Summary
Detta protokoll beskriver användningen av kisel nanotrådar för intracellulära optisk bio-modulering av cell i en enkel och lätt att utföra metod. Tekniken är mycket anpassningsbar till olika celltyper och kan användas för in vitro- såväl som in vivo-applikationer.
Abstract
Myofibroblasts kan spontant internalisera kisel nanotrådar (SiNWs), vilket gör dem till ett attraktivt mål för bioelektroniska applikationer. Dessa cell-kisel hybrider erbjuder blyfri optisk modulering kapacitet med minimala perturbation till normala cell beteende. De optiska funktionerna erhålls genom sinws fototermiska och fotoelektriska egenskaper. Dessa hybrider kan skördas med hjälp av standard vävnadskultur tekniker och sedan tillämpas på olika biologiska scenarier. Vi visar här hur dessa hybrider kan användas för att studera elektrisk koppling av hjärtceller och jämföra hur myofibroblasts par till varandra eller till kardiomyocyter. Denna process kan åstadkommas utan specialutrustning bortom ett fluorescerande mikroskop med kopplade laserlinjen. Också visas är användningen av en specialbyggd MATLAB rutin som gör att kvantifiering av kalcium förökning inom och mellan de olika cellerna i kulturen. Myofibroblasts visas ha en långsammare elektrisk respons än cardiomyocytes. Dessutom visar den myofibroblast intercellulära förökningen något långsammare, men jämförbara hastigheter till deras intracellulära hastigheter, vilket tyder på passiv förökning genom gap korsningar eller nanorör. Denna teknik är mycket anpassningsbar och kan enkelt tillämpas på andra cellulära arenor, för in vitro samt in vivo eller ex vivo undersökningar.
Introduction
Alla biologiska organismer använder elektricitet, i form av joner, för att reglera det cellulära beteendet. Cellmembran innehåller olika typer av specifika jonkanaler som möjliggör passiv och aktiv transport av joner. Dessa joner styr funktionerna i retbara celler, såsom neuronal aktivitet och skelett och hjärt muskel kontraktilitet. Bioelektricitet spelar dock också en viktig roll i icke-retbara celler, som styr många cellulära funktioner såsom cellproliferation1, neuroimmunity2,3,4, och stamcellsdifferentiering5.
Under de senaste decennierna har området bioelektricitet dragit ett ökande intresse, vilket har bidragit till utvecklingen av ett flertal tekniker för bioelektroniska gränssnitt. Mikroelektrod patch pipetter är guldmyntfoten för intracellulär inspelning och stimulering6. I denna metodik dras en glaspipett under särskilda förhållanden för att bilda en skarp kant med en porstorlek på få mikrometer. Denna pipetten är fylld med en buffert och pipetten möjliggör direktkontakt av bufferten med den intracellulära volymen. Detta resulterar i ett bioelektriskt gränssnitt som ger extremt hög signal till brusförhållanden, exakt kontroll över cellulär elektrisk aktivitet och extremt hög temporal upplösning. Även om denna metod är ett extremt kraftfullt verktyg, som nyligen var nedskalad till en nano-pipetkonfiguration7, är det förknippat med flera viktiga tekniska begränsningar. Cytosolspädningseffekten8, liksom mekaniska vibrationer, begränsar dess nytta till kortfristiga förhör, och det kräver dyr specialiserad utrustning och en hög nivå av teknisk skicklighet. Dessutom begränsar dess skrymmande antalet celler som kan registreras eller stimuleras samtidigt, och på grund av dess invasivitet, det kan inte konfigureras under ett experiment. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades mikroelektroder, men storleken på elektroderna begränsar den rumsliga upplösningen samt intracellulär åtkomst. Nanoelektroderrayer tillåter intracellulär inspelning och stimulering men kräver slipande elektroporation för att komma åt cytosol9,10. Dessutom är alla dessa metoder substratbundna och är därmed begränsade till in vitro-cellkulturer, eller till externa ytliga celler, utan tillgång till celler som finns inuti en 3-dimensionell (3D) vävnad.
Optogenetics11 används ofta för att ta itu med dessa 3D och in vivo begränsningar. Optogenetiska metoder är dock baserade på de perturbations av ljusaktiverade plasmamembran jonkanaler som distribueras vid plasmamembranet, begränsa 3D spatial upplösning12 och intracellulära kapacitet.
Vi har nyligen visat att kisel nanotrådar (SiNWs) kan användas för att utföra intracellulära bioelektriska förhör med submicron rumslig upplösning med olika icke-retbara celler, nämligen hjärt myofibroblasts och oligodendrocytes13. Dessutom använde vi dessa SiNWs att utföra ex-vivo cell specifika förhör inom en 3D-hjärt vävnad, att undersöka hur hjärtceller elektriskt par in vivo14. En stor fördel med denna metodik är dess enkelhet; det inte kräver någon genetisk modifiering eller skrymmande instrumentering. Många celler kommer spontant internalisera foto-lyhörda SiNWs med inget behov av ultraljudsbehandling eller elektroporation15. Dessutom kommer de att spontant fly den endosomala inkapsling och bilda en sömlös integration med cytosol och intracellulära organeller13,15. Dessa cell-SiNWs kompositer, kallas cell-kisel hybrider, besitter den dynamiska, mjuka och mångsidiga karaktär ursprungliga cellen, liksom optoelektriska kapacitet SiNWs. Efter hybridisering kan cell-SiNW hybrid skördas med hjälp av standard vävnadskultur tekniker och används för olika tillämpningar såsom intracellulära bioelektrisk stimulering; studera intercellulär bioelektrisk koppling in vitro; och för in vivo cell specifika förhör. Som en effektiv stimulering kräver samlokalisering av hög optisk effekt tätheter och SiNWs, kan man uppnå hög rumslig upplösning både i 2D och 3D. I detta protokoll beskriver vi i detalj metodiken, samt hur resultaten kan analyseras. Fokus läggs på den intra- och intercellulära undersökningen in vitro, men in vivo-implementeringen av denna metodik kan direkt utnyttjas för många andra biologiska scenarier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För att säkerställa överensstämmelse med etiska normer godkändes först alla djurprocedurer relaterade till att isolera kardiomyocyter från gnagarehjärtan av University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Dessutom genomfördes alla djurförsök i fullständig enlighet med vägledning från University of Chicago IACUC.
1. Beredning av cell-SiNWs hybrider
- Isolera primära kardiomyocyter (CMs) med hjälp av en kommersiell kit efter tillverkarens riktlinjer.
- Förbered komplett DMEM för primära cell isolering kompletteras med 10% värme-inaktiverade fetala nötkreatur serum, 1% penicillin-streptomycin och 1% L-glutamin.
- För att isolera myofibroblast (MFs) från MFs-CFs suspension, pre-plate de isolerade cellerna på en vävnad kultur skålen (celler isolerade från 2 hjärtan från steg 1.1. per 100 mm maträtt) för 1 h. Som CMs behöver en fibronectin eller kollagen behandlade yta att följa, endast MFs kommer att fästa vid vävnad kultur yta.
- Aspirera den anrikade CMs cell suspension. Dessa CMs kan användas för hetero-cellulära koppling experiment som beskrivs i avsnitt 3. Skölj MFs med DMEM för att eliminera eventuella återstående PM från MFs skålen.
- Lägg till färskt odlingsmedium till MFs och låt dem föröka sig tills de är ~ 80% konfluent (2-4 dagar). Byt medium varannan dag.
- När cellerna är klara (80 % konfluent) bereder du SiNWs för hybridiseringssteget nedan (steg 1,7).
OBS: Många typer av SiNWs kan användas för detta. I detta experiment, SiNWs som odlades av kemisk ånga nedfall (CVD) med en core-shell p-i-n korsning konfiguration användes som beskrivstidigare 16. Under CVD-tillväxten odlas SiNWs på ett kiselplattor och hålls så småningom som kiselchips täckta med SiNWs. - Skär en 3 mm x 3 mm chip från en wafer med CVD odlade SiNWs med hjälp av en diamant skrivare. Använd skarpa forceps för att hantera rånet och minimera den yta som vidrörs med tentarna, eftersom detta kan bryta SiNWs.
- Sterilisera chipet genom att skölja det med 70% etanol och låta etanolen torka i 30 min i UV-belysning i en biosäkerhet laminär flödeshuva.
- Överför chipet till ett sterilt mikrocentrifugrör och skölj överskott av etanol med hjälp av kompletta odlingsmedier.
- Lägg till 1 mL av kultur media och sonicate chipet i ultraljudsbehandling bad för 1-10 min. Medierna bör vända grumlig som SiNWs släpps ut i media.
OBS: Ultraljudsbehandling tid och makt bör optimeras för olika sonicators eller olika celler, som kortare löptider och lägre befogenheter kommer att ge längre SiNWs. - Tillsätt SiNWs suspension i 5 mL av odlingsmedia och så den på 100 mm vävnadskultur skålen med MFs. Låt SiNWs att internalisera i 4 h och skölj överskottet SiNWs av 5x med media. Låt delvis internaliserade SiNWs slutföra internaliseringen genom att låta dem sitta i ytterligare 1 h före användning.
OBS: Olika celltyper kan behöva olika SiNWs koncentration och / eller internalisering gånger. - Bered lösning för kollagenbeläggning genom att späda ut kollagen stamlösning (3 mg/mL) med steril 20 mM ättiksyra vid förhållandet 1:50. Tillsätt 0,5 mL beläggningslösning till en 35 mm glasbottenskål och låt den sitta i 1 h i 37 °C. Ta bort lösningen och skölj disken med steril PBS.
- Skörda cell-SiNWs hybriderna genom att behandla cellerna med 3 mL trypsin i 2 min vid 37 °C. Tillsätt 10 mL odlingsmedia och skölj hybriderna kraftigt genom pipettering. Centrifugera cellerna försiktigt vid 200 x g i 5 min för att undvika att skada cellerna med de internaliserade SiNWs. Avlägsna överskottsmedia, häng celler med 1 mL-media och så dem på kollagenbehandlade glas botten skålen.
OBS: Hybriderna kan sås ensamma, för att undersöka intracellulär eller intercellulär koppling eller med CMs för att undersöka hetero-cellulär koppling in vitro. - Utför en slutlig verifiering av SiNW-internalisering genom att märka cellernas cytosol (calcein-AM, 4 μM) och membran (membranmarkör, 2 μM) i 30 min vid 37 °C, och avbilda cellen med hjälp av konfokalmikroskopi. Som SiNWs är mycket reflekterande, reflekterat ljus kan användas i stället för fluorescens att visualisera dem.
2. Beredning av celler för intra- och intercellulära undersökningar
- Bered lösning för kollagenbeläggning som i 1.12
- För intracellulär elektrisk stimulering, kultur hybrider med låg sådddensiteter. Använd en vanlig hemocytometer för att räkna celler från avsnitt 1.11. och frö 50 000 celler på en 35 mm glasbottenskål i odlingsmedier. För intercellulära undersökningar, använd högre celltätheter (500 000 celler per fat). För intercellulär koppling mellan OEM-skivor och MF:er samkultur hybriderna med nyisolerade CMs.
- Låt celler fästa över natten innan du utför optisk stimulering experiment. För intercellulära undersökningar, tillåt 48 h vid 37 °C för cellerna att uttrycka intercellulära gap korsningar innan experimentet genomförs.
- Bered kalciumkänslig lagerlösning (får hållas i -20 °C) genom att tillsätta 50 μL DMSO till 50 μg Fluo-4 AM. Bered färgningslösning genom att späda 1 μL färgämne i 1 mL DMEM.
- Aspirera odlingsmediet från celler och tillsätt 1 mL färgningslösning. Låt färgämnet internaliseras i celler i 20-30 min vid 37 °C. Aspirera färgämnet och skölj två gånger med steril PBS.
- Slutligen, tillsätt 1 mL förvjuvade fenol-röd fri DMEM Media, och låt intracellulära Fluo-4 genomgå de-esterification för 30 min i 37 °C.
- Överför celler till mikroskop för avbildning och stimulering.
3. Optisk avbildning och stimulering
- Föruppvärm en befuktad mikroinkubator till 37 °C och bubbelluft-CO2-blandning (95:5).
- Använd ett mikroskop med en kollasterad laserlinje som kopplas ihop i ljusvägen för kalciumavbildning och optisk stimulering.
OBS: En scanning confocal mikroskop är det mest okomplicerade alternativet på grund av dess punkt stimulering kapacitet. Detta förfarande kan dock göras med hjälp av någon standard florescence mikroskop genom att koppla en collimated laserstrålen i oändligheten utrymmet i ljusvägen med hjälp av en balk splitter. Alla mikroskop mål är utformad så att en collimated laser passerade genom det kommer att fokuseras till en diffraktion begränsad laser plats vid fokalplanet. Laservåglängden ska vara nära excitationsljuset, så det kommer att reflekteras av den dichroiska spegeln och passeras av excitationsfiltret. - Visualisera SiNWs och bestämma stimuleringsplatsen med hjälp av brightfield-mikroskopi, överfört ljus eller reflekterande ljus. Sedan konfigurerar du om ljusvägen till fluorescensläge, samtidigt som stimuleringspunkten bibehålls på siNW:s fördefinierade plats.
- Validera den optimala stimuleringseffekten och pulslängden för varje SiNW-storlek och celltyp, för att minimera fototermiska skador på stimulerade celler. För en typisk stimulering protokoll, utföra en 2-10 s baslinje inspelning av intracellulära kalcium aktivitet. Applicera sedan en enda laserpuls på 1-10 mW effekt och 1-10 ms varaktighet (motsvarande 30-300 kW/mm2) för att stimulera SiNW, och registrera den resulterande kalciumvågen för ytterligare 2-10 s.
OBS: Det är väsentligt att optimera den optiska effekten och pulslängden för varje SiNW-storlek och -celler. Detta är nödvändigt för att minimera fototermiska skador på de stimulerade cellerna. - Överför de inspelade filmerna av den optiska stimuleringen, om nödvändigt, för ytterligare analys.
4. Videobearbetning
- Visualisera förändringar i Fluo-4 fluorescens med hjälp av "dF över F" makro17 tillgängliga för ImageJ18, som beräknar förändringen i fluorescens räknas för varje pixel, och normaliserar med det genomsnittliga värdet av vilobaslinjen. Konvertera utdata (flyttalsformat) till 8 bitar för vidare bearbetning.
- Bearbeta dF/F-filmen vidare med hjälp av "Ta bort extremvärden" selektivt medianfilter som finns i ImageJ. Definiera parametrar för att ta bort pixlar där deras värde är mer än 10 över medianvärdet i en radie på 2 pixlar och ersätta det pixelvärdet med medianvärdet.
- Beräkna det optiska flödet i varje ram via Lucas-Kanade-algoritmen, så som den implementeras i verktygslådan Matlab Computer Vision. Utdata från denna funktion var ett vektorfält som innehöll x- och y-komponenterna i det optiska flödet vid varje punkt i varje bild (kod finns i Tilläggsfil 1).
OBS: Medelvärdet optiskt flöde inom en cell, <ν>, motsvarar utvecklingen av kalcium flussmedel inom en cell. Differensen för det optiska flödet, Δ<ν> ger den tidpunkt vid vilken kalciumsignalering aktiverades, genom att identifiera var signalen var maximerad. Dessutom korreleras storleken på Δ<ν> vid sitt maximum till den hastighet med vilken kalciumvågsfronten fortskrider genom cellen. - Beräkna kalciumöverföringens intercellulära hastighet enligt följande ekvation.
vCa2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ),
där tmax,j och tmax,i är tiderna för aktivering för celler j och i, respektive, och r ij är avståndet mellan cellernas centroider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förmågan hos denna metodik att tillåta direkt tillgång till den intracellulära cytosolen beror på den spontana internaliseringen av SiNW i cellerna. Även SiNWs kommer att genomgå spontan internalisering i många celltyper15, vissa celler, såsom kardiomyocyter och nervceller, kommer att behöva siNWs som skall behandlas för att deras internalisering19. I detta protokoll vi beskriva internalisering processen för p-i-n SiNWs med 200-300 nm diameter och ~ 1-3 μm lång i hjärt MFs. Figur 1A visar hur de SiNWs verkade under överförda ljus mikroskopi. Med hjälp av standard faskontrastoptik, var de konfluenta cellerna lätt uppenbara. Dock var SiNWs knappt synliga, vilket gör deras platser omöjliga att definiera. Således använde vi mörk fältmikroskopi, där endast reflekterande objekt kan ses och bakgrunden är mörk. I denna kontrast kan dock cellerna inte ses, eftersom de inte är reflekterande. För att visa sinw-enhetens placering i cellerna lade vi över bilderna tillsammans, så att siNW-enhetens perinukleära arrangemang i cellerna är uppenbart. Även om colocalization av SiNWs och celler är uppenbart, är det fortfarande viktigt att kontrollera att SiNWs verkligen internaliseras inom cellerna, och inte vilar på plasmamembranet. För detta ändamål använde vi confocal mikroskopi (Figur 1B), där cytosolen var färgas med calcein-AM (grön) och plasmamembranet med en membran markör (röd). Den intracellulära placeringen av SiNWs var då uppenbart. Observera att detta steg är extremt viktigt för att verifiera den intracellulära placeringen av SiNWs, särskilt när en ny celltyp (eller linje) används. Men efter internaliseringen är etablerad för de färgade cellerna, bör andra prover användas för stimuleringsproceduren. Även om det inte ligger inom ramen för denna demonstration, är det också viktigt att nämna att i fall där SiNWs inte internaliseras, bioelektriska processer kan fortfarande undersökas på ett liknande, extracellulärtsätt 16. Efter att cellerna har hybridiserats med SiNW:erna kan de användas för att utföra bioelektriska studier.
Här visar vi användningen av denna metodik för att jämföra den homo-cellulära MF-MF elektriska koppling till hetero-cellulära koppling av MFs till MFs. Efter cellerna var hybridiserade med SiNWs, hybriderna var seedade med CMs och odlade. Det är viktigt att begränsa kulturtiden så att de prolifererade MFs inte överbefolkar kulturen. I figur 2 visas ett representativt exempel på ett sådant experiment. Co-odlade celler var laddade med kalcium känsligt färgämne (Fluo-4) och cellerna var avbildade under en snurrande skiva confocal mikroskop. Innan du applicerar någon laserpuls, erhölls en brightfield bild för att identifiera platsen för en SiNW som kommer att stimuleras. Sedan spelades en kort baslinje video, så den spontant slå CMs och vila MFs kan identifieras (Kompletterande Video 1 och kompletterande Video 2). I detta experiment stimulerades den identifierade SiNW med en enda punkt laserpuls (640 nm, 1 ms, 4 mW). Cellerna var ständigt avbildas före och efter stimulering för att visualisera kalcium dynamiken på optisk stimulering. Som celler i kultur skiljer sig mycket i sin ljusstyrka (Kompletterande Video 1), var de levande videor bearbetas till dF / F videor med blå till röd pseudocolor (Supplementary Video 2), så att kalciumsignalerna kommer att bli tydligare. I den här metoden jämförs varje pixel med sitt eget utgångsläge för vilande, innan stimuleringen tillämpades. De representativa bilderna i figur 2C visar kalciumutbredningen inom MFs-CMs samkultur och kan analyseras ytterligare för att studera den intercellulära elektriska kopplingen mellan de olika cellerna, samt den intracellulära kalciumdynamiken.
Bild 3A visar ett sätt att representera kalciumflödet i hela synfältet i en enda bild. Genom att analysera dF / F videor, visar vi den tid då de olika cellerna var upphetsad, som bestämdes av den punkt där förändringen i genomsnittligt optiskt flöde når sitt maximum. På så sätt kan man se hur kalciumflödet förökas från cell till cell. Ett specialbyggt MATLAB-skript (Supplementary File 1) skrevs och användes för att beräkna det optiska flödet och till stöd för att identifiera tiden för aktivering inom varje cellregion (figur 3B). Den inter-cellulära förökningshastigheten kan sedan bestämmas genom att mäta avståndet mellan centrojderna i varje cell och dividera med tidsskillnaden i deras aktivering. En liknande analys kan genomföras som ersätter avstånd med antalet korsningar korsningar; för våra syften, avståndet metriska mer troget presenterar överföringshastigheten som den också står för den tid som tillbringas i intra-cellulära förökning, som är icke-försumbar. Figur 3C visar hur de intra-cellulära hastigheter fastställdes: för varje cell, en linje drogs i riktning mot kalcium förökning och en kymograph genererades genom plottning intensiteten tidsprofilen längs den linjen. Vi passar en linje till framsidan av aktiveringsvågen i kymograph, så att lutningen på linjen representerade inversen av intra-cellulära förökningshastighet. Figur 3D sammanfattar de olika hastigheter (inter- och intra-cellulära) för de olika cellerna i samkulturen. Alla data som finns representerade i detta diagram härleddes från den enda video av ett enda representativt synfält som presenterades här.
Bild 1: SiNWs internaliserade i MFs. (A) Faskontrastbild av MF-filer som behandlats med SiNWs visar konfluenta celler (vänster). Darkfield bilden visar SiNWs spridda i synfältet (mitten), medan överlagra de två bilderna (höger) visar perinukleära arrangemang av SiNWs inom MFs. Skala barer är 20 μm. (B) Representativ konfokal bild (vänster, Scale bar är 10 μm) och 3 olika n-z tvärsnitt som motsvarar de 3 streckade linjer (höger, Skala barer är 5 μm) visar den inre delen av en MF och Den SiNW som är tydligt inne i cytosol. Cytosolen är grön (Calcein-AM), membranet rött (cellmask), och SiNWs vit (reflektion). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Kalciumförökning i samkulturen MF-CM. (A) Illustration av ett typiskt stimuleringsexperiment. MFs med internaliserade SiNWs stimuleras med en laserpuls, medan kalciumflödet övervakas av ett kalciumkänsligt färgämne. (B) En ljusfältsbild av cellerna visar den internaliserade SiNW inuti en av MFs (vänster) och en representativ fluorescensbild av kalciumfärgämnet (höger). Den stimulerade SiNW framhävs av en rosa pilspets. (C) En samkultur av MFs och MMs var laddad med kalcium känsligt färgämne och en SiNW stimulerades med en laserpuls (640 nm, 1 ms, 4 mW). Kalciumflödet övervakades av Fluo-4-intensiteten (toppbilder) och en dF/F-video härleddes från den (bottenbilder). DF/F-algoritmen gör visualiseringen av kalcium flux tydligare, eftersom den jämför intensiteten hos varje pixel med sin egen baslinje, och visar därmed förändringen, och inte den faktiska intensiteten. Skala barer är 20 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Analys pf de dF/F videor från figur 2. (A) kalciumutbredningen kan visualiseras via en optisk kartläggning bild, där färgkoderna för tid pixeln var upphetsad (vilket innebär ökning av kalciumkoncentration och Fluo-4 relativ intensitet). Den optiska mappningen kan göras för olika tidsramar, dvs korta (1,1 s, översta bilden) eller längre (5,5 s, botten bild) varaktigheter. Skala barer är 20 μm. ( B )Representativaexempel för beräkning av cell-cell överföringshastighet. Båda cellerna är MFs här, men samma beräkning kan utföras med MF-CM överföring. Diagrammen visar spåren för det genomsnittliga optiska flödet (mitten) och differentialen (botten) för varje cell. Cell-cellöverföringen kan sedan beräknas med hjälp av Tmax för både celler samt deras centroider, som beskrivs i texten. Röda asterisker betecknar två CMs med begränsad MF-CM koppling och därmed brist på svar på optisk stimulering. Skala barer är 20 μm. (C) MFs' intracellulära kalcium flux hastighet härleddes från lutningen på en kymograph genereras genom skivning de färgade linjerna. Kymograferna representerar intensitet längs linjen (x-axeln) och tid (y-axeln), så att brantare sluttningar motsvarar högre hastigheter. Skala barer är 20 μm. (D) De MFs-MFs och MFs-CMs inter-cellulära hastigheter, liksom MFs intra-cellulära hastigheter kan härledas från B och C respektive och ritas för jämförelse (p-value<0.0001). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande Video 1: Effekten av MF-SiNW hybrid optisk stimulering av Fluo-4. DEN CMs hastighet illustreras före och efter stimuleringen för jämförelse. Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)
Kompletterande Video 2: Effekt av MF-SiNW hybrid optisk stimulering av dF / F video, som härrör från Fluo-4 videor. DEN CMs hastighet illustreras före och efter stimuleringen för jämförelse. Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)
Kompletterande Figur Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har här visat ett enkelt sätt att utföra intracellulär elektrisk stimulering av celler. I denna demonstration använde vi MFs som prehybridized med SiNWs, sedan samkulturerade med CMs. I allmänhet har de flesta prolifereringsceller tendensen att internalisera SiNWs, vilket möjliggör användning av denna metodik med många andra celltyper. Dessutom, medan vi visat den intracellulära stimulering av celler, kan samma principer användas för att utföra extracellulära stimulering av celler. Detta kan göras genom att blockera endosomalkaskader 15 av celler som spontant kommer att internalisera dem, eller använda celler som inte internalisera SiNWs. Till exempel, även om CMs befanns internalisera vissa nanostrukturer20,21, de inte spontanously internalisera SiNWs15. SiNWsna som här användes syntetiserades genom att använda en kemisk dunstdeposition (CVD) apparatur. Se ytterligare resurser beträffande det detaljerade förfarandet för SiNWs-syntes, som finns på annan plats16. Efter att ha erhållit SiNWs, deras hantering och användning är enkla, och inte kräver någon sofistikerad eller dyr utrustning som inte är lätt tillgänglig i en standard bio-medicinska lab. SiNWs kan lätt ses med hjälp av standardmikroskopi från DarkField (Bild 1), vilket gör det enkelt för användaren att följa internaliseringsprocessen och bestämma lämplig SINW-koncentration och behandlingslängd som är nödvändig för en lyckad internalisering. Det rekommenderas också starkt att bestämma den exakta slutliga platsen för SiNWs efter internalisering steget är klar. Detta kan göras genom kommersiellt tillgängliga färgämnen som används för levande-döda analyser (såsom Calcein-AM, som används här) och konfokalmikroskopi (Figur 1B). Det här steget är viktigt när en annan linje av celler används för första gången, och cell-SiNW interaktion är oklart. Olika celler kan internalisera SiNW under olika förhållanden, dvs tid, koncentration och storleksfördelning. Men efter internalisering processen kännetecknas för en given cell, kan denna verifieringsprocedur hoppas över medan du utför mekanistiska bio-elektriska studier.
Efter att cellerna hybridiserats med SiNW:erna kan de skördas av standardvävnadskulturtekniker och användas för bioelektriska undersökningar. I det här protokollet använde vi MFs-SiNWs hybrider för att undersöka hur MFs elektriskt par till andra MFs, eller till MFs in vitro. Det är dock viktigt att notera att denna procedur kan användas för att utföra in vivo analyser också. Till exempel, i en tidigare studie från vårt labb använde vi denna metod för att studera hur MFs elektriskt par till INGs in vivo och jämföra det med deras koppling in vitro14. Eftersom denna process kräver vissa mer tekniska möjligheter, är det inte beskrivs i detta protokoll, men detaljerna kan hittas i vår tidigare studie. Här visar vi hur hybridcellerna kan användas för att lära sig hur kalciumförökar intra- och intercellulärt inom samkulturen (Bild 2A). För att påbörja experimentet bestäms platsen för en SiNW för punktstimulering. Även om SiNWs är knappt synliga med hjälp av faskontrast, är det viktigt att nämna att standard brightfield (utan fas eller darkfield kontrast) kommer också att tillåta deras visualisering (Bild 2B), utan något behov av fluorescerande märkning eller specialiserade mikroskopi tekniker. Efter att ha identifierat en SiNW av intresse, kan man tillämpa en optisk puls för att elektriskt stimulera cellen. Innan stimulering appliceras visar baslinjeregistrering av cellerna spontan elektrisk aktivitet i fyra olika grupper av CMs, som verkar vara osynkroniserade i sin elektriska aktivitet (Kompletterande Video 1 Och Kompletterande Video 2). Dessutom kan 8 olika MFs utan spontan elektrisk aktivitet ses. Representativa kalciumfärgämne och dF/F-bilder visar kalciumutbredningen i hela kulturen vid optisk stimulering (Bild 2COch Kompletterande Video 1 Och Kompletterande Video 2). Dessa livevideor kan analyseras ytterligare för att lära sig de olika cellernas elektriska koppling i synfältet (Bild 3). Först optisk kartläggning av videon (Bild 3A) visar sekvensen av celler som stimuleras av den optiska pulsen. Tidsstaplarna till höger är i förhållande till första bildrutan efter att den optiska stimuleringen applicerats. Eftersom CMs svar på stimulering är mycket snabbare än för MFs, utförde vi den optiska kartläggningen två gånger, med olika tidsramar. Den första utfördes för att visa den snabba CMs svar, så att färgområdet täcker 1.1 s efter stimuleringen. Detta visar i vilken ordning de olika CMs och de första MFs är upphetsad av stimulering. Men eftersom det finns MF som är längre nedströms vägen för spridning, deras excitation timing visas inte i den här mappningen. Således utfördes samma analys under en längre tid, vilket ger mindre detaljer om det ursprungliga svaret, men tydligt visar fördröjning och långsammare svar från MF som är nedströms från excitation webbplats. Med hjälp av vår specialbyggda algoritm kunde vi ge en reproducerbar kvantitativ analys av den maximala kalciumfluxtimingen, som vi använde som referens, tillsammans med cellens avstånd från stimuleringen, för att bestämma den intercellulära förökningshastigheten till den cellen. Detta utfördes på både DE-skivor och MF: erna, så att den tydliga skillnaden mellan den passiva (MF-MF) och förstärkt (MF-CM) förökningen kan mätas. Det kan dessutom tydligt visas att den elektriska aktiviteten hos två CMs (röda asterisker i Bild 3B) påverkas inte av den optiska stimulansen. Detta kan tillskrivas det faktum att inte alla celler är lika kopplade till en annan inom kulturen. Denna teknik gör det möjligt för användaren att identifiera vilka celler i synfältet som verkligen är kopplade till den stimulerade cellen, och vilka som inte är det. Dessutom kunde vi bestämma spridningsriktningen inom varje cell och ange en parallell linje som användes för att härleda en kymograf som beskriver spridningen inom den cellen. Detta användes för att bestämma den intracellulära kalcium fluxhastigheten, enligt kymografens lutning (Bild 3C). När alla intra- och intercellulära hastigheter sammanställdes, stod det klart att CMs svar var betydligt snabbare än svaret på MF:s svar på den optiska stimulansen. Samtidigt konstaterades MFs intracellulära hastigheter vara något snabbare, men jämförbara med MF-MF intercellulära föröknings hastigheter. Denna iakttagelse tyder på att till skillnad från den förstärkta elektriska kopplingen mellan MF till CMs, den intercellulära elektriska kopplingen mellan MF är passiv, och baserat på diffusion av kalcium genom den intracellulära volymen, och sedan intercellulära gap-korsningar22,23 eller tunneling nanorör24, agerar som en flaskhals som saktar ner förökningshastigheten. SiNW-kontorens förmåga att transduce den optiska stimuleringen till ett bioelektriskt förhör kan tillskrivas den fotoanodiska och fotokathodisk reaktionen vid sinws p-n-knutpunkt, eller till den fototermiska reaktionen på grund av SiNW-kontorens låga värmekapacitet13. Även om andra partiklar i nanoskala kan transduce optisk stimulering25, de är vanligtvis inkapslade till ett endosomalt kuvert26, begränsa deras förmåga att direkt gränssnitt med intracellulära organeller för lokala förhör. Det är viktigt att inse att den höga optiska densiteten av stimuleringen kan resultera i cellulära skador på grund av den fototermiska effekten. Således är det viktigt att optimera effekt och pulslängd så att en sådan effekt kommer att undvikas. För känsliga celler är det dock möjligt att studera hur kalciumet fortplantar sig mellan de andra cellerna i odlingen, även om lokal termisk skada appliceras på den stimulerade cellen.
En annan viktig aspekt av denna analysmetodik är att alla data som visas i figur 3D samlades in från en enda video av ett enda synfält inom den kulturen. Trots att de data som samlats in användes var de uppgifter som samlades in fortfarande tillräckligt starka för att få statistisk signifikans, vilket visar hur stark och effektiv denna metodik är. För att analysera och studera mer känsliga och subtila effekter kan en mycket större datamängd enkelt genereras genom att stimulera andra celler inom samma kultur. För en glasbottenskål med effektiv diameter på 10 mm, kan man hitta mer än 2000 synfält att analysera. Som en enkel punkt laser stimulering måste ställas in, bör varje stimulering experiment ta mindre än 1 min att utföra. Detta kommer att tillåta många mekanistiska studier som skall utföras på ett sätt som är otillgängliga med hjälp av traditionella tekniker såsom patch-clamp, eller microelectrode array med fördefinierade elektrod positioner. Dessutom möjliggör den nanoskala storleken på siNWs som används häri, stimulering med extremt hög rumslig upplösning. När det gäller den tidsmässiga upplösningen kommer den att bestämmas av det mikroskop som används för bilddiagnostiken/simuleringen. I detta sammanhang, med hjälp av bildbehandling kommer att resultera i låg tidsmässig upplösning, detta kan förbättras genom att använda mer tid känsliga elektrofysiologi tekniker, såsom patch clamp eller mikro-elektroder arrayer. Även om SiNWs anses vara bioabsorbable på lång sikt, har vi aldrig märkt någon märkbar nedbrytning inom tidsramen på upp till 7 dagar, vilket kommer att tillåta dess användning för de flesta in vitro-studier.
Sammantaget använde vi en enkel och rakt framåt teknik för att utföra en in vitro bio-elektrisk undersökning av hjärtceller. Vi visar hur vi kan studera olika sätt olika celler kopplas till varandra och beskrev ett reproducerbart sätt att kvantifiera kalciumförökning och hastighet. Tekniken är anpassningsbar till andra celltyper, samt till in vivo och ex vivo inställningar. Den är baserad på standardfluorescensmikroskopi och en kopplade laser som är allmänt tillgängliga för standard biomedicinska laboratorier, och det finns inget behov av specialiserad utrustning. Tekniken kan lätt behärskas och kan möjliggöra insamling av stora datamängder på minimal tid, jämfört med tillgängliga tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av flygvapnets kontor för vetenskaplig forskning (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
