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Biochemistry

Permitindo compensação em tempo real em oxidações fotoquímicas rápidas de proteínas para a determinação de mudanças de topografia de proteínas

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61580
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Biomolecular Sciences, University of Mississippi, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi, 3GenNext Technologies, Inc.

Summary

A oxidação fotoquímica rápida das proteínas é uma técnica emergente para a caracterização estrutural das proteínas. Diferentes aditivos e ligantes de solventes têm variadas propriedades de limpeza radical hidroxyl. Para comparar a estrutura proteica em diferentes condições, a compensação em tempo real dos radicais hidroxis gerados na reação é necessária para normalizar as condições de reação.

Abstract

A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) é uma técnica de biologia estrutural baseada em espectrometria de massa que sonda a área de superfície acessível de solventes das proteínas. Esta técnica se baseia na reação de cadeias laterais de aminoácidos com radicais hidroxil livremente difundindo em solução. FPOP gera esses radicais in situ por fotolise laser de peróxido de hidrogênio, criando uma explosão de radicais hidroxil que está esgotado na ordem de um microssegundo. Quando esses radicais hidroxis reagem com uma cadeia lateral de aminoácidos acessível a solventes, os produtos de reação exibem uma mudança de massa que pode ser medida e quantificada pela espectrometria de massa. Uma vez que a taxa de reação de um aminoácido depende, em parte, da superfície acessível de solvente médio desse aminoácido, mudanças medidas na quantidade de oxidação de uma determinada região de uma proteína podem estar diretamente correlacionadas com mudanças na acessibilidade solvente daquela região entre diferentes conformações (por exemplo, ligadura versus sem ligante, monômero vs. agregado, etc.) O FPOP tem sido aplicado em uma série de problemas na biologia, incluindo interações proteína-proteína, alterações conformacionais proteicas e ligação proteína-ligante. Como a concentração disponível de radicais hidroxilas varia de acordo com muitas condições experimentais no experimento FPOP, é importante monitorar a dose radical eficaz à qual o analito proteico é exposto. Este monitoramento é eficientemente alcançado incorporando um dosímetro inline para medir o sinal da reação FPOP, com fluência laser ajustada em tempo real para alcançar a quantidade desejada de oxidação. Com essa compensação, mudanças na topografia proteica refletindo alterações conformais, superfícies de ligação de ligantes e interfaces de interação proteína-proteína podem ser determinadas em amostras heterogêneas usando quantidades amostrais relativamente baixas.

Introduction

A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) é uma técnica emergente para a determinação de alterações topográficas proteicas por modificação covalente ultrarrápida da área de superfície exposta ao solvente de proteínas seguida pela detecção por LC-MS1. FPOP gera uma alta concentração de radicais hidroxílicos in situ por fotolise flash laser UV de peróxido de hidrogênio. Esses radicais hidroxis são muito reativos e de curta duração, consumidos em aproximadamente uma escala de tempo microssegundos sob as condições FPOP2. Esses radicais hidroxis se difundem através da água e oxidam vários componentes orgânicos em solução a taxas cinéticas geralmente variando de rápido (~106 M-1 s-1) a3controlados por difusão . Quando o radical hidroxyl encontra uma superfície proteica, o radical oxidará as cadeias laterais de aminoácidos na superfície da proteína, resultando em uma mudança em massa desse aminoácido (mais comumente a adição líquida de um átomo de oxigênio)4. A taxa de reação de oxidação em qualquer aminoácido depende de dois fatores: a reatividade inerente desse aminoácido (que depende da cadeia lateral e do contexto sequencial)4,5 e a acessibilidade dessa cadeia lateral ao radical hidroxílico difusor, que se correlaciona intimamente com a área média de superfície acessívelsolvente 6,,7. Todos os aminoácidos padrão, exceto a glicina, foram observados como rotulados por esses radicais hidroxil altamente reativos em experimentos FPOP, embora em rendimentos amplamente diferentes; na prática, Ser, Thr, Asn e Ala raramente são vistos como oxidados na maioria das amostras, exceto sob altas doses radicais e identificados pela cuidadosa e sensível fragmentação de ETD8,,9. Após a oxidação, as amostras são saciadas para remover peróxido de hidrogênio e oxidantes secundários (superóxido, oxigênio singlet, hidroperóxidos de peptidyl, etc.) As amostras saciadas são então digeridas proteolíticos para gerar misturas de peptídeos oxidados, onde as informações estruturais são congeladas como um "instantâneo" químico nos padrões dos produtos de oxidação dos vários peptídeos(Figura 1). A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) é usada para medir a quantidade de oxidação de aminoácidos em um determinado peptídeo proteolítico baseado nas intensidades relativas das versões oxidadas e nãoxidizadas desse peptídeo. Comparando esta pegada oxidativa da mesma proteína obtida em diferentes condições conformais (por exemplo, ligadura versus sem ligante), as diferenças na quantidade de oxidação de uma determinada região da proteína podem estar diretamente correlacionadas com diferenças na superfície acessível ao solvente daquela região6,,7. A capacidade de fornecer informações topográficas proteicas torna o FPOP uma tecnologia atraente para a determinação da estrutura de alta ordem de proteínas, inclusive na descoberta e desenvolvimento terapêutico de proteínas10,11.

Figure 1
Figura 1: Visão geral do FPOP. A superfície da proteína é covalentemente modificada por radicais hidroxil altamente reativos. Os radicais hidroxis reagirão com cadeias laterais de aminoácidos da proteína a uma taxa fortemente influenciada pela acessibilidade solvente da cadeia lateral. As alterações topográficas (por exemplo, devido à ligação de um ligante como mostrado acima) protegerão os aminoácidos na região de interação de reagir com radicais hidroxílicos, resultando em uma diminuição na intensidade do peptídeo modificado no sinal LC-MS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diferentes constituintes presentes na solução FPOP (por exemplo, ligantes, excipientes, tampões) têm diferentes atividades de limpeza em direção aos radicais hidroxílicos gerados sobre a fotolise laser do peróxido de hidrogênio3. Da mesma forma, uma pequena mudança na concentração de peróxido, fluência laser e composição de buffer pode alterar a dose radical eficaz, tornando a reprodução de dados FPOP desafiadora entre as amostras e entre diferentes laboratórios. Portanto, é importante poder comparar a dose radical hidroxyl disponível para reagir com proteína em cada amostra usando um dosímetros radicais hidroxílicos disponíveis12,,13,,14,,15,,16. Os dosímetros radicais hidroxilas atuam competindo com o analito (e com todos os catadores em solução) para a piscina de radicais hidroxila; a dose efetiva de radicais hidroxis é medida medindo a quantidade de oxidação do dosímetro. Note que a "dose radical hidroxíl" eficaz é uma função tanto da concentração inicial de radical hidroxílico gerada quanto da meia-vida do radical. Esses dois parâmetros são parcialmente dependentes um do outro, tornando a modelagem cinética teórica um pouco complexa(Figura 2). Duas amostras poderiam ter meias-vidas radicais iniciais extremamente diferentes enquanto ainda mantinham a mesma dose radical eficaz alterando a concentração inicial de radicais hidroxis formados; eles ainda vão gerar pegadas idênticas17. Adenina13 e Tris12 são dosímetros radicais hidroxílicos convenientes porque seu nível de oxidação pode ser medido pela espectroscopia UV em tempo real, permitindo que os pesquisadores identifiquem rapidamente quando há um problema com a dose radical hidroxílida eficaz e para solucionar seus problemas. Para resolver esse problema, um dosímetro inline localizado no sistema de fluxo logo após o local da irradiação que pode monitorar o sinal a partir de mudanças de absorção de adenina em tempo real é importante. Isso ajuda na realização de experimentos FPOP em buffers ou qualquer outro excipiente com níveis amplamente diferentes de capacidade de limpeza radical hidroxis17. Essa compensação de dosagem radical pode ser realizada em tempo real, produzindo resultados estatisticamente indistinguíveis para o mesmo conformador, ajustando a dose radical eficaz.

Neste protocolo, temos procedimentos detalhados para a realização de um experimento típico de FPOP com compensação de dosagem radical usando adenina como um dosímetro radical óptico interno. Este método permite que os pesquisadores comparem pegadas em condições FPOP que têm capacidade de limpeza diferente, realizando compensação em tempo real.

Figure 2
Figura 2: Simulação cinética de compensação baseada em dosimetria. A resposta dosímetro de adenina de 1 mM é medida em 5 μM de analito de lymo com uma concentração radical hidráxil inicial de 1 mM (▪OH t1/2=53 ns), e definida como resposta dosímetro alvo (preto). Após a adição de 1 mM da histidina excipiente catraca, a resposta dosímetro (azul) diminui junto com a quantidade de oxidação proteica de forma proporcional (ciano). A meia-vida do radical hidroxíll também diminui (▪OH t1/2=39 ns). Quando a quantidade de radical hidroxílico gerada é aumentada para dar um rendimento equivalente de dosímetro oxidado na amostra com 1 mM de histidina como alcançado com 1 mM radical hidroxyl na ausência de sca verador (vermelho), a quantidade de oxidação proteica que ocorre de forma semelhante torna-se idêntica (magenta), enquanto a meia-vida radical hidroxis diminui ainda mais (▪OH t1/2=29 ns). Adaptado com permissão da Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

1. Prepare o Banco Óptico e o Capilar para FPOP

ATENÇÃO: Os lasers excimer krf são perigos extremos dos olhos, e a luz direta ou refletida pode causar danos permanentes nos olhos. Use sempre proteção ocular adequada, evite a presença de quaisquer objetos reflexivos perto do caminho do feixe quando possível, e use controles de engenharia para impedir o acesso não autorizado a um laser ativo e conter quaisquer reflexos perdidos.

  1. Prepare o banco óptico FPOP.
    1. Ligue o laser para aquecer. Coloque o laser no gatilho externo, energia constante, sem substituição de gás. Defina a energia do laser por pulso (tipicamente entre 80-120 mJ/pulso).
    2. Configure o banco óptico com a lente plano-convexa (30 mm Dia. x 120 mm FL sem revestimento) diretamente no caminho do raio laser e um backstop não reflexivo para absorver a luz como mostrado na Figura 3A.

Figure 3
Figura 3: Banco óptico para o experimento FPOP. (A) A amostra é misturada com H2O2, dosímetro radical de adenina e catador de glutamina e carregada na seringa. A amostra é empurrada através da capilar de sílica fundida através do caminho de feixe focalado de um laser UV excimer KrF. A luz UV folliposa H2O2 em radicais hidroxil, que oxida a proteína e os dosímetros de adenina. O fluxo de seringa empurra a amostra iluminada para fora do caminho do laser antes do próximo pulso de laser, com um volume de exclusão nãoilluinado entre regiões iluminadas. Imediatamente após a oxidação, a amostra é passada através de um espectrofotômetro UV inline, que mede a absorvância UV da adenina a 265 nm. A amostra é então depositada em um tampão de saciar para eliminar os oxidantes restantes H2O2 e secundários. (B) O tamanho da mancha é medido após irradiar uma nota adesiva colorida afixada atrás do capilar com o laser a 248 nm. A largura do local é usada para calcular a taxa de fluxo amostral, e a silhueta do capilar no centro da mancha é usada para alinhar o banco óptico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Corte um comprimento apropriado da capilaridade de sílica fundida (360 μm de diâmetro externo e 100 μm de diâmetro interno) e usando uma manga, conecte-se à seringa apertada a gás usando um conector de baixo volume morto.
  2. Queime suavemente o revestimento de poliimida do capilar com uma tocha de butano no local onde o dosímetro inline lê o sinal de absorvência a 265 nm após a exposição a laser das amostras. Limpe os detritos do capilar gentilmente usando metanol em um lenço sem fiapos. O revestimento de poliimida no local da incidência de laser pode ser igualmente queimado com a tocha de butano ou queimado com o laser excimer disparando em baixa potência.
    NOTA: Aguarde que o capilar esfrie, pois é um risco de incêndio usar o metanol no capilar quente.
  3. Coloque este capilar através do caminho do feixe do laser e no dosímetro inline.
    1. Pressione a alavanca na parte superior do dosímetro da linha para abrir a dobradiça. Remova os suportes magnéticos. Coloque o capilar no sulco usinado do dosímetro inline, utilizando os suportes magnéticos para manter o capilar no lugar. Feche a dobradiça dosímetro sobre o capilar, pressionando-a até que a alavanca se eixe no lugar.
  4. Usando o software de dosimetria, clique no botão Iniciar Flash para começar a disparar o laser excimer. Defina a potência laser predefinida entre 50-100 mJ/pulse no próprio software de controle a laser e defina a taxa de repetição predefinida entre 10-20 Hz na guia Configurações do software de dosimetria.
    1. Concentre o raio laser usando uma lente convexa plano montada em um estágio motorizado linear. Meça a largura e a altura do ponto laser na posição do capilar em uma nota pegajosa precisamente usando uma pinça para calcular fluência incidente (mJ/mm2) como mostrado na Figura 3B.
  5. Coloque uma abertura opaca perto do capilar para garantir uma largura iluminada consistente do capilar, independentemente de alterações no tamanho do feixe devido ao movimento da lente ou alteração da energia por pulso do laser18.
    1. Com o disparo a laser, mova o estágio motorizado através de seu alcance de movimento. Certifique-se de que o feixe permanece centrado na abertura e a silhueta do capilar pode ser observada por toda parte. O diâmetro da abertura deve ser menor do que a largura do feixe focalizado em cada ponto da faixa do estágio motorizado.
  6. Passe a água pelo capilar a 20 μL/min por pelo menos um minuto para lavar o capilar.
    1. Clique no botão Iniciar Dados + AutoZero no software dosímetro para zerar o dosímetro na água e iniciar a coleta de dados.
      NOTA: Se o sistema tampão para FPOP tiver absorvância UV significativa a 265 nm, o sistema FPOP deve ser zerado no buffer, não na água.
  7. Defina a taxa de fluxo calculada na bomba de seringa.
    1. A taxa de fluxo da amostra de proteína depende do volume irradiado por tiro(VIrr),do número de tiros a laser por segundo(R),e da desejada fração de volume de exclusão unirradiated(FEx)para corrigir os efeitos de fluxo laminar e a difusão amostral (0,15-0,30 recomendado)2,,19,,20. Calcule o VIrr (em μL) com base no diâmetro interno do capilar em mm (d) e na largura do ponto laser que impinge sobre o capilar (ou seja, a largura da abertura) em mm(w) usando a seguinte equação:
      VIrr = π(d/2)2w
    2. Calcule a taxa de fluxo desejada (em μL/min) com base na seguinte equação:
      Fluxo = 60R[VIrr (1 + FEx)]

2. Preparação da solução proteica para FPOP

  1. Prepare a proteína nas duas ou mais condições diferentes a serem comparadas (por exemplo, ligadas a ligas e sem ligante; agregada e monômera; sozinha e com um parceiro de ligação proteína-proteína; etc.) para detectar as alterações de conformação.
  2. Defina o volume total utilizado para fpop para atender às necessidades do experimento. O limite mínimo geralmente depende do volume da capilarização de irradiação e do material necessário para detecção robusta e quantificação relativa, e variará dependendo em grande parte do sistema LC-MS/MS utilizado e do método de processamento da amostra pós-rotulagem. O volume total de soluções FPOP comumente utilizadas em nosso grupo é de 20 μL após a adição de peróxido de hidrogênio. A concentração final da proteína é comumente 1-10 μM, com glutamina de 17 mM (para limitar a vida útil do radical hidroxila), 1 mM de adenina (para agir como um dosímetro radical)13,,17 e 10 mM tampão fosfato (um tampão que é um pobre catador de radicais hidroxil). As amostras são geralmente preparadas com múltiplas réplicas para permitir a modelagem estatística dos resultados.
    1. Para fins mais gerais, prepare amostras em triplicado em ambos os estados, além de pelo menos uma amostra para usar como controle sem laser para medir a oxidação de fundo. Prepare 18 μL deste mix de soluções FPOP.
      NOTA: Muitos tampões e aditivos comumente usados na bioquímica são catadores radicais hidroxis. Estes aditivos e buffers podem ser usados; no entanto, podem ocorrer reduções na oxidação devido à limpeza radical hidroxílida do tampão. Em geral, mantenha todos os aditivos no mínimo exigido pelo sistema biológico para maximizar o rendimento da oxidação proteica. Sulfóxido de dimetila deve ser evitado devido à propensão de gerar radicais secundários; dimetilformamida tem sido uma alternativa útil em nossas mãos. Ao usar tampões que são fortes catadores radicais hidroxis, a glutamina pode muitas vezes ser excluída do mix de soluções FPOP.
  3. Prepare 1 M de peróxido de hidrogênio imediatamente antes do experimento FPOP.
    NOTA: 30% de peróxido de hidrogênio como comumente vendido pelos fornecedores inclui um estabilizador, o que aumenta a vida útil. Uma vez diluído, o peróxido de hidrogênio deve ser usado rapidamente, definitivamente no mesmo dia. Peróxido de hidrogênio também deve ser regularmente testado para decomposição por FPOP usando um dosímetro radical hidroxílico.
  4. Prepare tubos de microcentrifuuge contendo 25 μL de solução de saciamento de 0,5 μg/μL de amida de methionina e 0,5 μg/μL catalase. Se um volume amostral superior a 20 μL for usado para FPOP, aumente proporcionalmente o volume da solução de saciamento.

3. Realize o experimento FPOP

  1. Adicione 2 μL de peróxido de hidrogênio nos 18 μL da mistura de solução FPOP. Misture o conteúdo suavemente com uma pipeta e gire rapidamente a solução para a parte inferior dos tubos de microcentrifuuge. Colete imediatamente com uma seringa gastight e carregue na bomba de seringa.
  2. Inicie o fluxo na bomba de seringa com a taxa de fluxo determinada na etapa 1.8.1 (tipicamente entre 8-16 μL/min) clicando no botão Iniciar bomba no software dosímetro.
  3. Monitore a leitura de adenina em tempo real utilizando o dosímetro inline (ver Tabela de Materiais) e colete a amostra em resíduos. Espere o sinal do Abs265 estabilizar.
  4. Clique no botão Iniciar Flash no software dosímetro para começar a disparar o laser na taxa de repetição e energia predefinidas.
  5. Monitore a leitura de adenina em tempo real usando um dosímetro inline (ver Tabela de Materiais); a diferença no Abs265 com o laser desligado e o laser ligado é a leitura ΔAbs265.
    NOTA: O aparecimento de leituras altamente instáveis do Abs265 ao disparar o laser na presença de peróxido de hidrogênio deve-se à geração de bolhas em solução. Reduza a fluência do laser e/ou a concentração de peróxido de hidrogênio para eliminar as bolhas.

4. Realizar compensação

NOTA: Diferentes ligantes, tampões, etc. podem ter capacidade de limpeza diferente para radicais hidroxil. É importante garantir que doses radicais hidroxil eficazes comparáveis estejam disponíveis para reagir com proteína em diferentes amostras. Isso é feito garantindo uma resposta radical dosímetro hidroxílico igual entre as amostras. Utilizando dosimetria de adenina, a mudança na absorção uv a 265 nm (ΔAbs265) reflete a dose radical hidroxila eficaz; quanto maior o ΔAbs265,maior a dose radical de hidroxyl eficaz.

  1. Compare a leituraΔAbs 265 obtida com o dosímetro inline com a leitura desejada ΔAbs265 obtida por experimentos ou controles anteriores. Uma leituraΔAbs 265 inferior à leitura desejada indica uma dose eficaz insuficiente de radicais hidroxil; uma leitura ΔAbs265 indica uma dose radical eficaz que é muito alta. Se a leituraΔAbs 265 estiver no nível desejado, colete a amostra imediatamente após a irradiação a laser no tampão de sásia17.
  2. Compense a dose radical eficaz para equalizar os ΔAbs265. Essa compensação pode ser realizada de três maneiras: alterar a concentração de peróxido de hidrogênio, aumentar a fluência do laser alterando a energia do laser por pulso, ou aumentar a fluência do laser alterando o plano focal da lente focal.
    1. Para fazer uma grande mudança (>10 mAU) na leituraΔAbs 265, refaça a amostra com mais ou menos peróxido de hidrogênio e reprise a amostra conforme a Seção 3.
    2. Para fazer uma pequena alteração na leituraΔAbs 265 em tempo real, ajuste o plano focal do feixe incidente ajustando a posição da lente focal usando o Estágio Motorizado de 50 mm. Aproximar o plano focal da posição do capilar aumentará a leituraΔAbs 265; trazer o plano focal mais longe da posição do capilar diminuirá a leitura ΔAbs265.
  3. Monitore a adenina ΔAbs265 para medir a quantidade efetiva de radical hidroxyl presente na amostra após a irradiação a laser13. O monitoramento em tempo real com um detector capilar UV inline permite compensação em tempo real, conforme descrito em 4.2.2; ajustar a posição da lente usando o estágio motorizado até que a leituraΔAbs 265 seja igual à leitura desejada. As medidas de absorção pós-experimental com um espectrofotômetro UV também são precisas, mas exigem que novas amostras sejam usadas para cada dose radical eficaz.

5. Digerir as amostras de proteína

NOTA: A trippsina é mais comumente usada para digerir amostras de proteínas para FPOP, e é a protease usada neste protocolo. É um protease confiável que gera peptídeos com locais básicos tanto no N- quanto no C-terminus, promovendo íons de peptídeos carregados multiplicados em MS. Além disso, ele se apóia após lisina e arginina, dois aminoácidos que são apenas moderadamente reativos aos radicais hidroxil; portanto, alterações no padrão de digestão devido à oxidação de analito é rara. Outras proteases têm sido utilizadas com sucesso com fpop21,mas deve-se tomar cuidado para garantir que os padrões de digestão sejam comparáveis entre amostras nãoxidizadas e oxidadas.

  1. Meça o volume final da amostra FPOP saciada. Adicione 500 mM Tris, pH 8.0 com 10 mM CaCl2 contendo 50 mM dithiothiothreitol (DTT) à solução proteica após saciar a uma concentração final de 50 mM Tris, 1 mM CaCl2 e 5 mM DTT.
  2. Aqueça a amostra de proteína a 95 °C por 15 minutos.
  3. Esfrie imediatamente a amostra no gelo por 2 minutos.
  4. Adicione a razão de peso de trippsina/proteína de 1:20 às amostras.
  5. Digerir a proteína durante a noite a 37 °C com a mistura.
  6. Pare a reação de digestão pela adição de ácido fórmico de 0,1% e/ou aquecimento da amostra a 95 °C por 10 minutos.
  7. Adicione 2 mM DTT às amostras e aqueça a 60 °C por 15 minutos imediatamente antes de LC-MS/MS.
    NOTA: Embora outros grupos tenham relatado alquilação de thiols em experimentos FPOP, em nossas mãos temos notado produtos laterais sobre alquilação de proteínas oxidadas (possivelmente devido à reação com carbonisoes nucleofílicos formados como um produto de oxidação menor). Por isso, optamos por evitar a alquilação de thiols quando possível.

6. Realize espectrometria de massa cromatografia líquida tandem (LC-MS/MS)

  1. Prepare a fase móvel A consistindo em água contendo 0,1% de ácido fórmico e fase B móvel consistindo de acetonitrilo com ácido fórmico de 0,1%.
  2. Carregue a amostra primeiro em uma coluna de armadilha C18 (300 μm I.D. x 5 mm 100 Å tamanho de poros, 5 μm tamanho de partícula) trapping cartucho e lavagem com 2% solvente B por 3 minutos a uma taxa de fluxo de 5,0 μL/min para remover sais e moléculas pequenas hidrofílicas.
  3. Em seguida, separe os peptídeos na nanocolumn C18 (0,75 mm x 150 mm, tamanho de partícula de 2 μm, 100 Å poro) a uma taxa de fluxo de 300 nL/min. O gradiente consiste em um aumento linear de 2 a 35% de solvente B ao longo de 22 min, rampado para 95% solvente B acima de 5 min e mantido por 3 min para lavar a coluna, e depois retornou a 2% B sobre 3 min e segurou por 9 min para ree equilibrar a coluna.
    NOTA: Este gradiente é suficiente para LC-MS/MS da maioria das misturas FPOP de uma e duas proteínas que buscam fazer quantificação no nível de peptídeo. A porcentagem de solvente B pode precisar ser alterada para aumentar a resolução de peptídeos em casos raros em que peptídeos interferem uns com os outros devido a tempos de retenção semelhantes e valores m/z. FPOP22 em escala proteome ou projetos experimentais que buscam separar isômeros de produto de oxidação de peptídeos1,,23,,24,25 podem exigir gradientes de LC mais longos e estão fora do escopo deste relatório.
  4. Elute os peptídeos diretamente na fonte de nanospray de um espectrômetro de massa de alta resolução usando um emissor de nanospray condutivo.
  5. Adquira os dados no modo íon positivo. Coloque a tensão do spray em 2400 V, e a temperatura do tubo de transferência de íons para 300 °C.
  6. Adquira os exames de MS completos de m/z 250 a 2000 em uma resolução nominal em m/z 200 de 60.000 seguidos por oito subsequentes varreduras de íons lineares dependentes de dados MS/MS nos oito íons peptídeos mais abundantes usando dissociação induzida por colisão a 35% de energia normalizada para identificar os peptídeos. Fragmente os peptídeos até cinco vezes dentro dos 30 s e, em seguida, transfira para uma lista de exclusão para 60 s.

7. Processamento de dados e cálculo da oxidação média dos peptídeos

  1. Determine a cobertura sequencial dos valores de proteína, m/z e tempos de retenção de peptídeos não oxidados usando o mecanismo de busca de proteômica MS/MS.
  2. Defina a tolerância de massa precursora a 10 ppm e permita até dois locais de decote perdidos para as amostras digeridas de trippsina, usando a especificidade padrão do decote de trippsina.
  3. Defina a tolerância em massa do fragmento de peptídeo para 0,4 Daltons.
  4. Com base na razão m/z dos peptídeos não modificados detectados e nas mudanças de massa conhecidas dos principais produtos de oxidação, calcule o m/z dos vários produtos teóricos de oxidação de cada peptídeo4,,26,,27,,28,,29.
  5. Identifique o cromatograma de íon extraído desses valores m/z usando software para visualizar a corrida espectrométrica de massa(Figura 4). Identifique os produtos de oxidação de peptídeos com base em seu m/z,seu estado de carga e a semelhança no tempo de eluição com o peptídeo não modificado. Em nossas mãos, os produtos de oxidação de peptídeos eluto entre 240 segundos antes de 180 segundos após o peptídeo não modificado usando o gradiente LC acima. Como a oxidação muitas vezes resultará em múltiplos produtos de oxidação isomeric, é comum observar múltiplos picos parcialmente resolvidos nos cromatagramas de íons extraídos de produtos de oxidação de peptídeos, como mostrado na Figura 4. Os produtos de oxidação de peptídeos são quantificados com base na área do pico nos cromatgramas de íons extraídos.

Figure 4
Figura 4: Cromatograma de íon extraído de um peptídeo e seus produtos de oxidação após fpop. O m/z dos produtos de oxidação de peptídeos é calculado com base no m/z do peptídeo não oxidado e nos produtos de oxidação conhecidos; e as áreas desses produtos peptídeos são determinadas. A área dos produtos peptídeos é então utilizada para o cálculo dos eventos médios de oxidação por peptídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Calcule a oxidação média dos peptídeos usando a seguinte equação.

Equation 1

onde P denota o número médio de eventos de oxidação por molécula de peptídeo, e eu represento a área de pico do peptídeo nãooxidado (Iunoxidizado) e o peptídeo com n eventos de oxidação. Note que eu (singly oxidado) incluiria não apenas adições de um único átomo de oxigênio, mas também outros eventos de oxidação única menos comuns que o pesquisador pode optar por medir (por exemplo, descarboxingação oxidativa, formação de carbonyl, etc.) 4,26,27,28,29.

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Representative Results

Comparação da pegada de peptídeo de corrente pesada do biossimilar adalimumabe em tampão fosfato e quando aquecido a 55 °C por 1 h mostram resultados interessantes. O teste t do aluno é utilizado para a identificação de peptídeos que são significativamente alterados nessas duas condições (p ≤ 0,05). Os peptídeos 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 e 414-420 mostram proteção significativa do solvente quando a proteína é aquecida para formar agregados(Figura 5)30. Este experimento identificou as regiões de peptídeos que experimentam mudanças topográficas após o aquecimento e a agregação.

Figure 5
Figura 5: Pegada de nível de peptídeo da cadeia pesada de adalimumabe. A oxidação média do peptídeo de adalimumabe (azul) à temperatura ambiente, e (laranja) após adalimumabe é aquecida a 55 °C por 1 hora, depois resfriada à temperatura ambiente. As barras de erro representam um desvio padrão das medidas triplicadas. O asterisco representa os peptídeos que são significativamente alterados nas duas condições (p ≤ 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O experimento FPOP de mioglobina foi realizado na presença de fosfato de 10 mM e 10 mM 2-(N-morpholino)ácido esulfônico (MES). O buffer MES atua como um bom catador dos radicais hidroxil gerados sobre a fotolise do peróxido de hidrogênio depois que a amostra é exposta à irradiação a laser. A diferença na absorção da adenina é monitorada usando um dosímetro inline em tempo real. A fluência a laser é ajustada de forma a ter uma mudança comparável no nível de absorção de adenina no buffer MES em comparação com o tampão de fosfato(Figura 6)17. A oxidação média dos peptídeos foi menor na presença de tampão MES em comparação com o tampão fosfato. No entanto, como a fluência a laser foi aumentada para ter uma resposta de dosimetria de adenina igual, os valores médios de oxidação do peptídeo não foram significativamente diferentes após fpop no buffer MES e tampão fosfato(Figura 7)17. Este experimento mostra a importância da compensação do sinal para poder comparar a pegada com duas condições FPOP que têm capacidade de limpeza diferente. Experimentos semelhantes têm usado com sucesso compensação baseada em adenina para sondar mudanças estruturais de excipientes comuns nos preparativos adalimumab30.

Figure 6
Figura 6: Compensação das leituras de dosimetria da adenina. A leitura de adenina antes e depois da irradiação a laser foi registrada para FPOP em tampão fosfato a 265 nm com uso de dosímetro inline. Como o MES é um bom catador dos radicais hidroxis, a diferença nas leituras de adenina foi menor. Aumentou a fluência a laser da solução FPOP com buffer MES para "compensar" e superar o efeito do buffer MES para ter leitura de adenina semelhante à leitura de fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Compensação em tempo real da oxidação da mioglobina por dosimetria de adenina inline. Moglobina oxidada em (azul) tampão fosfato de 10 mM e (laranja) 10 mM MES tampão (laranja). Como observado, a oxidação dos peptídeos é menor no buffer MES. Como a fluência a laser é aumentada para as amostras no buffer MES ter nível de dosimetria de adenina quase semelhante em comparação com o tampão de fosfato (cinza), a oxidação do nível de peptídeo também é semelhante ao nível de oxidação visto em amostras com tampão fosfato. Este número foi adaptado com permissão da Química Analítica 2018, 90, 21, 12625-12630. Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Técnicas estruturais baseadas em espectrometria de massa, incluindo troca de deutério de hidrogênio, ligação química, rotulagem covalente e espectrometria de massa de spray nativo e mobilidade de íons têm crescido rapidamente em popularidade devido à sua flexibilidade, sensibilidade e capacidade de lidar com misturas complexas. O FPOP possui várias vantagens que aumentaram sua popularidade na área de técnicas estruturais baseadas em espectrometria de massa. Como a maioria das estratégias de rotulagem covalente, fornece um instantâneo químico estável da topografia proteica que é compatível com a maioria dos processos pós-rotulagem (por exemplo, digestão de trippsina, deglycosylation, etc.), evitando problemas de back-exchange e scrambling que dificultam a troca hidrogênio-deutério. No entanto, ao contrário das tecnologias tradicionais de rotulagem covalente que visam aminoácidos específicos, o FPOP é capaz de rotular uma ampla gama de aminoácidos em um único experimento. Além disso, o FPOP é capaz de completar a reação primária de proteína radical hidroxíl mais rapidamente do que as proteínas são capazes de se desdobrar para congelar um instantâneo químico da conformação nativa14, embora algumas reações secundárias possam ocorrer em uma escala de tempo mais lenta20,,31,,32. Ao contrário de experimentos anteriores em pegada de proteína radical hidroxíl usando linhas de síncrotron de raios-X, o FPOP permite essa rotulagem ultrarrápida em um formato benchtop33,34. Os principais obstáculos no FPOP enfrentados pelo laboratório típico de espectrometria de massa proteica é a experiência no manuseio de amostras para FPOP, a oxidação baseada a laser e a análise de dados. O objetivo deste relatório é ajudar novos pesquisadores a superar esses obstáculos para gerar resultados valiosos e reprodutíveis.

As proteínas podem sofrer oxidação de fundo que pode fornecer incorretamente a extensão da oxidação nos peptídeos identificados. Para entender melhor isso, uma amostra de controle é preparada em réplicas juntamente com amostras de FPOP nas quais todas as etapas são realizadas, exceto que o laser não é acionado (etapa 3.4). O nível de oxidação no controle sem laser revela o nível de oxidação de fundo. A oxidação in-source de peptídeos pode contribuir para a oxidação do peptídeo observado, podendo ser facilmente determinada pelo perfil de eluição da LC do peptídeo não modificado e do produto de modificação. Se os perfis de elução se sobrepõem de forma idêntica, o produto de oxidação é quase certamente devido à oxidação pós-coluna na fonte. A oxidação na fonte pode ser comumente reduzida reduzindo a tensão de ionização e/ou aumentando a distância entre o emissor e o tubo de transferência de íons. Outras oxidações de fundo podem estar presentes na proteína antes do tratamento FPOP, ou podem ser induzidas pela exposição ao peróxido de hidrogênio. Este último pode ser minimizado diminuindo a concentração de peróxido de hidrogênio usado e/ou diminuindo o tempo que a proteína está no peróxido de hidrogênio antes de saciar.

Um problema chave frequentemente encontrado por experimentadores que tentam FPOP pela primeira vez é a alta oxidação de fundo. Esta oxidação de fundo elevado é geralmente devido à adição de peróxido de hidrogênio à amostra antes da análise. Enquanto a oxidação de dois elétrons por peróxido de hidrogênio é muito mais lenta do que a oxidação de um elétron por radicais hidroxil, o peróxido de hidrogênio ainda é facilmente capaz de oxidar certos aminoácidos (mais notavelmente metionina e cisteína) em uma escala de tempo de minutos. Enquanto os outros componentes da mistura FPOP são muito mais estáveis, o peróxido de hidrogênio deve ser adicionado diretamente antes da oxidação pelo FPOP. Como regra geral, o tempo entre a adição de peróxido de hidrogênio e a deposição completa da amostra na solução de sacieçação deve ser mantido em menos de cinco minutos. É crucial sempre coletar um controle sem laser (onde a proteína é tratada normalmente para fpop, mas o laser não é acionado) para detectar quaisquer problemas com oxidação amostral, seja devido à exposição prolongada de peróxido ou devido à purificação e armazenamento de proteínas. Para casos em que a proteína é particularmente sensível ao peróxido de hidrogênio, a mistura on-line com peróxido de hidrogênio antes da irradiação com o laser excimer pode limitar a exposição a segundos ou menos31,,35. No entanto, para a maioria das proteínas, a mistura on-line é desnecessária.

O próximo obstáculo difícil para muitos experimentadores FPOP novatos é a configuração do caminho óptico. É importante que o laser impinge diretamente sobre o capilar, a fim de obter uma boa fotolise do peróxido de hidrogênio. Embora a luz laser UV seja invisível, fará com que muitos corantes presentes em papel colorido fluorescem na faixa visível. Portanto, usar um pedaço de papel de construção colorido no backstop pode ajudar no alinhamento da lente e capilar. O papel pode ser usado para garantir que o laser esteja atingindo diretamente o centro da lente de foco, e então um pedaço de papel colorido no backstop laser pode ajudar a dizer quando o capilar está posicionado com sucesso no centro do feixe focal, pois a difração do capilar causará uma silhueta no perfil do feixe(Figura 3B).

Também muitas vezes não é apreciado por investigadores iniciantes que a área transversal do feixe muda com base na energia do pulso. Portanto, se um pesquisador calcular a taxa de fluxo da bomba de seringa com base em uma energia laser de 100 mJ/pulso, e então aumentar a energia do laser para 120 mJ/pulso, a largura do raio laser aumentará da mesma forma, fazendo com que os cálculos sejam incorretos. Para evitar esse problema, recomenda-se o uso de uma abertura opaca. Para lasers excimer comerciais com os qual trabalhamos, quando a energia laser por pulso é aumentada a maior mudança está na seção transversal do feixe, não na fluência laser. Uma vez que a concentração de radicais hidroxis é baseada em parte na fluência da luz UV incidente, apenas mudar a energia laser por pulso é muitas vezes ineficiente em aumentar a dose radical hidroxíl.

A reprodutibilidade é outro obstáculo comum para os investigadores novatos superarem. Mais comumente, a falta de reprodutibilidade é causada por uma falha na geração de doses radicais hidroxílis equivalentes em diferentes réplicas. Isso pode ser devido ao alinhamento inadequado do banco óptico, ao uso involuntário de diferentes níveis de agentes radicais de limpeza hidroxis, ou ao uso de peróxido de hidrogênio envelhecido. Para todos os casos, o uso de um dosímetro interno permite a rápida identificação de problemas com dose radical hidroxil eficaz. Os dosímetros radicais hidroxilas atuam competindo com o analito (e com todos os catadores em solução) para a piscina de radicais hidroxila; a dose efetiva de radicais hidroxis é medida medindo a quantidade de oxidação do dosímetro. Note que a "dose radical hidroxíl" eficaz é uma função tanto da concentração inicial de radical hidroxílico gerada, quanto da meia-vida do radical. Esses dois parâmetros são parcialmente dependentes um do outro, tornando a modelagem cinética teórica um pouco complexa(Figura 2). Duas amostras poderiam ter meias-vidas radicais iniciais extremamente diferentes enquanto ainda mantinham a mesma dose radical eficaz alterando a concentração inicial de radicais hidroxis formados; eles ainda vão gerar pegadas idênticas17. Adenina13 e Tris12 são dosímetros radicais hidroxílicos convenientes porque seu nível de oxidação pode ser medido pela espectroscopia UV em tempo real, permitindo que os pesquisadores identifiquem rapidamente quando há um problema com a dose radical hidroxílida eficaz e para solucionar seus problemas.

A análise de dados continua sendo a parte mais intensiva de qualquer experimento FPOP. Embora existam relatórios utilizando embalagens comerciais para quantificar produtos de oxidação, esses algoritmos de quantificação têm dificuldades em definir adequadamente áreas de pico nos picos parcialmente resolvidos e assimétricos gerados a partir de grupos de isômeros de oxidação21. Em nossas mãos, embora os pacotes de software automatizados disponíveis atuais geralmente possam identificar corretamente as alterações na oxidação, muitas vezes eles não quantificam corretamente a magnitude dessas alterações (dados inéditos), exigindo auditoria e correção pós-análise. Dadas as dificuldades apresentadas pelos dados do FPOP, o status atual do software de análise de dados disponível capaz de lidar com a quantificação do FPOP é notável; no entanto, o desenvolvimento contínuo de software beneficiará o campo com aumentos de precisão e confiabilidade.

O protocolo descrito aqui gera uma resolução espacial em nível de peptídeo de pegadas de proteína radical hidroxíl. É possível gerar resolução espacial até o nível de aminoácido; no entanto, as discordâncias no campo permanecem em relação à precisão absoluta de diferentes métodos de geração desses dados FPOP de alta resolução. Um estudo recente comparando a troca de deutério de hidrogênio e fpop descobriu que os dados FPOP podem sondar a acessibilidade solvente no nível36do subaminoácido . Um método usa o HPLC para resolver os isômeros de oxidação tanto quanto possível e, em seguida, quantificar cada isômero pela área de pico1,,23,,24,25. No entanto, quando uma simples mistura de isômeros de oxidação de peptídeos sintéticos foi quantificada por este método, erros foram encontrados na quantificação absoluta e relatórios anteriores indicaram que a dissociação induzida por colisão MS/MS pode identificar erroneamente locais de oxidação37,,38. A quantificação por dissociação de transferência de elétrons (ETD) tem se mostrado precisa em padrões e proteínas sintéticas, mas a aplicação direta deste método requer a co-elução de todos os isômeros de peptídeos oxidados que não podem ser realizados usando HPLC de fase invertida e geralmente requer cromatografia de exclusão de tamanho ou HILIC7,39,,40,,41; caso contrário, devem ser utilizadas análises de ETD direcionadas complicadas e demoradas7,,8,,9. O consenso atual no campo parece ser que a quantificação do nível de aminoácido baseado na área de LC parece pelo menos identificar corretamente locais de oxidação que alteram e identificam corretamente a quantidade relativa de alteração (ou seja, a oxidação do aminoácido X diminui em Y% na conformação A em comparação com a conformação B), mas a precisão da quantificação da quantidade de oxidação (i.e., aminoáxico X é Y% oxidizado) permanece em disputa.

Os pontos fortes do FPOP como um método flexível de bancada para sondar a topografia de proteínas em muitos locais em um único experimento está impulsionando o interesse contínuo por essa tecnologia, apesar dos obstáculos atuais para o investigador novato. As opções comerciais para a realização do FPOP estão apenas começando a chegar ao mercado; no entanto, é bastante possível para o pesquisador interessado desenvolver seu próprio banco óptico FPOP e realizar experimentos usando software de análise de dados comumente disponível. À medida que o campo cresce e as melhorias nas ferramentas disponíveis continuarão, a facilidade de acesso à tecnologia FPOP aumentará.

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Disclosures

Joshua S. Sharp revela um interesse financeiro significativo na GenNext Technologies, Inc., uma pequena empresa que busca comercializar tecnologias para análise de estrutura de ordem superior de proteínas, incluindo a pegada de proteína radical hidroxíl.

Acknowledgments

Reconhecemos que o financiamento de pesquisa do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais concede R43GM125420-01 para apoiar o desenvolvimento comercial de um dispositivo FPOP benchtop e R01GM127267 para o desenvolvimento de protocolos de padronização e dosimetria para FPOP de alta energia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine Acros Organics 147440250 Soluble in water upto 3.5 mM
Aperture Edmund Optics 39-905 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture
Aperture holder Edmund Optics 53-287 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount
Catalse Sigma Aldrich C-40 Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein
COMPex Pro laser Coherent 1113836 COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl
Dithiotheitol (DTT) Promega V3151 DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)
Fraction collector GenNext Technologies, Inc. N/A Automated fraction collector
Fused silica capillay Molex 1068150023 Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375
Glutamine Acros Organics 119951000 L(+)-Glutamine, 99%
Holder for lens Edmund Optics 03-668 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-100 Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical
LC-MS/MS system Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer
Mas spec grade Acetonitrile Fisher Scientific A955-1 Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade formic acid Fisher Scientific A117-50 Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical
Mass spec grade water Fisher Scientific W6-4 Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical
MES buffer Sigma Aldrich M0164 MES hemisodium salt
Methionine amide Bachem 4000594.0005 H-met-NH2.HCl
Micro V clamp Thor Labs VK250 Micro V-clamp with stainless steel blades
Motorized stage Edmund Optics 68-638 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control
Nano C18 colum Thermo Scientific 164534 Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Optical bench Edmund Optics 56-935 18" x 18" breadboard
Pioneer FPOP Module System GenNext Technologies, Inc. N/A Inline FPOP Radical Dosimetry System
Post holder Edmund Optics 58-979 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder
Sodium phosphate dibasic Fisher Scientific BP331-500 Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP330-500 Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents
Syringe Hamilton 81065 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3
Syringe pump KD Scientific 788101 Legato 101 syringe pump
Trap C18 column Thermo Scientific 160454 Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns
Tris Sigma Aldrich 252859 Tris(hydroxymethyl)aminomethane
Trypsin Promega V5111 Sequencing Grade Modified Trypsin
UV plano convex lens Edmund Optics 84-285 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens

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References

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Bioquímica Edição 163 Oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) pegada de proteína biossimilar compensação espectrometria de cromatografia-massa líquida (LC-MS)
Permitindo compensação em tempo real em oxidações fotoquímicas rápidas de proteínas para a determinação de mudanças de topografia de proteínas
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Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling… More

Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. J. Vis. Exp. (163), e61580, doi:10.3791/61580 (2020).

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