Summary
Målet med detta protokoll är att syntetisera fluorescerande märkta liposomer och använda flödescytometri för att identifiera in vivo-lokalisering av liposomer på cellulär nivå.
Abstract
Det finns ett växande intresse för att använda liposomer för att leverera föreningar in vivo, särskilt för riktade behandlingsmetoder. Beroende på liposomformuleringen kan liposomer företrädesvis tas upp av olika celltyper i kroppen. Detta kan påverka effekten av den terapeutiska partikeln eftersom progressionen av olika sjukdomar är vävnads- och celltypspecifik. I detta protokoll presenterar vi en metod för att syntetisera och fluorescerande märka liposomer med DSPC, kolesterol och PEG-2000 DSPE och lipidfärgämnet DiD som en fluorescerande etikett. Detta protokoll presenterar också ett tillvägagångssätt för att leverera liposomer in vivo och bedöma cellspecifikt upptag av liposomer med hjälp av flödescytometri. Detta tillvägagångssätt kan användas för att bestämma vilka typer av celler som tar upp liposomer och kvantifiera fördelningen och andelen liposomupptag över celltyper och vävnader. Även om de inte nämns i detta protokoll, kommer ytterligare analyser såsom immunofluorescens och encellsfluorescensavbildning på en cytometer att stärka eventuella fynd eller slutsatser som görs eftersom de möjliggör bedömning av intracellulär färgning. Protokoll kan också behöva anpassas beroende på vävnaden / vävnaderna av intresse.
Introduction
Eftersom intresset för att utveckla terapier som använder nanopartiklar läkemedelsleverans växer, måste metoderna för att förbereda och bedöma partikelfördelning och upptag fortsätta att utvecklas, expandera och vara tillgängliga för forskarsamhället 1,2. Detta protokoll utvecklades för att bedöma de exakta celltyperna som tog upp liposomer in vivo efter en behandling med DiD-märkta liposomer laddade med tesaglitazar, en peroxisomproliferatoraktiverad receptor (PPAR)-α/γ-agonist 3,4. I dessa studier kunde vi bedöma vilka celltyper som påverkades direkt av liposomal tesaglitazarbehandling, effekten av att rikta in sig på delar och generera hypoteser för att förklara de behandlingsresultat vi observerade. Vidare tyder etablerade biologiska funktioner i en mängd olika celltyper på att fagocytiska celler såsom makrofager, dendritiska celler och leverspecifika Kupffer-celler tar upp de flesta liposomerna 5,6,7. Med hjälp av detta protokoll har vi visat att icke-klassiska fagocyter också kan ta upp liposomer 3,4.
Detta protokoll presenterar en optimerad metod för att solubilisera tesaglitazar, förbereda liposomer genom omvänd fasindunstning och använda kalciumacetat som ett lockmedel för fjärrladdning av läkemedel. De metoder som presenteras är tillgängliga för många laboratorier och saknar svårinförskaffade material och steg som kräver höga temperaturer. Protokollet producerar liposomer av storlekar som är optimala för ökad cirkulation in vivo8. Dessutom, som sammanfattats av Su et al., har hittills metoder för att utvärdera liposomdistribution in vivo och vävnadsupptag studerats och testats på djupet9. Positronemissionstomografi (PET), magnetisk resonanstomografi (MRT) och fluorescensmolekylär tomografi (FMT) metoder används för att kvantifiera vävnadsspecifik biodistribution och upptag 9,10,11. Även om dessa metoder har optimerats för att maximera detektion in vivo, saknar de fortfarande förmågan att kvantifiera liposomupptag in vivo vid cellulär upplösning. Protokollet som presenteras här syftar till att uppnå detta behov genom användning av flödescytometri. Slutligen, för detta protokoll, minskades cellulärt upptag till några vävnader inklusive fettvävnad. Det finns en växande mängd litteratur som undersöker potentialen för användning av nanopartiklar för att leverera terapier i inställningen av fetma, dysmetabolism och inflammation 12,13,14,15,16,17. Som sådan kände vi att det var viktigt att dela ett protokoll med effektiva metoder för bearbetning och analys av fettvävnad - en av vävnaderna som spelar en viktig roll i dessa patologier.
Protocol
Alla steg i detta protokoll är godkända av och följer riktlinjerna från Animal Care and Use Committee vid University of Virginia.
OBS: Det finns några viktiga kontroller att tänka på för senare analyssteg, som sammanfattas i tabell 1 och bör beaktas före liposomadministrering.
1. Beredning av fluorescerande märkta liposomer, laddade med kalciumacetat och tesaglitazar
- Kombinera DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin), kolesterol, PEG-2000-DSPE och DiD. För detta, kombinera DSPC, kolesterol och PEG-2000 DSPE vid ett massförhållande på 2: 1: 1. Tillsätt DiD-lipidfärgämne i en koncentration av 1 mg DiD per 1 ml liposomer (molförhållande 46: 1 DSPC: DiD).
OBS: DiD är en accepterad förkortning för 1,1'-dioktadecyl-3,3,3',3'tetrametylindokarbocyaninfärgämne. Eftersom den har två oktadecyl "feta svansar" av samma längd som DSPC som används i denna formulering, bör den mestadels införlivas i lipidmembranet. Lipidfärgämnen som DiO, DiD och DiI används rutinmässigt för liposomforskning8 och de anses vara icke-utbytbara18. - Använd en 20 ml scintillationsflaska för den inverterade fasemulsionen och liposompreparatet. Blanda i denna injektionsflaska en 2:1 eterkloroformlösning av lipider med vattenhaltigt kalciumacetat (Ca-acetat, 1 M, pH 7,4). Förhållandet mellan organisk fas och vattenfas bör vara 4:1, t.ex. 4 ml organisk fas och 1 ml vattenfas.
- Emulgera eter-kloroform lösning av lipider genom ultraljudsbehandling för 30 s vid rumstemperatur. Använd sonicator på 20 KHz och 50% effekt och använd en 1/2 tum. sond.
OBS: Håll spetsen på sonden av sonicator sond närmare botten av injektionsflaskan för att undvika skumning. Rör inte glaset med sondspetsen under ultraljudsbehandling, det kan gå sönder. Dessutom måste kloroform tillsättas etern som ett lösningsmedel: i närvaro av kolesterol separeras en eteremulsion snabbt, vilket gör detta steg i proceduren omöjligt. - Placera omedelbart injektionsflaskan med homogeniserad vatten-i-olja-emulsion på en roterande indunstare med en speciell adapter, manometermätare och en tryckregulatorventil. Förångaren ska anslutas till en vakuumledning för att avlägsna de organiska lösningsmedlen. Ställ in rotationshastigheten på 100 rpm och vakuumet på 0,5 atm och släpp om emulsionsskummningen ser överdriven ut. När en gel bildas och försvinner, öka vakuumet till 0,9 atm.
Anmärkning: Vid avlägsnande av flyktig organisk fas bör vakuumnivån justeras gradvis för att undvika snabb skumbildning, eftersom det kan leda till innehållsförlust från injektionsflaskan till den roterande indunstarens kropp. Så småningom, när etern och kloroformen delvis avdunstar och volymförhållandet mellan vattenhaltig och organisk lösningsmedelsfas är nära 1: 1, kommer en gel att bildas. Avdunstningen bör fortsätta tills gelén försvinner och återstående vattenhaltiga medier är helt flytande igen. Ytterligare blandning kan bidra till att påskynda avlägsnandet av organiskt lösningsmedel. Detta kan uppnås genom att placera en omrörningsstång av polytetrafluoretylen i indunstningskolven för att förbättra konvektionen av den viskösa gelén under roterande avdunstning. - Filtrera de resulterande liposomerna med spåretsade polykarbonatmembran för att uppnå homogen storleksfördelning.
- Utför filtrering genom att föra liposomen vattenhaltig dispersion fram och tillbaka flera gånger genom ett 200 nm-porigt polykarbonatfilter i en liposomextruder utrustad med två gastäta sprutor.
Mindre sprutor föredras (t.ex. 0,5 ml) eftersom de säkerställer generering av tillräckligt tryck för filtrering. Med ett högt kolesterolinnehåll i liposommembranet är en hög temperatur inte nödvändig, och proceduren kan utföras vid rumstemperatur. Ett udda antal filtreringar (t.ex. 21) utförs, så att det resulterande materialet hamnar på motsatt sida av filtret från början och om det försteriliseras kan det sterila provet av filtrerade storleksjusterade liposomer samlas in. Storleken på de resulterande liposomerna ligger vanligtvis nära den valda filterporstorleken. Två filter kan staplas (istället för ett) för att utföra finjustering för att sänka partikelstorleken. - Verifiera storleksfördelningen med dynamisk laserljusspridning (DLS)3,4.
- Tillsätt 1 till 3 ml saltlösning till en 1 cm kyvett med fyra transparenta sidor. Tillsätt 10-l liposomer och blanda försiktigt. Placera provet i apparaten och välj följande parametrar för mätning: lösningsmedelsviskositet, brytningsindex, brytningsindex för lipider. Klicka på Start-knappen . Mätningarna kommer att pågå i flera minuter och bestå av 100 eller fler körningar.
- Utför filtrering genom att föra liposomen vattenhaltig dispersion fram och tillbaka flera gånger genom ett 200 nm-porigt polykarbonatfilter i en liposomextruder utrustad med två gastäta sprutor.
- Ta bort externt Ca-acetat med en avsaltande spin-kolonn. Tillsätt tesaglitazar i vatten till hälften av partiet i 10 mM HEPES-buffert (pH 7,4) och inkubera under blandning vid 37 °C i 1 timme. Använd den andra halvan av satsen som en drogfri kontrollliposomformulering.
OBS: Förbalansera 2 ml avsaltningsspinkolonnen med 10 mM HEPES-buffert, pH 7,4, före användning. För att göra detta, placera 1 ml HEPES-buffert i kolonnen och snurra i en centrifug vid 1000 x g i 2 minuter. Ta bort genomgångsbufferten och upprepa detta fyra gånger. - Ta bort ofångad tesaglitazar från liposomer med hjälp av en 2 ml spin-kolonn och bestäm koncentrationen av infångad läkemedelsspektrofotometrisk.
- Tillsätt högst 0,5 ml liposomprov till gelbädden i torrkolonnen och vänta tills hela provet kommer in i gelen. Centrifugera vid exakt samma betingelser som tidigare (1000 x g, 2 min) och samla liposomprovet i genomgången renad från föreningar med liten molekylmassa.
- Kvantifiera slutpartikelegenskaper: partikelstorlek och koncentration med hjälp av DLS och zetapotential med ett kombinerat DLS-elektroforektiskt ljusspridningssystem (ELS)3,4 i 10 mM HEPES-buffert pH 7,4 och vid 25 °C.
- I likhet med steg 1.5.2, späd liposomdispersionen i mätbufferten (t.ex. 10 μL liposomer per 1 ml buffertlösning) i en U-formad kyvett med hjälp av en engångsspruta för Luer eller en pipett med en skuren spets. Se till att det inte finns några bubblor i "U" så att det finns oavbruten lösning för elektriskt strömflöde.
- Placera kyvetten i enheten (var uppmärksam på kyvettens fram- och baksida så att elektroderna är ordentligt anslutna till enheten). Stäng instrumentluckan; Därefter sker mätningen (med flera upprepningar), under kontroll av vägledningsprogramvaran.
2. Förbered liposomer för in vivo-administrering
- I ett biosäkerhetsskåp späds liposomer i steril saltlösning till lämplig koncentration i en slutlig volym på 50 μl för in vivo-administrering.
OBS: I tidigare studier innehöll vårt liposompreparat 2 mg / ml tesaglitazar, vilket motsvarar cirka 4,89 μmol tesaglitazar / ml, och vi administrerade liposomer i en dos av 1 μmol läkemedel / kg. För en 40 g mus skulle vi ta 8,2 μL liposomer upp till en slutlig volym på 50 μL i saltlösning. Med DLS/ELS bör antalet liposomer per volymenhet också kvantifieras för preparat av läkemedels- och vehikelladdade liposomer för att säkerställa att lika många vehikelliposomer administreras per gram musvikt jämfört med de läkemedelsladdade liposomerna. - Fyll liposomlösningen i en 27 G nål i biosäkerhetsskåpet. Förvara detta i rumstemperatur för att undvika att kall lösning injiceras i musen.
3. Administrera liposomer via retroorbital intravenös injektion
OBS: Det är också lämpligt att genomföra intravenös injektion med andra metoder, såsom svansveninjektioner om det föredras. Även om de inte omfattas av detta protokoll finns publicerade protokoll som förklarar denna metod19 tillgängliga.
- Ställ in arbetsytan för att leverera liposomer.
- Rengör arbetsbänken med 70% etanol. Se till att välja ett utrymme som tillåter användning av ett isoflurananestesisystem.
- Slå på en värmedyna och placera en ren dyna eller handduk över den för att hålla musen på en ren yta. Låt tillräckligt med tid för dynan att värmas upp innan du börjar arbeta med möss.
- Ställ in anestesisystemet så att kammaren är i närheten och näskonen ligger på värmedynan.
- Se till att alla andra aspekter av systemet är redo (till exempel är isoflurannivån tillräckligt hög i förångaren, kolfiltret har vägts, slangen är korrekt ansluten).
- Samla in de andra material som behövs för detta avsnitt av protokollet: oftalmisk smörjgel, ett lokalbedövningsmedel för behandling efter administrering, sterila gasbindor.
- Lugna musen med isofluran i induktionskammaren. När den inte svarar på ett försiktigt fottryck överför du snabbt musen till arbetsytan samtidigt som sederingen bibehålls genom en näskon.
OBS: Djuret bör hållas på 1,5% till 2,5% isofluran och bedömas för ett lämpligt anestesidjup (via brist på respons på tånypning) innan proceduren fortsätter. - Flytta musen åt sidan för liposomadministrering. Eftersom musen inte blinkar medan den bedövas, applicera en liten mängd oftalmiskt smörjmedel på båda ögonen för att hålla dem återfuktade under resten av proceduren.
- Tryck försiktigt ner på huden ovanför och under det exponerade ögat. Ögat ska lyfta över ansiktsplanet.
- Sätt försiktigt in nålspetsen vid medialburken, se till att nålen är under ögat och inte vidröra den. När nålen sätts in under ögat, injicera långsamt liposomerna i retroorbitalutrymmet. När nålen dras ut kan det vara nödvändigt att stänga ögonlocken i några sekunder för att uppnå hemostas.
- Om nålen inte förs in tillräckligt långt in kan lösningen dyka upp runt ögat. Avbryt injektionen omedelbart om detta syns och placera nålen igen.
- Applicera lokalbedövning, såsom proparakain, på ögat för att förhindra smärta och obehag efter proceduren.
- Håll musen på en värmedyna och övervaka tills den vaknar för att säkerställa att den är bra och bibehåller rätt kroppstemperatur.
- Sätt tillbaka musen i buren och dess normala bostadsmiljö tills tidpunkten för intresse anländer.
OBS: Detta bör göras i enlighet med lokala IACUC-riktlinjer.
4. Förbered material för vävnadsskörd, vävnadsbearbetning och färgning av flödescytometri
- Förbered lösningar för skörd, bearbetning och färgning (avsnitt 5\u20127): fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-heparin, HEPES-buffert, 2 mg/ml kollagenas typ I, AKC-lysbuffert, FACS-buffert, PBS, fixeringsbuffert (tabell 2). Förvara alla lösningar utom fixeringsbufferten vid 4 °C eller på is under proceduren.
- Förbered rör med buffertar och andra material för skörd och bearbetning av vävnader.
- För blod från varje mus, tillsätt 10 μL 0,5 M EDTA till ett 1,5 eller 1,7 ml mikrocentrifugrör för uppsamling av blodet. EDTA förhindrar att blodet koagulerar. En 1 ml spruta med en 25 G nål och en 15 ml konisk slang behövs också.
- För mjälten, samla ett 1,5 eller 1,7 ml mikrocentrifugrör med 1 ml HEPES-buffert, en 1 ml spruta, två 50 ml koniska rör och två 70 μm filter per mjälte.
- För varje fettvävnadsdepå, samla en 20 ml injektionsflaska med polyeten med 1,5 ml HEPES-buffert för malning av vävnaden, ett 50 ml koniskt rör och ett 70 μm filter per fettvävnadstyp per mus.
- Förbered arbetsytan för skörden.
- Rengör bänkutrymmet med 70% etanol. Förbered en gummibricka för att fästa musen under skörden genom att rengöra den med 70% etanol och täcka den med en absorberande dyna eller pappershanddukar. Se till att minst 5 stift är tillgängliga att arbeta med.
- Fyll en 10 ml spruta med PBS-heparin och fäst på en 25 G nål för perfusion.
- Samla verktyg och material att använda under skörden. Tång (två par), sax, pappershanddukar, luddfria våtservetter, mikrocentrifugrör med EDTA, mikrocentrifugrör med HEPES-buffert och injektionsflaskor av polyeten med HEPES-buffert behövs.
5. Skörda vävnaderna
- Avliva musen genom CO 2-kvävning. Gör inte en cervikal dislokation eftersom detta kan förhindra effektiv blodinsamling och vävnadsperfusion vid senare steg.
- På ett rengjort bänkområde med tillräckligt med arbetsutrymme och belysning för att se musen väl, sätt upp en gummidissektionsbricka, en hink med is för förvaring av prover och en sprayflaska med 70% etanol. Spraya ner musen med 70% etanol för att minska föroreningar och kontrollera hårspridning. Placera musen på ryggen på gummibrickan och kläm fast tassarna utspridda från kroppen.
- För att förbereda dig för att samla blod, gör försiktigt ett snitt i huden vid kanten av den kaudala änden av musens bröstkorg. Skär en liten, rak linje upp mot musens huvud (ca 1 cm) tills bröstmusklerna är exponerade.
- Vid det första snittet gör du två små snitt vinkelrätt mot linjen mot huvudet. Skär sedan försiktigt bort bröstmuskeln på ena sidan av bröstkorgen i det utsatta området. Detta möjliggör bättre åtkomst och visualisering för var nålen ska sättas in.
- För att samla blod, sätt in nålen mellan den tredje och fjärde revbenen på den sida där muskeln avlägsnades. Eftersom musens hjärta finns i mitten av bröstkaviteten, håll nålen så nära ribbburets mittlinje som möjligt. När du har satt in, dra försiktigt upp sprutan för att börja samla blod.
- När det har samlats in, överför blodet till det beredda mikrocentrifugröret med EDTA och förvara på is.
OBS: Om cirka 100 μl volym dras upp och inget blod kommer in i sprutan, försök att rotera sprutan åt höger eller vänster om nålöppningen pressas upp mot hjärtväggen. Om detta inte hjälper, flytta långsamt nålen längre in i bröstkaviteten eller börja ta bort. Om blod börjar samlas i sprutan vid denna tidpunkt, fortsätt att dra tillbaka sprutan långsamt. Överväg att rotera sprutan och nålen för framgångsrik extraktion. Slutligen, om inget blod samlas in, ta bort nålen eftersom den kan ha missat hjärtat. Försök att sätta in nålen igen och upprepa ovannämnda process igen.
- Därefter, för att perfusera musen, öppna bröstkaviteten för att komma åt hjärtat.
- För att göra detta, skär huden längs änden av ribbburet ner till musens sida på varje sida. Använd sedan pincetten för att hålla upp bröstbenet bort från arbetsytan. Gör ett litet, grunt snitt strax under bröstbenets ände för att skära genom bukhålan. Skär längs bukhinnan längs änden av ribbburet på var och en av musens sidor. Detta bör exponera levern och gallblåsan. Var försiktig så att du inte skär i någon av dessa vävnader.
- Gör sedan ett litet, grunt snitt i membranet, kranialt till levern. Skär sedan membranet längs kanten av bröstkorgen för att öppna bröstkaviteten. Var noga med att undvika att skära något av organen i bröstkaviteten.
- Gör två snitt längs ribbburet mot huvudet ca 2-3 mm från musens mittlinje och ca 0,75 cm lång.
OBS: Om de skärs upp för högt kommer artärerna som bor på toppen av bröstkorgen att skäras. Detta kommer att störa effekten av perfusion. - Lyft tillbaka mittstycket i bröstkorgen för att exponera bröstkaviteten. Flytta bort fett eller vävnad för att komma åt hjärtat.
- Gör ett litet snitt i det högra atriumet i musens hjärta för att skapa en öppning genom vilken du kan trycka ut blodet.
- Använd en 10 ml spruta PBS-heparin, sätt in nålen i vänster kammare i musens hjärta.
- Börja försiktigt trycka PBS in i hjärtat så långsamt som möjligt.
OBS: Blod bör observeras som kommer från höger förmak och fyller bröstkaviteten. Var noga med att hålla hjärtat i sin fysiologiska plats för att undvika att hämma flödet av PBS-heparin från hjärtat genom aorta. - När alla 10 ml PBS-heparin har perfuserats genom musen, kassera sprutan och nålen och ta bort överflödigt blod och PBS-heparin från bröstkaviteten med pappershanddukar eller luddfria våtservetter.
- Därefter, för att börja extrahera vävnader, skära ner huden och peritonealmembranet mot musens svans för att öppna bukhålan.
- Extrahera först den inguinala fettvävnadsdynan från varje sida av musen.
OBS: Läs denna process noggrant: var noga med att extrahera inguinal lymfkörtel från varje depå för att undvika att snedvrida fettvävnadens cellulära smink i resultaten.- Använd en andra uppsättning pincett, håll peritonealmembranet med en uppsättning pincett och kanten av huden överlagrad ovanför membranet på den sidan med de andra pincetterna. Dra försiktigt bort huden från bukhinnan för att separera dessa lager från varandra. Leta efter inguinal fettvävnadsdepå längs huden. Fäst ner ytterkanten av huden för att bättre komma åt fettdepån.
- Före extraktion, lokalisera inguinal lymfkörtel i mitten av fettdepån och ta bort den med pincett och sax efter behov.
OBS: Om möjligt, lokalisera de tre större artärerna som löper från depåns ytterkanter mot mitten. Lymfkörteln ligger runt där dessa artärer möts. - När lymfkörteln har tagits bort, håll försiktigt änden av fettdepån närmast den fästa punkten med pincetten och börja göra små snitt vid bindväven mellan fettvävnaden och huden. Lyft bort fettvävnaden från huden medan du gör snitt för att bättre komma åt membranet och se till att hela depån extraheras.
- Placera fettdepån i en beredd polyetenflaska med HEPES-buffert på is för att hålla vävnaden livskraftig under resten av skörden.
- Upprepa denna process på andra sidan musen för att extrahera båda depåerna. Depåer kan antingen smältas och bearbetas tillsammans eller separat. Om varje depå ska bearbetas separat måste fler rör förberedas.
- Därefter extrahera de epididymala fettdepåerna från den kaudala änden av bukhålan. Dra försiktigt den första epididymala fettdepån från musens dorsala ände med hjälp av pincett och lokalisera bitestiklarna och sädesledarna som är fästa vid denna depå.
OBS: Det finns två epididymala fettdepåer: en fäst vid varje bitestiklar och sädesledare.- Skär försiktigt mellan fettdepån och bitestiklarna och sädesledarna för att separera fettet från dessa andra vävnader. Placera fettdepån i en injektionsflaska av polyeten med HEPES-buffert på is för att hålla vävnaden livskraftig under resten av skörden.
- Slutligen extrahera mjälten, som finns till vänster om magen nära membranet. Dra försiktigt magen mot mitten av bukhålan med pincett för att exponera mjälten.
- Håll försiktigt ena änden av mjälten och dra den något bort från magen. Skär membranet mellan mjälten och dess intilliggande vävnad tills organet lossnar. Placera mjälten i det förberedda mikrocentrifugröret med HEPES-buffert och förvara på is.
- Innan du bearbetar vävnader eller skördar vävnader från nästa mus, kassera slaktkroppen och eventuella smutsiga pappershanddukar eller dynor. Torka av verktyg också.
Om det finns flera möss upprepar du dessa skördesteg för varje mus innan du går vidare till nästa bearbetningssteg. Om en kontrollmus / möss ingår, överväg att skörda dessa före liposombehandlade möss för att undvika kontaminering.
6. Bearbeta vävnader
OBS: Eftersom fettvävnaden har en lång matsmältningsinkubation rekommenderas det att börja med den processen först och arbeta med att bearbeta blodet och mjälten under matsmältningsperioden.
- Först, haka och smälta fettvävnaderna. Använd en eller två saxar, hacka fettvävnaden i varje polyetenflaska tills vävnaden är i små bitar mindre än 0,5 mm i storlek. Detta möjliggör effektivare matsmältning.
- När vävnaderna i alla injektionsflaskor har hackats, tillsätt 1,5 ml 2 mg/ml kollagenasbuffert till varje injektionsflaska. Placera injektionsflaskorna i en skakande inkubator inställd på 37 °C och 150 rpm. Inkubera i 30 till 45 minuter.
OBS: Om fettvävnaderna är särskilt stora, överväg att lägga till ytterligare 0,5 ml till 1,5 ml HEPES-buffert och en lika stor volym kollagenasbuffert till injektionsflaskan (erna) för att säkerställa att vävnaderna är helt nedsänkta och tillräckligt med enzym är närvarande. Den slutliga koncentrationen av kollagenas typ I vid digestion bör vara 1 mg/ml oavsett den slutliga lösningsvolymen. Om det inte finns någon skakinkubator kan proverna dessutom placeras i ett vattenbad som värmts upp till 37 °C. Skaka försiktigt proverna var 5:e minut för att blanda och suspendera matsmältningen. - Kontrollera proverna vid 30 min. Använd en 1 ml pipett för att pipettera provet upp och ner. Om vävnadsbitarna fortfarande är för stora för enkel pipettering, lägg tillbaka proverna i inkubatorn i ytterligare 15 minuter.
- När proverna är fullständigt smälta, fortsätt att pipeta provet upp och ner ytterligare 10 gånger för att säkerställa att en encellssuspension har skapats.
OBS: (Valfritt) Kontrollera proverna vid 30 min. Använd en 1 ml pipett för att pipettera provet upp och ner. Om vävnadsbitarna fortfarande är för stora för enkel pipettering, lägg tillbaka proverna i inkubatorn i ytterligare 15 minuter. - Pipettera cellsuspensionen genom ett 70 μm filter till ett 50 ml koniskt rör. Tillsätt 5 ml FACS-buffert till den tomma injektionsflaskan med matsmältning för att tvätta injektionsflaskan. Överför denna tvättbuffert genom filtret för att lägga till cellsuspensionen.
- Förvara prover på is medan andra bearbetas. När alla prover har filtrerats, snurra ner dem vid 400 x g, 4 °C i 5 minuter.
- Ta bort adipocytsupernatanten genom aspiration och avlägsna sedan försiktigt infranatanten mellan adipocytsupernatanten och pelleten genom aspiration för att lämna stromal-vaskulär fraktion (SVF) pellet.
- Återsuspendera denna pellet i 1 ml FACS-buffert och överför till ett rent 1,5 eller 1,7 ml mikrocentrifugrör. Alikvotceller nu om så önskas eller behövs. Håll på is tills alla prover är klara för färgning av flödescytometri.
OBS: Om fettdepåerna som smälts var stora, överväg att endast använda 50% eller 25% av provet för flödescytometrisk färgning och analys. Dessutom, om någon fluorescens-minus-en (FMO) kontroller eller ytterligare kontroller för flödescytometrianalys (tabell 1) behövs, var noga med att alikvotera extra prov i ett separat rör för bearbetning. FMO används för att skilja mellan negativ och positiv signal för en enskild fluoroforkonjugerad antikropp inom den annars kompletta panelen som används i experimentet.
- När vävnaderna i alla injektionsflaskor har hackats, tillsätt 1,5 ml 2 mg/ml kollagenasbuffert till varje injektionsflaska. Placera injektionsflaskorna i en skakande inkubator inställd på 37 °C och 150 rpm. Inkubera i 30 till 45 minuter.
- För det andra, bearbeta blodet.
- Överför 50 μL blod till ett 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt 1 ml AKC-lysbuffert till varje rör och pipettera upp och ner för att nå en encellssuspension. Tillsätt ytterligare 4 ml AKC-lysbuffert till varje rör och inkubera i 5\u201210 min. Om en shaker eller rotator finns tillgänglig, täta rörlocken ordentligt och placera rören på en av dessa för att förbättra blandningen.
- Tillsätt 5 ml FACS-buffert för att släcka lysprocessen och snurra proverna vid 400 x g, 4 °C i 5 minuter. Ta bort supernatanten och kontrollera pelleten. Om det fortfarande är ganska rött, upprepa lysprocessen. Annars suspenderar du pelletsen igen i 1 ml FACS-buffert och överför till ett rent 1,5 eller 1,7 ml mikrocentrifugrör. Håll på is tills alla prover är klara för färgning av flödescytometri.
- Slutligen bearbeta mjälten. Överför mjälten till ett 70 μm filter över ett 50 ml koniskt rör. Tvätta vävnaden med 1 ml FACS-buffert och mosa sedan mjälten genom filtret med kolvänden på en 1 ml spruta. Under hela mäskningsprocessen, tvätta cellerna i det 50 ml koniska röret med mer FACS-buffert. Den slutliga volymen i det koniska röret bör vara 10 ml.
- Snurra cellerna vid 300 x g vid 4 °C i 5 minuter. Ta bort supernatanten och suspendera igen i 1 ml AKC-lysbuffert. Tillsätt ytterligare 4 ml AKC-lysbuffert och inkubera i 5 minuter. Tillsätt 5 ml FACS-buffert för att släcka lysprocessen och snurra proverna vid 300 x g vid 4 °C i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och suspendera pelleten igen i 1 ml FACS-buffert. Överför suspensionen genom ett andra, rent 70 μm-filter till ett 50 ml koniskt rör. Tillsätt 4 ml FACS-buffert för att tvätta ut originalröret och överför bufferten genom filtret för en slutlig volym på 5 ml.
- Överför 50 μL av cellsuspensionen till ett rent 1,5 eller 1,7 ml mikrocentrifugrör och håll isen tills alla prover är klara för flödescytometrifärgning. Ytterligare alikvoter kan överföras till rör om fler önskas eller krävs.
OBS: Splenocyter är utmärkta celler att använda för en levande / död enda fläck. Överväg att överföra ytterligare en alikvot för den här kontrollen.
7. Fläckceller från vävnader för flödescytometri
- Snurra ner alikvoterade prover vid 400 x g, 4 °C i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och suspendera proverna på nytt i 50 μl Fc-block (utspätt) (tabell 2). Inkubera på is i 5 min.
- Tillsätt 50 μl 2x antikroppsblandning (tabell 3) till varje prov. Inkubera på is i mörkret i 20 min.
OBS: Eventuella enskilda fläckar ska INTE färgas med denna antikroppsblandning. Om FMO ska användas måste FMO-antikroppsblandningar dessutom framställas separat. - Tvätta proverna med 1 ml PBS och snurra vid 400 x g, 4 °C i 5 minuter. Ta bort supernatanten och suspendera proverna på nytt i en viabilitetsfläck på 200 μl (tabell 3). Inkubera på is i mörkret i 20 min.
OBS: Glöm inte att färga celler som avsatts för en levande / död enstaka fläck under detta steg. - Tvätta proverna med 1 ml FACS-buffert och snurra vid 400 x g, 4 °C i 5 minuter. Ta bort supernatanten och suspendera proverna (utom en enkelfläck av levande / död) i 50 μl fixeringsmedium (reagens A) för att fixera proverna. Inkubera vid rumstemperatur i mörker i 15 minuter.
- Resuspendera den levande/döda enkelfläcken i 100 μl 2 % PFA. Inkubera vid rumstemperatur i mörker i 5 minuter.
- Tvätta provet med 1 ml FACS-buffert och snurra vid 800 x g, 4 °C i 5 minuter. Avlägsna supernatanten och suspendera proverna på nytt i 250–500 μl FACS-buffert. Förvaras vid 4 °C tills prover kan tas på flödescytometern.
- Tvätta proverna med 1 ml FACS-buffert och snurra vid 800 x g, 4 °C i 5 minuter. Avlägsna supernatanten och suspendera proverna på nytt i 50 μl permeabiliseringsmedium (reagens B) plus antikroppar mot intracellulära proteiner. Inkubera vid rumstemperatur i mörker i 20 minuter.
- Tvätta proverna med 1 ml FACS-buffert och snurra vid 800 x g vid 4 °C i 5 minuter. Ta bort supernatanten och suspendera proverna igen i 100 μl 2 % paraformaldehyd (PFA). Inkubera vid rumstemperatur i mörker i 5 minuter.
- Tvätta proverna med 1 ml FACS-buffert och snurra vid 800 x g, 4 °C i 5 minuter. Ta bort supernatanten och suspendera proverna på nytt i 250–500 μl FACS-buffert. Förvaras vid 4 °C tills prover kan tas på flödescytometern.
Representative Results
Liposomproduktion
Resultaten som publiceras här liknar dem i vårt tidigare publicerade arbete 3,4,20. Med hjälp av protokollet som presenteras här förväntar vi oss att producera liposomer med en storlek på cirka 150–160 nm. DLS avslöjar en genomsnittlig liposomdiameter på 163,2 nm och en zetapotential på -19,2 mV (figur 1A). Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) avbildning avslöjar cirkulära liposomer (figur 1B) och DLS-diagrammet avslöjar en relativt liten standardavvikelse från medeldiametern (figur 1C).
Positiv liposombindning kräver en PBS-behandlad kontroll
Tidigare studier från vår grupp som använde detta protokoll undersökte vilka cellundergrupper i fett-SVF, mjälte och blod bundet till liposomer efter en veckas in vivo-administrering 3,4. Med hjälp av en PBS-behandlad mus färgades bukhålan och mjältceller med samma antikroppspanel som används på prover från liposombehandlade möss. Vävnaderna skördades efter en veckas behandlingar (figur 2A). Proverna från den PBS-behandlade musen fungerade som en DiD FMO för att skapa positiva DiD-grindar (figur 2B, C). En positiv grind kan skapas med hjälp av DiD-positiv signal, men prover som saknar DiD-signal måste också användas för att verifiera att den positiva grinden inte innehåller några DiD-negativa prover.
Titrering behövs för att optimera fluorescenssignaler
Innan ett fullständigt experiment utförs måste olika förhållanden, inklusive koncentrationen av fluorescerande konjugerade antikroppar som används under cellfärgning och lipidfärg som används under liposomberedning optimeras. Flödescytometrar har en övre detektionsgräns för fluorescensintensitet, så för mycket färgämne som ingår i liposomerna kommer att leda till okvantifierbara nivåer av DiD-signal i prover som går genom cytometern. Dessutom kan för mycket DiD i liposomerna leda till höga nivåer av icke-specifik färgöverföring, vilket kan skeva cellulära upptagsresultat. Figur 3 rapporterar resultat från ett experiment där koncentrationer av lipidfärgämne titrerades för att identifiera koncentrationen som skulle ge en optimal signal inom detektionsområdet för flödescytometern som användes. Detta utfördes på vävnaderna av intresse för det slutliga experimentet: Blod (Figur 3A), inguinal fett SVF (Figur 3B) och epididymal fett SVF (Figur 3C). De koncentrationer som valdes för testning var 10 mg DiD (hög, röd), 1 mg DiD (mitten, blå) eller 0,1 mg DiD (låg, grå) per 1 ml liposomer. Den högsta koncentrationen som användes i liposomerna var för hög och överträffade cytometerns kvantifierbara intervall i alla tre vävnaderna (figur 3A\u2012C, röd). Den lägsta koncentrationen av DiD visade någon signal (Figur 3 A\u2012C, grå), men en tydlig population bortom de PBS-behandlade cellerna (Figur 3A\u2012C, svart) observerades inte. Vid kvantifiering visade det aritmetiska medelvärdet av DiD MFI för varje vävnad och koncentration en tydlig skillnad mellan PBS-kontroller och den mellersta koncentrationen av DiD (figur 3D). Således, som anges i protokollet, valde vi den mellersta koncentrationen (figur 3, blå) som skulle användas i vår liposomberedning.
Användningen av multi-antikroppspanel möjliggör identifiering av liposomupptag av olika cellundergrupper
Med hjälp av panelen som beskrivs i tabell 3 färgades celler med antikroppar mot markörer för makrofager, B-celler, T-celler, dendritiska celler, monocyter och endotelceller (figur 4). Något olika grindstrategier krävs för varje vävnadstyp, men de flesta av samma celltyper kan identifieras i varje. Några undantag inkluderar endotelceller, som normalt inte finns i blodet, och monocyter, som vanligtvis har högre frekvens i blodet än andra vävnader. När populationer har identifierats kan den totala storleken på varje cellpopulation och frekvensen vid vilken de är DiD + kvantifieras. Ytterligare beräkningar kan utföras för att karakterisera DiD + -populationen: vilken procent av DiD + -celler är makrofager, endotelceller etc. Observera att detta är exempel på grindstrategier, men inte det enda sättet att analysera proverna. Analysen kommer att dikteras av den valda panelen och flödescytometer (er) tillgängliga.
Figur 1: Exempel på egenskaper hos beredda liposomer.
(A) Storlek och zetapotential mättes enligt beskrivningen ovan och har rapporterats i tabellform. Varje parameter presenteras som medelvärdet ± standardavvikelsen. (B) Cryo-EM användes för att avbilda de beredda liposomerna. Den vita skalstången är 50 nm lång. (C) DLS användes för att generera ett histogram över liposomernas diameter i denna prep. Denna siffra är anpassad från Osinski et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ DiD-färgning från PBS- eller liposombehandlade möss.
(A) Experimentell schematisk för PBS- och liposombehandlingar. PBS eller liposomer injicerades tre gånger under loppet av en vecka. Vävnader skördades på dag 8 av behandlingen. (B, C) Representativa flödesdiagram visar positiv DiD-färgning hos liposombehandlade (C), men inte PBS-behandlade (B) möss. FSC, framåtriktad spridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Titrering av DiD i liposomer.
Liposomer framställdes med tre olika koncentrationer av DiD och injicerades i möss. Grått indikerar den låga koncentrationen vid 0,1 mg DiD per 1 ml liposomer, blått indikerar den mellersta koncentrationen vid 1 mg DiD / ml liposomer och rött indikerar den höga koncentrationen vid 10 mg DiD / ml liposomer. En PBS-behandlad mus användes som en negativ kontroll (svart). Blod (A, cirkel), inguinalfett (B, triange) och bitestikelfett (C, kvadrat) skördades 24 timmar efter injektion och bearbetades för att isolera en encellssuspension. Dessa prover kördes på en flödescytometer till nivån av detekterbar DiD. Vävnadsspecifika histogram med överlagringar av varje behandlingsgrupp presenteras för att visa fluorescensintensitet per koncentration (A\u2012C). Det aritmetiska medelvärdet av DiD kvantifierades också för varje vävnad och koncentration och plottades (D). SSC = sidospridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativ flödescytometrianalys av cellundergrupper i fett-SVF, blod och mjälte.
(A\u2012C) Schematisk representant för grindstrategi för att identifiera cellundergrupper och DiD + -celler i fett SVF (A), mjälte (B) och blod (C). Förkortningar: FSC = forward scatter; LD = levande/döda; L-DCs = lymfoida dendritiska celler; M-DCs = myeloida dendritiska celler; SSC = sidospridning. Denna siffra är anpassad från Osinski et al.3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Kontroll | Avsikt |
| Mus behandlad med PBS eller saltlösning | Använd cellerna från den här musen för följande flödescytometrikontroller: |
| 1. Ofärgade celler | |
| 2. Levande / död enstaka fläck | |
| 3. Celler färgade med hela panelen, men saknar liposomfluorescensen för att bestämma positiv liposomsignal under analys | |
| Denna / dessa mus / möss kommer också att användas för att avgöra om liposomer har några effekter in vivo eftersom du kommer att ha en icke-liposomkontroll i ditt experiment. | |
| Lossade liposomer | Om du laddar en förening i dina liposomer, bör en del av din liposomsats syntetiseras utan föreningen. Detta står för eventuella in vivo-effekter av liposomerna ensamma. |
| DiD ensam | Eftersom DiD också kan tas upp av cellmembran, kommer tilldelning av vissa möss för att få fritt färgämne i en mängd som är lika med den som finns i liposomerna att hjälpa till att redogöra för eventuell bakgrundsmembranfärgning. |
| FMO-kontroller (fluorescens-minus-ett) | Dessa är celler färgade med alla utom en av antikropparna i din panel. Liksom # 3 i rutan ovan hjälper detta till att bestämma sann positiv signal för den antikroppen under analysen |
Tabell 1: Kontroller som ska användas i detta protokoll.
| Lösning | Komponenter | Ungefärlig volym som behövs per batch/mus |
| Liposomberedning | ||
| Kalciumacetat | 1 M kalciumacetat iH2O | 50 ml |
| HEPES buffert | 10 mM HEPES iH2O, pH 7,4 | 50 ml |
| Tesaglitazar i HEPES | i 10 mM HEPES | 10 ml |
| Vävnadsskörd, bearbetning och färgning | ||
| Fosfatbuffrad lösning (PBS) | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mMNa2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 i destilleradH2O | 2 ml |
| PBS-heparin | 0,1 mM heparin i PBS | 10 ml |
| HEPES buffert | 20 mM HEPES i PBS | 5 ml |
| Digestion buffert | 2 mg/ml kollagenas typ I i HEPES-buffert | 5 ml |
| AKC-lysbuffert | 0,158 M NH 3 Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA i ddH 2 O, pH7,2 | 15 ml |
| FACS-buffert | 1% BSA, 0,05% NaN3 i PBS | 15 ml |
| Fc-block (utspätt) | 1:50 Fc-block i FACS-buffert | 250 μL |
| Fixeringsbuffert | 2% paraformaldehyd i PBS | 200 μL |
Tabell 2: Lösningar att förbereda.
| A | B | C | D |
| Extracellulär färgning (2x antikroppsblandning) | |||
| Antigen | Fluorofor | Ab-volym per 100 μL-test | Total volym som behövs: |
| CD45 | PerCP | 0,5 μL | Kolumn C x 1,2 x Totalt # prover |
| CD11b | PerCP Cy5.5 | 0,25 μL | (0,5 μl/test) x (1,2) x (# prover) |
| F4/80 | PE Cy7 | 0,25 μL | (0,25 μl/test) x (1,2) x (# prover) |
| CD19 | PE-CF594 | 1 μL | (0,25 μl/test) x (1,2) x (# prover) |
| CD3 | FITC | 1 μL | (1,0 μl/test) x (1,2) x (# prover) |
| CD31 | BV605 | 0,25 μL | etc... |
| CD11c | APC ef780 | 1 μL | |
| CD115 | PE | 1,5 μL | |
| För att skapa din antikroppsblandning, kombinera antikropparna beräknade i kolumn D med FACS-buffert eller Brilliant Violet Staining Buffer* till en slutlig volym på (50 μL x 1,2 x Totalt # prover) | |||
| Levande / död färgning (1x) | |||
| Levande/död | Fluorofor | L/D-volym per 200 uL test | Total volym som behövs: |
| Levande/död | Aqua | 0,67 μL | Kolumn C x 1,2 x Totalt # prover |
| Intracellulär färgning (1x) | |||
| Antigen | Fluorofor | Ab-volym per 50 μl-test | Total volym som behövs: |
| αSMA | FITC | 0.125 | Kolumn C x 1,2 x Totalt # prover |
| *Brilliant Violet Staining Buffer ska användas om mer än en antikropp konjugerad till en Brilliant Violet-fluorofor används i din panel. | |||
Tabell 3: Exempel på antikroppspanel och beräkningar av färgningsblandningar som ska användas för flödesfärgning.
Discussion
Här beskriver vi ett tredelat protokoll för att (i) förbereda liposomer som är märkta med ett fluorescerande lipidfärgämne och laddade med en antidiabetisk förening, tesaglitazar, (ii) administrera liposomer till en mus via retroorbital injektion, och (iii) skörda, bearbeta och fläcka vävnader för att detektera liposomupptag på cellulär nivå genom flödescytometri. Detta protokoll granskar beredning av cirka 150 μm liposomer och bedömning av upptag i fett, blod och mjälte. Liposompreparatet är skalbart, utförs mestadels vid rumstemperatur och använder omvänd fasavdunstning för att maximera läkemedelsbelastning och avlägsnande av organiska lösningsmedel. Med hjälp av detta protokoll kan upp till 2 mg / ml tesaglitazarkoncentration uppnås i det renade liposomprovet. De beredda liposomerna kan förvaras i HEPES-buffert vid 4 °C i över ett år. Enligt vår erfarenhet visade de minimal variation av genomsnittlig partikelstorlek. Under 10% av läkemedelsinnehållsförlusten visades spektrofotometriskt, efter ultrafiltreringsseparation av liposomer från externt läkemedel med ett 10 kDa centrifugalfilter.
Under liposomberedning finns det några kritiska steg och faktorer att tänka på. För det första är ordningen på protokollstegen viktig och måste följas. För det andra måste pH-värdet i den lösning som används vid påfyllning av tesaglitazar hållas vid 7,4 för att maximera lösligheten och effektiv belastning. För det tredje säkerställer korrekt montering av utrustning och filter att utgången från varje steg är av rätt storlek och renhet. Till exempel, om 100- och 200-nm-filter inte monteras ordentligt, kan en mer heterogen och felaktigt dimensionerad sats liposomer resultera. För det fjärde behövs fullständigt avlägsnande av Ca-acetat före läkemedelsladdning för att maximera överföringen av tesaglitazar till liposomerna. För att testa för fullständigt avlägsnande av Ca-acetat, använd höghastighetssedimentering för att avlägsna liposomerna och sedan mäta Ca-acetatnivåerna i den icke-liposomala lösningen. För det femte är det viktigt att väga och registrera massan av alla material som läggs till liposompreparatet vid varje steg. Detta säkerställer att lämpliga koncentrationer kan beräknas och nödvändiga materialförhållanden bibehålls. Slutligen, om tekniken inte utförs korrekt, kan det finnas en oönskad nivå av heterogenitet. Det är viktigt att noggrant kontrollera denna parameter med DLS och andra metoder som elektronmikroskopi. Om du vill förbättra homogeniteten bör du överväga att justera den valda filterstorleken eller stapla två filter.
Dessutom är det viktigt att kontroller och en antikroppspanel för flödescytometri planeras och optimeras innan detta protokoll genomförs i sin helhet (tabell 1, tabell 3). Antikroppar bör testas för att säkerställa att lämpliga koncentrationer används för färgning och att överlappningen mellan fluoroforer är minimal. Excitationen och utsläppet av färgämnet som används under liposomberedning måste också beaktas i panelplaneringen. I våra resultat använde vi DiD, som har en liknande excitation och emission som fluoroforer som Allophycocyanin (APC) och AlexaFluor 647. Således valde vi inte antikroppar konjugerade till dessa fluoroforer i vår antikroppspanel. Dessutom ingår inte isotypkontroller i detta protokoll. Detta beror på att antikropparna som valts för detta protokoll är välvaliderade, kommersiellt tillgängliga antikroppar. Men om du är intresserad av att använda en antikropp som inte har optimerats tidigare, överväg att testa antikroppen mot en isotypkontroll på vävnaderna av intresse innan du utför hela experimentet.
Medan detta protokoll visar hur man extraherar och bearbetar blod, mjälte, inguinal fett och bitestikelfettvävnad från musen efter behandling, kan detta allmänna tillvägagångssätt tillämpas på andra vävnader. Beroende på vävnaden av intresse kan bearbetnings- och matsmältningsprotokoll behöva ändras som publiceras för följande vävnader: lunga21, lever22, bukhålan 3, benmärg3,23, hjärna 24.
En viktig begränsning med denna metod att beakta är att upptaget endast kan bedömas vid en tidpunkt per djur. Det kan därför vara fördelaktigt att koppla detta protokoll till andra icke-invasiva avbildningstekniker eller planera därefter för att säkerställa tillräckliga resurser för att genomföra bedömningen. Tidpunkten för cellulärt upptag och cellulär omsättning är viktiga faktorer att tänka på: liposomer kommer att cirkulera i hela kroppen under de första 24 timmarna och beroende på livslängden hos cellerna som tar upp liposomer eller hur de svarar på upptag kan celldöd eller ytterligare fagocytos uppstå. Vår tidigare studie visade förändringar i populationskarakteristika för DiD + -populationer vid olika tidpunkter3. Av den anledningen är det viktigt att utvärdera upptaget vid tidigare tidpunkter eller tidpunkter som är mest relevanta för biologin av mekanismen av intresse. Dessutom, medan kvantifiering av cellupptag i hela vävnaden kan utföras med detta protokoll, kan flödescytometri inte avslöja vävnadslokalisering. Att koppla detta tillvägagångssätt med histologiska metoder kan hjälpa till att hantera denna begränsning.
I allmänhet kompletterar detta protokoll befintlig metodik såsom histologi och helkroppsfluorescensavbildning. Med de fortsatta framstegen inom flödescytometriverktyg och metoder kommer utvecklingen av större paneler till mer och mer specifika cellpopulationer att bli möjlig. Vi föreslår att detta protokoll används utöver de ovan nämnda metoderna eftersom detta kommer att förbättra utvärderingen av cellulärt upptag och också ge möjlighet att validera de resultat som observerats med flödescytometri. Till exempel bör det konstateras att en majoritet av partiklarna i fettvävnad togs upp av makrofager genom flödescytometri. Immunofluorescens av ytterligare en alikvot av samma fettvävnad kan sparas, fixeras, snittas och färgas för makrofagmarkörer för att verifiera att celltypen verkligen tar upp liposomer. Detta tillvägagångssätt bör lägga till noggrannhet i nanopartikelbiodistributionsanalyser som utförs: validera cellspecifik inriktning, kvantifiera cellulärt upptag, identifiera off-target upptag och förhoppningsvis tillhandahålla information för att generera mekanistiska hypoteser för observerade terapeutiska resultat. Detta protokoll kan också anpassas för framtida studier med olika liposomer, undersöka upptag i andra vävnader och testa nya föreningar vid fetma och dysmetabolism eller någon annan sjukdom där nanopartikelleverans är ett genomförbart terapeutiskt alternativ.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Michael Solga och resten av Flow Cytometry Core-personalen för att ha tillhandahållit flödescytometriutbildning och tjänster. Författarna vill också erkänna Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye och Prasad Srikakulapu för deras hjälp med liposomberedning (SSKD, DKB), vävnadsskördar (MAM, JCG) och flödescytometrifärgning och provförvärv (AU, PS, CM). Detta arbete stöddes av bidrag från AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 och R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 och T32 HL007284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL syringe | BD | 309659 | |
| 10-mL syringe | BD | 302995 | |
| 25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
| 27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
| Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
| Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
| Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
| Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
| Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
| Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
| Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
| Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
| Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
| Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
| FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
| Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
| Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
| Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
| Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
| Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
| Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
| Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
| Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
| Sonicator | Misonix | XL2020 | |
| T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
| Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
| Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
| ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |
References
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 286 (2015).
- Osinski, V., et al. In vivo liposomal delivery of PPARα/γ dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects. Theranostics. 10 (2), (2020).
- Bauknight, D. K., et al. Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects. PLoS ONE. 14 (11), (2019).
- Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity. BioMed Research International. , (2017).
- He, H., Ghosh, S., Yang, H. Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases. Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).
- Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases. Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).
- Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes. BBA - Biomembranes. , (1994).
- Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).
- Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging. PLoS One. 6 (6), 20594 (2011).
- Larmann, J., et al. In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation. Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).
- Feng, B., et al. Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice. PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).
- Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance. The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).
- Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice. Biomaterials. 110, 81-88 (2016).
- Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues. Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).
- Nakhlband, A., et al. Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective. BioImpacts. , (2018).
- Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment. International Journal of Nanomedicine. , (2018).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. Journal of Cell Biology. , (1986).
- Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2019).
- Dasa, S. S. K., et al. Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer. Theranostics. , (2018).
- Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis. Journal of Clinical Investigation. , (2003).
- Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jirón Tamburini, B. A. Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e58621 (2019).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation research. , (2019).
- O'Brien, C. A., Harris, T. H. ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain. PLoS ONE. , (2020).
