Permitindo compensação em tempo real em oxidações fotoquímicas rápidas de proteínas para a determinação de mudanças de topografia de proteínas

Resumo

A oxidação fotoquímica rápida das proteínas é uma técnica emergente para a caracterização estrutural das proteínas. Diferentes aditivos e ligantes de solventes têm variadas propriedades de limpeza radical hidroxyl. Para comparar a estrutura proteica em diferentes condições, a compensação em tempo real dos radicais hidroxis gerados na reação é necessária para normalizar as condições de reação.

Resumo

A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) é uma técnica de biologia estrutural baseada em espectrometria de massa que sonda a área de superfície acessível de solventes das proteínas. Esta técnica se baseia na reação de cadeias laterais de aminoácidos com radicais hidroxil livremente difundindo em solução. FPOP gera esses radicais in situ por fotolise laser de peróxido de hidrogênio, criando uma explosão de radicais hidroxil que está esgotado na ordem de um microssegundo. Quando esses radicais hidroxis reagem com uma cadeia lateral de aminoácidos acessível a solventes, os produtos de reação exibem uma mudança de massa que pode ser medida e quantificada pela espectrometria de massa. Uma vez que a taxa de reação de um aminoácido depende, em parte, da superfície acessível de solvente médio desse aminoácido, mudanças medidas na quantidade de oxidação de uma determinada região de uma proteína podem estar diretamente correlacionadas com mudanças na acessibilidade solvente daquela região entre diferentes conformações (por exemplo, ligadura versus sem ligante, monômero vs. agregado, etc.) O FPOP tem sido aplicado em uma série de problemas na biologia, incluindo interações proteína-proteína, alterações conformacionais proteicas e ligação proteína-ligante. Como a concentração disponível de radicais hidroxilas varia de acordo com muitas condições experimentais no experimento FPOP, é importante monitorar a dose radical eficaz à qual o analito proteico é exposto. Este monitoramento é eficientemente alcançado incorporando um dosímetro inline para medir o sinal da reação FPOP, com fluência laser ajustada em tempo real para alcançar a quantidade desejada de oxidação. Com essa compensação, mudanças na topografia proteica refletindo alterações conformais, superfícies de ligação de ligantes e interfaces de interação proteína-proteína podem ser determinadas em amostras heterogêneas usando quantidades amostrais relativamente baixas.

Introdução

A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) é uma técnica emergente para a determinação de alterações topográficas proteicas por modificação covalente ultrarrápida da área de superfície exposta ao solvente de proteínas seguida pela detecção por LC-MS¹. FPOP gera uma alta concentração de radicais hidroxílicos in situ por fotolise flash laser UV de peróxido de hidrogênio. Esses radicais hidroxis são muito reativos e de curta duração, consumidos em aproximadamente uma escala de tempo microssegundos sob as condições FPOP². Esses radicais hidroxis se difundem através da água e oxidam vários componentes orgânicos em solu....

Protocolo

1. Prepare o Banco Óptico e o Capilar para FPOP

ATENÇÃO: Os lasers excimer krf são perigos extremos dos olhos, e a luz direta ou refletida pode causar danos permanentes nos olhos. Use sempre proteção ocular adequada, evite a presença de quaisquer objetos reflexivos perto do caminho do feixe quando possível, e use controles de engenharia para impedir o acesso não autorizado a um laser ativo e conter quaisquer reflexos perdidos.

1. Prepare o banco óptico FPOP.
   1. Ligue o laser para aquecer. Coloque o laser no gatilho externo, energia constante, sem substituição de gás. Defina a energia do laser por pulso (tipicamente entre 80-120 ....

Resultados

Comparação da pegada de peptídeo de corrente pesada do biossimilar adalimumabe em tampão fosfato e quando aquecido a 55 °C por 1 h mostram resultados interessantes. O teste t do aluno é utilizado para a identificação de peptídeos que são significativamente alterados nessas duas condições (p ≤ 0,05). Os peptídeos 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 e 414-420 mostram proteção significativa do solvente quando a proteína é aquecida para formar agregados(Figura 5)^3.......

Discussão

Técnicas estruturais baseadas em espectrometria de massa, incluindo troca de deutério de hidrogênio, ligação química, rotulagem covalente e espectrometria de massa de spray nativo e mobilidade de íons têm crescido rapidamente em popularidade devido à sua flexibilidade, sensibilidade e capacidade de lidar com misturas complexas. O FPOP possui várias vantagens que aumentaram sua popularidade na área de técnicas estruturais baseadas em espectrometria de massa. Como a maioria das estratégias de rotulagem covalente, fornece u.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Adenine	Acros Organics	147440250	Solúvel em água até 3.5 mM
Abertura	Edmund Optics	39-905	1000 μ m Diâmetro da Abertura, Cobre Banhado a Ouro
Suporte de Abertura	Edmund Optics	53-287	25.8mm Diâmetro Externo, Montagem Pinhole de Precisão
Catalse	Sigma Aldrich	C-40	Catalase de fígado bovino, pó liofilizado, ≥ 10.000 unidades/mg de proteína
COMPex Pro laser	Coerente	1113836	COMPexPRO 102, versão F-V, laser KrF, sem XeCl
Ditioteitol (DTT)	Promega	V3151	DTT, Grau Molecular (DL-Ditiotreitol)
Coletor de frações	GenNext Technologies, Inc.	N/A	Coletor de frações
automatizado Sílica fundida Molex		1068150023	Polymicro Tubo capilar de sílica fundida flexível, diâmetro interno 100 µ m, Diâmetro Externo 375 µ m, TSP100375
Glutamina	Acros Organics	119951000	L(+)-Glutamina, 99%
Suporte para lente	Edmund Optics	03-668	53 mm Diâmetro externo, Montagem em anel ajustável de três parafusos
Peróxido de hidrogênio	Fisher Scientific	H325-100	30% (Certificado ACS), Sistema Fisher Chemical
LC-MS/MS	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBCX	Dionex Ultimate 3000 acoplado ao espectrômetro de massa Orbitap Fusion Tribrid
Mas grau de especificação Acetonitrila	Fisher Scientific	A955-1	Acetonitrila, Grau Optima LC/MS,
Ácido fórmico de grau de especificação de massa	Fisher Chemical Fisher Scientific	A117-50	, 99.0+%, Optima™ Grau LC / MS, Fisher Chemical
Mass spec grau de água	Fisher Scientific	W6-4	Água, Optima Grau LC / MS, Fisher Chemical
MES buffer	Sigma Aldrich	M0164	MES sal hemissódico
Metionina amida	Bachem	4000594.0005	H-met-NH2< / sub>. Grampo HCl
Micro V	Thor Labs	VK250	Micro V-braçadeira com lâminas de aço inoxidável
Palco motorizado	Edmund Optics	68-638 Sistema de	estágio motorizado de 50 mm com controle manual
Nano C18 colum	Thermo Scientific	164534	Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Colunas
Bancada óptica	Edmund Optics	56-935	18" x 18" placa de ensaio
Sistema de Módulo FPOP Pioneiro	GenNext Technologies, Inc.	/A	Sistema de Dosimetria de Radicais FPOP Inline
Suporte de Poste	Edmund Optics	58-979	3" de Comprimento, Rosca ¼-20, Suporte de Poste
Fosfato de Sódio dibásico	Fisher Scientific	BP331-500	Fosfato de Sódio Dibásico Heptahidratado (Cristais Incolores a Brancos), Fisher BioReagents
Fosfato de Sódio monobásico	Fisher Scientific	BP330-500	Fosfato de Sódio Monobásico Monohidratado (Cristais Incolores a Brancos), Seringa Fisher BioReagents
	Hamilton	81065	100 µ L, Modelo 1710 RN SYR, Pequeno NDL Removível, 22s ga, 2 in, estilo de ponta 3
Bomba de seringa	KD Scientific	788101	Legato  Bomba de seringa 101
Trap C18 coluna	Thermo Scientific	160454	Thermo Scientific  Acclaim PepMap 100 C18 Colunas HPLC
Tris	Sigma Aldrich	252859	Tris(hidroximetil)aminometano
Tripsina	Promega	V5111	Grau de Sequenciamento Modificado Tripsina
UV lente convexa plana	Edmund Optics	84-285	30 mm Dia. x 120 mm FL Não revestido, UV Lente Plano-Convexa

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