Snabb fotokemisk oxidation av proteiner är en framväxande teknik för den strukturella karakteriseringen av proteiner. Olika lösningsmedelstillsatser och ligander har varierade hydroxylradikala rensningsegenskaper. För att jämföra proteinstrukturen i olika förhållanden krävs realtidskompensation av hydroxylradikaler som genereras i reaktionen för att normalisera reaktionsförhållandena.
Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) är en masspektrometribaserad strukturbiologiteknik som undersöker proteiners lösningstillgängliga yta. Denna teknik bygger på reaktionen av aminosyran sidokedjor med hydroxylradikaler fritt sprida i lösning. FPOP genererar dessa radikaler på plats genom laser fotolys av väteperoxid, skapa en explosion av hydroxylradikaler som är uttömda på order av en mikrosekund. När dessa hydroxylradikaler reagerar med en lösningsmedelsåtkomlig aminosyras sidokedja uppvisar reaktionsprodukterna en massförskjutning som kan mätas och kvantifieras genom masspektrometri. Eftersom reaktionshastigheten för en aminosyra delvis beror på den aminosyrans genomsnittliga tillgängliga yta för lösningsmedel, kan uppmätta förändringar i mängden oxidation av en viss region av ett protein korreleras direkt till förändringar i lösningstillgängligheten i den regionen mellan olika konformationer (t.ex. ligandbunden ligand-fri, monomer kontra aggregera, etc.) FPOP har tillämpats i ett antal problem inom biologi, inklusive protein-protein interaktioner, protein konformationella förändringar, och protein-ligand bindning. Eftersom den tillgängliga koncentrationen av hydroxylradikaler varierar utifrån många experimentella tillstånd i FPOP-experimentet, är det viktigt att övervaka den effektiva radikaldos som proteinalyten exponeras för. Denna övervakning uppnås effektivt genom att man införlivar en inline-dosimeter för att mäta signalen från FPOP-reaktionen, med laserfluens justerad i realtid för att uppnå önskad mängd oxidation. Med denna kompensation kan förändringar i proteintopografi som reflekterar konformationsförändringar, ligandbindande ytor och/eller protein-proteininteraktionsgränssnitt bestämmas i heterogena prover med hjälp av relativt låga provmängder.
Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) är en framväxande teknik för bestämning av proteintopografiska förändringar genom ultrasnabb kovalent modifiering av den lösningsmedelsexponerade ytan av proteiner följt av detektion av LC-MS1. FPOP genererar en hög koncentration av hydroxylradikaler in situ genom UV-laserblixt fotolys av väteperoxid. Dessa hydroxylradikaler är mycket reaktiva och kortlivade, konsumeras på ungefär en mikrosekund tidsskala under FPOP villkor2. Dessa hydroxylradikaler sprider sig genom vatten och oxiderar olika organiska komponenter i lösning vid kinetiska satser som generellt sett sträcker sig från snabb (~106 M-1 s-1) till diffusionsstyrd3. När hydroxylradikala möter en proteinyta kommer radikalen att oxidera aminosyrans sidokedjor på proteinytan, vilket resulterar i en massförskjutning av den aminosyran (oftast den nettotillsats av en syreatom)4. Oxidationsreaktionens hastighet vid någon aminosyra beror på två faktorer: den inneboende reaktiviteten av den aminosyran (som beror på sidokedjan och sekvenssammanhang)4,5 ochden sidokedjans tillgänglighet till den spridande hydroxylradikala, som nära korrelerar till den genomsnittliga lösningsmedels åtkomliga ytan6,7. Alla av de standarda aminosyrorna utom glycin har observerats som märkta av dessa mycket reaktiva hydroxylradikaler i FPOP-experiment, om än vid vitt skilda avkastningar; i praktiken, Ser, Thr, Asn, och Ala ses sällan som oxideras i de flesta prover utom under höga radikala doser och identifieras genom noggrann och känslig riktade ETD fragmentering8,9. Efter oxidation släcks proverna för att avlägsna väteperoxid och sekundära oxidanter (superoxid, singlet oxygen, peptidylhydroxider etc.) De släckta proverna är sedan proteolytiskt rötade för att generera blandningar av oxiderade peptider, där den strukturella informationen fryses som en kemisk “ögonblicksbild” i mönstren för oxidationsprodukter av de olika peptiderna (Figur 1). Vätskekromatografi som kopplas till masspektrometri (LC-MS) används för att mäta mängden oxidation av aminosyror i en given proteolytisk peptid baserat på de relativa intensiteterna hos de oxiderade och ooxiderade versionerna av den peptiden. Genom att jämföra detta oxidativa fotavtryck av samma protein som erhållits under olika konformationsförhållanden (t.ex. ligandbundet kontra ligandfritt) kan skillnader i mängden oxidation av en viss region av proteinet korreleras direkt med skillnader i den lösningsmedelstillgängliga ytan i denregionen 6,7. Förmågan att tillhandahålla protein topografisk information gör FPOP till en attraktiv teknik för högre ordningens strukturbestämning av proteiner, bland annat vid proteinterapeutisk upptäckt och utveckling10,11.
Bild 1: Översikt av FPOP. Proteinens yta kovalent modifieras av mycket reaktiva hydroxylradikaler. De hydroxylradikaler kommer att reagera med aminosyra sidokedjor av proteinet i en takt som starkt påverkas av lösningsmedel tillgänglighet av sidokedjan. Topografiska förändringar (till exempel på grund av bindningen av en ligand som visas ovan) kommer att skydda aminosyror i regionen av interaktion från att reagera med hydroxylradikaler, vilket resulterar i en minskning av intensiteten av modifierad peptid i LC-MS signalen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Olika beståndsdelar som finns i FPOP-lösningen (t.ex., ligander, hjälpämnen, buffertar) har olika rensningsaktivitet mot de hydroxylradikaler som genereras på laserfotolysen av väteperoxid3. På samma sätt kan en liten förändring i peroxidkoncentration, laserfluens och buffertkomposition ändra den effektiva radikaldosen, vilket gör reproduktionen av FPOP-data utmanande över proverna och mellan olika laboratorier. Därför är det viktigt att kunna jämföra den hydroxylradikala dos som finns att reagera med protein i varje prov med hjälp av en av flera tillgängliga hydroxylradikala dosimeter12,13,14,15,16. Hydroxylradikala dosimeters agera, genom att konkurrera med analyten (och med alla asätare i lösning) för slå samman av hydroxylradikaler; den effektiva dosen av hydroxylradikaler mäts genom mätning av mängden oxidation av dosimetern. Observera att “effektiv hydroxylradikala dos” är en funktion av både den initiala koncentrationen av hydroxylradikala genereras och halveringstiden för den radikala. Dessa två parametrar är delvis beroende av varandra, vilket gör den teoretiska kinetiska modelleringen något komplex (Figur 2). Två prover kunde ha vilt olika inledande radikala halveringstid samtidigt som samma effektiva radikal dos genom att ändra den ursprungliga koncentrationen av hydroxylradikala bildas; de kommer fortfarande att generera identiska fotavtryck17. Adenin13 och Tris12 är bekväma hydroxylradikala dosimeter eftersom deras oxidationsnivå kan mätas med UV-spektroskopi i realtid, vilket gör det möjligt för forskare att snabbt identifiera när det finns ett problem med effektiv hydroxylradikala dos och att felsöka deras problem. För att lösa detta problem, en inline dosimeter som ligger i flödessystemet direkt efter platsen för bestrålning som kan övervaka signalen från adenin absorbans förändringar i realtid är viktigt. Detta hjälper i utförandet av FPOP experiment i buffertar eller någon annan hjälpämne med vitt skilda nivåer av hydroxylradikala rensning kapacitet17. Denna radikala doseringskompensation kan utföras i realtid, ger statistiskt omöjlig att skilja resultat för samma conformer genom att justera den effektiva radikal dos.
I detta protokoll, Vi har detaljerade förfaranden för att utföra en typisk FPOP experiment med radikal dosering ersättning med hjälp av adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Med den här metoden kan prövarna jämföra avtryck mellan FPOP-villkor som har olika rensningskapacitet genom att utföra kompensation i realtid.
Figur 2: Kinetisk simulering av dosimetribaserad ersättning. 1 mM adenin dosimeter svar mäts i 5 μM lysozym analyte med en 1 mM initial hydroxylradikala koncentrationen (▪OH t1/2=53 ns), och som ett mål dosimeter svar (svart). Vid tillsats av 1 mM av asätaren excipient histidin, dosimetern svaret (blå) minskar tillsammans med mängden protein oxidation på ett proportionellt sätt (cyan). Halveringstiden för hydroxylradikala minskar också (▪ H.1/2=39 ns). När mängden hydroxylradikala genereras ökas för att ge en motsvarande avkastning av oxiderad dosimeter i provet med 1 mM histidin asopvenger som uppnås med 1 mM hydroxylradikala i frånvaro av sca med en mängd proteinoxidation som uppträder på liknande sätt blir identiskt (magenta), medan den hydroxylradikala halveringstiden minskar ännu mer (▪OH t1/2=29 ns). Anpassad med tillstånd från Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Masspektrometribaserade strukturella tekniker, inklusive väte-deuteriumutbyte, kemisk tvärbindning, kovalent märkning och infödda spraymasspektrometri och jonrörlighet har snabbt ökat i popularitet på grund av deras flexibilitet, känslighet och förmåga att hantera komplexa blandningar. FPOP ståtar med flera fördelar som har ökat sin popularitet inom området masspektrometri-baserade strukturella tekniker. Liksom de flesta kovalenta märkning strategier, ger det en stabil kemisk ögonblicksbild av protein top…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner forskningsfinansiering från National Institute of General Medical Sciences bevilja R43GM125420-01att stödja kommersiell utveckling av en bänkskiva FPOP enhet och R01GM127267 för utveckling av standardisering och dosimetri protokoll för hög energi FPOP.
Adenine | Acros Organics | 147440250 | Soluble in water upto 3.5 mM |
Aperture | Edmund Optics | 39-905 | 1000 μm Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture |
Aperture holder | Edmund Optics | 53-287 | 25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount |
Catalse | Sigma Aldrich | C-40 | Catalase from bovine liver, lyophilized powder, ≥10,000 units/mg protein |
COMPex Pro laser | Coherent | 1113836 | COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl |
Dithiotheitol (DTT) | Promega | V3151 | DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) |
Fraction collector | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Automated fraction collector |
Fused silica capillay | Molex | 1068150023 | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 µm, Outer Diameter 375 µm, TSP100375 |
Glutamine | Acros Organics | 119951000 | L(+)-Glutamine, 99% |
Holder for lens | Edmund Optics | 03-668 | 53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical |
LC-MS/MS system | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer |
Mas spec grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-1 | Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade formic acid | Fisher Scientific | A117-50 | Formic Acid, 99.0+%, Optima™ LC/MS Grade, Fisher Chemical |
Mass spec grade water | Fisher Scientific | W6-4 | Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical |
MES buffer | Sigma Aldrich | M0164 | MES hemisodium salt |
Methionine amide | Bachem | 4000594.0005 | H-met-NH2.HCl |
Micro V clamp | Thor Labs | VK250 | Micro V-clamp with stainless steel blades |
Motorized stage | Edmund Optics | 68-638 | 50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control |
Nano C18 colum | Thermo Scientific | 164534 | Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Optical bench | Edmund Optics | 56-935 | 18" x 18" breadboard |
Pioneer FPOP Module System | GenNext Technologies, Inc. | N/A | Inline FPOP Radical Dosimetry System |
Post holder | Edmund Optics | 58-979 | 3" Length, ¼-20 Thread, Post Holder |
Sodium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP331-500 | Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents |
Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP330-500 | Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents |
Syringe | Hamilton | 81065 | 100 µL, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3 |
Syringe pump | KD Scientific | 788101 | Legato 101 syringe pump |
Trap C18 column | Thermo Scientific | 160454 | Thermo Scientific Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns |
Tris | Sigma Aldrich | 252859 | Tris(hydroxymethyl)aminomethane |
Trypsin | Promega | V5111 | Sequencing Grade Modified Trypsin |
UV plano convex lens | Edmund Optics | 84-285 | 30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens |