प्रोटीन का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक उभरती हुई तकनीक है। विभिन्न सॉल्वेंट एडिटिव्स और लिगामेंट्स में विभिन्न हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी सफाई गुण होते हैं। विभिन्न परिस्थितियों में प्रोटीन संरचना की तुलना करने के लिए, प्रतिक्रिया में उत्पन्न हाइड्रोक्सिल कणों के वास्तविक समय के मुआवजे की प्रतिक्रिया स्थितियों को सामान्य करने के लिए आवश्यक है।
प्रोटीन का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (एफपीओपी) एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक है जो प्रोटीन के विलायक-सुलभ सतह क्षेत्र की जांच करती है। यह तकनीक हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स के साथ अमीनो एसिड साइड चेन की प्रतिक्रिया पर निर्भर करती है जो समाधान में स्वतंत्र रूप से फैलाना है। एफओपी हाइड्रोजन पेरोक्साइड के लेजर फोटोलिसिस द्वारा सीटू में इन कणों को उत्पन्न करता है, जो हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स का एक फट पैदा करता है जो माइक्रोसेकंड के क्रम पर समाप्त हो जाता है। जब ये हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स सॉल्वेंट-सुलभ अमीनो एसिड साइड चेन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, तो प्रतिक्रिया उत्पाद एक बड़े पैमाने पर बदलाव प्रदर्शित करते हैं जिसे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मापा और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। चूंकि अमीनो एसिड की प्रतिक्रिया की दर उस अमीनो एसिड की औसत सॉल्वेंट सुलभ सतह पर निर्भर करती है, इसलिए प्रोटीन के किसी दिए गए क्षेत्र के ऑक्सीकरण की मात्रा में मापा गया परिवर्तन विभिन्न अनुरूपों के बीच उस क्षेत्र की विलायक पहुंच में परिवर्तन से सीधे सहसंबद्ध हो सकता है (जैसे, लिगांड-बाउंड बनाम लिगांड-फ्री, मोनोमर बनाम कुल, आदि) एफपीओपी को जीव विज्ञान में कई समस्याओं में लागू किया गया है, जिसमें प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, प्रोटीन कॉन्फॉर्मेशनल बदलाव और प्रोटीन-लिगांड बाइंडिंग शामिल हैं । चूंकि हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथियों की उपलब्ध एकाग्रता एफओपी प्रयोग में कई प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर भिन्न होती है, इसलिए प्रभावी कट्टरपंथी खुराक की निगरानी करना महत्वपूर्ण है जिसके लिए प्रोटीन एनालिटे उजागर होता है। इस निगरानी को FPOP प्रतिक्रिया से संकेत को मापने के लिए एक इनलाइन डोसिमेटर को शामिल करके कुशलतापूर्वक प्राप्त किया जाता है, जिसमें ऑक्सीकरण की वांछित मात्रा को प्राप्त करने के लिए वास्तविक समय में लेजर फ्लूसेंस समायोजित किया जाता है। इस मुआवजे के साथ, प्रोटीन स्थलाकृति में परिवर्तन अनुरूप परिवर्तन, ligand बाध्यकारी सतहों को दर्शाती है, और/या प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन इंटरफेस अपेक्षाकृत कम नमूना मात्रा का उपयोग कर विषम नमूनों में निर्धारित किया जा सकता है ।
प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (FPOP) प्रोटीन के विलायक उजागर सतह क्षेत्र के अल्ट्रा-फास्ट सहसंयोजक संशोधन द्वारा प्रोटीन स्थलाकृतिक परिवर्तनों के निर्धारण के लिए एक उभरती हुई तकनीक है जिसके बाद एलसी-एमएस1द्वारा पता लगाया जाता है। एफओपी हाइड्रोजन पेरोक्साइड के यूवी लेजर फ्लैश फोटोलिसिस द्वारा सीटू में हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की उच्च सांद्रता उत्पन्न करता है। ये हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स बहुत प्रतिक्रियाशील और अल्पकालिक होते हैं, जो एफओपी शर्तों2के तहत लगभग एक माइक्रोसेकंड टाइमस्केल पर खपत होते हैं। ये हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स पानी के माध्यम से फैलते हैं और गतिज दरों पर समाधान में विभिन्न कार्बनिक घटकों को ऑक्सीकरण करते हैं आम तौर पर तेजी से (~ 106 एम-1 एस-1)से लेकरप्रसार-नियंत्रित 3तक। जब हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी एक प्रोटीन सतह का सामना करता है, तो कट्टरपंथी प्रोटीन सतह पर अमीनो एसिड साइड चेन को ऑक्सीकरण करेगा, जिसके परिणामस्वरूप उस अमीनो एसिड (आमतौर पर एक ऑक्सीजन परमाणु का शुद्ध जोड़)4का एक बड़ा बदलाव होगा। किसी भी अमीनो एसिड पर ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया की दर दो कारकों पर निर्भर करती है: उस अमीनो एसिड की अंतर्निहित प्रतिक्रियाशीलता (जो साइड चेन और अनुक्रम संदर्भ पर निर्भर करती है)4,,5 और उस साइड चेन की पहुंच डिफ्यूजिंग हाइड्रोक्सिल रेडिकल से होती है, जो औसत सॉल्वेंट सुलभ सतह क्षेत्र6,,7से निकटता से संबंधित है। ग्लाइसिन को छोड़कर सभी मानक अमीनो एसिड FPOP प्रयोगों में इन अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथियों द्वारा लेबल के रूप में देखा गया है, हालांकि व्यापक रूप से अलग पैदावार पर; व्यवहार में, सेर, थ्र, एसेन और अला को शायद ही कभी उच्च कट्टरपंथी खुराकों को छोड़कर अधिकांश नमूनों में ऑक्सीकृत के रूप में देखा जाता है और सावधान और संवेदनशील लक्षित ईटीडी विखंडन8, 9,द्वारा पहचानाजाताहै। ऑक्सीकरण के बाद, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और माध्यमिक ऑक्सीडेंट (सुपरऑक्साइड, सिंगलेट ऑक्सीजन, पेप्टिडाइल हाइड्रोपेरॉक्साइड आदि) को हटाने के लिए नमूने बुझाए जाते हैं। शमन नमूनों को ऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड्स के मिश्रण उत्पन्न करने के लिए प्रोटियोलिटिक रूप से पचाया जाता है, जहां संरचनात्मक जानकारी विभिन्न पेप्टाइड्स(चित्रा 1)के ऑक्सीकरण उत्पादों के पैटर्न में रासायनिक “स्नैपशॉट” के रूप में जम जाती है। उस पेप्टाइड के ऑक्सीकृत और अक्ओसीडीकृत संस्करणों की सापेक्ष तीव्रता के आधार पर दिए गए प्रोटियोलिटिक पेप्टाइड में अमीनो एसिड के ऑक्सीकरण की मात्रा को मापने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया जाता है। विभिन्न अनुरूप परिस्थितियों (उदाहरण के लिए, लिगांड-बाउंड बनाम लिगांड-मुक्त) के तहत प्राप्त एक ही प्रोटीन के इस ऑक्सीडेटिव पदचिह्न की तुलना करके, प्रोटीन के किसी दिए गए क्षेत्र के ऑक्सीकरण की मात्रा में अंतर सीधे उस क्षेत्र के विलायक-सुलभ सतह क्षेत्र में अंतर के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है6,,7। प्रोटीन स्थलाकृतिक जानकारी प्रदान करने की क्षमता प्रोटीन चिकित्सीय खोज और विकास10, 11,11सहित प्रोटीन के उच्च क्रम संरचना निर्धारण के लिए एफओपी एक आकर्षक तकनीक बनाती है।
चित्रा 1: FPOP का अवलोकन। प्रोटीन की सतह को अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हाइड्रोक्सिल कणों द्वारा सहसंयोजक रूप से संशोधित किया जाता है। हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स प्रोटीन की अमीनो एसिड साइड चेन के साथ एक दर पर प्रतिक्रिया करेंगे जो साइड चेन की सॉल्वेंट पहुंच से दृढ़ता से प्रभावित होता है। स्थलाकृतिक परिवर्तन (उदाहरण के लिए, ऊपर दिखाए गए लिगामेंट के बाध्यकारी के कारण) हाइड्रोक्सिल कणों के साथ प्रतिक्रिया करने से बातचीत के क्षेत्र में अमीनो एसिड की रक्षा करेगा, जिसके परिणामस्वरूप एलसी-एमएस सिग्नल में संशोधित पेप्टाइड की तीव्रता में कमी आएगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
एफओपी समाधान में मौजूद विभिन्न घटकों (उदाहरण के लिए, लिगांड, एक्सपिएजेंट्स, बफ़र्स) में हाइड्रोजन पेरोक्साइड3के लेजर फोटोलिसिस पर उत्पन्न हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की ओर अलग-अलग सफाई गतिविधि होती है। इसी तरह, पेरोक्साइड एकाग्रता, लेजर फ्लूसेंस और बफर संरचना में एक छोटा सा परिवर्तन प्रभावी कट्टरपंथी खुराक को बदल सकता है, जिससे नमूनों में और विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच एफपीओपी डेटा का प्रजनन चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसलिए , यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक नमूने में प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए उपलब्ध हाइड्रोक्सिल रेडिकल डोज की तुलना करने में सक्षम होना चाहिए, जिसमें से एक कई उपलब्ध हाइड्रोक्सिल रेडिकल डोसीमीटर12,13 ,14,15,16में16से एक है । हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी कणों के पूल के लिए एनालिट (और समाधान में सभी सफाई कर्मियों के साथ) के साथ प्रतिस्पर्धा करके हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी डोसिमेटर कार्य करते हैं; हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की प्रभावी खुराक को डोसिमीटर के ऑक्सीकरण की मात्रा को मापकर मापा जाता है। ध्यान दें कि “प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक” हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी उत्पन्न की प्रारंभिक एकाग्रता और कट्टरपंथी के आधे जीवन दोनों का एक कार्य है। ये दोनों पैरामीटर आंशिक रूप से एक-दूसरे पर निर्भर हैं, जिससे सैद्धांतिक गतिज मॉडलिंग कुछ जटिल(चित्रा 2)हो जाती है । दो नमूनों बेतहाशा अलग प्रारंभिक कट्टरपंथी आधा जीवन हो सकता है, जबकि अभी भी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी का गठन की प्रारंभिक एकाग्रता को बदलने के द्वारा एक ही प्रभावी कट्टरपंथी खुराक को बनाए रखने; वे अभी भी समान पैरों के निशानउत्पन्न करेंगे 17. एडेनिन13 और ट्राइस12 सुविधाजनक हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी डोसीमीटर हैं क्योंकि ऑक्सीकरण के उनके स्तर को वास्तविक समय में यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जा सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक के साथ समस्या होने पर जल्दी से पहचानने और उनकी समस्या का निवारण करने की अनुमति मिलती है। इस समस्या को हल करने के लिए, विकिरण की साइट के बाद सीधे प्रवाह प्रणाली में स्थित एक इनलाइन डोसिमेटर जो वास्तविक समय में एडेनिन अवशोषण परिवर्तनों से संकेत की निगरानी कर सकता है महत्वपूर्ण है। यह बफ़र्स या किसी अन्य एक्सपिएजेंट में एफपीओपी प्रयोगों को करने में मदद करता है जिसमें हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी मैला ढोने की क्षमता17के व्यापक रूप से भिन्न स्तर हैं । इस कट्टरपंथी खुराक मुआवजा वास्तविक समय में किया जा सकता है, प्रभावी कट्टरपंथी खुराक को समायोजित करके एक ही अनुरूप के लिए सांख्यिकीय अविवेच्य परिणाम उपज ।
इस प्रोटोकॉल में, हमारे पास आंतरिक ऑप्टिकल कट्टरपंथी डोसिमेटर के रूप में एडेनिन का उपयोग करके कट्टरपंथी खुराक मुआवजे के साथ एक विशिष्ट एफओपी प्रयोग करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं हैं। यह विधि जांचकर्ताओं को एफपीओपी स्थितियों में पैरों के निशान की तुलना करने की अनुमति देती है जिनमें वास्तविक समय में मुआवजा देकर अलग-अलग सफाई क्षमता होती है।
चित्रा 2: डोसिमेट्री-आधारित मुआवजे का काइनेटिक सिमुलेशन। 1 एमएमए एडीन डोसिमेटर प्रतिक्रिया को 1 एमएम प्रारंभिक हाइड्रोक्सिल रेडिकल एकाग्रता (▪ओएच टी1/2=53 एनएस) के साथ 5 माइक्रोन लिसोजिमे विश्लेषण में मापा जाता है, और एक लक्ष्य डोसिमेटर प्रतिक्रिया (काला) के रूप में निर्धारित किया जाता है। मेहतर के 1 mm के अलावा हिस्टिडीन उत्तेजित, डोसिमेटर प्रतिक्रिया (नीला) आनुपातिक तरीके से प्रोटीन ऑक्सीकरण की मात्रा के साथ कम हो जाती है (सियान)। हाइड्रोक्सिल रेडिकल का आधा जीवन भी कम हो जाता है (▪ओएच टी1/2=39 एनएस)। जब हाइड्रोक्सिल रेडिकल उत्पन्न की मात्रा में वृद्धि होती है, तो 1 एमएम हिस्टिडीन मेहतर के साथ नमूने में ऑक्सीडाइज्ड डोसिमेटर की बराबर उपज देने के लिए, जैसा कि मेहतर (लाल) की अनुपस्थिति में 1 एमएम हाइड्रोक्सिल रेडिकल के साथ हासिल किया जाता है, तो प्रोटीन ऑक्सीकरण की मात्रा जो होती है वह समान (मैजेंटा) हो जाती है, जबकि हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी आधा जीवन और भी कम हो जाता है (▪ ओह टी1/2=29 ns) । शार्प जेएस, एएम फार्मासियूट रेव 22, 50-55, 2019 से अनुमति के साथ अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित संरचनात्मक तकनीकों, जिसमें हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज, रासायनिक क्रॉस-लिंकिंग, सहसंयोजक लेबलिंग, और देशी स्प्रे मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आयन गतिशीलता शामिल ह?…
The authors have nothing to disclose.
हम राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान अनुदान R43GM125420-01 से अनुसंधान वित्तपोषण को स्वीकार करते हैं, जो उच्च ऊर्जा एफओपी के लिए मानकीकरण और डॉसिमेट्री प्रोटोकॉल के विकास के लिए एक बेंचटॉप एफपीओपी डिवाइस और R01GM127267 के वाणिज्यिक विकास का समर्थन करता है।
Adenine | Acros Organics | 147440250 | Soluble in water upto 3.5 mM |
Aperture | Edmund Optics | 39-905 | 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture |
Aperture holder | Edmund Optics | 53-287 | 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount |
Catalse | Sigma Aldrich | C-40 | Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein |
COMPex Pro laser | Coherent | 1113836 | COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl |
Dithiotheitol (DTT) | Promega | V3151 | DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) |
Fraction collector | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Automated fraction collector |
Fused silica capillay | Molex | 1068150023 | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375 |
Glutamine | Acros Organics | 119951000 | L(+)-Glutamine, 99% |
Holder for lens | Edmund Optics | 03-668 | 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical |
LC-MS/MS system | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer |
Mas spec grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-1 | Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade formic acid | Fisher Scientific | A117-50 | Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade water | Fisher Scientific | W6-4 | Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
MES buffer | Sigma Aldrich | M0164 | MES hemisodium salt |
Methionine amide | Bachem | 4000594.0005 | H-met-NH2.HCl |
Micro V clamp | Thor Labs | VK250 | Micro V-clamp with stainless steel blades |
Motorized stage | Edmund Optics | 68-638 | 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control |
Nano C18 colum | Thermo Scientific | 164534 | Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Optical bench | Edmund Optics | 56-935 | 18" x 18" breadboard |
Pioneer FPOP Module System | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Inline FPOP Radical Dosimetry System |
Post holder | Edmund Optics | 58-979 | 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP331-500 | Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents |
Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP330-500 | Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents |
Syringe | Hamilton | 81065 | 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3 |
Syringe pump | KD Scientific | 788101 | Legato 101 syringe pump |
Trap C18 column | Thermo Scientific | 160454 | Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Tris | Sigma Aldrich | 252859 | Tris(hydroxymethyl)aminomethane |
Trypsin | Promega | V5111 | Sequencing Grade Modified Trypsin |
UV plano convex lens | Edmund Optics | 84-285 | 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens |