Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Flow cytometrisk karakterisering af Murine B Cell Development

Published: January 22, 2021 doi: 10.3791/61565
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Regeneron Tech Centers, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 2Regeneron Therapeutic Proteins, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 3Immunology and Inflammation, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver heri en simpel analyse af heterogeniteten af murin immun B celle rum i bughinden, milt, og knoglemarvsvæv ved flow cytometri. Protokollen kan tilpasses og udvides til andre musevæv.

Abstract

Omfattende undersøgelser har karakteriseret udviklingen og differentiering af murin B-celler i sekundære lymfoide organer. Antistoffer udskilles af B-celler er blevet isoleret og udviklet til veletablerede terapier. Validering af murin B-celleudvikling i forbindelse med autoimmune mus eller hos mus med modificeret immunforsvar er en afgørende komponent i udvikling eller test af terapeutiske midler hos mus og er en passende anvendelse af flowcytometri. Veletablerede B celle flow cytometri parametre kan bruges til at evaluere B celle udvikling i murin peritoneum, knoglemarv, og milt, men en række bedste praksis skal overholdes. Derudover bør flowcytometrisk analyse af B-cellerum også supplere yderligere udlæsninger af B-celleudvikling. Data genereret ved hjælp af denne teknik kan fremme vores forståelse af vilde type, autoimmune tilbøjelige musemodeller samt humaniserede mus, der kan bruges til at generere antistof eller antistoflignende molekyler som terapi.

Introduction

Monoklonale antistoffer er i stigende grad blevet den foretrukne terapi for mange menneskelige sygdomme, som de bliver en del af mainstream medicin1,2. Vi har tidligere beskrevet genetisk manipulerede mus, som effektivt producerer antistoffer, der huser fuldt menneskelige variable regioner med mus IgH konstanter3,4. Senest har vi beskrevet genetisk manipulerede mus, der producerer antistoflignende molekyler, der har forskellige antigenbindinger5. Antistoffer udskilles af B-celler og danner grundlaget for adaptiv humoral immunitet. Der er to forskellige typer B-celler, B-1 og B-2. Hos pattedyr stammer B-1-celler i fosterlever og beriges i slimhindevæv og pleural- og bughulen efter fødslen, mens B-2-celler stammer fra fosterlever før fødslen og derefter i knoglemarven (BM). B-2 celler er beriget i sekundære lymfoid organer, herunder milten og blod6,7,8. I BM, B-2 hæmatoopoietic forfædre begynder at differentiere sig til pro-B celler ved indledningen af Ig mu tunge kæde omlægning9,10. Vellykket omlægning af Ig tung kæde og dens samling i præ-B celle receptor (pre-BCR), sammen med signalering og proliferative ekspansion, fører til differentiering til præ-B celler. Efter pre-B celler omarrangere deres Ig kappa (Igκ), eller hvis uproduktive, Ig lambda (Igλ) lyskæder, de par med μ tung kæde, hvilket resulterer i overflade IgM BCR udtryk. Det er vigtigt at påpege, at IgM overflade udtryk er kendt for at være reduceret under betingelser for autoreaktivitet, hvilket bidrager til selvtolerance i funktionelt ikke reagerer eller anergiske B-celler11,12. Umodne B-celler går derefter ind i en overgangsfase, hvor de begynder at co-udtrykke IgD og migrere fra BM til milten. I milten øges IgD-udtrykket yderligere, og cellerne modnes til en anden fase af overgangs B-celler, efterfulgt af færdiggørelse af deres modningsstatus og udvikling til enten marginalzone (MZ) eller follikulære (Fol) celler13,14,15. Hos voksne mus, i en ikke-syge indstilling, forbliver antallet af modne B-celler konstant på trods af at 10-20 millioner umodne B-celler genereres dagligt i BM. Af disse kommer kun tre procent ind i puljen af modne B-celler. Størrelsen af det perifere B-cellerum er begrænset af celledød, til dels på grund af flere faktorer, herunder selvreaktivitet og ufuldstændig modning16,17,18. Flow cytometrisk analyse er blevet flittigt brugt til at karakterisere og opregne mange immuncelleunderrum hos mennesker og mus. Mens der er nogle ligheder mellem menneskelige og murin B celle rum, denne protokol gælder kun for analyse af murin B-celler. Denne protokol blev udviklet med det formål at phenotyping genetisk manipulerede mus, at afgøre, om genmanipulation ville ændre B celle udvikling. Flow cytometri har også været enormt populær i mange ekstra applikationer, herunder i måling af celleaktivering, funktion, spredning, cyklusanalyse, DNA-indholdsanalyse, apoptose og cellesortering 19,20.

Flowcytometri er det foretrukne værktøj til at karakterisere forskellige lymfocytrum hos mus og mennesker, herunder i komplekse organer som milten, BM og blod. På grund af bredt tilgængelige musespecifikke antistofreagenser til flowcytometri kan denne teknik bruges til at undersøge ikke kun celleoverfladeproteiner, men også intracellulære fosfoproteiner og cytokiner samt funktionelle udlæsninger21. Heri demonstrerer vi, hvordan flowcytometri reagenser kan bruges til at identificere B-celler subsets som de modnes og differentiere i sekundære lymfoide organer. Efter optimering af farvningsforhold kan prøvehåndtering, korrekt instrumentopsætning og dataindsamling og endelig dataanalyse anvendes en protokol til omfattende flowcytometrisk analyse af B-cellerummet i mus. En sådan omfattende analyse er baseret på en årtier gammel nomenklatur udtænkt af Hardy og kolleger, hvor udvikling af BM B-2 celler kan opdeles i forskellige fraktioner (Fraction) afhængigt af deres udtryk for B220, CD43, BP-1, CD24, IgM og IgD22. Hardy et al., viste, at B220+ CD43 BM B-celler kan opdeles i fire undersæt (B-C') på basis af BP-1- og CD24 (30F1) udtryk, mens B220+ CD43-(dim to neg) BM B-celler kan oversættes til tre delsæt (Brøk D-F) baseret på differentialudtryk af IgD og overflade IgM23. Brøk A (præ-pro-B-celler) defineres som BP-1- CD24 (30F1)-, Brøk B (tidlige pro-B-celler) defineres som BP-1- CD24 (30F1)+, Brøk C (sene pro-B-celler) defineres som BP-1+ CD24 (30F1)+, og Brøk C' (tidlige før-B-celler) defineres som BP-1+ og CD24high. Desuden defineres B220+ CD43- IgM- B-celler, og Brøk E (nygenererede B-celler, kombination af umodne og midlertidige) defineres som B220+ CD43- IgM+ B-celler, og Brøk F (modne, recirkulerende B-celler) defineres som B220high CD43- IgM+ B-celler. I modsætning hertil kan de fleste naive B-celler, der findes i milten, opdeles i modne (B220+ CD93-) B-celler og overgangsceller (T1, T2, T3) afhængigt af udtryk for CD93, CD23 og IgM. Modne B-celler kan løses i marginalzone og follikulære undersæt baseret på udtryk af IgM og CD21/CD35, og follikulære undersæt kan yderligere opdeles i modne follikulær type I og follikulær type II B celleundersæt afhængigt af niveauet af deres IgM og IgD overfladeudtryk24. Disse milnic B cellepopulationer udtrykker overvejende Igκ lyskæde. Endelig er B-1 B-cellepopulationer, der stammer fra fosterlever og hovedsageligt findes i de peritoneale og pleuralhulrum hos voksne mus, blevet beskrevet i litteraturen. Disse peritoneale B-celler kan skelnes fra de tidligere beskrevne B-2 B-celler ved deres mangel på CD23-udtryk. De er derefter yderligere opdelt i B-1a eller B-1b populationer, med førstnævnte defineret af tilstedeværelsen af CD5 og sidstnævnte ved dens fravær25. B-1 celle forfædre er rigelige i fosterlever, men findes ikke i voksen BM. Mens B-1a og B-1b celler stammer fra forskellige forfædre, de begge frø bugnende og pleural hulrum24. I modsætning til B-2-celler er B-1-celler unikt i stand til selvfornyelse og er ansvarlige for produktion af naturlige IgM antistoffer.

Defekter i B-celleudvikling kan opstå i mange tilfælde, herunder mangler i komponenterne i BCR26,27, forstyrrelser af signalmolekyler, der påvirker BCR signaleringsstyrke14,28,29, eller forstyrrelse af cytokiner, der modulerer B-celleoverlevelse30,31 . Flow cytometri analyse af lymfoid rum har bidraget til karakterisering af B celle udvikling blokke i disse mus og mange andre. En fordel ved flowcytometrisk analyse af lymfoidrum er, at det giver mulighed for at foretage målinger på individuelle celler, der er fremstillet af levende dissocieret væv. Tilgængeligheden af reagenser i et stadigt voksende udvalg af fluorophorer giver mulighed for samtidig analyse af flere parametre og muliggør vurdering af B-celle heterogenitet. Desuden, optælling af B-celler ved flow cytometri analyse supplerer andre immunologiske assays såsom immunohistochemistry metoder, der visualiserer celle lokalisering i lymfoid organer, påvisning af cirkulerende antistofniveauer som et mål for humoral immunitet, samt to foton mikroskopi til at måle B celle svar i realtid og tid32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle museundersøgelser blev overvåget og godkendt af Regenerons Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Eksperimentet blev udført på væv fra tre C57BL/6J hunmus (17 uger) fra Jackson Laboratories. Titrere alle antistoffer før starten af eksperimentet for at bestemme ideel koncentration. Når du bruger kompensation perler til en-farve kompensation, sikre, at de plette så lyse eller lysere end dine prøver. Opbevar alle buffere, antistoffer og celler på is eller ved 4 °C. Efter tilsætning af levedygtighed farvestof, udføre alle trin og inkubationer ved 4 ° C i enten svagt lys eller i mørke.

1. Peritoneal celle høst og enkelt celle isolation

  1. Aflive musen ved hjælp af CO2 eller i henhold til godkendt protokol.
  2. Læg musen på ryggen, spray med 70% ethanol, og skær ydre abdominal hud med en saks, pas på ikke at skære bughinden.
  3. 3 mL iskold vaskebuffer (0,5 % bSA (kvægserum) i DPBS [vol/vol]) ind i bughulen med en 3 mL-sprøjte udstyret med en 25-gauge nål.
  4. Massér forsigtigt bughinden med fingerspidserne.
  5. Gentag trin 1.3 og 1.4.
  6. Sæt en 3 mL sprøjte udstyret med en 18 G nål gennem bughinden, idet du er omhyggelig med at undgå organer og fedt.
  7. Udtræk vaskebufferen, der nu indeholder bugnende celler, og overfør til 15 ML konisk rør på is.
  8. Gentag trin 1.3 og 1.4.
  9. Skær et lille hul i bughinden, mens du holder op med pincet.
  10. Indsæt en engangsoverførselspipette i hullet og saml den resterende vaskebuffer, så du igen undgår fedt og organer.
  11. Overfør de opsamlede resterende peritoneale celler til det 15 mL koniske rør på is.
    BEMÆRK: Kassér prøven, hvis der er 500.000.
  12. Inkuber cellerne på is, indtil milten og knogleudvindingen er færdig.
  13. Centrifugere cellerne ved 300 x g i 8 min ved 4 °C. Aspirere supernatanten.
  14. Brug cellepillen igen i 1 mL vaskebuffer.
  15. Filtrer cellerne gennem en 70 μM cellesnive i et rent 15 mL konisk rør på is.
  16. Bestem cellekoncentrationen ved hjælp af et celletællerinstrument eller hæmocytometer.

2. Milthøst og isolation med enkeltceller

  1. Læg musen på maven og skær gennem bughinden på venstre bagside ved hjælp af ren saks. Skær milten ud, fjern fedt og bindevæv.
  2. Milten overføres til et 1,5 mL mikrocentrifugerør, der indeholder 1 mL vaskebuffer på is.
  3. Inkuber milten på isen, indtil knogleudvindingen er færdig.
  4. Flyt milten til automatisk dissociation rør med 5 mL af røde blodlegemer lysis buffer. Placer røret på vævssekoblingsinstrumentet og afsykkes i 60'erne for at skabe en enkelt celleaffjedring.
    BEMÆRK: Det er også tilladt at bruge andre rutinemæssige metoder til at opnå enkeltcellede miltaffjedring, såsom at smadre mellem matterede glasrutschebaner i vaskebuffer. Hvis der anvendes en anden metode til dissociation, skal du følge dissociationen med centrifugering, aspiration og derefter resuspension i 5 mL rød blodlegemer lysis buffer, før du fortsætter til trin 2.5.
  5. Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 3 min.
  6. Der tilsættes 10 mL 4 °C vaskebuffer, der indeholder 2 m EDTA.
  7. Overfør til et rent 15 mL konisk rør.
  8. Centrifugere cellerne ved 300 x g i 8 min ved 4 °C. Aspirere supernatanten.
  9. Brug cellepillen igen i 5 mL af 4 °C vaskebuffer.
  10. Filtrer cellerne gennem en 70 μM cellesnive i et rent 15 mL konisk rør på is.
  11. Bestem cellekoncentrationen ved hjælp af et celletællerinstrument eller hæmocytometer.

3. BM høst og enkelt celle isolation

  1. Fjern huden fra den nederste halvdel af musens krop. Trim den overskydende muskel fra benet. Fjern hele benet med en saks, pas på ikke at skære lårbenet. Rengør lårbenet og skinnebenet ved at fjerne resterende muskler, fedt og fødder.
  2. Knoglerne overføres til et 1,5 mL mikrocentrifugerør, der indeholder 1 mL vaskebuffer på is.
  3. Perforere bunden af en 0,5 mL mikrocentrifuge rør, efterlader et hul lille nok til ben knogler ikke at stikke ud. 0,5 mL-røret sættes i et rent 1,5 mL mikrocentrifugerør. Klip enden af lårbenet og skinnebenet proksimale til knæet og læg de afskårne ender nedad i 0,5 mL-røret.
  4. Centrifugere cellerne ved 6.780 x g i 2 min ved 4 °C.
  5. Brug cellepillen igen i 1 mL af lysisbufferen med røde blodlegemer og overføres til et 15 mL konisk rør, der indeholder yderligere 3 mL lysisbuffer.
  6. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min.
  7. Der tilsættes 10 mL 4 °C vaskebuffer, der indeholder 2 m EDTA.
  8. Centrifugere cellerne ved 300 x g i 8 min ved 4 °C. Aspirere supernatanten.
  9. Brug cellepillen igen i 3 mL af 4 °C vaskebuffer.
  10. Filtrer celler gennem en 70 μM cellesnive ind i et rent 15 mL konisk rør på is.
  11. Bestem cellekoncentrationen ved hjælp af et celletællerinstrument eller hæmocytometer.

4. Plet celler og forberede kompensation

  1. Aliquot 106 celler af hver celletype fra hvert dyr til en 96 godt U bundplade.
    1. Sørg for at inkludere nok brønde til alle prøver og kontroller, herunder fuld plet, fluorescens-minus-en (FMO), unstained, og endelig den valgfri enkelt-farve kompensation for hver fluorophore anvendes.
    2. For BM modning panel og milt modning panel, aliquot celler i 2 brønde, 106 celler pr godt, for hver fuld plet prøve. For enkeltfarvekompensations levedygtighedskontrollerne skal du føje 2 x 106 celler af hver celletype til individuelle brønde.
  2. Centrifuge pladen ved 845 x g i 2 min ved 4 °C. Dekanter supernatanten ved hurtigt at vende og svirpe pladen over en vask, idet man passer på ikke at krydsforurene brønde.
  3. Brug cellerne igen i 200 μL DPBS (uden BSA eller FBS). Dette trin er vigtigt at fjerne protein før farvning med amine-reaktiv levedygtighed farvestof.
  4. Gentag trin 4.2 og 4.3.
  5. Gentag trin 4.2.
  6. Brug cellerne igen i 100 μL levedygtighedsfarvestof fortyndet 1:1.000 i DPBS.
    BEMÆRK: Hvis du bruger celler til enkeltfarvekompensation, må du ikke tilføje levedygtighedsfarve til disse brønde.
    1. For hver plet sæt, lad flere ufarvede brønde for en helt unstained prøve og andre kontroller, du måtte have brug for.
    2. For hver plet sæt, efterlade en ekstra ufarvet godt for levedygtighed FMO kontrol.
    3. For enkelt-farve levedygtighed kompensation kontrol: Resuspend de 2 x 106 celler, aliquoted i trin 4.1, i 200 μL af fortyndet levedygtighed farvestof. Overfør 100 μL celler til et 1,5 mL mikrocentrifugerør, varmeceller i 5 min ved 65 °C, og overfør de 100 μL varmedr./min.
  7. Inkuber celler ved 4 °C, beskyttet mod lys, i 30 min.
  8. Centrifuge pladen ved 845 x g i 2 min ved 4 °C. Dekanter supernatanten ved hurtigt at vende og svirpe pladen over en vask, idet man passer på ikke at krydsforurene brønde.
  9. Brug cellerne igen i 200 μL DPBS (uden BSA eller FBS).
  10. Gentag trin 4.8 og 4.9.
  11. Gentag trin 4.8.
  12. Brug cellerne igen i 50 μL af Fc-blokken fortyndet 1:50 (endelig koncentration=10 μg/mL) i pletbuffer (0,5% BSA i DPBS [vol/vol]).
    1. For peritoneale celler - tilsæt også 5 μL monocyt blocker for at reducere ikke-specifik farvning.
  13. Inkuberes cellerne ved 4 °C, beskyttet mod lys, i 15 min.
  14. Forbered fuld plet master blander og FMOs i plet buffer for et sidste volumen på 100 μl pr 106 celler. Der henvises til tabel 1-tabel 4 for antistoflisterne.
    BEMÆRK: FMO'er foretages ved at inkludere alle antistoffer i et pletsæt undtagen ét. Forbered en FMO for hvert antistof i et pletsæt. Når et pletsæt indeholder flere strålende farvestoffer, erstatte 50 μL strålende plet buffer for plet buffer per prøve
  15. Uden at fjerne Fc blok, tilføje 100 μL af fuld plet blandinger og FMOs til udvalgte brønde.
  16. Forbered enkelt-farve kompensation kontrol for hvert antistof i en plet sæt.
    1. Hvis du bruger kompensation perler følge producentens anvisninger til brug.
    2. Hvis du bruger celler, tilsættes titreret antistof til 106 celler, der tidligere var reserveret i trin 4.6.1 uden levedygtighedsfarve, i 100 μL-pletbuffer. Hvis alle celler i prøven er positive for en bestemt markør, skal der udtages ikke-farvede celler, der skal anvendes ved anskaffelse af kompensationsdata på flowcytometeret.
  17. Inkuberes cellerne og perlerne ved 4 °C, beskyttet mod lys, i 30 min.
  18. Centrifuge pladen ved 845 x g i 2 min ved 4 °C. Dekanter supernatanten ved hurtigt at vende og svirpe pladen over en vask, idet man passer på ikke at krydsforurene brønde.
  19. Resuspend celler og perler i 200 μL af plet buffer.
  20. Gentag trin 4.18 og 4.19 to gange.
  21. Gentag trin 4.18.
  22. For at fiksere prøverne til analyse inden for 48 timer skal celler og perler genbruges i 200 μL på 2% paraformaldehyd i DPBS.
    FORSIGTIG: Parafomaldehyd er en alvorlig sundhedsfare og brandfarlig. Se Safty-databladet før brug.
  23. Inkuberes cellerne og perlerne ved 4 °C, beskyttet mod lys, i 30 min.
  24. Gentag trin 4.18 og 4.19 to gange.
  25. Placer en filterplade over en ren 96 godt U-bundplade. Ved hjælp af en multi-pipette overføres hver prøve til en brønd af filterpladen.
  26. Centrifuge filterpladen-96 godt U-bundplade setup ved 845 x g i 2 min ved 4 °C. Fjern filterpladen og dekanter supernatanten ved hurtigt at vende og svirpe pladen over en vask, idet du passer på ikke at krydsforurene brønde.
  27. For BM og milt modning paneler genbruge de fuldt farvede celler i 100 μL af plet buffer. Kombiner de 2 brønde for hvert dyr i 1 brønd. Brug de resterende paneler, FMO'er og styringer igen i 200 μL pletbuffer.
  28. Inkuber faste celler og perler ved 4 °C, beskyttet mod lys, natten over.

5. Flow cytometrisk dataindsamling

  1. Initialiser og QC flowcyometeret i henhold til producentens anvisninger.
  2. Indlæs skabelonen, der er specifik for hvert panel.
  3. Før du optager data, skal du sikre dig, at alle hændelser for hver prøve er i stor skala og synlige på prikplotterne.
  4. Registrer kompensationskontrol for hvert pletpanel ved hjælp af enkeltpletkompensationer, der er udarbejdet i trin 4.16. Indstil positive og negative porte for hver prøve. Få softwaren til at beregne kompensationsmatrixen.
  5. Begynd at anskaffe den første prøve, og sørg for, at portene er indstillet korrekt.
  6. Indstil maskinen til at registrere mindst 50.000 B-cellehændelser for cellepanelet for peritoneal B og milt Igκ- og Igλ-panelet. 150.000 B-cellehændelser til BM-modningspanelet og 300.000 B-cellehændelser for miltmodningspanelet.
  7. For hvert pletpanel skal du køre og optage de fuldt farvede prøver for hvert dyr, en uplettet prøve og FMOs.

6. Analyser data

  1. Fortsæt med dataanalyse ved hjælp af flowcytometrianalysesoftware. Følg gating strategier skitseret i figur 1, figur 2, figur 3, Figur 4. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her præsenterer vi gating strategi for at karakterisere B celle udvikling i mus bughinden, BM og milt. Grundlaget for analysen er dannet omkring begrebet farvning med levedygtighed farvestof, derefter gating ud doublets baseret på Forward-Scatter-Area (FSC-A) og Forward-Scatter-Height (FSC-H), og endelig gating ud vragrester ved at vælge celler i henhold til deres FSC-A og Side-Scatter-Area (SSC-A) egenskaber, der her omtales som størrelsen gate, som afspejler relativ cellestørrelse og celle granularitet, før gating på befolkningen af interesse.

Flowcytometrisk analyse af peritoneale B-celler viser frekvenserne af levedygtige peritoneale celler, samlede B-celler, B-1 og B-2 delmængder samt B-1a- og B-1b-celler i C57BL/6J-mus (figur 1) ved hjælp af et farvningspanel, der er beskrevet i tabel 1. Det gennemsnitlige absolutte celletal for disse frekvenser vises i tabel 5. Forstyrrelser i B-1-celler kan afgrænses ved fordeling af celleundersæt, enten efter cellefrekvens eller absolutte celletal pr. mus.

Flowcytometrisk analyse af BM B-celler viser hyppigheden af levedygtige BM-celler, samlede B-celler, Brøk A (præ-pro-B-celler og kontaminerende lymfocytter), præ-pro-B-celler, Brøk B, Brøk C, Brøk C', Brøk D, umoden (delmængde i fraktion E), overgangs (delmængde i Brøk E) og Brøk F B-celler i C57BL/6J mus (figur 2) ved hjælp af et farvningspanel, der er skitseret i tabel 2. Det gennemsnitlige absolutte celletal for disse frekvenser vises i tabel 6. Forstyrrelser i BM B-celler kan afgrænses ved fordeling af celleundersæt, enten ved cellefrekvens eller absolutte celletal pr. ben(er).

Flow cytometrisk analyse af milt B-celler viser hyppigheden af levedygtige miltceller, samlede B-celler, overgangs B-celler, T1, T2, T3-celler, modne B-celler, follikulære I-celler (Fol I), follikulære II-celler (Fol II), marginalzoneceller (MZ) prækursorerceller, modne MZ-celler og B-1-celler i C57BL/6J-mus (figur 3) ved hjælp af et farvningspanel, der er skitseret i tabel 3. Det gennemsnitlige absolutte celletal for disse frekvenser vises i tabel 7. Forstyrrelser i milt B-celler kan afgrænses ved fordeling af celleundersæt, enten efter cellefrekvens eller absolutte celletal pr. milt.

Tilsvarende viser flowcytometrisk analyse af milten frekvenserne af Igκ+ og Igλ+ B-celler i C57BL/6J mus (figur 4) ved hjælp af et farvningspanel, der er skitseret i tabel 4. Det gennemsnitlige absolutte celletal for disse frekvenser vises i tabel 8. Forstyrrelser i Igκ+ og Igλ+ Bcells kan afgrænses ved fordeling af celleundersæt, enten efter cellefrekvens eller absolutte celletal pr. milt.

Antistof Fluorophore klon
CD19 APC-H7 1D3
B220 APC RA3-6B2
Igm PeCy7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD43 FITC S7
CD23 BUV395 B3B4
CD11b BV711 M1/70
CD5 BV605 53-7.3

Tabel 1: Peritoneal B-cellepanel

Antistof Fluorophore klon
CD19 APC-H7 1D3
B220 APC RA3-6B2
Igm PeCy7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD43 FITC 1B11
CD24 (HSA) PE 30-F1
C-kit BUV395 2B8
BP-1 BV786 BP-1
CD93 BV711 AA4.1
dump kanal
CD3 AF700 17-A2
CD11b AF700 M1/70
GR1 (Ly6C/6G) AF700 RB6-8C5
Ter119 AF700 TER-119

Tabel 2: Panelet for modning af knoglemarv

Antistof Fluorophore klon
CD19 APC-H7 1D3
B220 APC RA3-6B2
Igm PeCy7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD43 FITC S7
CD23 BUV395 B3B4
CD21/35 BV421 7G6
CD11b AF700 M1/70
CD5 BV605 53-7.3
CD93 PE AA4.1

Tabel 3: Miltmodningspanelet

Antistof Fluorophore klon
CD19 APC-H7 1D3
B220 APC RA3-6B2
Igm PeCy7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD3 PB 17-A2
Kappa FITC 187.1
Lambda PE RML-42

Tabel 4: Milt Igκ og Igλ Panel

Figure 1
Figur 1: Karakterisering af B-cellepopulationer i bughinden. Levedygtige, enkeltcellede, peritoneale B-celler adskilles først fra forurenende celler ved gating på IgM+ celler. B-1 og B-2 celler skelnes derefter fra hinanden ved fravær (B-1) eller tilstedeværelse af CD23 (B-2). Næste CD5-udtryk bruges til at afgrænse B-1a-celler (CD5+) fra B-1b-celler (CD5-). FMO'er blev brugt til empirisk at bestemme, hvor porte skal tegnes. Tal er procentdele af hver population inden for samme tæthedsplot. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering af B-celleundersæt i BM. Levedygtige, enkeltcellede BM B-celler i størrelse adskilles fra ikke-B-celler ved gating på B220+ dump- (hvor dump refererer til CD3/GR-1/CD11b/TER119) celler. CD43- og B220-udtrykket definerer yderligere Hardy Fraction A-C' (CD43+ B220+) og Hardy Fraction D-F (CD43low/neg B220+/++). Brøk A-C' adskilles yderligere ved udtryk for BP-1 og CD24. Brøk A (BP-1- CD24-) svarer til præ-pro-B-celler sammen med forurenende celler. Hvis du vil adskille præ-pro-B-celler fra kontaminerende celler i brøkdel A, anvendes udtrykket af CD93 og fraværet af CD19. B (BP-1- CD24int) og Brøk C (BP-1+ CD24int) svarer til henholdsvis tidlige og sene pro-B-celler, og Brøk C' (BP-1+/- CD24+) svarer til tidlige før-B-celler. For at adskille Brøk D-F anvendes udtryk for IgM og IgD. Brøk D svarer til sene før-B-celler (IgM-/lav IgD-); Brøk E (blå port, IgMint/høj IgD-) til både umodne (Imm, IgMint IgD-) og overgangsceller (Tran, IgMhigh IgD-) B-celler; og Brøk F (IgMint/høj IgD+) til recirkulerende modne B-celler. FMO'er blev brugt til empirisk at bestemme, hvor porte skal tegnes. Tal er procentdele af hver population inden for samme tæthedsplot. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering af milt B-cellemodning. Levedygtige, enkeltcellede, størrelse gated milt B-celler adskilles fra ikke-B-celler ved gating på B220 + celler. For at identificere B-1-delsættet identificeres og defineres CD23- CD19+-celler ved hjælp af udtryk for CD43. For at klassificere B-2-populationer adskilles CD19+-celler i overgangsceller (CD93+ B220+) og modne (CD93- B220+) B-celler. Overgangsceller (CD93+ B220+) opdeles yderligere i T1-populationer (IgM+ CD23-), T2 (IgM+ CD23+) og T3 (IgMint CD23+). Modne (CD93- B220+) celler er opdelt i marginal zone (CD21/35+ IgM+) og follikulære (CD21/35int IgMint/+) B-celler. Udtrykket af CD23 bruges yderligere til at adskille MZ-forløber (CD23+ B220+) celler fra mere modne MZ-celler (CD23- B220+). Follikulære populationer afgrænses derefter i Fol I-celler (IgD+ IgMint) og Fol II -celler (IgD+ IgM+). FMO'er blev brugt til empirisk at bestemme, hvor porte skal tegnes. Tal er procentdele af hver population inden for samme tæthedsplot Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Igκ og Igλ udtryk for milt B-celler. Levedygtige, enkeltcellede, størrelse gated milt B-celler adskilles fra ikke-B-celler ved gating på B220 + CD3-celler. B-celler skelnes derefter af udtrykket Igλ og Igκ. Tal er procentdele af hver population inden for samme tæthedsplot. Klik her for at se en større version af dette tal.

Absolut celletal
Dyrenummer Levedygtige bugnende celler B-celler B-1a celler B-1b-celler B-2-celler
1 1.02E+07 4.67E+06 1.28E+06 8.95E+05 2.35E+06
2 9.92E+06 4.52E+06 1.49E+06 9.60E+05 1.91E+06
3 1.15E+07 4.56E+06 1.71E+06 9.19E+05 1.78E+06
Gennemsnitlig 1.05E+07 4.58E+06 1.49E+06 9.25E+05 2.01E+06

Tabel 5: Absolutte celletal for peritoneale B-celleundersæt

Absolut celletal
Dyrenummer Levedygtige knoglemarvsceller B-celler Brøk A Pre-pro Brøk B Brøk C Brøk C« Brøk D Umoden Overgangsperiode Brøk F
1 5.05E+07 9.70E+06 1.13E+06 1.95E+05 2.22E+05 9.14E+04 6.31E+05 1.59E+06 4.56E+05 7.81E+05 4.03E+06
2 5.39E+07 1.03E+07 1.14E+06 2.29E+05 2.89E+05 1.22E+05 8.40E+05 2.11E+06 5.39E+05 8.07E+05 3.67E+06
3 5.93E+07 1.01E+07 1.10E+06 2.12E+05 2.84E+05 1.05E+05 9.02E+05 2.72E+06 5.94E+05 7.62E+05 2.59E+06
Gennemsnitlig 5.46E+07 1.00E+07 1.12E+06 2.12E+05 2.65E+05 1.06E+05 7.91E+05 2.14E+06 5.29E+05 7.83E+05 3.43E+06

Tabel 6: Absolutte celletal for knoglemarvs B-celleundersæt

Absolut celletal
Dyrenummer Levedygtige miltceller B-celler Overgangs B-celler T1-celler T2-celler T3-celler Modne B-celler Follikulære I-celler Follikulære II-celler Forløber marginalzoneceller Modne celler i marginalzonen B-1-celler
1 9.16E+07 4.61E+07 3.66E+06 1.55E+06 1.10E+06 7.16E+05 4.06E+07 2.39E+07 5.27E+06 2.17E+06 3.98E+06 8.83E+05
2 9.97E+07 5.18E+07 4.88E+06 1.97E+06 1.57E+06 1.00E+06 4.49E+07 2.68E+07 7.33E+06 3.42E+06 3.84E+06 8.15E+05
3 1.02E+08 5.34E+07 4.64E+06 1.98E+06 1.41E+06 8.54E+05 4.62E+07 2.81E+07 5.84E+06 3.58E+06 4.02E+06 1.01E+06
Gennemsnitlig 9.77E+07 5.04E+07 4.39E+06 1.83E+06 1.36E+06 8.58E+05 4.39E+07 2.63E+07 6.15E+06 3.06E+06 3.94E+06 9.02E+05

Tabel 7: Absolutte celletal for milnic B-celleundersæt

Absolut celletal
Dyrenummer Levedygtige miltceller B-celler Igκ+ B-celler Igλ+ B-celler
1 9.16E+07 4.97E+07 4.51E+07 2.46E+06
2 9.97E+07 5.63E+07 5.08E+07 3.16E+06
3 1.02E+08 5.91E+07 5.33E+07 3.24E+06
Gennemsnitlig 9.77E+07 5.50E+07 4.97E+07 2.95E+06

Tabel 8: Absolutte celletal for Igκ- og Igλ B-celleundersæt

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flow cytometrisk analyse af lymfoide og ikke-lymfoide væv har gjort det muligt samtidig identifikation og optælling af B-celle delpopulationer i mus og mennesker siden 1980'erne. Det er blevet brugt som et mål for humoral immunitet og kan anvendes yderligere til at evaluere B-cellefunktionalitet. Denne metode udnytter reagensets tilgængelighed til at vurdere forskellige stadier af B-cellemodning hos mus og mennesker ved samtidig analyse af flere parametre, der muliggør vurdering af B-celle heterogenitet, selv i sjældne populationer. Hvis det bruges til at måle komplekse heterogene prøver, kan det detektere underpopulationer inden for få minutter, på individuelle celler33. Sekventiel gating analysestrategi, oftest anvendes til flow cytometrisk analyse, kan være enkel og intuitiv, når en bestemt population skal identificeres34. Endelig er en anden fordel ved flowcytometri, at det er let at tilpasse i de fleste akademiske laboratorier, mens det er under vejledning af erfarne brugere. Vores protokol beskriver med succes vurdering af B-1-populationer i bughinden, BM og milten af mus ved at beskrive og opregne B-1-populationer og dykke ned i udviklingen af B-2 pro-B-celler, præ-B-celler, umodne, midlertidige og modne B-celler samt deres overfladeudtryk af Igκ- eller Igλ-lyskæder. Flowcytometri er den mest udbredte og nemmeste metode at anvende, når man undersøger B-celleudvikling hos mus.

Mens flowcytometri genererer uvurderlige data, er der nogle grænser for denne teknologi, når de bruges til at undersøge heterogeniteten af immun B-cellerummet. Kæmpe datasæt kan være overvældende, fordi 10 farvefarvning tillader anerkendelse af mere end 1.024 forskellige cellepopulationer34. Man skal tage i betragtning, at nogle almindeligt anvendte lymfoid celle markører har vist sig at være mindre specifikke end oprindeligt antaget. Dette kan løses ved at anvende et væld af celleoverflademarkører til at fastslå gating på ønskede populationer. Mens flowcytometrisk analyse kan være enkel og intuitiv, er en anden begrænsning for at flyde cytometrisk analyse, at det typisk kun tillader visualisering af to parametre ad gangen, selvom datavisualiseringsværktøjer som t-SNE kan bruges til at gruppere cellepopulationer mere effektivt, når du bruger høj parameterflowcytometri. En anden vigtig begrænsning er, at de porte, der anvendes under både erhvervelse og analyse, undertiden er afhængige af operatørens subjektivitet.

For en vellykket tilpasning eller replikering af denne protokol er der flere kritiske parametre, der skal tages i betragtning35. Der skal tages nøje hensyn til paneldesign og valg af fluorokrom. Det er bydende nødvendigt at parre dim eller vigtige antigener med lyse fluorochromes. Der skal udføres antistoftrration for at undgå overskydende antistofbinding til celler, ikke specifikt, hvilket potentielt øger baggrundsfarvning og faldende opløsning. Antistof titrering udføres ved farvning af et kendt antal celler med faldende koncentrationer af antistoffer for at bestemme det bedste separationsindeks36. Dette bør gentages for hver masse antistof. Under prøveforberedelse og farvning er det vigtigt at sikre en enkelt celleaffjedring ved at undgå Ca++ og Mg++. Derudover kan tilsætning af EDTA hjælpe med at forhindre cellesammenlægning og enzymatisk aktivitet, som kan føre til antistofmedieret stimilulation og internalisering af mærkede markører. Før dataindsamlingen skal prøverne suspenderes korrekt, filtreres og være fri for aggregater. Afsmittende signal fra en parameter til en anden løses ved hjælp af kompensationskontrol i form af enkelt farvede celler eller kommercielt tilgængelige kompensationsperler35. En anden vigtig overvejelse er at have ordentlig kontrol i hvert eksperiment. Ufarvede celler etablerer baseline for autofluorescence. Isotype-kontrolelementer anses ikke længere for at være egnede til gating på grund af ikke-specifik binding. Det vigtigste skridt i at hjælpe med at gøre nøjagtige porte er brugen af FMO kontrol. I en FMO-kontrol er alle konjugerede antistoffer til stede i pletten undtagen den, der kontrolleres for. FMO-kontroller gør det muligt at måle spredningen af alle fluorophorer i den manglende kanal og giver derfor mulighed for at etablere porte i overensstemmelse hermed. Det er afgørende, at nok celler er erhvervet for ekstra nøjagtighed. Som tommelfingerregel bør der indsamles mindst 2.000 begivenheder i befolkningen af interesse. Endelig skal kompensationskontrol, hvad enten det drejer sig om perler eller celler, nøjagtigt matches med de fluorokrom, der anvendes, og kontrollerne skal være mindst lige så lyse som forsøgsprøverne37.

Samlet set er lav cytometrisk analyse af B-cellerum meget udbredt i immunologiområdet. Denne teknik kan bruges til at undersøge forstyrrelser i humoral immunitet i både vilde type og genetisk modificerede mus, under ikke-sygdomstilstande og på immunologisk udfordring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere er medarbejdere og aktionærer i Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Acknowledgments

Vi takker Matthew Sleeman for den kritiske læsning af manuskriptet. Vi takker også Vivarium Operations og Flow Cytometry Core afdelinger på Regeneron for at støtte denne forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes Eppendorf  22363611 0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes  Eppendorf  22364111 1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes  Corning  352097 15 mL conical tube
18 gauge needle BD 305196
25 gauge needle BD  305124
3 mL syringe BD 309657
70 mM MACS SmartStrainer  Miltenyi Biotec  130-110-916  70 mM cell strainer
96 well U bottom plate  VWR 10861-564
ACK lysis buffer  GIBCO  A1049201 red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate Pall Corporation 8027 filter plate
B220 eBiosciences 17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ BD 552843 compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ BD 552844 compensation beads
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A8577 BSA
BP-1 BD 740882
Brilliant Stain Buffer BD 566349 brilliant stain buffer
C-Kit BD 564011
CD11b BD 563168
CD11b BioLegend 101222
CD19 BD 560143
CD21/35 BD 562756
CD23  BD 740216
CD24 (HSA) BioLegend 138504
CD3 BD 561388
CD3 BioLegend 100214
CD43 BD 553270
CD43 BioLegend 121206
CD5 BD 563194
CD93 BD 740750
CD93 BioLegend 136504
DPBS (1x) ThermoFisher 14190-144 DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 ThermoFisher 65-0866-14 viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette Samco 233 disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer BD custom order flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) BD 553142 Fc block
FlowJo Flowjo flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes  Miltenyi Biotec  130-096-334 automated dissociation tube 
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters  Miltenyi Biotec  130-095-937 tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G) BioLegend 108422
IgD BioLegend 405710
IgM eBiosciences 25-5790-82
Kappa BD 550003
Lambda BioLegend 407308
paraformaldehyde, 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714
Ter119 BioLegend 116220
True-Stain Monocyte Blocker BioLegend 426103 monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575038 EDTA
Vi-CELL XR Beckman Coulter 731050 cell counter instrument 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220 (2017).
  2. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
  3. Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
  4. Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
  5. Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
  6. Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
  7. Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
  8. Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
  9. Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
  10. von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
  11. Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
  12. Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
  13. Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
  14. Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
  15. Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
  16. Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
  17. Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
  18. Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
  19. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
  20. Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
  21. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  22. Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
  23. Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
  24. Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
  25. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  26. Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
  27. Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
  28. Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
  29. Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
  30. Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
  31. Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
  32. Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
  33. Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
  34. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
  35. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
  36. Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21 (2007).
  37. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).

Tags

Immunologi og infektion Problem 167 B-celler lymfocytter udvikling differentiering bughinden knoglemarv milt flowcytometri mus
Flow cytometrisk karakterisering af Murine B Cell Development
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harris, F. M., Meagher, K. A.,… More

Harris, F. M., Meagher, K. A., Zhong, M., Daniel, B. J., Eckersdorff, M., Green, J. A., Voronina, V., Guo, C., Limnander, A., Macdonald, L. E. Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development. J. Vis. Exp. (167), e61565, doi:10.3791/61565 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter