льду.
- Определите концентрацию клеток с помощью прибора счетчика клеток или гемоцитометра.
4. Окрашивание клеток и подготовка компенсации
- Аликвот 106 клеток каждого типа клеток от каждого животного к нижней пластине 96 лунок U.
- Убедитесь, что в них достаточно скважин для всех образцов и элементов управления, включая полное окрашивание, флуоресценцию минус один (FMO), неокрашенное и, наконец, дополнительную одноцветную компенсацию для каждого используемого флуорофора.
- Для панели созревания BM и панели созревания селезенки ячейки аликвоты в 2 скважины, по 106 ячеек на скважину, на каждый полный образец пятна. Для элементов управления жизнеспособностью одноцветной компенсации добавьте 2 x 106 ячеек каждого типа клеток в отдельные скважины.
- Центрифугировать пластину при 845 х г в течение 2 мин при 4 °C. Декантируйте супернатант, быстро переворачивая и перебрасывая пластину на раковину, стараясь не перекрестно загрязнить скважины.
- Повторное суспендирование клеток в 200 мкл DPBS (без BSA или FBS). Этот шаг важен для удаления белка перед окрашиванием аминореактивным красителем жизнеспособности.
- Повторите шаги 4.2 и 4.3.
- Повторите шаг 4.2.
- Повторное суспендирование клеток в 100 мкл жизнеспособности красителя разбавляется 1:1000 в DPBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете ячейки для одноцветной компенсации, не добавляйте краситель жизнеспособности в эти колодцы.- Для каждого набора пятен оставьте несколько незапятнанных колодцев для совершенно незапятнанного образца и любых других элементов управления, которые могут вам понадобиться.
- Для каждого набора пятен оставьте дополнительный незапятнанный колодец для контроля жизнеспособности FMO.
- Для одноцветных элементов управления компенсацией жизнеспособности: повторное суспендирование 2 x 106 клеток, аликвотированных на этапе 4.1, в 200 мкл разбавленного красителя жизнеспособности. Перенесите 100 мкл клеток в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, нагревайте клетки в течение 5 мин при 65 °C и перенесите 100 мкл термоубитых клеток обратно в исходную скважину с оставшимися живыми клетками 100 мкл.
- Инкубировать клетки при 4 °C, защищенные от света, в течение 30 мин.
- Центрифугировать пластину при 845 х г в течение 2 мин при 4 °C. Декантируйте супернатант, быстро переворачивая и перебрасывая пластину на раковину, стараясь не перекрестно загрязнить скважины.
- Повторное суспендирование клеток в 200 мкл DPBS (без BSA или FBS).
- Повторите шаги 4.8 и 4.9.
- Повторите шаг 4.8.
- Повторно суспендируют клетки в 50 мкл блока Fc, разбавленном 1:50 (конечная концентрация=10 мкг/мл) в пятновом буфере (0,5% BSA в DPBS [об/об]).
- Для перитонеальных клеток – также добавляют 5 мкл блокатора моноцитов для уменьшения неспецифического окрашивания.
- Инкубировать клетки при 4 °C, защищенные от света, в течение 15 мин.
- Подготовьте полные малярные смеси и GMO в буфере пятен для конечного объема 100 мкл на 106 клеток. Список антител приведен в Таблице 1-Таблица 4 .
ПРИМЕЧАНИЕ: FMO производятся путем включения всех антител в набор пятен, кроме одного. Подготовьте FMO для каждого антитела в наборе пятен. Если набор пятен содержит несколько блестящих красителей, замените 50 мкл буфера блестящих пятен на буфер пятен на образец - Не удаляя блок Fc, добавьте 100 мкл полных пятнистых смесей и GMO в выбранные скважины.
- Подготовьте одноцветные элементы управления компенсацией для каждого антитела в наборе пятен.
- При использовании компенсационных бусин следуйте инструкциям производителя по применению.
- При использовании клеток добавляют титрованное антитело к 106 клеткам, зарезервированным ранее на этапе 4.6.1 без красителя жизнеспособности, в 100 мкл пятнового буфера. Если все клетки в образце положительны для определенного маркера, отложите незапятнанные клетки для использования при получении компенсационных данных на проточном цитометре.
- Инкубировать клетки и шарики при 4 °C, защищенные от света, в течение 30 мин.
- Центрифугировать пластину при 845 х г в течение 2 мин при 4 °C. Декантируйте супернатант, быстро переворачивая и перебрасывая пластину на раковину, стараясь не перекрестно загрязнить скважины.
- Повторное суспендирование клеток и шариков в 200 мкл буфера пятен.
- Повторите шаги 4.18 и 4.19 два раза.
- Повторите шаг 4.18.
- Для фиксации образцов для анализа в течение 48 ч повторно суспендируют клетки и шарики в 200 мкл 2% параформальдегида в DPBS.
ВНИМАНИЕ: Парафомальдегид представляет серьезную опасность для здоровья и легковоспламеняется. Перед использованием обратитесь к техническому описанию Safty. - Инкубировать клетки и шарики при 4 °C, защищенные от света, в течение 30 мин.
- Повторите шаги 4.18 и 4.19 два раза.
- Поместите фильтровальную пластину на чистую 96-луночную U-образную нижнюю пластину. Используя мультипипетку, перенесите каждый образец в колодец фильтрующей пластины.
- Центрифуга фильтрующей пластины-96 скважины U-образной нижней пластины устанавливается при 845 х г в течение 2 мин при 4 °C. Снимите фильтрующую пластину и декантируйте супернатант, быстро перевернув и щелкнув пластиной по раковине, стараясь не перекрестно загрязнить колодцы.
- Для БМ и панелей созревания селезенки повторно саспендируют полностью окрашенные клетки в 100 мкл пятнового буфера. Объедините 2 лунки для каждого животного в 1 лунку. Повторное суспендирование оставшихся панелей, GMO и элементов управления в буфере пятен объемом 200 мкл.
- Инкубировать неподвижные ячейки и шарики при 4 °C, защищенные от света, на ночь.
5. Сбор проточных цитометрических данных
- Инициализируйте и контролируйте проточный цитометр в соответствии с инструкциями производителя.
- Загрузите шаблон, специфичный для каждой панели.
- Перед записью данных убедитесь, что все события для каждого образца находятся в масштабе и видны на точечных графиках.
- Запишите элементы управления компенсацией для каждой пятновой панели с использованием компенсаций одного пятна, подготовленных на этапе 4.16. Установите положительные и отрицательные затворы для каждого образца. Пусть программное обеспечение рассчитает компенсационную матрицу.
- Начните приобретать первый образец и убедитесь, что ворота установлены соответствующим образом.
- Установите машину для записи не менее 50 000 событий В-клеток для перитонеальной панели В-ячеек и панели Igκ и Igλ селезенки; 150 000 событий В-клеток для панели созревания BM; и 300 000 событий В-клеток для панели созревания селезенки.
- Для каждой пятнистой панели запустите и запишите полностью окрашенные образцы для каждого животного, незапятнанный образец и GMO.
6. Анализ данных
- Приступайте к анализу данных с помощью программного обеспечения для анализа проточной цитометрии. Следуйте стратегиям гаширования, описанным на рисунке 1, рисунке 2, рисунке 3, рисунке 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы представляем стратегию гатинга для характеристики развития В-клеток в брюшине мыши, БМ и селезенке. Основа анализа формируется вокруг концепции окрашивания красителем жизнеспособности, затем вытеснения дублетов на основе области прямого рассеяния (FSC-A) и высоты прямого рассеяния (FSC-H) и, наконец, уничтожения мусора путем выбора клеток в соответствии с их характеристиками FSC-A и Side-Scatter-Area (SSC-A), называемыми здесь размерными затворами, которые отражают относительный размер ячейки и зернистость ячейки, перед тем, как обратить внимание на интересующее население.
Проточный цитометрический анализ перитонеальных В-клеток показывает частоты жизнеспособных перитонеальных клеток, общих В-клеток, подмножеств B-1 и B-2, а также клеток B-1a и B-1b у мышей C57BL/6J (рисунок 1), используя полосу окрашивания, описанную в таблице 1. Среднее абсолютное число ячеек этих частот приведено в таблице 5. Возмущения в клетках B-1 могут быть очерчены распределением подмножеств клеток, либо по частоте клеток, либо по абсолютному числу клеток на мышь.
Проточный цитометрический анализ BM B-клеток показывает частоты жизнеспособных BM-клеток, общих В-клеток, фракции A (пре-про-В-клетки и загрязняющие лимфоциты), пре-про-В-клеток, фракции B, фракции C, фракции C', фракции D, незрелых (подмножество во фракции E), переходных (подмножество во фракции E) и фракции F B клеток у мышей C57BL/6J (рисунок 2), используя панель окрашивания, описанную в таблице 2. Среднее абсолютное число ячеек этих частот приведено в таблице 6. Возмущения в БМ-клетках могут быть очерчены распределением подмножеств клеток, либо по частоте клеток, либо по абсолютному числу клеток на ногу (ы).
Проточный цитометрический анализ селезеночных В-клеток показывает частоту жизнеспособных клеток селезенки, общих В-клеток, переходных В-клеток, Т1, Т2, Т3-клеток, зрелых В-клеток, фолликулярных I-клеток (Fol I), фолликулярных II (Fol II) клеток-предшественников, клеток маргинальной зоны (MZ), зрелых клеток MZ и клеток B-1 у мышей C57BL/6J (Рисунок 3), используя панель окрашивания, описанную в таблице 3. Среднее абсолютное число ячеек этих частот приведено в таблице 7. Возмущения в селезеночных В-клетках могут быть очерчены распределением подмножеств клеток, либо по частоте клеток, либо по абсолютному количеству клеток на селезенку.
Аналогичным образом, проточный цитометрический анализ селезенки показывает частоты клеток Igκ+ и Igλ+ B у мышей C57BL/6J (рисунок 4) с использованием окрашивающей панели, описанной в таблице 4. Среднее абсолютное число ячеек этих частот приведено в таблице 8. Возмущения в B-клетках Igκ+ и Igλ+ могут быть очерчены распределением подмножеств клеток либо по частоте клеток, либо по абсолютному числу клеток на селезенку.
| Антитело | Флуорофор | клон |
| СД19 | БТР-Н7 | 1Д3 |
| В220 | БТР | РА3-6Б2 |
| ИгМ | Пеци7 | II/41 |
| ИгД | ПерКпСи5.5 | 11-26с.2а |
| СД43 | ФИТК | С7 |
| СД23 | БУВ395 | Б3Б4 |
| СД11б | БВ711 | М1/70 |
| СД5 | БВ605 | 53-7.3 |
Таблица 1: Перитонеальная панель В-клеток
| Антитело | Флуорофор | клон |
| СД19 | БТР-Н7 | 1Д3 |
| В220 | БТР | РА3-6Б2 |
| ИгМ | Пеци7 | II/41 |
| ИгД | ПерКпСи5.5 | 11-26с.2а |
| СД43 | ФИТК | 1Б11 |
| CD24 (HSA) | ЧП | 30-Ф1 |
| C-Kit | БУВ395 | 2Б8 |
| ВР-1 | БВ786 | ВР-1 |
| СД93 | БВ711 | АА4.1 |
| канал дампа | ||
| СД3 | АФ700 | 17-А2 |
| СД11б | АФ700 | М1/70 |
| GR1 (Ly6C/6G) | АФ700 | РБ6-8С5 |
| Тер119 | АФ700 | ТЕР-119 |
Таблица 2: Панель созревания костного мозга
| Антитело | Флуорофор | клон |
| СД19 | БТР-Н7 | 1Д3 |
| В220 | БТР | РА3-6Б2 |
| ИгМ | Пеци7 | II/41 |
| ИгД | ПерКпСи5.5 | 11-26с.2а |
| СД43 | ФИТК | С7 |
| СД23 | БУВ395 | Б3Б4 |
| СД21/35 | БВ421 | 7Г6 |
| СД11б | АФ700 | М1/70 |
| СД5 | БВ605 | 53-7.3 |
| СД93 | ЧП | АА4.1 |
Таблица 3: Панель созревания селезенки
| Антитело | Флуорофор | клон |
| СД19 | БТР-Н7 | 1Д3 |
| В220 | БТР | РА3-6Б2 |
| ИгМ | Пеци7 | II/41 |
| ИгД | ПерКпСи5.5 | 11-26с.2а |
| СД3 | ПБ | 17-А2 |
| Каппа | ФИТК | 187.1 |
| Лямбда | ЧП | РМЛ-42 |
Таблица 4: Селезенка Igκ и панель Igλ
Рисунок 1: Характеристика популяций В-клеток в брюшине. Жизнеспособные, одноклеточные, размером закрытые перитонеальные В-клетки сначала отделяются от загрязняющих клеток путем наведения на клетки IgM+. Клетки B-1 и B-2 затем отличаются друг от друга отсутствием (B-1) или присутствием CD23 (B-2). Следующая экспрессия CD5 используется для очерчивания клеток B-1a (CD5+) от B-1b клеток (CD5-). МФО использовались для эмпирического определения того, где рисовать ворота. Цифры представляют собой проценты от каждой популяции в пределах одного и того же участка плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характеристика подмножеств В-клеток в БМ. Жизнеспособные, одноэлементные, закрытые по размеру BM В-клетки отделяются от не-В-клеток путем наложения на B220+ дамп- (где дамп относится к CD3 / GR-1 / CD11b / TER119) ячейки. Выражение CD43 и B220 дополнительно определяет харди-фракцию A-C' (CD43+ B220+) и харди-фракцию D-F (CD43low/neg B220+/++). Фракция A-C' дополнительно разделяется экспрессией BP-1 и CD24. Фракция А (BP-1-CD24-) соответствует пре-про-В клеткам вместе с загрязняющими клетками. Для отделения препро-В-клеток от загрязняющих клеток фракции А используется экспрессия CD93 и отсутствие CD19. Фракция B (BP-1-CD24int) и фракция C (BP-1+ CD24int) соответствуют ранним и поздним про-В-клеткам соответственно, а фракция C' (BP-1+/- CD24+) соответствует ранним пре-В-клеткам. Для разделения фракции D-F используются выражения IgM и IgD. Фракция D соответствует поздним пре-В-клеткам (IgM-/низкий IgD-); Фракция E (синий затвор, IgMint/высокий IgD-) как к незрелым (Imm, IgMint IgD-), так и к переходным (Tran, IgMhigh IgD-) В-клеткам; и фракция F (IgMint/высокий IgD+) для рециркуляции зрелых В-клеток. МФО использовались для эмпирического определения того, где рисовать ворота. Цифры представляют собой проценты от каждой популяции в пределах одного и того же участка плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика созревания селезеночных В-клеток. Жизнеспособные, одноклеточные, размером с закрытые селезеночные В-клетки отделяются от не-В-клеток путем нанесения на клетки B220+. Чтобы идентифицировать подмножество B-1, клетки CD23-CD19+ идентифицируются и определяются экспрессией CD43. Чтобы классифицировать популяции B-2, клетки CD19+ разделяют на переходные (CD93 + B220 +) и зрелые (CD93-B220 +) В-клетки. Переходные (CD93+ B220+) клетки далее делятся на популяции Т1 (IgM+ CD23-), Т2 (IgM+ CD23+) и Т3 (IgMint CD23+). Зрелые (CD93-B220+) клетки разделяются на маргинальные зонные (CD21/35+ IgM+) и фолликулярные (CD21/35int IgMint/+) В-клетки. Экспрессия CD23 дополнительно используется для отделения клеток-предшественников MZ (CD23 + B220 +) от более зрелых клеток MZ (CD23- B220 +). Фолликулярные популяции затем разграничиваются на клетки Fol I (IgD + IgMint) и Fol II (IgD + IgM +). МФО использовались для эмпирического определения того, где рисовать ворота. Цифры - это проценты каждой популяции в пределах одного и того же участка плотности Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Экспрессия Igκ и Igλ селезеночных В-клеток. Жизнеспособные, одноклеточные, размером закрытые селезеночные В-клетки отделяются от не-В-клеток путем наведения на B220+ CD3-клетки. Затем В-клетки различают по экспрессии Igλ и Igκ. Цифры представляют собой проценты от каждой популяции в пределах одного и того же участка плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Абсолютное число ячейки | |||||
| Номер животного | Жизнеспособные перитонеальные клетки | В-клетки | Ячейки B-1a | Ячейки B-1b | Ячейки B-2 |
| 1 | 1.02Е+07 | 4.67Е+06 | 1.28Е+06 | 8.95E+05 | 2.35E+06 |
| 2 | 9.92Е+06 | 4.52Е+06 | 1.49Е+06 | 9.60Е+05 | 1.91Е+06 |
| 3 | 1.15E+07 | 4.56Е+06 | 1.71Е+06 | 9.19Е+05 | 1.78Е+06 |
| Средний | 1.05Е+07 | 4.58Е+06 | 1.49Е+06 | 9.25E+05 | 2.01Е+06 |
Таблица 5: Абсолютное число клеток перитонеальных подмножеств В-клеток
| Абсолютное число ячейки | |||||||||||
| Номер животного | Жизнеспособные клетки костного мозга | В-клетки | Фракция А | Пре-про | Фракция В | Фракция С | Фракция С' | Фракция D | Незрелый | Переходный | Фракция F |
| 1 | 5.05Е+07 | 9.70Е+06 | 1.13Е+06 | 1.95E+05 | 2.22Е+05 | 9.14Е+04 | 6.31Е+05 | 1.59E+06 | 4.56Е+05 | 7.81Е+05 | 4.03Е+06 |
| 2 | 5.39E+07 | 1.03Е+07 | 1.14E+06 | 2.29Е+05 | 2.89Е+05 | 1.22E+05 | 8.40Е+05 | 2.11Е+06 | 5.39Е+05 | 8.07Е+05 | 3.67Е+06 |
| 3 | 5.93E+07 | 1,01Е+07 | 1.10Е+06 | 2.12Е+05 | 2.84Е+05 | 1.05Е+05 | 9.02Е+05 | 2.72Е+06 | 5.94E+05 | 7.62Е+05 | 2.59Е+06 |
| Средний | 5.46Е+07 | 1.00Е+07 | 1.12Е+06 | 2.12Е+05 | 2.65E+05 | 1.06Е+05 | 7.91Е+05 | 2.14Е+06 | 5.29E+05 | 7.83E+05 | 3.43Е+06 |
Таблица 6: Абсолютное число клеток подмножеств В-клеток костного мозга
| Абсолютное число ячейки | ||||||||||||
| Номер животного | Жизнеспособные клетки селезенки | В-клетки | Переходные В-клетки | Т1 ячейки | Т2 ячейки | Т3 ячейки | Зрелые В-клетки | Фолликулярные I клетки | Фолликулярные II клетки | Клетки маргинальной зоны-предшественника | Зрелые клетки маргинальной зоны | Ячейки B-1 |
| 1 | 9.16Е+07 | 4.61Е+07 | 3.66Е+06 | 1.55E+06 | 1.10Е+06 | 7.16Е+05 | 4.06Е+07 | 2.39Е+07 | 5.27Е+06 | 2.17Е+06 | 3.98Е+06 | 8.83E+05 |
| 2 | 9.97E+07 | 5.18Е+07 | 4.88Е+06 | 1.97Е+06 | 1.57E+06 | 1.00Е+06 | 4.49Е+07 | 2.68Е+07 | 7.33Е+06 | 3.42Е+06 | 3.84Е+06 | 8.15Е+05 |
| 3 | 1.02Е+08 | 5.34Е+07 | 4.64Е+06 | 1.98Е+06 | 1.41Е+06 | 8.54E+05 | 4.62Е+07 | 2.81Е+07 | 5.84Е+06 | 3.58Е+06 | 4.02Е+06 | 1.01Е+06 |
| Средний | 9.77E+07 | 5.04Е+07 | 4.39Е+06 | 1.83Е+06 | 1.36E+06 | 8.58Е+05 | 4.39Е+07 | 2.63Е+07 | 6.15Е+06 | 3.06Е+06 | 3.94E+06 | 9.02Е+05 |
Таблица 7: Абсолютное число ячеек подмножеств Селезеночных В-клеток
| Абсолютное число ячейки | ||||
| Номер животного | Жизнеспособные клетки селезенки | В-клетки | Igκ+ В-клетки | Igλ+ В-клетки |
| 1 | 9.16Е+07 | 4.97Е+07 | 4.51Е+07 | 2.46Е+06 |
| 2 | 9.97E+07 | 5.63Е+07 | 5.08Е+07 | 3.16Е+06 |
| 3 | 1.02Е+08 | 5.91Е+07 | 5.33Е+07 | 3.24Е+06 |
| Средний | 9.77E+07 | 5.50Е+07 | 4.97Е+07 | 2.95Е+06 |
Таблица 8: Абсолютные числа ячеек подмножеств Igκ и Igλ B
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Проточный цитометрический анализ лимфоидных и нелимфоидных тканей позволил одновременно идентифицировать и перечислить субпопуляции В-клеток у мышей и людей с 1980-х годов. Он был использован в качестве меры гуморального иммунитета и может быть применен в дальнейшем для оценки функциональности В-клеток. Этот метод использует наличие реагентов для оценки различных стадий созревания В-клеток у мышей и людей путем одновременного анализа нескольких параметров, позволяющих оценить гетерогенность В-клеток даже в редких популяциях. При использовании для измерения сложных гетерогенных образцов он может обнаруживать субпопуляции в течение нескольких минут на отдельных клетках33. Стратегия последовательного анализа, чаще всего применяемая к проточному цитометрическому анализу, может быть простой и интуитивно понятной, когда необходимо идентифицировать конкретную популяцию34. Наконец, еще одним преимуществом проточной цитометрии является то, что она легко адаптируется в большинстве академических лабораторий, находясь под руководством опытных пользователей. Наш протокол успешно описывает оценку популяций В-клеток в брюшине, БМ и селезенке мышей, описывая и перечисляя популяции B-1 и углубляясь в развитие про-В-клеток В-2, пре-В-клеток, незрелых, переходных и зрелых В-клеток, а также их поверхностную экспрессию легких цепей Igκ или Igλ. Проточная цитометрия является наиболее широко используемым и простым методом для применения при исследовании развития В-клеток у мышей.
В то время как проточная цитометрия генерирует бесценные данные, существуют некоторые ограничения для этой технологии при использовании для исследования гетерогенности иммунного В-клеточного компартмента. Огромные наборы данных могут быть ошеломляющими, потому что окрашивание 10 цветов позволяет распознавать более 1024 различных популяций клеток34. Следует учитывать, что некоторые широко используемые маркеры лимфоидных клеток оказались менее специфичными, чем первоначально предполагалось. Это может быть решено путем использования множества маркеров клеточной поверхности для определения наведения на желаемые популяции. В то время как проточный цитометрический анализ может быть простым и интуитивно понятным, еще одним ограничением для проточного цитометрического анализа является то, что он обычно позволяет визуализировать только два параметра одновременно, хотя инструменты визуализации данных, такие как t-SNE, могут использоваться для более эффективного кластеризации популяций клеток при использовании высокопараметрической проточной цитометрии. Другим важным ограничением является то, что затворы, используемые как во время сбора, так и при анализе, иногда зависят от субъективности оператора.
Для успешной адаптации или репликации этого протокола существует несколько критических параметров, которые необходимо учитывать35. Необходимо тщательно учитывать дизайн панелей и выбор фторхрома. Крайне важно сочетать тусклые или важные антигены с яркими фторхромами. Титрование антител должно проводиться, чтобы избежать избыточного связывания антител с клетками неспецифическими, потенциально увеличивающим фоновое окрашивание и уменьшающим разрешение. Титрование антител проводят путем окрашивания известного количества клеток с уменьшающимися концентрациями антител, для определения наилучшего индекса разделения36. Это должно быть повторено для каждой партии антител. Во время подготовки образцов и окрашивания важно обеспечить одноклеточную суспензию, избегая Ca++ и Mg++. Кроме того, добавление ЭДТА может помочь предотвратить агрегацию клеток и ферментативную активность, что может привести к стимуляции, опосредованной антителами, и интернализации меченых маркеров. Перед сбором данных образцы должны быть надлежащим образом приостановлены, отфильтрованы и свободны от агрегатов. Перетекание сигнала от одного параметра к другому разрешается с помощью компенсационных элементов управления, в виде одиночных окрашенных ячеек или коммерчески доступных компенсационных шариков35. Другим важным соображением является наличие надлежащего контроля в каждом эксперименте. Неокрашенные клетки устанавливают базовую линию автофлуоресценции. Элементы управления изотипами больше не считаются подходящими элементами управления для затвора из-за неспецифического связывания. Наиболее важным шагом в создании точных ворот является использование элементов управления FMO. В контроле FMO все конъюгированные антитела присутствуют в пятне, за исключением того, которое контролируется. Элементы управления FMO позволяют измерять распространение всех флуорофоров в отсутствующий канал и, следовательно, позволяют соответствующим образом устанавливать затворы. Очень важно, чтобы было получено достаточное количество клеток для дополнительной точности. Как правило, должно быть собрано не менее 2000 событий интересующего населения. Наконец, контроль компенсации, будь то шарики или клетки, должен точно соответствовать используемым фторхромам, а контроль должен быть по крайней мере таким же ярким, как и экспериментальные образцы37.
В целом, низкоцитометрический анализ компартментов В-клеток широко используется в области иммунологии. Этот метод может быть использован для исследования возмущений гуморального иммунитета как у диких, так и у генетически модифицированных мышей, при небольничных состояниях и при иммунологическом вызове.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками и акционерами Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
Мы благодарим Мэтью Слимана за критическое прочтение рукописи. Мы также благодарим отделы операций вивария и проточной цитометрии в Regeneron за поддержку этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).
