Summary
Denne protokollen beskriver bruken av silisium nanowires for intracellulær optisk bio-modulasjon av celle i en enkel og enkel å utføre metode. Teknikken er svært tilpasningsdyktig til ulike celletyper og kan brukes til in vitro samt in vivo applikasjoner.
Abstract
Myofibroblaster kan spontant internalisere silisium nanowires (SiNWs), noe som gjør dem til et attraktivt mål for bioelektroniske applikasjoner. Disse celle-silisium hybrider tilbyr blyfri optisk modulasjon evner med minimal perturbasjon til normal celle atferd. De optiske egenskapene oppnås av de fototermiske og fotoelektriske egenskapene til SiNWs. Disse hybridene kan høstes ved hjelp av standard vev kultur teknikker og deretter brukes på ulike biologiske scenarier. Vi demonstrerer her hvordan disse hybridene kan brukes til å studere elektrisk kobling av hjerteceller og sammenligne hvordan myofibroblaster par til hverandre eller til kardiomyocytter. Denne prosessen kan oppnås uten spesialutstyr utover et fluorescerende mikroskop med koplet laserlinje. Også vist er bruken av en spesialbygd MATLAB rutine som tillater kvantifisering av kalsium forplantning i og mellom de forskjellige cellene i kulturen. Myofibroblaster er vist å ha en langsommere elektrisk respons enn kardiomyocytter. Videre viser myofibroblast intercellulær forplantning litt langsommere, selv om sammenlignbare hastigheter til deres intracellulære hastigheter, noe som tyder på passiv forplantning gjennom gapkryss eller nanorør. Denne teknikken er svært tilpasningsdyktig og kan enkelt brukes på andre cellulære arenaer, for in vitro samt in vivo eller ex vivo undersøkelser.
Introduction
Alle biologiske organismer bruker elektrisitet, i form av ioner, for å regulere cellulær oppførsel. Cellemembraner inneholder ulike typer spesifikke iionkanaler som tillater passiv og aktiv transport av ioner. Disse ionene styrer funksjonene til spennende celler, som nevronal aktivitet og skjelett- og hjertemuskelkontraktilitet. Bioelektrisitet spiller imidlertid også en viktig rolle i ikke-spennende celler, som styrer mange cellulære funksjoner som cellespredning1,nevroimmunitet2,3,4og stamcelledilatering5.
I de siste tiårene har bioelektrisitetsfeltet trukket et økende interessenivå, noe som har bidratt til utviklingen av en rekke teknologier for bioelektroniske grensesnitt. Mikroelektrod patch pipetter er gullstandarden for intracellulær opptak og stimulering6. I denne metodikken trekkes en glasspipette under spesifikke forhold for å danne en skarp kant med en porestørrelse på få mikrometer. Denne pipetten er fylt med en buffer og pipetten tillater direkte kontakt med bufferen med det intracellulære volumet. Dette resulterer i et bioelektrisk grensesnitt som gir ekstremt høye signal-til-støyforhold, presis kontroll over mobilnettets elektriske aktivitet og ekstremt høy temporal oppløsning. Selv om denne metoden er et ekstremt kraftig verktøy, som nylig ble nedskalert til en nanopipettekonfigurasjon7,er den forbundet med flere viktige tekniske begrensninger. Cytosol fortynning effekt8, samt mekaniske vibrasjoner, begrenser verktøyet til kortsiktige avhør, og det krever dyrt spesialisert utstyr og et høyt nivå av tekniske ferdigheter. Videre begrenser dens bulkiness antall celler som kan registreres eller stimuleres samtidig, og på grunn av invasiviteten kan den ikke konfigureres på nytt gjennom et eksperiment. For å overvinne disse begrensningene ble mikroelektrodarrayer utviklet, men størrelsen på elektrodene begrenser romlig oppløsning samt intracellulær tilgang. Nanoelektrodarrayer tillater intracellulær opptak og stimulering, men krever slipende elektroporasjon for å få tilgang til cytosol9,10. I tillegg er alle disse metodene substrat bundet og er dermed begrenset til in vitro cellekulturer, eller til eksterne overfladiske celler, uten tilgang til celler som er inne i et 3-dimensjonalt (3D) vev.
Optogenetics11 er mye brukt til å løse disse 3D og in vivo begrensninger. Imidlertid er optogenetiske metoder basert på perturbasjonene av lysaktiverte plasmamembranionkanaler som distribueres ved plasmamembranen, og begrenser 3D-romligoppløsning 12 og intracellulære evner.
Vi har nylig vist at silisium nanowires (SiNWs) kan brukes til å utføre intracellulær bioelektrisk avhør med submicron romlig oppløsning med forskjellige ikke-spennende celler, nemlig hjerte myofibroblaster og oligodendrocytes13. Videre brukte vi disse SiNWs til å utføre ex-vivo cellespesifikt avhør i et 3D-hjertevev, for å undersøke hvordan hjerteceller elektrisk par i vivo14. En stor fordel med denne metodikken er dens enkelhet; det krever ingen genetisk modifikasjon eller klumpete instrumentering. Mange celler vil spontant internalisere fotoresponsive SiNWs uten behov for sonikering eller elektroporasjon15. I tillegg vil de spontant unnslippe den enoforale innkapslingen og danne en sømløs integrasjon med cytosol og intracellulære organeller13,15. Disse celle-SiNWs kompositter, be begrepcelle-silisium hybrider, har den dynamiske, myke og allsidige natur den opprinnelige cellen, samt optoelektriske evner av SiNWs. Etter hybridisering, celle-SiNW hybrid kan høstes ved hjelp av standard vev kultur teknikker og brukes for ulike applikasjoner som intracellulær bioelektrisk stimulering; studere intercellulær bioelektrisk kobling in vitro; og for in vivo cellespesifikke avhør. Som en effektiv stimulering krever sam-lokalisering av høy optisk effekt tettheter og SiNWs, kan man oppnå høy romlig oppløsning både i 2D og 3D. I denne protokollen beskriver vi i detalj metodikken, samt hvordan resultatene kan analyseres. Fokuset er plassert på intra- og intercellulær undersøkelse in vitro, men in vivo implementeringen av denne metodikken kan brukes direkte for mange andre biologiske scenarier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For å sikre overholdelse av etiske standarder ble alle dyreprosedyrer knyttet til å isolere kardiomyocytter fra gnagerhjerter først godkjent av University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I tillegg ble alle dyreforsøk utført i fullstendig samsvar med veiledning fra University of Chicago IACUC.
1. Utarbeidelse av celle-SiNWs hybrider
- Isoler primære kardiomyocytter (CMs) ved hjelp av et kommersielt sett etter produsentens retningslinjer.
- Forbered komplett DMEM for primær celleisolasjon supplert med 10% varmeinaktivert fostersvinserum, 1% penicillin-streptomycin og 1% L-glutamin.
- For å isolere myofibroblast (MFs) fra MFs-CMs suspensjon, pre-plate de isolerte cellene på en vev kultur parabolen (celler isolert fra 2 hjerter fra trinn 1.1. per 100 mm parabolen) for 1 time. Siden CMs trenger en fibronectin eller kollagen behandlet overflate for å feste, bare MFs vil feste til vev kultur overflaten.
- Aspirer den berikede CMs celle suspensjon. Disse CMs kan brukes til hetero-cellulære koblingseksperimenter som beskrevet i avsnitt 3. Skyll MFs med DMEM for å eliminere eventuelle gjenværende CMs fra MFs parabolen.
- Legg til fersk kultur medium til MFs og la dem spre seg til de er ~ 80% samløpet (2-4 dager). Bytt medium annenhver dag.
- Når cellene er klare (80 % samløpet), klargjør SiNWs for hybridiseringstrinnet nedenfor (trinn 1.7).
MERK: Mange typer SiNWs kan brukes til dette. I dette eksperimentet ble SiNWs som ble dyrket av kjemisk dampdeponering (CVD) med en kjerneskall p-i-n-koblingskonfigurasjon brukt som beskrevet tidligere16. Under CVD-veksten dyrkes SiNWs på et silisiumwafer-substrat, og blir til slutt holdt som silisiumbrikker dekket med SiNWs. - Klipp en 3 mm x 3 mm chip fra en wafer med CVD dyrket SiNWs ved hjelp av en diamant skriver. Bruk skarpe tang til å håndtere wafer og minimere overflatearealet som berøres med tang, da dette kan bryte SiNWs.
- Steriliser brikken ved å skylle den med 70% etanol og la etanol tørke i 30 min under UV-lys i en biosikkerhet laminær strømningshette.
- Overfør brikken til et sterilt mikrocentrifugerør og skyll overflødig etanol ved hjelp av komplette kulturmedier.
- Tilsett 1 ml kulturmedier og sonicate brikken i sonikering bad i 1-10 min. Mediene skal bli overskyet når SiNWs slippes inn i media.
MERK: Sonikeringstid og -kraft bør optimaliseres for forskjellige sonicatorer eller forskjellige celler, da kortere varigheter og lavere krefter vil gi lengre SiNWs. - Tilsett SiNWs suspensjon i 5 ml kulturmedier og frø den på 100 mm vev kultur parabolen med MFs. La SiNWs internalisere i 4 timer og skyll overflødig SiNWs av 5x med media. La delvis internaliserte SiNWs fullføre internaliseringen ved å la dem sitte i ytterligere 1 time før bruk.
MERK: Ulike celletyper kan trenge forskjellige SiNWs konsentrasjons- og/eller internaliseringstider. - Forbered kollagenbeleggoppløsning ved å fortynne kollagenlageroppløsning (3 mg/ml) med sterilt 20 mM eddiksyre i forholdet 1:50. Tilsett 0,5 ml beleggoppbelegg til en 35 mm glassbunnsfat og la den sitte i 1 time i 37 °C. Fjern oppløsningen og skyll parabolen med steril PBS.
- Høst celle-SiNWs hybrider ved å behandle cellene med 3 ml trypsin i 2 min ved 37 °C. Tilsett 10 ml kulturmedier og skyll hybridene kraftig ved å pipettering. Sentrifuger cellene forsiktig ved 200 x g i 5 min for å unngå å skade cellene med de internaliserte SiNWs. Fjern overflødige medier, suspender celler med 1 ml media og frø dem på kollagenbehandlet glass bunnrett.
MERK: Hybridene kan seedes alene, for å undersøke intracellulær eller intercellulær kobling eller med CMs for å undersøke hetero-cellulær kobling in vitro. - Utfør en endelig verifisering av SiNW internalisering ved å merke cellenes cytosol (calcein-AM, 4 μM) og membran (membranmarkør, 2 μM) i 30 min ved 37 °C, og bilde av cellen ved hjelp av konfokal mikroskopi. Siden SiNWs er svært reflekterende, kan reflektert lys brukes i stedet for fluorescens for å visualisere dem.
2. Fremstilling av celler for intra- og intercellulære undersøkelser
- Forbered kollagenbeleggoppbelegg som i 1,12
- For intracellulær elektrisk stimulering, kultur hybrider med lav såing tettheter. Bruk et standard hemocytometer for å telle celler fra pkt. 1.11. og frø 50.000 celler på en 35 mm glass bunnrett i kulturmedier. For intercellulære undersøkelser, bruk høyere celletettheter (500.000 celler per tallerken). For intercellulær kobling mellom CMs og MFs, co-kultur hybrider med nyisolerte CMs.
- La cellene festes over natten før de utfører optiske stimuleringseksperimenter. For intercellulære undersøkelser, la 48 h ved 37 °C for cellene å uttrykke intercellulære gapkryss før eksperimentet utføres.
- Klargjør kalsiumfølsom fargestofflagerløsning (kan oppbevares i -20 °C) ved å tilsette 50 μL DMSO til 50 μg Fluo-4 AM. Forbered fargeløsningen ved å fortynne 1 μL fargestoff i 1 ml DMEM.
- Aspirer kulturmediet fra celler og tilsett 1 ml fargingsløsning. La fargestoffet internaliseres i celler i 20-30 min ved 37 °C. Aspirer fargestoffet og skyll to ganger med steril PBS.
- Til slutt legger du til 1 ml forhåndsoppvarmet fenolrødt fritt DMEM Media, og la intracellulær Fluo-4 gjennomgå de-esterification i 30 min i 37 °C.
- Overfør celler til mikroskop for avbildning og stimulering.
3. Optisk avbildning og stimulering
- Forvarm en fuktet mikroinkubator til 37 °C og bobleluft-CO2-blanding (95:5).
- Bruk et mikroskop med en kollidert laserlinje sammenlignet med lysbanen for kalsiumavbildning og optisk stimulering.
MERK: Et konfokalt skannemikroskop er det enkleste alternativet på grunn av punktstimuleringsfunksjonene. Denne prosedyren kan imidlertid gjøres ved hjelp av et hvilket som helst standard florescence-mikroskop ved å koble en kollidert laserstråle inn i evighetsrommet på lysbanen ved hjelp av en strålesplitter. Ethvert mikroskop mål er utformet slik at en kollidert laser passert gjennom det vil være fokusert til en diffraksjon begrenset laser flekk på fokalplanet. Laserbølgelengden skal være nær eksitasjonslyset, så det vil bli reflektert av det diktrodiske speilet og passert av eksitasjonsfilteret. - Visualiser SiNWs og bestem stimuleringsstedet ved hjelp av brightfield mikroskopi, overført lys eller reflekterende lys. Deretter konfigurerer du lysbanen til fluorescensmodus på nytt, samtidig som stimuleringspunktet opprettholdes på den forhåndsdefinerte plasseringen av SiNW.
- Valider den optimale stimuleringskraften og pulslengden for hver SiNW-størrelse og celletype, for å minimere fototermisk skade på stimulerte celler. For en typisk stimuleringsprotokoll, utfør en 2-10 s baseline opptak av intracellulær kalsiumaktivitet. Deretter påfør en enkelt laserpuls på 1-10 mW effekt og 1-10 ms varighet (tilsvarende 30-300 kW / mm2) for å stimulere SiNW, og registrere den resulterende kalsiumbølgen for en annen 2-10 s.
MERK: Det er viktig å optimalisere den optiske strøm- og pulslengden for hver SiNW-størrelse og -celler. Dette er nødvendig for å minimere fototermisk skade på de stimulerte cellene. - Overfør de innspilte filmene av den optiske stimuleringen, om nødvendig, for videre analyse.
4. Videobehandling
- Visualiser endringer i Fluo-4 fluorescens ved hjelp avmakroen "dF over F" som er tilgjengelig for ImageJ18, som beregner endringen i fluorescenstellinger for hver piksel, og normaliserer med gjennomsnittsverdien for hvilende grunnlinje. Konverter utdataene (flyttallsformat) til 8 biter for videre behandling.
- Behandle dF/F-filmen videre ved hjelp av"Fjern outliers" selektiv medianfilter tilgjengelig i ImageJ. Definer parametere for å fjerne piksler der verdien er mer enn 10 over medianverdien i en radius på to piksler og erstatte denne pikselverdien med medianen.
- Beregn den optiske flyten i hver ramme via Lucas-Kanade-algoritmen, som implementert i Matlab Computer Vision-verktøykassen. Utdataene fra denne funksjonen var et vektorfelt som inneholdt x- og y-komponentene i den optiske flyten på hvert punkt i hvert bilde (koden er tilgjengelig i supplerende fil 1).
MERK: Gjennomsnittlig optisk strøm i en celle, <ν>, tilsvarer utviklingen av kalsiumstrøm i en celle. Differensialen av den optiske strømmen, Δ<ν> gir tidspunktet da kalsiumsignalering ble aktivert, ved å identifisere hvor signalet ble maksimert. I tillegg er størrelsen på Δ<ν> på sitt maksimale korrelert med hastigheten som kalsiumbølgefronten utvikler seg gjennom cellen. - Beregn den intercellulære hastigheten på kalsiumoverføring i henhold til følgende ligning.
vCa2+ = rij / ( tmaks, j − t maks,i ),
hvor tmax, j og t max, jeg er tider for aktivering for celler j og i, henholdsvis, og r ij er avstanden mellom centroids av cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metodikkens evne til å gi direkte tilgang til intracellulær cytosol avhenger av den spontane internaliseringen av SiNW i cellene. Selv om SiNWs vil gjennomgå spontan internalisering i mange celletyper15,vil noen celler, som kardiomyocytter og nevroner, trenge SiNWs som skal behandles for å tillate deres internalisering19. I denne protokollen beskriver vi internaliseringsprosessen av p-i-n SiNWs med 200-300 nm diameter og ~ 1-3 μm lang inn i hjerte MFs. Figur 1A demonstrerer hvordan SiNWs dukket opp under overført lys mikroskopi. Ved hjelp av standard fasekontrastoptikk var de samtidige cellene lett synlige. SiNWs var imidlertid knapt synlige, noe som gjorde deres steder umulige å definere. Dermed brukte vi mørk feltmikroskopi, hvor bare reflekterende objekter kan ses og bakgrunnen er mørk. I denne kontrasten kan cellene imidlertid ikke ses, da de ikke reflekterer. For å vise plasseringen av SiNW i cellene, la vi bildene sammen, slik at perinukleærarrangementet til SiNWs i cellene er tydelig. Selv om colocalization av SiNWs og celler er tydelig, er det fortsatt viktig å verifisere at SiNWs er faktisk internalisert i cellene, og ikke hviler på plasmamembranen. For dette formål brukte vi konfokal mikroskopi (figur 1B), hvor cytosolen ble farget med calcein-AM (grønn) og plasmamembranen med en membranmarkør (rød). Den intracellulære plasseringen av SiNWs var da tydelig. Vær oppmerksom på at dette trinnet er ekstremt viktig for å kontrollere den intracellulære plasseringen av SiNWs, spesielt når en ny celletype (eller linje) brukes. Men etter at internaliseringen er etablert for de beisede cellene, bør andre prøver brukes til stimuleringsprosedyren. Selv om det ikke er innenfor rammen av denne demonstrasjonen, er det også viktig å nevne at i tilfeller der SiNWs ikke er internalisert, kan bioelektriske prosesser fortsatt undersøkes på en lignende, ekstracellulær måte16. Etter at cellene er hybridisert med SiNWs, kan de brukes til å utføre bioelektriske studier.
Her demonstrerer vi bruken av denne metodikken for å sammenligne den homocellulære MF-MF elektriske koblingen med den hetero-cellulære koblingen av MFs med CMs. Etter at cellene ble hybridisert med SiNWs, hybrider ble seeded med CMs og kultivert. Det er viktig å begrense kulturtiden slik at de voksende MFs ikke overbefolker kulturen. Figur 2 viser et representativt eksempel på et slikt eksperiment. Co-kultiverte celler ble lastet med kalsiumfølsom fargestoff (Fluo-4) og cellene ble avbildet under en spinnende plate konfokal mikroskop. Før du bruker laserpuls, ble det innhentet et brightfield-bilde for å identifisere plasseringen av en SiNW som vil bli stimulert. Deretter ble en kort baseline video tatt opp, slik at spontant slå cMs og hvile MFs kan identifiseres (Supplerende Video 1 og Supplerende Video 2). I dette eksperimentet ble den identifiserte SiNW stimulert med ett punkt laserpuls (640 nm, 1 ms, 4 mW). Cellene ble stadig avbildet før og etter stimuleringen for å visualisere kalsiumdynamikken ved optisk stimulering. Som celler i kultur sterkt forskjellig i deres lysstyrke (Supplerende Video 1),live videoer ble behandlet i dF / F videoer med blå til rød pseudocolor (Supplerende Video 2), slik at kalsiumsignalene vil bli klarere. I denne metoden sammenlignes hver piksel med sin egen hviletilstand ved baseline, før stimuleringen ble påført. De representative bildene i figur 2C viser kalsiumforplantningen i MFs-CMs-samkulturen og kan analyseres videre for å studere den intercellulære elektriske koblingen mellom de forskjellige cellene, samt den intracellulære kalsiumdynamikken.
Figur 3A viser en måte å representere kalsiumfluksen i hele synsfeltet i ett enkelt bilde. Ved å analysere dF / F-videoene, viser vi tidspunktet da de forskjellige cellene var begeistret, noe som ble bestemt av det punktet hvor endringen i gjennomsnittlig optisk flyt når sitt maksimale. På denne måten kan man se hvordan kalsiumfluksen forplantet seg fra celle til celle. Et spesialbygd MATLAB-skript (Tilleggsfil 1) ble skrevet og brukt til å beregne den optiske flyten og for å hjelpe til med å identifisere aktiveringstidspunktet i hvert celleområde (figur 3B). Den intercellulære forplantningshastigheten kan deretter bestemmes ved å måle avstanden mellom centroids av hver celle og dele etter tidsforskjellen i aktiveringen. En lignende analyse kan utføres som erstatter avstand med antall veikryss; for våre formål presenterer avstandsmålingen mer trofast overføringshastigheten, da den også står for tiden som brukes i intracellulær forplantning, noe som ikke er ubetydelig. Figur 3C viser hvordan de intracellulære hastighetene ble bestemt: For hver celle ble en linje trukket i retning av kalsiumforplantning og en kymograf ble generert ved å plotte intensitetstidsprofilen langs den linjen. Vi passer en linje til forsiden av aktiveringsbølgen i kymografen, slik at skråningen av linjen representerte den inverse av den intracellulære forplantningshastigheten. Figur 3D oppsummerer de forskjellige hastighetene (inter- og intracellulære) for de forskjellige cellene i samkulturen. Alle dataene som er representert i denne grafen, ble avledet fra den ene videoen av et enkelt representativt synsfelt som ble presentert her.
Figur 1: SiNWs internalisert til MFs. (A) Fasekontrastbilde av MFs behandlet med SiNWs viser samtidige celler (venstre). Darkfield-bildet viser SiNWs spredt i synsfeltet (midten), mens overlaging av de to bildene (høyre) viser perinukleærarrangementet til SiNWs i MFs. Skalalinjer er 20 μm. (B) Representativt konfokalbilde (venstre, Skalalinjen er 10 μm) og 3 forskjellige n-z-tverrsnitt som tilsvarer de 3 stiplede linjene (høyre, Skalastengene er 5 μm) viser den indre delen av en MF og SiNW som er tydelig inne i cytosolen. Cytosolen er grønn (Calcein-AM), membranen rød (cellemaske), og SiNWs hvit (refleksjon). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kalsiumforplantning i MF-CM-samkultur. (A)Illustrasjon av et typisk stimuleringseksperiment. MFs med internaliserte SiNWs stimuleres med laserpuls, mens kalsiumfluksen overvåkes av et kalsiumfølsomt fargestoff. (B) Et lyst feltbilde av cellene viser den internaliserte SiNW inne i en av MFs (venstre) og et representativt fluorescensbilde av kalsiumfargestoffet (høyre). Den stimulerte SiNW er uthevet av et rosa pilhode. (C) En co-kultur av MFs og CMs ble lastet med kalsiumfølsom fargestoff og en SiNW ble stimulert med en laser puls (640 nm, 1 ms, 4 mW). Kalsiumstrømmen ble overvåket av Fluo-4 intensitet (toppbilder) og en dF / F video ble avledet fra det (nederste bilder). DF/ F-algoritmen gjør visualiseringen av kalsiumfluksen klarere, da den sammenligner intensiteten til hver piksel med sin egen grunnlinje, og viser dermed endringen, og ikke den faktiske intensiteten. Skala barer er 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Analyse pf dF / F videoer fra figur 2. (A)kalsiumforplantningen kan visualiseres via et optisk kartbilde, hvor fargekodene for tiden pikselen var spent (noe som betyr økning i kalsiumkonsentrasjon og Fluo-4 relativ intensitet). Den optiske kartleggingen kan gjøres for ulike tidsrammer, det vil si korte (1,1 s, toppbilde) eller lengre (5,5 s, nederste bilde) varigheter. Skalalinjer er 20 μm. (B) Representative eksempler for beregning av cellecelleoverføringshastighet. Begge cellene er MFs her, men samme beregning kan utføres med MF-CM-overføring. Grafene viser sporene for den gjennomsnittlige optiske flyten (midten) og differensialen (nederst) for hver celle. Cellecelleoverføringen kan deretter beregnes ved hjelp av Tmax for begge cellene så vel som deres centroids, som beskrevet i teksten. Røde stjerner betegner to CMs med begrenset MF-CM kobling og dermed mangel på respons på optisk stimulering. Skalastenger er 20 μm. (C) MFs intracellulære kalsiumflukshastighet ble avledet fra skråningen av en kymograf generert ved å kutte de fargede linjene. Kymografene representerer intensitet langs linjen (x akse) og tid (y akse), slik at brattere bakker tilsvarer høyere hastigheter. Skalalinjer er 20 μm. (D) MFs-MFs og MFs-CMs inter-cellulære hastigheter, samt MFs intracellulære hastigheter kan utledes fra henholdsvis B og C og plottet for sammenligning (p-verdi<0.0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende video 1: Effekten av MF-SiNW hybrid optisk stimulering av Fluo-4. CMs-hastigheten illustreres før og etter stimuleringen for sammenligning. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende Video 2: Effekten av MF-SiNW hybrid optisk stimulering av dF / F-videoen, avledet fra Fluo-4-videoene. CMs-hastigheten illustreres før og etter stimuleringen for sammenligning. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende figur Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har vist her en enkel måte å utføre intracellulær elektrisk stimulering av celler. I denne demonstrasjonen brukte vi MFs som var prehybridized med SiNWs, deretter co-kultivert med CMs. Generelt har de fleste voksende celler tendensen til å internalisere SiNWs, noe som gjør det mulig å bruke denne metodikken med mange andre celletyper. Videre, mens vi demonstrerte intracellulær stimulering av celler, kan de samme prinsippene brukes til å utføre ekstracellulær stimulering av celler. Dette kan gjøres ved å blokkere ensyosomale kaskader15 av celler som spontant vil internalisere dem, eller ved hjelp av celler som ikke internaliserer SiNWs. For eksempel, selv om CMs ble funnet å internalisere noen nanostrukturer20,21, de ikke spontant internalisere SiNWs15. SiNWs som brukes her ble syntetisert ved hjelp av et kjemisk dampdeponeringsapparat (CVD). Se flere ressurser angående den detaljerte prosedyren for SiNWs syntese, som finnes andre steder16. Etter å ha fått SiNWs, er deres håndtering og bruk enkel, og krever ikke noe sofistikert eller dyrt utstyr som ikke er lett tilgjengelig i et standard biomedisinsk laboratorium. SiNWs kan lett ses ved hjelp av standard darkfield mikroskopi (Figur 1), noe som gjør det enkelt for brukeren å følge internaliseringsprosessen og bestemme riktig SINW konsentrasjon og behandlingsvarighet som er nødvendig for vellykket internalisering. Det anbefales også sterkt å bestemme den nøyaktige endelige plasseringen av SiNWs etter at internaliseringstrinnet er fullført. Dette kan gjøres ved kommersielt tilgjengelige fargestoffer som brukes til levende døde analyser (som Calcein-AM, brukt her) og konfokal mikroskopi (figur 1B). Dette trinnet er viktig når en annen linje med celler brukes for første gang, og celle-SiNW-samhandlingen er uklar. Ulike celler kan internalisere SiNW under forskjellige forhold, det vil si tid, konsentrasjon og størrelsesfordeling. Men etter at internaliseringsprosessen er preget for en gitt celle, kan denne verifiseringsprosedyren hoppes over mens du utfører mekanistiske bioelektriske studier.
Etter at cellene er hybridisert med SiNWs, kan de høstes av standard vevskulturteknikker og brukes til bioelektriske undersøkelser. I denne protokollen brukte vi MFs-SiNWs hybrider til å undersøke hvordan MFs elektrisk par til andre MFs, eller til CMs in vitro. Det er imidlertid viktig å merke seg at denne prosedyren kan brukes til å utføre in vivo-analyser også. For eksempel, i en tidligere studie fra laboratoriet vårt brukte vi denne metodikken til å studere hvordan MFs elektrisk par til CMs in vivo og sammenligne det med deres kobling in vitro14. Siden denne prosessen krever noen flere tekniske evner, er den ikke beskrevet i denne protokollen, men detaljene finner du i vår forrige studie. Her viser vi hvordan hybridcellene kan brukes til å lære hvordan kalsium forplanter seg intra- og intercellulært innenfor samkulturen (Figur 2A). For å begynne eksperimentet bestemmes plasseringen av en SiNW for punktstimulering. Selv om SiNWs knapt er synlige ved hjelp av fasekontrast, er det viktig å nevne at standard brightfield (uten fase eller darkfield kontrast) også vil tillate visualisering (Figur 2B), uten behov for fluorescerende merking eller spesialiserte mikroskopiteknikker. Etter å ha identifisert en SiNW av interesse, kan man bruke en optisk puls for å stimulere cellen elektrisk. Før stimulering påføres, viser baseline registrering av cellene spontan elektrisk aktivitet i fire forskjellige grupper av CMs, som synes å være usynkronisert i sin elektriske aktivitet (Tilleggsvideo 1 Og Tilleggsvideo 2). Videre kan 8 forskjellige MFs uten spontan elektrisk aktivitet ses. Representative kalsiumfargestoffer og dF/F-bilder viser forplantning av kalsium gjennom hele kulturen ved optisk stimulering (Figur 2COg Tilleggsvideo 1 Og Tilleggsvideo 2). Disse live videoer kan analyseres videre for å lære den elektriske koblingen av de forskjellige cellene i synsfeltet (Figur 3). Først optisk kartlegging av videoen (Figur 3A) viser sekvensen av celler som stimuleres av den optiske pulsen. Tidslinjene til høyre er i forhold til første ramme etter at den optiske stimuleringen ble påført. Siden CMs respons på stimuleringen er mye raskere enn for MFs, utførte vi den optiske kartleggingen to ganger, med forskjellige tidsrammer. Den første ble utført for å vise den raske CMs respons, slik at fargeområdet dekker 1,1 s etter stimuleringen. Dette viser rekkefølgen de forskjellige CMs og de første MFs er begeistret for stimulering. Siden det er MFs som er lenger nedstrøms forplantningsbanen, vises imidlertid ikke tidsberegningen i denne tilordningen. Dermed ble den samme analysen utført for en lengre varighet, noe som gir mindre detaljer om det første svaret, men viser tydelig forsinkelsestid og langsommere respons av MFs som er nedstrøms fra eksitasjonsstedet. Ved hjelp av vår spesialbygde algoritme kunne vi gi en reproduserbar kvantitativ analyse av maksimal kalsiumflukstiming, som vi brukte som referanse, sammen med cellens avstand fra stimuleringen, for å bestemme den intercellulære forplantningshastigheten til den cellen. Dette ble utført på både CMs og MFs, slik at den klare forskjellen mellom passiv (MF-MF) og forsterket (MF-CM) forplantning kan måles. Videre kan det tydelig vises at den elektriske aktiviteten til to CMs (røde stjerner i Figur 3B) påvirkes ikke av den optiske stimuleringen. Dette kan tilskrives det faktum at ikke alle celler er like skrevet til en annen i kulturen. Denne teknikken gjør det mulig for brukeren å identifisere hvilke celler i synsfeltet som faktisk er skrevet til den stimulerte cellen, og som ikke er det. I tillegg var vi i stand til å bestemme forplantningsretningen i hver celle og angi en parallell linje som ble brukt til å utlede en kymograf som beskriver forplantningen i cellen. Dette ble brukt til å bestemme intracellulær kalsiumflukshastighet, i henhold til skråningen av kymografen (Figur 3C). Når alle intra- og intercellulære hastigheter ble kompilert, var det klart at CMs respons var betydelig raskere enn for MFs respons på optisk stimulering. Samtidig ble MFs intracellulære hastigheter funnet å være litt raskere, men sammenlignbare med MF-MF intercellulære forplantningshastigheter. Denne observasjonen antyder at i motsetning til den forsterkede elektriske koblingen mellom MFs til CMs, er den intercellulære elektriske koblingen mellom MFs passiv, og basert på diffusjon av kalsium gjennom intracellulært volum, og deretter intercellulære gap-veikryss22,23 eller tunnelering nanorør24, fungerer som en flaskehals som bremser ned forplantningshastigheten. SiNWs evne til å transdusere den optiske stimuleringen til et bioelektrisk avhør kan tilskrives den fotoanodiske og fotokakriiske reaksjonen ved p-n-krysset av SiNWs, eller til den fototermiske reaksjonen på grunn av sinws lave varmekapasitet på grunn av sinws lave varmekapasitet13. Selv om andre nanoskalapartikler kan transdusere optisk stimulering25, innkapsled de vanligvis i en ensosomisk konvolutt26, begrense deres evne til å direkte grensesnitt med intracellulære organeller for lokale avhør. Det er viktig å innse at den høye optiske tettheten av stimuleringen kan føre til cellulær skade på grunn av den fototermiske effekten. Dermed er det viktig å optimalisere kraft- og pulslengden slik at en slik effekt vil bli unngått. Men for sensitive celler er det mulig å studere hvordan kalsiumet forplanter seg mellom de andre cellene i kulturen, selv om lokal termisk skade påføres den stimulerte cellen.
Et annet viktig aspekt ved denne analysemetodikken er at alle dataene som vises i figur 3D, ble samlet inn fra en enkelt video av ett enkelt synsfelt i den kulturen. Til tross for å bruke et enkelt synsfelt, var dataene som ble samlet inn, fortsatt sterke nok til å oppnå statistisk signifikans, noe som viser styrken og effektiviteten til denne metodikken. For å analysere og studere mer delikate og subtile effekter, kan et mye større datasett enkelt genereres ved å stimulere andre celler i samme kultur. For en glassbunnsfat med en effektiv diameter på 10 mm, kan man finne mer enn 2000 synsfelt å analysere. Som et enkelt punkt laserstimulering må settes, bør hvert stimuleringseksperiment ta mindre enn 1 min å utføre. Dette vil tillate mange mekanistiske studier som skal utføres på en måte som er utilgjengelig ved hjelp av tradisjonelle teknikker som patch-clamp, eller mikroelektrod array med forhåndsdefinerte elektrodeposisjoner. Videre gjør nanoskalastørrelsen på SiNWs som brukes her, stimulering med ekstremt høy romlig oppløsning. Når det gjelder den timelige oppløsningen, vil det bli bestemt av mikroskopet som brukes til bildebehandling / simulering. I denne sammenheng vil bruk av bildebehandling resultere i lav temporal oppløsning, dette kan forbedres ved hjelp av mer tidssensitive elektrofysiologiteknikker, for eksempel patch clamp eller mikroelektroder arrays. Selv om SiNWs anses å være bioabsorberbare på lang sikt, har vi aldri lagt merke til noen merkbar nedbrytning innen tidsrammen på opptil 7 dager, noe som vil tillate bruk for de fleste in vitro-studier.
Samlet brukte vi en enkel og rett frem teknikk for å utføre en in vitro bio-elektrisk undersøkelse av hjerteceller. Vi viser hvordan vi kan studere på forskjellige måter forskjellige celler er koplet til hverandre og beskrev en reproduserbar måte å kvantifisere kalsiumforplantning og hastighet. Teknikken er tilpasningsdyktig til andre celletyper, samt til in vivo og ex vivo innstillinger. Den er basert på standard fluorescensmikroskopi og en kombinert laser som er bredt tilgjengelig for standard biomedisinske laboratorier, og det er ikke behov for spesialisert utstyr. Teknikken kan enkelt mestres og kan tillate innsamling av store datasett i minimal tid, sammenlignet med tilgjengelige teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
