Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor een gestandaardiseerd in vitro hemodynamic loop model. Dit model maakt het mogelijk om de hemocompatibiliteit van perfusiebuizen of vasculaire stents te testen in overeenstemming met ISO (International Organization for Standardization) norm 10993-4.
Abstract
In deze studie werd de hemocompatibiliteit van buizen met een binnendiameter van 5 mm van polyvinylchloride (PVC) en bekleed met verschillende bioactieve conjugaten vergeleken met ongecoate PVC-buizen, latexbuizen en een stent voor intravasculaire toepassing die in de PVC-buizen werd geplaatst. Evaluatie van hemocompatibiliteit werd gedaan met behulp van een in vitro hemodynamic loop model dat wordt aanbevolen door de ISO-norm 10993-4. De buizen werden gesneden in segmenten van identieke lengte en gesloten om lussen te vormen vermijden van een kloof op de splice, vervolgens gevuld met menselijk bloed en gedraaid in een waterbad op 37 °C voor 3 uur. Daarna werd het bloed in de buizen verzameld voor de analyse van het aantal volle bloedcellen, hemolyse (vrije plasmahemoglobine), complementsysteem (sC5b-9), stollingssysteem (fibrinopeptide A) en leukocyteactivering (polymorfoele elastase, tumor necrosefactor en interleukine-6). De activering van de hostcel werd bepaald voor de activering van bloedplaatjes, de integrinstatus van leukocyte en monocyteplaatjes met behulp van stroomcytometrie. Het effect van onnauwkeurige lussluiting werd onderzocht met röntgenmicrotomografie en scanning elektronenmicroscopie, die trombusvorming bij de splice toonde. Latex buizen toonden de sterkste activering van zowel plasma- als cellulaire bestanddelen van het bloed, wat wijst op een slechte hemocompatibiliteit, gevolgd door de stentgroep en ongecoate PVC-buizen. De gecoate PVC-buizen vertoonden geen significante afname van de activeringsstatus van bloedplaatjes, maar vertoonden een toename in complement- en stollingscascade in vergelijking met ongecoate PVC-buizen. Het lusmodel zelf leidde niet tot de activering van cellen of oplosbare factoren, en het hemolyseniveau was laag. Daarom voorkomt het gepresenteerde in vitro hemodynamische lusmodel overmatige activering van bloedbestanddelen door mechanische krachten en dient het als een methode om in vitro interacties tussen donorbloed en vasculaire medische hulpmiddelen te onderzoeken.
Introduction
Hemocompatibiliteitstesten van medische hulpmiddelen is een cruciale stap in de ontwikkeling van nieuwe apparaten zoals vasculaire stents of perfusiebuizen voor extracorporale membraan oxygenatie. Tot op de dag van vandaag worden diermodellen beschouwd als standaardgereedschap om de procedure voor het testen van de medische hulpmiddelen af te ronden voorafgaand aan de implementatie bij de mens. Voortaan moeten er alternatieve in vitro modellen worden gevonden die verder helpen bij het minimaliseren van onderzoeken naar dieren. In deze studie hebben we daarom een miniatuur in vitro hemodynamic loop model verkend. Het doel van deze gepresenteerde methode is om de in vitro bloedcompatibiliteit van medische hulpmiddelen te testen in overeenstemming met de ISO 10993-4-norm.
De ISO 10993-4-norm beschrijft gestandaardiseerde sets klinische parameters die moeten worden onderzocht op bloedmonster1. Kortom, dit zijn trombose (bloedplaatjes aggregatie en telling), stolling (fibrinopeptide A, FPA), hematologische analyse (aantal hele bloedcellen), hemolyse-index (vrije plasmahemoglobine) en het complementsysteem (terminal complement complex, sC5b9). Echter, extra markers, zoals neutrofiele polymorfuclear elastase (PMN), interleukine 6 (IL-6) en tumor necrose factor - alfa (TNF) als gevolg van de activeringsstatus van leukocyten kan ook worden verantwoord voor metingen. Om de circulerende celvrije eiwitten die in bloedplasma aanwezig zijn te bepalen en te kwantificeren, vertegenwoordigt sandwich enzymatische gekoppelde immunosorbenttest (ELISA) een conventionele en meest betrouwbare methode2,3. Evenzo kan de fenotype- en activeringsstatus van de gastheercellen (bijvoorbeeld leukocyten) worden gekwantificeerd door de expressie van het celoppervlak van moleculen te detecteren door flow cytometrie (FACS) die op één cel suspensie gebaseerde uitlezingen biedt, waarbij fluorescerende gelabelde specifieke antilichamen zich binden aan de beoogde celoppervlaktemoleculen4. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) wordt ook aanbevolen om de trombusvorming op het geteste materiaal te bepalen door de ISO 10993-4 norm1. Deze methode kan worden aangevuld met röntgenmicrotomografie (μCT), om structurele analyse van de trombus uit te voeren, bijvoorbeeld de dikte, grootte en lokalisatie in een 3D-weergegeven afbeelding5.
De achterliggende gedachte achter het gebruik van dit in vitro hemodynamische model is om te screenen op de best presterende en compatibele medische hulpmiddelen door inzicht te krijgen in de fundamentele fysiologische dynamiek van bloedbestanddelen zoals bloedplaatjes, die betrokken zijn bij de primaire hemostase of leukocyten en hun interactie met verschillende soorten vasculaire apparaten. Dergelijke in vitro systemen zijn zeer gevraagd als ze verminderen de noodzaak voor dierstudies.
Het hier gepresenteerde lusmodel voldoet aan deze eisen. Dit model werd voor het eerst beschreven door A.B Chandler in 1958 voor de productie van bloed trombi en is daarom ook wel Chandler Loop model6. Tot nu toe is dit model gebruikt in een reeks experimenten en wijzigingen om de bloedbiocompatibiliteit van medische hulpmiddelen7,8 ,9,10,11,12,13,14te onderzoeken . Het bestaat uit polymeerbuizen, die gedeeltelijk met bloed worden gevuld en in re-closable lussen worden gevormd. Deze lussen draaien in een temperatuurgecontroleerd waterbad om vasculaire stromingscondities te simuleren met zijn hemorheologische effecten. Alternatieve methoden zoals pomp aangedreven modellen of modellen die mechanische kogelkleppen in de lussen gebruiken om een bloedstroom in de polymeerbuizen te induceren zijn al beschreven15,16. Echter, het algemene voordeel van de hier gepresenteerde methode is dat de mechanische kracht toegepast op de bloedcellen en eiwitten laag is, het vermijden van hemolyse, en er is geen contact tussen bloed en connectoren, dat zou kunnen leiden tot flow turbulenties en activering van bloedbestanddelen. De belangrijkste activerende factoren in de lus zijn het testmateriaal zelf en de lucht die erin gevangen zit. Dit helpt om meetbronnen te minimaliseren en een hoge reproduceerbaarheid te leveren, zelfs als de bloed-luchtinterface kan leiden tot eiwitverdenaturatie17. Het is ook mogelijk om variëteiten van buizenmaterialen en stentdiameters te onderzoeken zonder lengte- of groottebeperkingen, waardoor het gebruik van buizen met verschillende lengte en binnendiameter mogelijk wordt. Bovendien zijn hosthemocompatibilities op onnauwkeurige lussluiting en blootstelling aan het ongecoate buisoppervlak ook mogelijk om te onderzoeken. Andere soortgelijke medische toepassingen van dit in vitro hemodynamische lusmodel is dat het ook kan worden gebruikt om de interacties tussen immunotherapeutica (drugs) en bloedbestanddelen te bestuderen tijdens preklinische ontwikkeling of individuele screening op het gebied van de veiligheid van geneesmiddelen voorafgaand aan de eerste-in-man fase I klinische studie, of voor de generatie van trombusmateriaal dat kan worden gebruikt in verdere experimenten18,19,20.
Deze studie beschrijft een gedetailleerd protocol voor het testen van de hemocompatibiliteiten van perfusiebuizen en/of stents. Hier, de vergelijking tussen ongecoate en gecoate PVC buizen (hepPVC: heparine coating, polyPVC: coating met een bioactief polymeer). Verlaagde activering van bloedplaatjes, maar een hogere activering van het stollingssysteem (FPA) werd gevonden voor beide gecoate buizen in vergelijking met de ongecoate buizen. De hepPVC buizen die hier worden gebruikt zijn gewijzigd met covalent gebonden heparine om ze tromboresistant21 en zijn al gebruikt in een lus model te optimaliseren en te karakteriseren verschillende parameters22. De polyPVC buizen die in deze studie worden gebruikt zijn commercieel beschikbare buizen die worden gebruikt in klinische omgevingen van extracorporale bloedperfusie en zijn bekleed met een heparinepolymeer om hun trombogeneiteit te verminderen23. Soms worden in klinische toepassingen zelfs ongecoate PVC-buizen gebruikt. Daarom hebben we latexbuizen opgenomen als een positieve controlegroep die overmatige activering van bloedplaatjes, stollingssysteem en oplosbare factoren zoals IL-6, TNF en PMN elastase vertoonde. Trombus formatie werd opgemerkt toen onjuiste lus sluiting werd gesimuleerd. Dit leidde tot de activering van stolling en complementsysteem evenals leukocyten en bloedplaatjes in vergelijking met de basislijnvoorwaarden. Bovendien leidde het bloedcontact met het hier gebruikte stentmateriaal (bare metal nitinol stent, bedekt met koolstof-geïmpregneerd geëxregeerde polytetrafluorethyleen) tot een hogere bloedplaatjes en leukocytenactivering in termen van PMN-elastase. Over het geheel genomen induceert het gepresenteerde model geen hemolyse in een van de geteste vasculaire hulpmiddelen, omdat ze vergelijkbaar waren met de basislijn of statische omstandigheden, met uitzondering van de latexbuizen, waar rode bloedcel (RBC) hemolyse duidelijk was. Bovendien kunnen deze perfusiebuizen worden onderzocht door beeldvorming of door histologie. Hoewel histologische evaluaties haalbaar zouden kunnen zijn, richtten we ons voornamelijk op ELISA en flow cytometrie om deze experimenten uit te voeren en zo de haalbaarheid mogelijk te maken van het uitvoeren van experimenten op basis van het hier gepresenteerde model voor veel laboratoria. Deze methode vertegenwoordigt dus een haalbare methode om de bloedbiocompatibiliteit van vasculaire medische hulpmiddelen te testen in overeenstemming met de aanbevelingen van de ISO 10993-4-norm. Bovendien kan deze methode worden gebruikt wanneer een interactie tussen bloed en materialen moet worden getest onder stromingsomstandigheden, waarbij de in vivo omstandigheden worden nagebootst.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de medische faculteit van het Universitair Ziekenhuis Maagdenburg (aanvraagnummer 88/18) en de proefpersonen gaven schriftelijke toestemming voorafgaand aan de bloedafnameprocedure.
1. Heparine voorraadbereiding en bloedafname
- Bereken de hoeveelheid bloed die nodig is voor de hele experimenten.
OPMERKING: Bijna, 5 mL van gehepariniseerd bloed is vereist voor elk vasculaire apparaat in duplicaten (lussen). Ook is 5 mL bloed vereist voor elke basislijn en statische toestand die bij kamertemperatuur opzij wordt gehouden. - Bereid een heparinevoorraadoplossing voor bij de concentratie van 100 IE/mL door de niet-gefractioneerde heparine (bijvoorbeeld Rotexmedia) in gedeïoniseerd water te verdunnen. Gebruik 150 μL van deze oplossing voor de heparinisatie van 10 mL vers bloed.
- Bereken de hoeveelheid bloed en plasma die nodig zijn voor het aantal volle bloedcellen, ELISA en FACS-testen.
OPMERKING: De metingen die in deze studie worden weergegeven, zijn verkregen uit twee lussen die parallel lopen (één als duplicaat) met een totaal bloedvolume van 10 mL. - Vul op basis van de vereiste hoeveelheid bloed 10 mL-spuiten met 150 μL heparinevoorraadoplossing om bloedstolling te voorkomen met een laatste heparineconcentratie van 1,5 IE/mL-bloed.
- Teken bloed met een vlinder (grootte: 21 G). Vul de spuiten zeer voorzichtig om hemolyse of celactivering als gevolg van overmatig vacuüm te voorkomen.
OPMERKING: Toestemming van de lokale ethische commissie moet worden verkregen vóór het begin van de experimenten. Verkrijg geïnformeerde toestemming van elke menselijke bloeddonor. Zorg ervoor dat de bloeddonor gezond is en geen medicatie neemt, vooral geen antiplateletmiddelen of niet-steroïde ontstekingsremmende geneesmiddelen gedurende ten minste 10 dagen voorafgaand aan de experimenten. Van belang, dezelfde donor heeft de voorkeur bij het vergelijken van verschillende soorten vasculaire apparaten voor de eerste keer zoals gepresenteerd in dit manuscript. Om de inter-individuele verschillen verder te evalueren, kan het protocol worden herhaald met verschillende donoren. - Verzamel bloed in een glazen beker, vermijd overmatige agitatie.
2. In vitro hemodynamic loop assembly
- Vul het waterbad tot het waterniveau tot aan het midden van de rotatie-eenheid reikt. Stel de watertemperatuur in op 37 °C.
- Lusassemblage voor het testen van verschillende buizenmaterialen (polyPVC, hepPVC, PVC en latex)
- Snijd met de buissnijder twee 50 cm lange stukken van elk buismateriaal (binnendiameter 5 mm). Zorg ervoor dat het snijoppervlak vlak is, omdat dit bijzonder belangrijk is voor een perfecte sluiting voor de lussen met kleine diameters, zodat het bloed stroomt zonder vervorming op de montagerand.
LET OP: Dit hele protocol maakt gebruik van de buizen met een binnendiameter van 5 mm. - Om de behandeling te vergemakkelijken en vertraging na de verwerking na de rotatie te voorkomen, voert u slechts vier lussen (2 materialen in duplicaten) parallel uit.
- Om een lusvorm te genereren, sluit je de open eindes van de buizen aan op een kort stukje siliciumbuis dat de buitendiameter van de onderzoeksbuis past.
- Gebruik de polycarbonaat spanbanden om een goede sluiting van de lussen te garanderen. Bij het gebruik voor de eerste keer, pas de lengte van de banden aan de buitenste diameter van de lus te passen door het snijden van de spanningsband met een schaar in de vereiste lengtes en zet het vast met een 3 mm koppel moersleutel.
- Draai de vergrendelingsschroef van de spanbandconnector voorzichtig aan bij inspectie van de buisuiteinden. Pas de sluitkracht zo aan dat er geen gat blijft tussen de buisuiteinden. Als de vergrendelingsschroef volledig is aangedraaid en de spanning van de polycarbonaatband te laag lijkt om de kloof tussen de buisuiteinden te dichten, opent u het systeem en snijdt u een paar mm van de spanningsband. Herhaal dit, totdat nauwkeurige lussluiting is bereikt(figuur 1A).
- Als het buizenstelsel zeer zacht is en de neiging heeft om in de spanbanden te glijden, bevestigt u de lus met elektrische tape aan de spanband(figuur 1B,C).
- Bereid een extra lus pvc voor temperatuurregeling met dezelfde afmetingen als de testlussen.
- Zet de lussen in de luswieg van de rotatie-eenheid buiten het waterbad. Bevestig vervolgens de luswieg aan de rotatie-eenheid in het waterbad(figuur 1E).
- Ontmantel de spanband deels uit de lussen en haal de stekker uit het ene uiteinde van elke buis om de lus te openen.
- Vul elke lus voorzichtig met 5 mL bloed met een serologische pipet van 5 mL. Meng het bloed zachtjes twee keer in het glazen bekerglas door langzaam pipetten op en neer voor het laden in de lussen.
- Neem de wegwerpthermometer en plaats deze in de temperatuurregelingslus. Als de thermometer te groot is, snijd deze dan met een schaar om kleinere buizen te passen. Vul de lus met 5 mL gedeïmiseerd water bij kamertemperatuur.
- Sluit de lussen en zorg ervoor dat de lussen, de spanbanden en het rek goed zijn gemonteerd.
- Stel de rotatiesnelheid in op 30 ronden per minuut (rpm) en draai 3 uur.
- Snijd met de buissnijder twee 50 cm lange stukken van elk buismateriaal (binnendiameter 5 mm). Zorg ervoor dat het snijoppervlak vlak is, omdat dit bijzonder belangrijk is voor een perfecte sluiting voor de lussen met kleine diameters, zodat het bloed stroomt zonder vervorming op de montagerand.
- Lusassemblage voor het testen van de impact van onjuiste lussluiting (gap)
- Bereid vier lussen (polyPVC) zoals beschreven in 2.2.
- Sluit twee van de lussen goed met de spanbanden en vermijd een opening tussen de buisuiteinden.
- Voor de andere twee lussen sluit de open uitgangen in de grotere buis zoals beschreven in 2.2.3, maar laat een gat van 1-2 mm tussen de lus eindigt. Gebruik de spanbanden niet voor deze lussen(figuur 1D).
- Bereid één temperatuurregelingslus voor zoals beschreven in de 2.2.7 en 2.2.11.
- Vul alle lussen met bloed zoals beschreven in 2.2.10.
- Stel de rotatiesnelheid in op 30 tpm en draai 3 uur.
- Lusassemblage voor stenttesten
- Bereid vier lussen voor zoals beschreven in 2.2 en volgt.
OPMERKING: Om de biocompatibiliteit van stents in het bloed te beoordelen, moet het buizenmateriaal zelf worden getest om biocompatibel te zijn om het maskeren van celactivering te voorkomen. Als er geen gegevens zijn, kan het buismateriaal zelf worden getest zoals beschreven in punt 2.2. Bovendien kan het diameterbereik binnen de stent worden toegepast (zie de instructies van de fabrikant) en moet het passen in de binnendiameter van het buismateriaal. - Open twee van de lussen en haal de buis uit het spanbandsysteem.
- Plaats de stent in het midden van de buis volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik de andere twee lussen zonder stent als controle. Vul alle lussen met bloed zoals beschreven in 2.2.10.
- Stel de rotatiesnelheid in op 30 rpm en draai 3 uur.
- Bereid vier lussen voor zoals beschreven in 2.2 en volgt.
- Temperatuurregeling
- Op elk moment tijdens de duur en wanneer de rotatie wordt gestopt, wordt de temperatuur van het bloed in de lussen aangegeven door de thermometer in de temperatuurregelingslus. Om de temperatuur af te lezen, stop de rotatie en lees onmiddellijk de door de thermometer aangegeven temperatuur af.
3. Verwerking van bloedmonsters
- Laat de lussen na rotatie 2 min in het rek staan in een opwaartse positie om het bloed zich aan de onderkant van de lussen te laten ophopen, waardoor morsen tijdens het openen van de lussen wordt vermeden.
- Inspecteer het bloed links voor statische omstandigheden: Als dit bloed wordt gestold, een onjuiste heparinisatie wordt uiteindelijk verdacht. Herhaal in dit geval het experiment bij voorkeur ook met een andere bloeddonor.
- Haal de lussen voorzichtig uit het rek. Open de connectoren en laat het bloed in een 10 mL glazen beker.
- Pool het bloed uit de buizen die worden uitgevoerd in duplicaten.
- Trek vers bloed voor basisanalyse van dezelfde donor als beschreven in 1.5 en 1.6.
- Verzameling natriumcitraatbloed
- Voor het verzamelen van natriumcitraatbloed vult u vier buizen van 1,5 mL, elk met een natriumcitraatoplossing van 111 μL, verzameld uit natriumcitraatbuizen, om een uiteindelijke concentratie van 3,2% natriumcitraat te genereren.
- Vul elke buis met 1 liter bloed uit de glazen bekers zoals beschreven in 1.6 en 3.3.
- Houd het bloed op kamertemperatuur en gebruik het bloed voor FACS-analyses zoals beschreven in 12.
OPMERKING: Als u de lengte van de lussen voor verschillende experimentele opstellingen wilt wijzigen, plant u op de juiste wijze aliquots op basis van de hoeveelheid metingen die moeten worden uitgevoerd. Het kan nodig zijn om alle vereiste metingen met vers bloed voorafgaand aan de echte experimenten vast te stellen om ervoor te zorgen dat het volume van het bloed in de lussen voldoende is voor alle metingen.
- Verzameling van ethyleenediaminetetraacetische zure (EDTA) bloed- en plasmamonsters.
- Van elk glazen bekerglas met bloed (zie 1.6 en 3.3) breng 4,5 ml bloed in één 5 ml EDTA-buis. Vul twee EDTA-buizen van elk 10 ml glazen bekerglas met bloed.
- Meng het bloed voorzichtig en houd het op ijs.
- Breng 2 mL bloed over in een 2 mL vergrendelingscentrifugatiebuis en gebruik dit bloed voor het aantal bloedcellen en gratis hemoglobinemeting zoals beschreven in 5. En 6.
- Centrifugeren het resterende bloed op 3.500 x g gedurende 20 minuten.
- Verzamel het plasma voorzichtig in de supernatant in 500 μL aliquots en vries onmiddellijk bij -80 °C.
4. Scanning elektronenmicroscopie en μCT-beelden
- Na de verwerking van het bloedmonster, spoel de geleegde lussen bereid zoals beschreven in 2.3 met 10 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) elk.
- Snijd voorzichtig een 1 cm lang monster van elk uiteinde van elke buis af met een scalpel.
- Incubeermonster 's nachts bij 4 °C in een 2% glutaraldehydeoplossing.
LET OP: Inademing van aldehydedampen kan neusklachten veroorzaken, zoals een loopneusertsent en irritatie van de luchtwegen, en contact met huid veroorzaakt dermatitis. Aldehyden moeten worden behandeld in een rookkap tijdens het dragen van handschoenen, een beschermende jurk en veiligheidsbril. - Spoel het monster (3 keer) af met PBS.
- Bereid een 1% oplossing van osmiumtetroxide (OsO4) in gedeïmiseerd water en incubbaatmonster gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: OsO4 is een sterk oxiderend middel, het kan worden verminderd door blootstelling aan licht. Om de reductie tijdens de bereiding te voorkomen, slaat u OsO4 op in een bruine glazen fles. OsO4 is zeer vluchtig, de dampen zijn giftig voor ogen, neus en keel. Werk altijd onder een rookkap en gebruik handschoenen en kleding, zodat geen enkel deel van het lichaam wordt blootgesteld aan OsO4. Neem contact op met de richtlijnen van uw instelling met betrekking tot de verwerking van afvalverwijdering en -opslag. In het algemeen is OsO4 enkele maanden bewaard, maar het heeft speciale glazen flessen met Teflon voering en een desiccator nodig, omdat OsO4 de interne oppervlakken en inhoud van de koelkast kan verkleuren in aanwezigheid van lekkende dampen. - Neem monsters, breng ze in een nieuwe 15 mL centrifuge buizen en spoel monsters 3 keer met PBS.
- Bereid een serie ethanol met verschillende concentraties (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
- Dehydraatmonsters in ethanol: incubeer gedurende 20 min elk in 25%, 50%, 75% en 90% en 30 min in 100%.
- Neem monsters uit 100% ethanol en laat het 's nachts drogen bij kamertemperatuur.
- Bestudeer monsters in de scanning elektronenmicroscoop bij een versnellingsspanning van 5 kV en met de Röntgen μCT-scanner.
5. Aantal bloedcellen
- Neem 2 mL van het EDTA-bloed verkregen zoals beschreven in punt 3.7.3
- Plaats de buis in de geautomatiseerde hematologie analyzer en volg de instructies van de fabrikant.
6. Meting van vrije hemoglobine (fHb) in plasma
- Ontdooi één plasmamonster van elke in punt 3.7.5 verkregen aandoening. Bewaar op ijs na ontdooien.
LET OP: Ontdooi bevroren plasmamonsters altijd in een waterbad bij 37 °C en breng onmiddellijk over op ijs, met wat water, om de temperatuur te verlagen. Dit is belangrijk om activering van bloedbestanddelen tijdens het ontdooien te voorkomen. - Gebruik het fHb-reagens en volg de instructies van de fabrikant. Voorkom besmetting na het openen en bescherm het reagens tegen direct licht (zon, UV-licht).
- Gebruik een pipettingschema (zie instructies van de fabrikant) met 1:5 verdunning.
- Voeg 1000 μL van het hemoglobinereagens toe in een semi-micro cuvette van 1,6 mL. Gebruik deze cuvette om de lege waarde te bepalen.
- Voeg 1000 μL van het hemoglobinereagens en 250 μL van het plasmamonster toe in een andere semi-micro cuvette.
- Meng de inhoud in beide cuvettes door de pipet grondig door te spoelen door herhaaldelijk te vullen met reactiemengsel en broed minstens 3 min bij kamertemperatuur uit.
- Bepaal het uitsterven (E) van het monster tegen fHb-reagens als blanco reagens. Bereken de fHb-concentratie (mmol/l) van het monster: E540-E680 x 0,452.
7. Meting van FPA
- Ontdooi een plasmamonster van elke in punt 3.7.5 verkregen aandoening en bewaar na ontdooien op ijs.
- Gebruik de FPA Elisa kit en volg de instructies van de fabrikant.
8. Meting van sC5b9
- Ontdooi een plasmamonster van elke in punt 3.7.5 verkregen aandoening en bewaar na ontdooien op ijs.
- Gebruik de sC5b-9 ELISA kit en volg de instructies van de fabrikant.
9. Meting van PMN
- Ontdooi een plasmamonster van elke in punt 3.7.5 verkregen aandoening en bewaar na ontdooien op ijs.
- Gebruik de PMN-Elastase ELISA kit en volg de instructies van de fabrikant.
10. Meting van TNF
- Microplaten moeten een dag voor het uitvoeren van de ELISA worden gecoat. Voeg voor coating 's nachts 100 μL van de afvangantilichaamoplossing toe aan alle putten, afdichtingsplaat en incubeer bij 2 °C-8 °C.
- Ontdooi één plasmamonster van elke in punt 3.7.5 verkregen aandoening. Bewaar op ijs na ontdooien.
- Gebruik de TNF ELISA kit en volg de instructies van de fabrikant.
11. Meting van IL-6
- Microplaten moeten een dag voor het experiment worden bekleed met vangantilichamen. Voeg voor de coating 100 μL van de afvangantilichaamoplossing toe aan alle putten van de microplaat die bij de set, de afdichtingsplaat en de incubaat 's nachts bij 4 °C worden geleverd
- Ontdooi een plasmamonster van elke in punt 3.7.5 verkregen aandoening. en bewaar op ijs na ontdooien.
- Gebruik de IL-6 ELISA kit en volg de instructies van de fabrikant..
12. FACS-analyses
- Bereid 500 mL FACS buffer voor door 10 mL foetale kalfsserum en 2 mL EDTA-oplossing (0,5 M) toe te voegen aan 488 mL van 1x PBS. De FACS buffer kan 4 weken bij 4°C worden opgeslagen.
- Gebruik 100 μL natriumcitraatbloed (zie 3.6.3) voor elke kleuringsprocedure (monocyte platelet aggregaten (MPA), platelet activatie (PA), leukocyte integrins (LI)).
- Pipette 100 μL bloed van elk monster in een 5 mL FACS buis. Bereid uit elk monster 3 buizen voor voor antilichaam kleuring en label met MPA (monocyte platelet aggregaten) paneel, PA (platelet aggregaten) paneel en LI (leukocyte integrin) paneel.
- Meng de rest van de 4 monsters in een 5 mL FACS buis. Gebruik deze mix voor onbevlekte en fluorescentie minus een (FMO) besturingselementen.
- Bereid 6 FACS buizen door 100 μL van het gemengde monsterbloed in elke buis te pipetten. Label 3 buizen als onbevlekt en 3 buizen als FMO-CD41, FMO-CD62P en FMO-CD162.
- Voeg 100 μL van 4% paraformaldehydeoplossing toe en incubaal gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
LET OP: Paraformaldehyde is giftig voor huid en ogen. Het kan leiden tot ernstige longirritatie bij inademing en kan leiden tot longschade na langdurige blootstelling. Bovendien is het geclassificeerd als een kankerverwekkende stof en een reproductief toxine. Draag altijd handschoenen en veiligheidsbrillen en werk onder de rookkap. - Voeg 1 mL wasbuffer toe aan elke buis en centrifuge op 287 x g gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en herhaal de wasstap twee keer.
- Voeg voor de lyse van rode bloedcellen (RBC) 1 mL 1x buffer RBC lyse buffer (verdun 10x RBC lysis buffer in gedeïmplanteerd water), meng door langzaam op en neer te pipetten en 5 minuten in RT in het donker in te broeden.
- Bereid compensatie kralen voor enkele vlekken. Voeg tot 1 mL FACS-buffer 4 druppels van elke positieve en negatieve kralen toe. Vortex grondig en voeg 100 μL kralen oplossing aan een 5 mL FACS buis.
- Bereid 4 tubes met kralen en label als CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC en CD62P-PE. Voeg 1 mL FACS buffer toe aan elke buis en centrifuge op 287 x g gedurende 5 minuten. Gooi supernatant weg en blijf op ijs.
- Voeg na RBC lysis 1 mL FACS-buffer toe aan elke buis en was zoals beschreven in 12,7. Gooi supernatant weg.
- Bereid antilichaamcocktails:
- MPA-paneel: Voeg 4 μL CD45-APC, 4 μL CD14-FITC en 4 μL CD41-BV421 toe aan 388 μL FACS-buffer.
- PA-paneel: Voeg 1,6 μL CD41-BV421 en 12 μL CD62P-PE toe aan 386,4 μL FACS-buffer.
- LI-paneel: Voeg 4 μL CD45-APC en 8 μL CD162-BV421 toe aan 388 μL FACS-buffer. Blijf op ijs.
- Enkele vlekken voorbereiden: Voeg 0,5 μL toe aan 499,5 μL FACS-buffer voor cd14-FITC, CD41-BV421 en CD45-APC. Voeg voor CD62P-PE 0,3 μL toe aan 499,7 μL FACS-buffer. Blijf op ijs.
- FMO-besturingselementen voorbereiden: (i) MPA-paneel (FMO-CD41): Voeg 1 μL CD14-FITC-antilichaam en 1 μL CD45-APC-antilichaam toe aan de 98 μL FACS-buffer. ii) PA-paneel (FMO-CD62P): Voeg 0,4 μL CD41-BV421 toe aan 99,6 μL FACS-buffer. iii) LI-paneel (FMO-CD162): Voeg 1 μL CD45-APC toe aan 99 μL FACS-buffer. Houd FMO-controles op ijs.
- Vortex antilichaam cocktails en voeg 100 μL van elke antilichaam cocktail zoals bereid in 12,12 aan elk van de respectieve gelabelde buizen (MPA, PA en LI paneel) zoals beschreven in 12.3 en meng zachtjes door pipetting op en neer. Blijf op RT in het donker.
- Vortex single stain antilichaam verdunningen en voeg 100 μL van de enkele vlek antilichaam verdunningen zoals bereid in 12.13. aan elk van de respectieve gelabelde buizen met kralen zoals beschreven in 12.7 en meng zachtjes door op en neer te pipetten. Blijf op RT in het donker.
- Vortex FMO antilichaam cocktails en voeg 100 μL van elke FMO-1 antilichaam cocktail zoals bereid in 12.14. op elk van de respectieve gelabelde buizen (FMO-controles) zoals beschreven in punt 12.5. en meng zachtjes door pipetting op en neer. Blijf bij RT in het donker.
- Incubeer alle buizen met antilichaam kleuring gedurende 30 minuten op RT in het donker.
- Neem de drie buizen voor niet-bevlekte besturing (zie 12,4) en resuspend pellet in 250 μL facs buffer. Blijf op ijs.
- Na de incubatietijd was je alle buizen behalve niet-bevlekte bediening één keer met facs-buffer zoals beschreven in 12.7. Resuspend pellet in 250 μL facs buffer en het verwerven van gegevens over de stroom cytometer.
- Gebruik niet-gekleurde cellen voor negatieve instellingen en compensatie muis kralen voor positieve instellingen in FACS software. Verder, gebruik FMO om de gating strategie te controleren, waar FMO-CD41 wordt gebruikt in MPA paneel, FMO-CD62P wordt gebruikt in PA paneel en FMO-CD162 wordt gebruikt in LI paneel.
- Verwerf bijna 0,5 x 106 - 0,25 x 106-gebeurtenissen per buis voor FACS. Sla gegevens op en analyseer met een analysesoftware (versie 9.9.6).
Representative Results
Alle gepresenteerde gegevens, met uitzondering van FACS plots, werden geanalyseerd met een statistische software. De FACS percelen werden geanalyseerd met behulp van flow cytometrie software.
De analyse van het aantal bloedcellen in het hele bloed heeft geen significante verschillen laten zien met betrekking tot erytrocyten tussen alle geteste omstandigheden (figuur 2). Maar, bloedplaatjes en leukocyten werden drastisch verminderd in de latex groep, wat wijst op een zeer slechte biocompatibiliteit van latex. Dit wordt verder onderstreept door verhoogde niveaus van vrije hemoglobine in de latex-groep, wat aangeeft dat, met uitzondering van de latexgroep, geen van de andere vasculaire apparaten of aandoeningen leidde tot uitgebreide hemolyse(figuur 2). Verder leidden de gecoate PVC-buizen, polyPVC en hepPVC, evenals de geteste stent niet tot trombose door middel van bloedplaatjes en leukocytenverlies, terwijl latex het hoogste plaat- en leukocytenverlies vertoonde, gevolgd door ongecoate PVC-buizen die een verminderde trend vertoonden.
Terwijl alle geteste vasculaire apparaten leidden tot een verhoogde activering van het stollingssysteem (FPA) en complementcomponent (sC5b-9), vertoonden de hepPVC-lussen een trend voor verminderde niveaus van FPA en sC5b-9 in vergelijking met polyPVC-lussen(figuur 3). Interessant is dat ongecoate PVC- en Gap-lussen lagere niveaus van FPA vertoonden in vergelijking met polyPVC, maar het niveau van statistische significantie niet bereikten. Niettemin vertoonden latex lussen aanzienlijk verhoogde niveaus van FPA in vergelijking met baseline en statische omstandigheden.
In overeenstemming met de tellingen van de gehele bloedcellen vertoonden latexlussen de hoogste niveaus van TNF, IL-6 en PMN elastase (figuur 4), het bereiken van het niveau van statistische significantie in vergelijking met de rest van de groepen in termen van TNF en IL-6 (figuur 4A,B), terwijl statische en basislijnomstandigheden in termen van PMN elastase (figuur 4C). Deze resultaten wijzen op de krachtige activering van leukocyten door latex. De basislijnniveaus van activeringsmarkers waren altijd vergelijkbaar met statische omstandigheden, wat wijst op een juiste heparinisatie van het bloed.
Interessant is dat werd aangetoond dat bloedplaatjes en leukocyten telt voor gap geïnduceerde lussen waren slechts licht verminderd met matige activering van het coagulatorium systeem (FPA) en leukocyten (PMN elastase), hoewel onjuiste lus sluiting met de resulterende stroom turbulenties en bloedcontact met de ongecoate, ruwe snijoppervlak leidde tot macroscopisch zichtbare stolsels op de splice (Figuur 1F). De stolsels en de verdeling ervan over het hele splice oppervlak waren duidelijk met μCT en SEM beelden, terwijl er geen stolsel werd gevonden toen de lussen werden gesloten met de externe sluiting apparaat waardoor er geen kloof tussen de lus uitgangen (Figuur 5).
Flow cytometrische analyse van host bloedcellen die waren gekleurd met bloedplaatjes specifieke markers, CD41 en bloedplaatjes activering marker CD62P, worden weergegeven in figuur 6A, B. Hier, de latex buizen tentoongesteld buitengewoon hoge mediane fluorescentie intensiteit (MFI) voor CD62P op bloedplaatjes, gevolgd door stent, terwijl heparine gecoate polyPVC buizen tentoongesteld minimale activering van bloedplaatjes beeltenis van anti-trombogene eigenschap van polyPVC buizen. Bovendien werden leukocyten ingedeeld op basis van de cd45 en SSC (side scatter) gebaseerde granulariteit in (i) granulocyten; ii) monocyten en (iii) lymfocyten (figuur 7), en de uitdrukking van CD162+ integrin werd gedetecteerd op elke subpopulatie van leukocyten waarvan bekend is dat ze interageren met de CD62P op bloedplaatjes24. Het werd opgemerkt dat de integrin uitdrukkingen drastisch werden verminderd op granulocyten en lymfocyten in latex lussen. Dit resultaat was in overeenstemming met verlaagde niveaus van de totale frequenties van leukocyten in de latexlussen (figuur 2). In het algemeen waren de integrinniveaus hoger onder monocyten in vergelijking met granulocyten en lymfocyten, wat de kans op de monocyteninteractie met geactiveerde bloedplaatjes aangeeft. In dit verband werden monocyt bloedplaatjes aggregaten ook geëvalueerd door de bloedcellen te bevlekken met CD14 (als monocytenmarkering) en CD41 (als bloedplaatjesmarker) en uiteindelijk dubbele positieve cellen te identificeren, d.w.z. CD14+CD41+MPA(figuur 8). Hier merkten we dat de stentgroep de hoogste cd41-expressie op de MPA vertoonde, gevolgd door de latex-groep, wat wijst op een verhoogde neiging om MPA te vormen, ondanks de verminderde frequentie van monocyte (<1 %) in de latex lussen.
Figuur 1: Overzicht van het in vitro hemodynamische lusmodel en de wijzigingen daarvan. (A) Loop voor de kloof experiment met externe lus sluiten systeem, waardoor er geen gat op de splice. (B) Loop gemaakt van polyPVC gecoate PVC buis en stent binnen (pijl). (C) Loop gemaakt van latex buis. (D) Loop voor de gap experiment zonder de externe lus sluiten systeem waardoor een kloof tussen de buis eindigt (pijl). (E) Lussen geplaatst in de lus wieg in het water bad en gevuld met bloed. (F) Trombus resulterend in een gat op de splice (pijl) na rotatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Resultaten voor het aantal bloedcellen en plasmahemoglobine. (A) Erythrocyten tellen. (B) Bloedplaatjes tellen. (F) Leukocyten tellen. (D) Gratis plasma hemoglobine. De resultaten wijzen op de slechte biocompatibiliteit van latex, wat leidt tot overmatige hemolyse. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde waarde; foutbalken geven SEM. n=1 aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Resultaten voor activering van het stollings- en complementsysteem. a) Activering van stollingssysteem, gemeten aan de geperciteerd door de niveaus van Fibrinopeptide A (FPA) (B) Aanvulling van de systeemactivering, gemeten aan de gedes te houden met sC5b-9. Terwijl latex buizen opgeroepen aanzienlijke verhoogde niveaus van de FPA, de aanvulling activering was sterk voor alle geteste materialen. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde waarde, foutbalken geven SEM aan. *p<0,05, n=1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Leukocyte activeringsmarkeringen. (A) Tumor necrose factor alpha (TNF). b) Interleukine 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. De resultaten wijzen op een verhoogde activering van leukocyten als gevolg van verhoogde niveaus van de geanalyseerde markers, gevolgd door stentlussen, die alleen maar leidden tot verhoogde niveaus voor PMN Elastase, maar niet TNF of IL-6. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde waarde, foutbalken geven SEM aan. * p<0.5; **p<0,01, n=1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Beeldvorming van de splice van de lussen. (A) μ-computertomografie (μCT) van lussen met onjuiste sluiting (tussenruimte). De rode gebieden geven trombusmateriaal aan. (B) Weergave van de luminale zijde van de buis. De rechthoekige selectie geeft het gebied aan voor het scannen van elektronenmicroscopie (SEM)(C). (D) μCT van lussen met externe lussluitingsinrichting en geen opening op de splice en (E) rendering en weergave van het luminale oppervlak. Er is geen trombusmateriaal gevonden. (F) SEM-afbeelding van de rechthoekige selectie in (E). Op het snijvlak werd geen trombusmateriaal gevonden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: FACS-plot voor bloedplaatjesactivering (CD62P). (A) Representatieve FACS-plot (basisvoorwaarde) met de bloed-CD41+ bloedplaatjes. (B) Grafiek met de activeringsstatus van bloedplaatjes die wordt weerspiegeld door de gemiddelde fluorescentieintensiteit (MFI) van de verschillende soorten vasculaire hulpmiddelen in vergelijking met de statische RT- en basislijnomstandigheden. De gegevensbalken presenteren gegevens van afzonderlijke metingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: FACS-plot voor leukocyte integrin (CD162). (A) Representatieve FACS-plot (basisvoorwaarde) met de bloed-CD45+ leukocyten en subgroepen (B) Grafiek met de leukocyte CD162+ integrin gemiddelde fluorescentieintensiteit (MFI) van de verschillende soorten vasculaire hulpmiddelen in vergelijking met de statische en basislijnomstandigheden. De gegevensbalken presenteren gegevens van afzonderlijke metingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: FACS-plot voor platelet monocyte aggregaten (CD41/CD14). (A) Representatieve FACS-plot (basisvoorwaarde) met de gating voor bloedmonocyten (CD45+/CD14+), bloedplaatjes (CD41+) en monocytenplaatjes aggregaten (CD41+/CD14+) (B) Grafiek met de CD41+ gemiddelde fluorescentieintensiteit (MFI) op monocyteplaatplaatjes aggregaten voor de verschillende vasculaire apparaten in vergelijking met de statische en omstandigheden. De gegevensbalken presenteren gegevens van afzonderlijke metingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Deze studie heeft aangetoond dat het gepresenteerde in vitro hemodynamische lusmodel een betrouwbare methode biedt voor het testen van de in vitro bloedcompatibiliteit van medische hulpmiddelen in overeenstemming met de ISO 10993-4-norm.
Kritische stappen in het protocol zijn het trekken van bloed en het vullen van de buizen met bloed, waarbij overmatige vacuüm of agitatie moet worden vermeden om te voorkomen dat de bloedbestanddelen door de behandelingsprocedure worden geactiveerd. Bovendien is het erg belangrijk om de plasmamonsters onmiddellijk te bevriezen en ze na het ontdooien op ijs te houden, omdat de activering van het complement- en stollingssysteem kan worden geknoeid door de monsters langer op kamertemperatuur te houden.
Aangezien dit model zowel verdiensten als verdiensten heeft in vergelijking met andere in vitro modellen, moet bij het ontwerpen van de experimenten rekening worden gehouden met verschillende factoren.
Ten eerste kunnen de lussen worden gevarieerd in lengte en diameter om verschillende experimentele opstellingen te passen. In het geval dat de opstelling contrasterende buizen van verschillende binnendiameters bevat, moet in gedachten worden gehouden dat de verschillen in diameter zullen resulteren in verschillende afschuifkrachten, waardoor de stolling wordt beïnvloed en cascade7wordt aangevuld. Ten tweede werd de rotatiesnelheid in dit experiment ingesteld op 30 rpm. Dit zal resulteren in een bloedstroom van ongeveer 25 cm/s, die vergelijkbaar is met de bloedstroomsnelheid in menselijke coronaire bypass grafts25. De stamsnelheid, gegenereerd door de rotatie van de lussen, is de belangrijkste parameter die biochemische cascades van bloedbestanddelen zal initiëren, waaronder cellen en celvrije eiwitten. Maar omdat bloed een niet-Newtoniaanse vloeistof is, zal de stamsnelheid ook worden beïnvloed door de buiskromming, respectievelijk de lengte van de buizen die zijn gesloten voor lussen10. Wanneer de rotatiesnelheid of lusgrootte wordt gewijzigd, is het belangrijk om te bedenken dat de correlatie tussen spanningssnelheid en rotatiesnelheid niet lineair is. De correlatie tussen de rotatiesnelheid en de spanningssnelheid wordt tot op de dag van vandaag onvoldoende onderzocht en verdere studies zijn nodig om deze specifieke parameters10,26,27te onderzoeken . Echter, op basis van een model voor laminaire grenslaag, de opgegeven buisdiameter van 5 mm en de rotatiesnelheid van 25 cm/s, een ruwe schatting van de muurschuifspanning (W SS) zou waarden tussen 2.20-22.00 pascal voor een afstand van 1.00-0,01 mm aan de muur van de buis aangeven wanneer de bloeddichtheid wordt geschat op 1060 kg*m-3 en de kinetische viscositeit is ingesteld op 0,0025 pascal*s28,29. Interessant, ook een meer gedetailleerde computationele analyse van de stroomdynamiek in de kromming van menselijke kransslagaders toonde WSS waarden variërend van 11,33 tot 16,77 pascal op ongeveer vergelijkbare parameters voor de snelheid, dichtheid en viscositeit van het bloed30.
Naast deze beperking is het gepresenteerde lusmodel een drukloos systeem, dat de intravasculaire bloeddrukverhoudingen van het menselijke vasculaire systeem niet nabootst.
De volgende belangrijke beperking is dat het bloed in contact is met lucht in de lussen, wat extra storingen met zich meebrengt. Een dergelijk bloed-luchtcontact wordt beïnvloed door twee parameters, waaronder de gasdoorlaatbaarheid van de buizen en het vasthouden van lucht in de lussen terwijl ze met bloed worden gevuld. Elk buismateriaal beschikt over een bepaalde gaspermeabiliteit die kan leiden tot significante veranderingen in de gasconcentraties in de buizen. Hoewel sommige auteurs stellen dat het resulterende effect van de gasdoorlaatbaarheid op de activering van bloedbestanddelen onduidelijk blijft31, is het bekend dat de functie van de bloedstollatoren zeer gevoelig is voor een pH-shift, die kan worden veroorzaakt door CO2-diffusie 32,33,34. Hier hebben we de biocompatibiliteit van bloedperfusiebuizen getest onder binnenluchtomstandigheden, vergelijkbaar met klinische scenario's van extracorporale bloedperfusie. Voor toekomstige verbeteringen van het gepresenteerde model kan het nuttig zijn om dit model verder te standaardiseren.
Ook kan de bloed-lucht interface binnen de lussen leiden tot activering van plasma-eiwitten en celfracties van het bloed35,36. De roller pomp aangedreven apparaten zonder lucht in de buizen kan voorkomen dat de afgifte van bloed-lucht interface, maar ze zeker leiden tot schade aan bloedcellen met aanzienlijke verhoogde niveaus van hemoglobine in vergelijking met de hier gepresenteerde lus model, en de hemoglobine in plasma kan interfereren met de gevoeligheid van geteste analyten in ELISA16. In deze studie hebben we aangetoond dat het hemolytische effect van het lusmodel zelf minimaal blijft bij gebruik van biocompatibele materialen zoals heparine gecoate PVC-buizen. Zo veroorzaakt het model aan de ene kant geen overmatige celschade in vergelijking met pompaangedreven modellen, maar aan de andere kant het opwekken van plasma-eiwitten als gevolg van bloedluchtcontact. Van Oeveren et al. ontwikkelde een kogelklepgebaseerd lusmodel dat lucht in de lussenvermijdt 16. Dit veelbelovende alternatief voor de hier gepresenteerde lus model kan het probleem van de bloed-air-interface te overwinnen, echter, in vergelijking met het model hier gepresenteerd, bloedplaatjes hechting is nog steeds hoger voor de kogel-klep gebaseerde lus model.
Met betrekking tot de statische controle, is het van belang dat glas zelf is aangetoond dat een krachtige activator van het coagulatoriumsysteem 37. In de gepresenteerde opstelling leidde incubatie in een glazen beker (statische controle) echter niet tot overmatige activering of activering van de gastheercel in vergelijking met de basiswaarden direct na het tekenen van het bloed. Tot slot kan het nuttig zijn om bijvoorbeeld polypropyleenbuizen te gebruiken als de statische controle een hoge activeringsniveaus vertoont.
Of het nu gaat om een lus of een pompgestuurd model, deze in vitro modellen missen volledig de authentieke biologische interacties die voornamelijk worden bijgedragen door een intact endotheel, een ideaal bloedcontactoppervlak. De reden achter dit probleem is duidelijker wanneer een medisch apparaat zoals een stent wordt getest, die verschillende uitkomsten zou kunnen geven, in termen van activering en plasma-eiwitten, tijdens de interactie met bloedbestanddelen in aanwezigheid van endotheel. Dit verklaart een groot nadeel van alle besproken in vitro systemen nabootsen van de bloedsomloop. Om dit probleem op te lossen, winnen nieuwe microfluïde systemen die volledig bedekt zijn met endotheel immense belangstelling, maar toch, in vergelijking met het hier gepresenteerde lusmodel, zijn ze nog steeds beperkt tot kleinere bloedvolumes en minimale stroomsnelheden38,39
Zo concluderen we dat het Chandler Loop-model nog steeds een robuust model is voor het uitvoeren van gestandaardiseerde tests op de biocompatibiliteit van vasculaire medische hulpmiddelen op het gebied van cardiovasculair onderzoek.
Disclosures
De financier [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Duitsland] verstrekte een financiële steun in de vorm van verbruiksgoederen en publicatiekosten aan de auteur van dit manuscript [Max Wacker]. De financiers hadden geen extra rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Acknowledgments
De auteurs zijn mevrouw Elena Denks dankbaar voor haar technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml tube, K3 EDTA | Sarstedt | 32332 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | Becton Dickinson BioSciences | 552843 | |
| APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | |
| BD LSR Fortessa II cell analyzer | Becton Dickinson | 647465 | |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | Becton Dickinson | 369714 | |
| BD Vacutainer one-use holder | Becton Dickinson | 364815 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok butterfly canula 21 G | Becton Dickinson | 367282 | |
| Beaker glass ROTILABO short 10 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X686.1 | |
| Beaker glass ROTILABO short 50 ml | Carl Roth GmbH + Co. KG | X688.1 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD162 Antibody | BioLegend | 328808 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human CD41 Antibody | BioLegend | 303730 | |
| Centrifuge ROTINA 420 | 420 R | Hettich Zentrifugen | 4701 | 4706 | |
| Centrifuge tubes, 50 ml | Greiner Bio-One GmbH | 227261 | |
| CHC Super modified, 5mm PVC tubing | Corline Sweden | 1807-148 | Referred to as hepPVC tube |
| Circular Precision Cutter | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 007-20 | |
| Closing Unit (complete with tension bands) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 008-20 | |
| Electric tape Scotch Super 33+ | VWR | MMMA331933 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human IL-6 | BioLegend | 430504 | |
| ELISA MAX Deluxe Set Human TNF-a | BioLegend | 430204 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,1 – 2,5 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000012 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 0,5 – 10 µL, gray | Eppendorf AG | 3123000020 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 10 – 100 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000047 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 100 – 1,000 µL, blue | Eppendorf AG | 3123000063 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. box, 20 – 200 µL, yellow | Eppendorf AG | 3123000055 | |
| Eppendorf Pipette Research plus, single channel, inkl. epT.I.P.S. sample bag, 0,5 – 5 mL, violet | Eppendorf AG | 3123000071 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| FACS tubes polystyrene 5.0 ml round bottom | Corning BV | 352052 | |
| Fetal bovine serum Gold Plus | Bio-Sell | FBS.GP.0500 | |
| FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 367116 | |
| Fluency plus stent 13.5 x 60 mm | Angiomed GmbH & Co | FVM14060 | |
| Free Hemoglobin fHb Reagent | Bioanalytics GmbH | 004001-0250 | |
| Gibco PBS Tablets | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Gloves Vasco Nitril white L | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208437 | |
| Gloves Vasco Nitril white M | B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG | 9208429 | |
| Glutaraldehyde 25% aequous solution | Sigma Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, 25.000 IE in 5 ml | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN 3862340 | |
| Human Fibrinopeptide A (FPA) ELISA Kit | Hölzel Diagnostika | abx253234 | |
| Kodan tincture forte colourless | Schülke & Mayr GmbH | 104012 | |
| Latex tube, ID 5 mm | Laborhandel24 GmbH | 305 0507 | |
| Loop Stand | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 009-20 | |
| Medimex venous tourniquet classic | ROESER Medical GmbH | 310005 | |
| Microplate reader Infinite 200 Pro M Plex | Tecan | TEC006418I | |
| Microplate shaker PMS-1000i | VWR | 444-0041 | |
| Nalgene Metric non-phthalate PVC tubing, ID 5 mm | VWR | NALG8703-0508 | Referred to as PVC tube |
| NexTemp (Standard) Single-Use Clinical Thermometer | Medical Indicators | 2112-20 | |
| Nunc MaxiSorp ELISA Plates, uncoated | BioLegend | 423501 | |
| Osmium tetroxide solution | Fisher Scientific | 10256970 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| PE anti-human CD16Antibody | BioLegend | 302008 | |
| PE anti-human CD62P (P-Selectin) Antibody | BioLegend | 304906 | |
| Pipette controller, pipetus | VWR | 612-1874 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. 0.2 - 5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5186480 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 0,1 - 10µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 9409410 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 2 - 200µl | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.870 | |
| Pipette tips epT.I.P.S. standard 50 - 1000µl blue | Th. Geyer GmbH & Co. KG | 0030 000.919 | |
| PMN (Neutrophil) Elastase Human ELISA Kit | Fisher Scientific | BMS269 | |
| Probe stand ROTILABO combi | CARL ROTH | K082.1 | |
| Rack for rotation unit (12 slots 3/8 '' with variable slot width) | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 011-20 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
| Reagent reservoirs | VWR | 613-1184 | |
| Rotation Unit | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 010-20 | |
| Safe-Lock micro test tubes 0.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409320 | |
| Safe-Lock micro test tubes 1.5 ml | OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG | 5409331 | |
| sc5b9 Human ELISA KIT | TECOmedicalGroup | A029 | |
| Scalpel no 10 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scanning electron microscope XL30 ESEM-FEG | Philips | n.a. | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 1000 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X715.1 | |
| Screw top bottle ROTILABO Clear glass, 500 ml, GL 45 | Carl Roth GmbH + Co. KG | X714.1 | |
| Semi-micro cuvette 1.6 ml | Sarstedt | 67.746 | |
| Serological pipette 10.0 ml | Corning BV | 4488 | |
| Serological pipette, 25.0 ml | Corning BV | 4489 | |
| Serological pipette, 5.0 ml | Corning BV | 4487 | |
| Silicon tube, inner diameter 8 mm, outer diameter 12 mm | VWR | BURK8803-0812 | |
| Sprout mini centrifuge | Biozym | 552034 | |
| Stop Solution for TMB Substrate | BioLegend | 77316 | |
| Swabs, sterile | Fuhrmann GmbH | 32055 | |
| Syringe, 10 ml | Becton Dickinson | 300296 | |
| Temperature controlled water basin | ebo kunze industriedesign, Neuffen, Germany | CLS 020-20 | |
| tert-Butanol, 99.5%, extra pure, ACROS Organics | Fisher Scientific | 10000730 | |
| TMB Substrate Set | BioLegend | 421101 | |
| Trillium PVC tube, 5 mm ID | Medtronic | 161100107100103 | Referred to as polyPVC tube |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0250 | |
| UV-Vis Spektrometer Lambda 2 | Perkin Elmer | 33539 | |
| Vornado Mini Vortexer | Biozym | 55BV101-B-E | |
| XN-3000 workstation blood analyzer | Sysmex Europe | n.a. | |
| μ-CT Phoenix Nanotom S | GE Sensing & Inspection, Wunstorf, Germany | n.a. |
References
- International Organisation for Standardisation. DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood. International Organisation for Standardisation. , (2017).
- Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum. Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).
- Maiolini, R., et al. A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor. Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).
- Shapiro, H. M. Flow Cytometry: The Glass Is Half Full. Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).
- Betke, U., et al. Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study. Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus. Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).
- Fink, H., et al. An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).
- Lenz-Habijan, T., et al. Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model. Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).
- Olsen, A. L., Long, M. Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).
- Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).
- Feyerabend, F., et al. Blood compatibility of magnesium and its alloys. Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).
- Lukas, K., et al. Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane. Materials. 10 (4), Basel, Switzerland. 355 (2017).
- Paul, A., et al. Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).
- Link, A., et al. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. Journal of Visualized Experiments. (157), e60610 (2020).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. 2012, 673163 (2012).
- Maa, Y. F., Hsu, C. C. Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface. Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).
- Fletcher, E. A. K., et al. Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics. International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue. Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).
- Gong, J., et al. Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model. Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).
- Tevaearai, H. T., et al. Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility. The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).
- Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils. Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).
- Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries. Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).
- Gardner, R. A. An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).
- Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis. Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).
- Böswirth, L. Technische Strömungslehre. 8 edn. , Springer Vieweg. (2010).
- Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers. Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).
- Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis. Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).
- Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space. Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).
- Foley, M. E., McNicol, G. P. An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage. The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).
- Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study. The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).
- Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood. Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).
- Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface. Micromachines. 11 (1), Basel. 18 (2019).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
