Summary
Målet med denne protokol er at syntetisere fluorescerende mærkede liposomer og bruge flowcytometri til at identificere in vivo-lokalisering af liposomer på celleniveau.
Abstract
Der er en stigende interesse for at bruge liposomer til at levere forbindelser in vivo, især til målrettede behandlingsmetoder. Afhængigt af liposomformuleringen kan liposomer fortrinsvis optages af forskellige celletyper i kroppen. Dette kan påvirke effekten af den terapeutiske partikel, da progression af forskellige sygdomme er vævs- og celletypespecifik. I denne protokol præsenterer vi en metode til syntetisering og fluorescerende mærkning af liposomer ved hjælp af DSPC, kolesterol og PEG-2000 DSPE og lipidfarvestoffet DiD som en fluorescerende etiket. Denne protokol præsenterer også en tilgang til levering af liposomer in vivo og vurdering af cellespecifik optagelse af liposomer ved hjælp af flowcytometri. Denne tilgang kan bruges til at bestemme de typer celler, der optager liposomer og kvantificere fordelingen og andelen af liposomoptagelse på tværs af celletyper og væv. Selvom det ikke er nævnt i denne protokol, vil yderligere assays såsom immunofluorescens og enkeltcellefluorescensbilleddannelse på et cytometer styrke eventuelle fund eller konklusioner, da de tillader vurdering af intracellulær farvning. Det kan også være nødvendigt at tilpasse protokollerne afhængigt af det eller de pågældende væv.
Introduction
Efterhånden som interessen for at udvikle terapier, der anvender nanopartikler drug delivery, vokser, skal metoderne til forberedelse og vurdering af partikelfordeling og optagelse fortsætte med at fremme, udvide og være tilgængelige for forskningssamfundet 1,2. Denne protokol blev udviklet til at vurdere de nøjagtige celletyper, der optog liposomer in vivo efter en behandling med DiD-mærkede liposomer fyldt med tesaglitazar, en peroxisomproliferatoraktiveret receptor (PPAR)-α/γ agonist 3,4. I disse undersøgelser var vi i stand til at vurdere, hvilke celletyper der blev direkte påvirket af liposomal tesaglitazarbehandling, effektiviteten af målretning af dele og generere hypoteser for at forklare de behandlingsresultater, vi observerede. Desuden tyder etablerede biologiske funktioner i en række celletyper på, at fagocytiske celler såsom makrofager, dendritiske celler og leverspecifikke Kupffer-celler optager de fleste liposomer 5,6,7. Ved hjælp af denne protokol har vi demonstreret, at ikke-klassiske fagocytter også kunne optage liposomer 3,4.
Denne protokol præsenterer en optimeret metode til opløselighed af tesaglitazar, fremstilling af liposomer ved omvendt fasefordampning og anvendelse af calciumacetat som tiltrækningsmiddel til fjernindlæsning af lægemidler. De præsenterede metoder er tilgængelige for mange laboratorier og mangler svært at erhverve materialer og trin, der kræver høje temperaturer. Protokollen producerer liposomer af størrelser, som er optimale til øget cirkulation in vivo8. Som opsummeret af Su et al. er metoder til evaluering af in vivo liposomfordeling og vævsoptagelse hidtil blevet undersøgt og testet i dybden9. Positronemissionstomografi (PET), magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) og fluorescensmolekylærtomografi (FMT) metoder anvendes til at kvantificere vævsspecifik biodistribution og optagelse 9,10,11. Mens disse metoder er optimeret til at maksimere detektion in vivo, mangler de stadig evnen til at kvantificere liposomoptagelse in vivo ved cellulær opløsning. Protokollen, der præsenteres her, sigter mod at opnå dette behov ved brug af flowcytometri. Endelig blev cellulær optagelse for denne protokol indsnævret til nogle få væv, herunder fedtvæv. Der er en voksende mængde litteratur, der undersøger potentialet for brug af nanopartikler til at levere terapier i forbindelse med fedme, dysmetabolisme og betændelse 12,13,14,15,16,17. Som sådan følte vi det vigtigt at dele en protokol med effektive metoder til behandling og analyse af fedtvæv - et af de væv, der spiller en vigtig rolle i disse patologier.
Protocol
Alle trin i denne protokol er godkendt af og følger retningslinjerne fra Animal Care and Use Committee ved University of Virginia.
BEMÆRK: Der er nogle vigtige kontroller, der skal overvejes til senere analysetrin, som er opsummeret i tabel 1 og bør overvejes før liposomadministration.
1. Fremstilling af fluorescerende mærkede liposomer, fyldt med calciumacetat og tesaglitazar
- Kombiner DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin), kolesterol, PEG-2000-DSPE og DiD. Til dette kombineres DSPC, kolesterol og PEG-2000 DSPE i et masseforhold på 2: 1: 1. Tilsæt DiD-lipidfarvestof i en koncentration på 1 mg DiD pr. 1 ml liposomer (molært forhold på 46: 1 DSPC: DiD).
BEMÆRK: DiD er en accepteret forkortelse for 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'tetramethylindocarbocyaninfarvestof. Da den har to octadecyl "fede haler" af samme længde som DSPC, der anvendes i denne formulering, bør den for det meste inkorporeres i lipidmembranen. Lipidfarvestoffer som DiO, DiD og DiI bruges rutinemæssigt til liposomforskning8 , og de betragtes som ikke-udskiftelige18. - Brug et 20 ml scintillationshætteglas til inverteret faseemulsion og liposompræparat. I dette hætteglas blandes en 2:1 ether-chloroform opløsning af lipider med vandig calciumacetat (Ca-acetat, 1 M, pH 7,4). Forholdet mellem organisk og vandig fase skal være 4:1, f.eks. 4 ml organisk fase og 1 ml vandig fase.
- Emulgerer ether-chloroformopløsningen af lipider ved sonikering i 30 s ved stuetemperatur. Betjen sonikatoren ved 20 KHz og 50% effekt og brug en 1/2 in. sonde.
BEMÆRK: Hold spidsen af sonikatorsonden tættere på bunden af hætteglasset for at undgå skumdannelse. Rør ikke glasset med sondespidsen under sonikering, det kan gå i stykker. Derudover skal chloroform tilsættes til etheren som et co-opløsningsmiddel: i nærvær af kolesterol adskilles en ether-only emulsion hurtigt, hvilket gør dette trin i proceduren umuligt. - Anbring straks hætteglasset med homogeniseret vand-i-olie-emulsion på en roterende fordamper med en speciel adapter, manometermåler og en trykregulatorventil. Fordamperen skal tilsluttes en vakuumledning for at fjerne de organiske opløsningsmidler. Indstil rotationshastigheden til 100 o / min og vakuumet til 0,5 atm, og slip, hvis emulsionsskumdannelse ser overdreven ud. Når en gel dannes og forsvinder, øges vakuumet til 0,9 atm.
BEMÆRK: Under fjernelse af flygtige organiske faser skal vakuumniveauet justeres gradvist for at undgå hurtig skumdannelse, da det kan føre til tab af indhold fra hætteglasset ind i kroppen af den roterende fordamper. Til sidst, når ether og chloroform delvist fordamper, og volumenforholdet mellem vandig og organisk opløsningsmiddelfase er tæt på 1: 1, dannes en gel. Fordampningen bør fortsætte, indtil gelen forsvinder, og det resterende vandige medie er helt flydende igen. Yderligere blanding kan hjælpe med at fremskynde fjernelse af organisk opløsningsmiddel. Dette kan opnås ved at anbringe en polytetrafluorethylenomrøringsstang i fordampningskolben for at øge konvektionen af den viskøse gel under rotationsfordampning. - Filtrer de resulterende liposomer ved hjælp af sporætsede polycarbonatmembraner for at opnå homogen størrelsesfordeling.
- Udfør filtrering ved at føre liposomets vandige dispersion frem og tilbage flere gange gennem et 200 nm-pore polycarbonatfilter i en liposomekstruder udstyret med to gastætte sprøjter.
BEMÆRK: Mindre sprøjter foretrækkes (f.eks. 0,5 ml), da de sikrer generering af tilstrækkeligt tryk til filtrering. Med et højt kolesterolindhold i liposommembranen er en høj temperatur ikke nødvendig, og proceduren kan udføres ved stuetemperatur. Et ulige antal filtreringer (f.eks. 21) udføres, således at det resulterende materiale ender på den modsatte side af filteret fra starten, og hvis det præsteriliseres, kan den sterile prøve af filtrerede størrelsesjusterede liposomer opsamles. Størrelsen af de resulterende liposomer er typisk tæt på den valgte filterporestørrelse. To filtre kan stables (i stedet for et) for at udføre finjustering til lavere partikelstørrelse. - Kontroller størrelsesfordelingen ved hjælp af dynamisk laserlysspredning (DLS)3,4.
- Tilsæt 1 til 3 ml saltvand til en 1 cm kuvette med fire gennemsigtige sider. Til det tilsættes 10-220 μL liposomer og blandes forsigtigt. Prøven anbringes i apparatet, og følgende parametre måles således: opløsningsmiddelviskositet, brydningsindeks, brydningsindeks for lipider. Klik på knappen Start . Målingerne varer flere minutter og består af 100 eller flere kørsler.
- Udfør filtrering ved at føre liposomets vandige dispersion frem og tilbage flere gange gennem et 200 nm-pore polycarbonatfilter i en liposomekstruder udstyret med to gastætte sprøjter.
- Fjern eksternt Ca-acetat ved hjælp af en afsaltende spin-kolonne. Til halvdelen af batchen tilsættes vandig tesaglitazar i 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4) og inkuberes ved blanding ved 37 °C i 1 time. Brug anden halvdel af batchen som en lægemiddelfri kontrolliposomformulering.
BEMÆRK: Forligevægt af 2 ml afsaltningsspinsøjlen med 10 mM HEPES-buffer, pH 7,4, før brug. For at gøre dette skal du placere 1 ml HEPES-buffer i søjlen og dreje i en centrifuge ved 1000 x g i 2 minutter. Fjern gennemgangsbufferen, og gentag dette fire gange. - Fjern ufanget tesaglitazar fra liposomer ved hjælp af en 2 ml spin-kolonne, og bestem koncentrationen af indesluttet lægemiddel spectrophotometrisk.
- Tilsæt ikke mere end 0,5 ml liposomprøve til gellejet med tør søjle, og vent, indtil hele prøven kommer ind i gelen. Der centrifugeres under nøjagtig de samme betingelser som tidligere (1000 x g, 2 min), og lysstofprøven opsamles i gennemløbet, der er oprenset fra små molekylære masseforbindelser.
- Kvantificer endelige partikelegenskaber: partikelstørrelse og koncentration ved hjælp af DLS og zetapotentiale med et kombineret DLS-elektroforektisk lysspredningssystem(ELS) 3,4 i 10 mM HEPES-buffer pH 7,4 og ved 25 °C.
- I lighed med trin 1.5.2 fortyndes liposomdispersionen i målebufferen (f.eks. 10 μL liposomer pr. 1 ml bufferopløsning) i en U-formet kuvette ved hjælp af en engangs Luer-sprøjte eller en pipette med en skåret spids. Sørg for, at der ikke er bobler i "U", så der er uafbrudt løsning til elektrisk strømstrøm.
- Placer kuvetten i enheden (vær opmærksom på kuvettens for- og bagside, så elektroderne er korrekt forbundet til enheden). Luk instrumentdøren; Herefter finder målingen sted (med flere gentagelser) under kontrol af vejledningssoftwaren.
2. Forbered liposomer til in vivo administration
- I et biosikkerhedsskab fortyndes liposomer i sterilt saltvand til den passende koncentration i et slutvolumen på 50 μL til in vivo-administration.
BEMÆRK: I tidligere undersøgelser indeholdt vores liposompræparat 2 mg / ml tesaglitazar, hvilket svarer til ca. 4,89 μmol tesaglitazar / ml, og vi administrerede liposomer i en dosis på 1 μmol lægemiddel / kg. For en 40 g mus ville vi bringe 8,2 μL liposomer op til et endeligt volumen på 50 μL i saltvand. Ved hjælp af DLS / ELS bør antallet af liposomer pr. volumenenhed også kvantificeres for præparater af lægemiddel- og køretøjsfyldte liposomer for at sikre, at et lige antal køretøjsliposomer administreres pr. gram musevægt sammenlignet med de lægemiddelfyldte liposomer. - Læg liposomopløsningen i en 27 G nål i biosikkerhedsskabet. Opbevar dette ved stuetemperatur for at undgå at injicere kold opløsning i musen.
3. Administrer liposomer via retro-orbital intravenøs injektion
BEMÆRK: Det er også hensigtsmæssigt at foretage intravenøs injektion ved andre metoder, såsom haleveneinjektioner, hvis det foretrækkes. Selvom de ikke er omfattet af denne protokol, er offentliggjorte protokoller, der forklarer denne metode19 , tilgængelige.
- Konfigurer arbejdsområdet til levering af liposomer.
- Rengør arbejdsbordet med 70% ethanol. Sørg for at vælge et rum, der tillader brug af et isofluranæstesisystem.
- Tænd for en varmepude, og læg en ren pude eller et håndklæde over den for at holde musen på en ren overflade. Giv puden tid nok til at varme op, før du begynder at arbejde med mus.
- Indstil anæstesisystemet, så kammeret er i nærheden, og næsekeglen er på opvarmningspude.
- Sørg for, at alle andre aspekter af systemet er klar (f.eks. er isofluranniveauet højt nok i fordamperen, kulfilteret er vejet, slangen er tilsluttet korrekt).
- Saml de andre materialer, der er nødvendige for dette afsnit af protokollen: oftalmisk smøremiddelgel, lokalbedøvelse til behandling efter administration, sterile gasbind.
- Bedøm musen med isofluran i induktionskammeret. Når den ikke reagerer på et blidt fodtryk, skal du hurtigt overføre musen til arbejdsområdet, mens du opretholder sedation gennem en næsekegle.
BEMÆRK: Dyret skal holdes på 1,5% til 2,5% isofluran og vurderes for en passende dybde af anæstesi (via manglende respons på tåklemmen), før forsøget fortsættes. - Skift musen til den ene side for liposomadministration. Fordi musen ikke blinker under bedøvelse, skal du anvende en lille mængde oftalmisk smøremiddel på begge øjne for at holde dem fugtede under resten af proceduren.
- Tryk forsigtigt ned på huden over og under det blottede øje. Øjet skal løfte sig over ansigtets plan.
- Indsæt forsigtigt spidsen af nålen ved den mediale kant, og sørg for, at nålen er under øjet og ikke rører ved den. Når nålen er indsat under øjet, injiceres liposomerne langsomt i retro-orbitalrummet. Når nålen trækkes ud, kan det være nødvendigt at lukke øjenlågene i et par sekunder for at opnå hæmostase.
- Hvis nålen ikke stikkes langt nok ind, kan opløsningen dukke op omkring øjet. Stop straks med at injicere, hvis dette ses, og placer nålen igen.
- Påfør en lokalbedøvelse, såsom proparacain, til øjet for at forhindre smerter og ubehag efter proceduren.
- Hold musen på en varmepude og overvåg, indtil den vågner for at sikre, at den har det godt og opretholder korrekt kropstemperatur.
- Sæt musen tilbage i buret og det normale boligmiljø, indtil interessepunktet ankommer.
BEMÆRK: Dette skal gøres i overensstemmelse med lokale IACUC-retningslinjer.
4. Forbered materialer til vævshøst, vævsbehandling og flowcytometrifarvning
- Forbered opløsninger til høst, forarbejdning og farvning (afsnit 5-20127): fosfatbufret saltvand (PBS)-heparin, HEPES-buffer, 2 mg/ml kollagenasetype I, AKC-lysisbuffer, FACS-buffer, PBS, fikseringsbuffer (tabel 2). Opbevar alle opløsninger undtagen bindingsbufferen ved 4 °C eller på is under proceduren.
- Forbered rør med buffere og andre materialer til høst og behandling af væv.
- For blod fra hver mus tilsættes 10 μL 0,5 M EDTA til et 1,5 eller 1,7 ml mikrocentrifugerør til opsamling af blodet. EDTA forhindrer blodet i at størkne. En 1 ml sprøjte med en 25 G nål og et 15 ml konisk rør er også nødvendige.
- Til milten samles et 1,5 eller 1,7 ml mikrocentrifugerør med 1 ml HEPES-buffer, en 1 ml sprøjte, to 50 ml koniske rør og to 70 μm filtre pr. milt.
- For hvert fedtvævsdepot samles et 20 ml polyethylenhætteglas med 1,5 ml HEPES-buffer til hakning af vævet, et 50 ml konisk rør og et 70 μm filter pr. fedtvævstype pr. mus.
- Forbered arbejdsområdet til høsten.
- Rengør bordpladsen med 70% ethanol. Forbered en gummibakke til fastgørelse af musen under høst ved at rengøre den med 70% ethanol og dække den med en absorberende pude eller køkkenrulle. Sørg for, at der er mindst 5 ben til rådighed til at arbejde med.
- Fyld en 10 ml sprøjte med PBS-heparin og fastgør en 25 G kanyle til perfusion.
- Saml værktøjer og materialer til brug under høsten. Der er brug for pincet (to par), saks, køkkenrulle, fnugfri servietter, mikrocentrifugerøret/mikrocentrifugeglassene med EDTA, mikrocentrifugeglasset/mikrocentrifugeglassene med HEPES-buffer og hætteglasset med polyethylen med HEPES-buffer.
5. Høst vævene
- Aflive musen ved CO2 kvælning. Udfør ikke en cervikal dislokation, da dette kan forhindre effektiv blodindsamling og vævsperfusion ved senere trin.
- På et rengjort bænkområde med tilstrækkelig arbejdsplads og belysning til at se musen godt, skal du oprette en gummidissektionsbakke, en spand is til opbevaring af prøver og en sprayflaske med 70% ethanol. Spray musen ned med 70% ethanol for at reducere forurening og kontrollere hårspredning. Placer musen på ryggen på gummibakken og fastgør poterne spredt væk fra kroppen.
- For at forberede sig på at samle blod skal du forsigtigt lave et snit i huden ved kanten af den kaudale ende af musens brystkasse. Skær en lille, lige linje op mod musens hoved (ca. 1 cm), indtil pectoralis musklerne er udsatte.
- På det indledende snitsted skal du lave to små snit vinkelret på linjen mod hovedet. Skær derefter forsigtigt pectoralismusklen væk på den ene side af ribbenburet i det udsatte område. Dette giver bedre adgang og visualisering for, hvor nålen skal indsættes.
- For at samle blod skal du indsætte nålen mellem tredje og fjerde ribben på den side, hvor musklen blev fjernet. Da musens hjerte findes i midten af brysthulen, skal nålen holdes så tæt på brystkassens midterlinje som muligt. Når sprøjten er indsat, skal du forsigtigt trække op på sprøjten for at begynde at samle blod.
- Når det er opsamlet, overføres blodet til det fremstillede mikrocentrifugerør med EDTA og opbevares på is.
BEMÆRK: Hvis ca. 100 μL volumen trækkes op, og der ikke kommer blod ind i sprøjten, skal du prøve at dreje sprøjten til højre eller venstre, hvis kanyleåbningen presses op mod hjertevæggen. Hvis dette ikke hjælper, skal du langsomt flytte nålen længere ind i brysthulen eller begynde at fjerne. Hvis blodet begynder at samle sig i sprøjten på dette tidspunkt, skal du fortsætte med at trække langsomt tilbage på sprøjten. Overvej at dreje sprøjten og nålen for vellykket ekstraktion. Endelig, hvis der ikke opsamles blod, skal du fjerne nålen, da den kan have savnet hjertet. Prøv at sætte nålen i igen og gentag den førnævnte proces igen.
- For at perfusere musen skal du åbne brysthulen for at få adgang til hjertet.
- For at gøre dette skal du skære huden langs enden af ribbenburet ned til musens side på hver side. Brug derefter tangen til at holde brystbenet væk fra arbejdsfladen. Lav et lille, lavt snit lige under brystbenets ende for at skære gennem bughulen. Skær langs peritonealmembranen langs enden af ribbenburet på hver af musens sider. Dette bør udsætte leveren og galdeblæren. Pas på ikke at skære i nogen af disse væv.
- Lav derefter et lille, lavt snit i membranen, kranial til leveren. Skær derefter membranen langs kanten af ribbenburet for at åbne brysthulen. Sørg for at undgå at skære nogen af organerne i brysthulen.
- Lav to snit langs ribbenburet mod hovedet ca. 2-3 mm fra musens midterlinje og ca. 0,75 cm lang.
BEMÆRK: Hvis de skæres for højt op, vil arterierne, der ligger øverst i brystkassen, blive skåret. Dette vil forstyrre effekten af perfusion. - Løft det midterste stykke af brystkassen tilbage for at udsætte brysthulen. Flyt fedt eller væv væk for at få adgang til hjertet.
- Lav et lille snit i musens højre atrium for at skabe en åbning, hvorigennem blodet kan skubbes ud.
- Brug en 10 ml sprøjte PBS-heparin til at indsætte nålen i venstre ventrikel i musens hjerte.
- Begynd forsigtigt at skubbe PBS ind i hjertet så langsomt som muligt.
BEMÆRK: Der skal observeres blod, der kommer ud af højre atria og fylder brysthulen. Sørg for at holde hjertet i sin fysiologiske placering for at undgå at hæmme strømmen af PBS-heparin fra hjertet gennem aorta. - Når alle 10 ml PBS-heparin er blevet perfuseret gennem musen, kasseres sprøjten og kanylen, og overskydende blod og PBS-heparin fjernes fra brysthulen ved hjælp af papirhåndklæder eller fnugfri klude.
- For at begynde at udvinde væv skal du derefter skære ned på huden og peritonealmembranen mod musens hale for at åbne bughulen.
- Først ekstraheres den inguinale fedtvævspude fra hver side af musen.
BEMÆRK: Læs denne proces omhyggeligt: Sørg for at udtrække den indinale lymfeknude fra hvert depot for at undgå skævhed i fedtvævets cellulære sammensætning i resultaterne.- Brug et andet sæt tang til at holde peritonealmembranen med et sæt tang og kanten af huden overlejret over membranen på den side med de andre tang. Træk forsigtigt huden væk fra peritonealmembranen for at adskille disse lag fra hinanden. Se efter det inguinale fedtvævsdepot langs huden. Pin ned den ydre kant af huden for bedre adgang til fedtdepotet.
- Før ekstraktion skal du lokalisere den indinale lymfeknude i midten af fedtdepotet og fjerne den ved hjælp af tang og saks efter behov.
BEMÆRK: Hvis det er muligt, skal du lokalisere de tre større arterier, der løber fra depotets ydre kanter mod midten. Lymfeknuden er placeret omkring, hvor disse arterier mødes. - Når lymfeknuden er fjernet, skal du forsigtigt holde enden af fedtdepotet nærmest det fastgjorte punkt med tangen og begynde at lave små snit ved bindemembranen mellem fedtvævet og huden. Løft fedtvævet væk fra huden, mens du laver nedskæringer for at få bedre adgang til membranen og sikre, at hele depotet ekstraheres.
- Anbring fedtdepotet i et forberedt hætteglas af polyethylen med HEPES-buffer på is for at holde vævet levedygtigt under resten af høsten.
- Gentag denne proces på den anden side af musen for at udtrække begge depoter. Depoter kan enten fordøjes og behandles sammen eller separat. Hvis hvert depot skal behandles separat, skal der forberedes flere rør.
- Derefter ekstraheres de epididymale fedtdepoter fra den kaudale ende af peritonealhulen. Brug tang til forsigtigt at trække det første epididymale fedtdepot langt fra musens dorsale ende og lokalisere epididymis og vas deferens fastgjort til dette depot.
BEMÆRK: Der er to epididymale fedtdepoter: et fastgjort til hver epididymis og vas deferens.- Skær forsigtigt mellem fedtdepotet og epididymis og vas deferens for at adskille fedtet fra disse andre væv. Anbring fedtdepotet i et hætteglas af polyethylen med HEPES-buffer på is for at holde vævet levedygtigt under resten af høsten.
- Endelig ekstraheres milten, som findes til venstre for maven nær membranen. Brug tang til forsigtigt at trække maven mod midten af bughulen for at udsætte milten.
- Hold forsigtigt den ene ende af milten og træk den lidt væk fra maven. Skær membranen mellem milten og dets tilstødende væv, indtil organet løsnes. Milten anbringes i det tilberedte mikrocentrifugerør med HEPES-buffer og opbevares på is.
- Før du behandler væv eller høster væv fra den næste mus, skal du kassere slagtekroppen og eventuelle snavsede papirhåndklæder eller puder. Tør også værktøj af.
BEMÆRK: Hvis der er flere mus, skal du gentage disse høsttrin for hver mus, før du går videre til næste behandlingstrin. Hvis en kontrolmus / mus er inkluderet, skal du overveje at høste disse før liposombehandlede mus for at undgå forurening.
6. Procesvæv
BEMÆRK: Da fedtvævet har en lang fordøjelsesinkubation, anbefales det at starte med denne proces først og arbejde på at behandle blodet og milten i fordøjelsesperioden.
- Først hakke og fordøje fedtvævene. Brug en eller to saks til at hakke fedtvævet i hvert hætteglas med polyethylen, indtil vævet er i små stykker på mindre end 0,5 mm i størrelse. Dette giver mulighed for mere effektiv fordøjelse.
- Når vævet i alle hætteglas er hakket, tilsættes 1,5 ml 2 mg/ml kollagenasebuffer til hvert hætteglas. Anbring hætteglassene i en rystekuvøse indstillet til 37 °C og 150 omdr./min. Inkuber i 30 til 45 min.
BEMÆRK: Hvis fedtvævet er særligt stort, skal du overveje at tilføje yderligere 0,5 ml til 1,5 ml HEPES-buffer og et tilsvarende volumen kollagenasebuffer til hætteglasset (e) for at sikre, at vævene er helt nedsænket, og at der er nok enzym til stede. Den endelige koncentration af kollagenasetype I ved fordøjelsen bør være 1 mg/ml uanset volumen af den endelige opløsning. Hvis der ikke findes en rysteinkubator, kan prøverne anbringes i et vandbad opvarmet til 37 °C. Ryst forsigtigt prøverne hvert 5. minut for at blande og resuspendere fordøjelsen. - Kontroller prøverne på 30 min. Brug en 1 ml pipet til at pipet prøven op og ned. Hvis vævsstykkerne stadig er for store til let pipettering, returneres prøverne til inkubatoren i yderligere 15 minutter.
- Når prøverne er fuldt fordøjet, skal du fortsætte med at pipet prøven op og ned yderligere 10 gange for at sikre, at der er skabt en enkeltcellesuspension.
BEMÆRK: (Valgfrit) Kontroller prøverne efter 30 min. Brug en 1 ml pipette til at pipettere prøven op og ned. Hvis vævsstykkerne stadig er for store til let pipettering, returneres prøverne til inkubatoren i yderligere 15 minutter. - Pipetten cellesuspensionen gennem et 70 μm filter ind i et 50 ml konisk rør. Tilsæt 5 ml FACS-buffer til det tomme hætteglas med fordøjelse for at vaske hætteglasset ud. Overfør denne vaskebuffer gennem filteret for at tilføje til cellesuspensionen.
- Opbevar prøver på is, mens andre behandles. Når alle prøver er filtreret, drejes de ned ved 400 x g, 4 °C i 5 minutter.
- Adipocytsupernatanten fjernes ved aspiration, hvorefter infranatanten forsigtigt fjernes mellem adipocytsupernatanten og pellet ved aspiration for at forlade pelletten stromalvaskulær fraktion (SVF).
- Resuspender denne pellet i 1 ml FACS-buffer og overfør til et rent 1,5 eller 1,7 ml mikrocentrifugerør. Alikvote celler nu, hvis det ønskes eller er nødvendigt. Opbevares på is, indtil alle prøver er klar til flowcytometrifarvning.
BEMÆRK: Hvis de fordøjede fedtdepoter var store, skal du overveje kun at bruge 50% eller 25% af prøven til flowcytometrisk farvning og analyse. Derudover, hvis der er behov for fluorescens-minus-on (FMO) kontroller eller yderligere kontroller til flowcytometrianalyse (tabel 1), skal du sørge for at alikvote ekstra prøve i et separat rør til behandling. FMO'er bruges til at skelne mellem negativt og positivt signal for et individuelt fluoroforkonjugeret antistof inden for det ellers komplette panel, der anvendes i eksperimentet.
- Når vævet i alle hætteglas er hakket, tilsættes 1,5 ml 2 mg/ml kollagenasebuffer til hvert hætteglas. Anbring hætteglassene i en rystekuvøse indstillet til 37 °C og 150 omdr./min. Inkuber i 30 til 45 min.
- For det andet behandle blodet.
- Overfør 50 μL blod til et 15 ml konisk rør.
- Tilsæt 1 ml AKC-lysisbuffer til hvert rør og pipet op og ned for at nå en enkeltcellesuspension. Tilsæt yderligere 4 ml AKC-lysisbuffer til hvert glas og inkuber i 5-10 minutter. Hvis en ryster eller rotator er tilgængelig, skal du forsegle rørhætterne tæt og placere rørene på en af disse for at forbedre blandingen.
- Der tilsættes 5 ml FACS-buffer for at slukke lysisprocessen, og prøverne centrifugeres ved 400 x g, 4 °C i 5 minutter. Supernatanten tages af, og pelletnen kontrolleres. Hvis det stadig er ret rødt, gentag lyseprocessen. Ellers resuspenderes pellets i 1 ml FACS-buffer og overføres til et rent 1,5 eller 1,7 ml mikrocentrifugerør. Opbevares på is, indtil alle prøver er klar til flowcytometrifarvning.
- Endelig behandle milten. Overfør milten til et 70 μm filter over et 50 ml konisk rør. Servietten vaskes med 1 ml FACS-buffer, og milten moses derefter gennem filteret ved hjælp af stempelenden af en 1 ml sprøjte. Under hele mæskningsprocessen vaskes cellerne i det 50 ml koniske rør ved hjælp af mere FACS-buffer. Det endelige volumen i det koniske rør skal være 10 ml.
- Drej cellerne ved 300 x g ved 4 °C i 5 min. Supernatanten fjernes og resuspenderes i 1 ml AKC-lysisbuffer. Tilsæt yderligere 4 ml AKC-lysisbuffer og inkuber i 5 min. Der tilsættes 5 ml FACS-buffer for at slukke lysisprocessen, og prøverne centrifugeres ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter.
- Supernatanten fjernes og pellets resuspenderes i 1 ml FACS-buffer. Overfør suspensionen gennem et andet, rent 70 μm filter til et 50 ml konisk rør. Tilsæt 4 ml FACS-buffer for at vaske det originale rør ud og overfør bufferen gennem filteret til et endeligt volumen på 5 ml.
- Overfør 50 μL af cellesuspensionen til et rent 1,5 eller 1,7 ml mikrocentrifugerør, og hold det på is, indtil alle prøver er klar til flowcytometrifarvning. Yderligere delprøver kan overføres til rør, hvis der ønskes eller kræves mere.
BEMÆRK: Splenocytter er fremragende celler til brug for en levende / død enkelt plet. Overvej at overføre en ekstra delprøve til dette kontrolelement.
7. Pletceller fra væv til flowcytometri
- Centrifuger alikvoterede prøver ved 400 x g, 4 °C i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og prøverne resuspenderes i 50 μl Fc Block (fortyndet) (tabel 2). Inkuber på is i 5 min.
- Der tilsættes 50 μL 2x antistofblanding (tabel 3) til hver prøve. Inkuber på is i mørke i 20 min.
BEMÆRK: Eventuelle enkelte pletter bør IKKE farves med denne antistofblanding. Hvis FMO'er skal anvendes, skal FMO-antistofblandinger desuden fremstilles separat. - Prøverne vaskes med 1 ml PBS og centrifugeres ved 400 x g, 4 °C i 5 minutter. Supernatanten fjernes, og prøverne resuspenderes i 200 μl levedygtighedsplet (tabel 3). Inkuber på is i mørke i 20 min.
BEMÆRK: Glem ikke at plette celler, der blev afsat til en levende / død enkelt plet under dette trin. - Prøverne vaskes med 1 ml FACS-buffer og centrifugeres ved 400 x g, 4 °C i 5 minutter. Supernatanten fjernes, og prøverne (undtagen levende/døde enkeltpletter) opslæmmes i 50 μliter fikseringssubstrat (reagens A) for at fiksere prøverne. Inkuber ved stuetemperatur i mørke i 15 min.
- Resuspender Live/Dead enkeltpletten i 100 μL 2% PFA. Inkuber ved stuetemperatur i mørke i 5 min.
- Prøven vaskes med 1 ml FACS-buffer og centrifugeres ved 800 x g, 4 °C i 5 min. Supernatanten fjernes, og prøverne resuspenderes i 250-500 μl FACS-buffer. Opbevares ved 4 °C, indtil prøverne kan køres på flowcytometeret.
- Prøverne vaskes med 1 ml FACS-buffer og centrifugeres ved 800 x g, 4 °C i 5 minutter. Supernatanten fjernes og prøverne resuspenderes i 50 μliter permeabiliseringsmedium (reagens B) plus antistof/antistoffer mod intracellulære proteiner. Inkuber ved stuetemperatur i mørke i 20 min.
- Prøverne vaskes med 1 ml FACS-buffer og centrifugeres ved 800 x g ved 4 °C i 5 minutter. Supernatanten fjernes og prøverne resuspenderes i 100 μl 2% paraformaldehyd (PFA). Inkuber ved stuetemperatur i mørke i 5 min.
- Prøverne vaskes med 1 ml FACS-buffer og centrifugeres ved 800 x g, 4 °C i 5 minutter. Supernatanten fjernes og prøverne resuspenderes i 250-500 μl FACS-buffer. Opbevares ved 4 °C, indtil prøverne kan køres på flowcytometeret.
Representative Results
Liposom produktion
Resultaterne offentliggjort her ligner dem i vores tidligere offentliggjorte arbejde 3,4,20. Ved hjælp af den protokol, der præsenteres her, forventer vi at producere liposomer på ca. 150-160 nm i størrelse. DLS afslører en gennemsnitlig liposomdiameter på 163,2 nm og et zetapotentiale på -19,2 mV (figur 1A). Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) billeddannelse afslører cirkulære liposomer (figur 1B), og DLS-diagrammet afslører en relativt lille standardafvigelse fra den gennemsnitlige diameter (figur 1C).
Positiv liposombinding kræver en PBS-behandlet kontrol
Tidligere undersøgelser fra vores gruppe, der anvender denne protokol, undersøgte, hvilke celleundergrupper i fedt-SVF, milt og blod bundet til liposomer efter en uges in vivo-administration 3,4. Ved hjælp af en PBS-behandlet mus blev bughulen og miltcellerne farvet med det samme antistofpanel, der blev brugt på prøver fra liposombehandlede mus. Væv blev høstet efter en uges behandlinger (figur 2A). Prøverne fra den PBS-behandlede mus fungerede som en DiD FMO, hvormed man kunne skabe positive DiD-porte (figur 2B, C). En positiv gate kan oprettes ved hjælp af DiD-positivt signal, men prøver, der mangler DiD-signal, skal også bruges til at verificere, at den positive gate ikke indeholder nogen DiD-negative prøver.
Titreringer er nødvendige for at optimere fluorescenssignaler
Før der udføres et fuldstændigt eksperiment, skal forskellige betingelser, herunder koncentrationen af fluorescerende konjugerede antistoffer, der anvendes under cellefarvning, og lipidfarvestof, der anvendes under liposompræparation, optimeres. Flowcytometre har en øvre detektionsgrænse for fluorescensintensitet, så for meget farvestof inkorporeret i liposomerne vil føre til ikke-kvantificerbare niveauer af DiD-signal i prøver, der løber gennem cytometeret. Desuden kan for meget DiD i liposomerne føre til høje niveauer af ikke-specifik farveoverførsel, hvilket kan skæve cellulære optagelsesresultater. Figur 3 rapporterer resultater fra et eksperiment, hvor koncentrationer af lipidfarvestof blev titreret for at identificere den koncentration, der ville producere et optimalt signal inden for detektionsområdet for det flowcytometer, der blev anvendt. Dette blev udført på væv af interesse for det endelige eksperiment: Blod (figur 3A), lyskefedt SVF (figur 3B) og epididymal fedt-SVF (figur 3C). De koncentrationer, der blev udvalgt til testning, var 10 mg DiD (Høj, rød), 1 mg DiD (mellem, blå) eller 0,1 mg DiD (Lav, grå) pr. 1 ml liposomer. Den højeste koncentration, der blev anvendt i liposomerne, var for høj og oversteg cytometerets kvantificerbare område i alle tre væv (figur 3A\u2012C, rød). Den laveste koncentration af DiD viste et vist signal (figur 3 A\u2012C, grå), men der blev ikke observeret en klar population ud over de PBS-behandlede celler (figur 3A\u2012C, sort). Når det blev kvantificeret, viste det aritmetiske gennemsnit af DiD-MFI'en for hvert væv og hver koncentration en klar sondring mellem PBS-kontroller og den midterste koncentration af DiD (figur 3D). Som angivet i protokollen valgte vi således den midterste koncentration (figur 3, blå) til brug i vores liposompræparat.
Brugen af multi-antistofpanel muliggør identifikation af liposomoptagelse af forskellige celleundergrupper
Ved hjælp af panelet skitseret i tabel 3 blev celler farvet med antistoffer mod markører for makrofager, B-celler, T-celler, dendritiske celler, monocytter og endotelceller (figur 4). Lidt forskellige gating-strategier er nødvendige for hver vævstype, men de fleste af de samme celletyper kan identificeres i hver. Nogle undtagelser omfatter endotelceller, som normalt ikke findes i blodet, og monocytter, som typisk er ved højere frekvens i blodet end andre væv. Når populationerne er identificeret, kan den samlede størrelse af hver cellepopulation og hyppigheden, hvormed de er DiD +, kvantificeres. Yderligere beregninger kan udføres for at karakterisere DiD + -populationen: hvilken procentdel af DiD + -celler er makrofager, endotelceller osv. Bemærk, at dette er eksempler på gating-strategier, men ikke den eneste måde at analysere prøverne på. Analysen dikteres af det valgte panel og flowcytometer(er), der er tilgængelige.
Figur 1: Eksempel på egenskaber ved forberedte liposomer.
(A) Størrelsen og zetapotentialet blev målt som beskrevet ovenfor og er blevet rapporteret i tabelform. Hver parameter præsenteres som gennemsnittet ± standardafvigelsen. (B) Cryo-EM blev brugt til at afbilde de fremstillede liposomer. Den hvide skalastang er 50 nm lang. (C) DLS blev brugt til at generere et histogram af diameteren af liposomer i denne prep. Denne figur er tilpasset fra Osinski et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ DiD-farvning fra PBS- eller liposombehandlede mus.
(A) Eksperimentelt skema for PBS og liposombehandlinger. PBS eller liposomer blev injiceret tre gange i løbet af en uge. Væv blev høstet på dag 8 af behandlingen. (B, C) Repræsentative flowplots afslører positiv DiD-farvning i liposombehandlede (C), men ikke PBS-behandlede (B) mus. FSC, fremad spredning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Titrering af DiD i liposomer.
Liposomer blev fremstillet med tre forskellige koncentrationer af DiD og injiceret i mus. Grå angiver den lave koncentration ved 0,1 mg DiD pr. 1 ml liposomer, blå angiver den midterste koncentration ved 1 mg DiD/ml liposomer, og rød angiver den høje koncentration ved 10 mg DiD/ml liposomer. En PBS-behandlet mus blev brugt som negativ kontrol (sort). Blod (A, cirkel), lyskefedt (B, triange) og epididymalt fedt (C, firkantet) blev høstet 24 timer efter injektion og behandlet for at isolere en enkeltcellesuspension. Disse prøver blev kørt på et flowcytometer til niveauet af detekterbar DiD. Vævsspecifikke histogrammer med overlejringer af hver behandlingsgruppe præsenteres for at demonstrere fluorescensintensitet pr. koncentration (A\u2012C). Det aritmetiske gennemsnit af DiD blev også kvantificeret for hvert væv og koncentration og plottet (D). SSC = sidespredning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativ flowcytometrianalyse af celleundergrupper i fedt-SVF, blod og milt.
(A\u2012C) Skematisk repræsentativ for gating-strategi til identifikation af celleundergrupper og DiD + celler i fedt-SVF (A), milt (B) og blod (C). Forkortelser: FSC = fremadrettet spredning; LD = levende/døde; L-DC'er = lymfoide dendritiske celler; M-DC'er = myeloide dendritiske celler; SSC = sidespredning. Denne figur er tilpasset fra Osinski et al.3. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Kontrol | Formål |
| Mus behandlet med PBS eller saltvand | Brug cellerne fra denne mus til følgende flowcytometrikontroller: |
| 1. Ufarvede celler | |
| 2. Levende/død enkelt plet | |
| 3. Celler farvet med hele panelet, men mangler liposomfluorescens til bestemmelse af positivt liposomsignal under analyse | |
| Denne / disse mus / mus vil også blive brugt til at bestemme, om liposomer har nogen virkninger in vivo, da du vil have en ikke-liposomkontrol i dit eksperiment. | |
| Lossede liposomer | Hvis du lægger en forbindelse i dine liposomer, skal en del af din liposombatch syntetiseres uden forbindelsen. Dette tegner sig for eventuelle in vivo-effekter af liposomerne alene. |
| DiD alene | Da DiD også kan optages af cellemembraner, vil tildeling af nogle mus til at modtage frit farvestof i en mængde svarende til den, der findes i liposomerne, hjælpe med at tage højde for enhver baggrundsmembranfarvning. |
| FMO-kontroller (fluorescens-minus-on) | Disse er celler farvet med alle undtagen et af antistofferne i dit panel. Ligesom # 3 i boksen ovenfor hjælper dette med at bestemme ægte positivt signal for det antistof under analysen |
Tabel 1: Kontrolelementer til brug i denne protokol.
| Opløsning | Komponenter | Omtrentlig volumen, der kræves pr. batch/mus |
| Liposom forberedelse | ||
| Calciumacetat | 1 M calciumacetat iH2O | 50 ml |
| HEPES-buffer | 10 mM HEPES i H2O, pH 7,4 | 50 ml |
| Tesaglitazar i HEPES | i 10 mM HEPES | 10 ml |
| Vævshøst, forarbejdning og farvning | ||
| Fosfatbufret opløsning (PBS) | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 i destilleret H 2O | 2 ml |
| PBS-heparin | 0,1 mM heparin i PBS | 10 ml |
| HEPES-buffer | 20 mM HEPES i PBS | 5 ml |
| Fordøjelsesbuffer | 2 mg/ml kollagenase type I i HEPES-buffer | 5 ml |
| AKC lysis buffer | 0,158 MNH3Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mMNa2EDTA i ddH 2 O, pH7,2 | 15 ml |
| FACS-buffer | 1% BSA, 0,05%NaN3 i PBS | 15 ml |
| Fc Block (fortyndet) | 1:50 Fc blok i FACS-buffer | 250 μL |
| Fikseringsbuffer | 2% paraformaldehyd i PBS | 200 μL |
Tabel 2: Løsninger til forberedelse.
| En | B | C | D |
| Ekstracellulær farvning (2x antistofblanding) | |||
| Antigen | Fluorofor | Ab volumen pr. 100 μL prøvning | Samlet behov for volumen: |
| CD45 | PerCP | 0,5 μL | Kolonne C x 1,2 x prøver i alt # |
| CD11b | PerCP Cy5,5 | 0,25 μL | (0,5 μL/test) x (1,2) x (# prøver) |
| F4/80 | PE Cy7 | 0,25 μL | (0,25 μL/test) x (1,2) x (# prøver) |
| CD19 | PE-CF594 | 1 μL | (0,25 μL/test) x (1,2) x (# prøver) |
| CD3 | FITC | 1 μL | (1,0 μL/test) x (1,2) x (# prøver) |
| CD31 | BV605 | 0,25 μL | osv... |
| CD11c | APC ef780 | 1 μL | |
| CD115 | PE | 1,5 μL | |
| For at oprette din antistofblanding skal du kombinere antistofferne beregnet i kolonne D med FACS-buffer eller Brilliant Violet Staining Buffer* til et endeligt volumen på (50 μL x 1,2 x Total # prøver) | |||
| Levende/død farvning (1x) | |||
| Levende/døde | Fluorofor | L/D volumen pr. 200 uL prøvning | Samlet behov for volumen: |
| Levende/døde | Aqua | 0,67 μL | Kolonne C x 1,2 x prøver i alt # |
| Intracellulær farvning (1x) | |||
| Antigen | Fluorofor | Ab volumen pr. 50 μL prøvning | Samlet behov for volumen: |
| αSMA | FITC | 0.125 | Kolonne C x 1,2 x prøver i alt # |
| *Brilliant Violet Staining Buffer bør anvendes, hvis der anvendes mere end ét antistof konjugeret mod en strålende violet fluorofor i dit panel. | |||
Tabel 3: Eksempel på antistofpanel og beregninger af farvningsblandinger, der skal bruges til flowfarvning.
Discussion
Her beskriver vi en tredelt protokol til (i) at forberede liposomer, der er mærket med et fluorescerende lipidfarvestof og fyldt med en antidiabetisk forbindelse, tesaglitazar, (ii) administrere liposomer til en mus via retro-orbital injektion og (iii) høste, behandle og plette væv for at detektere liposomoptagelse på celleniveau ved flowcytometri. Denne protokol gennemgår forberedelse af ca. 150 μm liposomer og vurdering af optagelse i fedt, blod og milt. Liposompræparatet er skalerbart, udføres hovedsagelig ved stuetemperatur og anvender omvendt fasefordampning for at maksimere lægemiddelbelastning og fjernelse af organiske opløsningsmidler. Ved hjælp af denne protokol kan der opnås op til 2 mg/ml tesaglitazarkoncentration i den oprensede liposomprøve. De tilberedte liposomer kan opbevares i HEPES-buffer ved 4 °C i over et år. Efter vores erfaring viste de minimal variation i gennemsnitlig partikelstørrelse. Under 10% af lægemiddelindholdstabet blev påvist spektrophotometrisk efter ultrafiltreringsseparation af liposomer fra eksternt lægemiddel med et 10 kDa centrifugalfilter.
Under liposomforberedelse er der nogle kritiske trin og faktorer at overveje. For det første er rækkefølgen af protokoltrinnene vigtig og skal overholdes. For det andet skal pH-værdien af den opløsning, der anvendes ved påfyldning af tesaglitazar, holdes på 7,4 for at maksimere opløseligheden og den effektive belastning. For det tredje sikrer korrekt montering af udstyr og filtre, at udgangen fra hvert trin er af den rette størrelse og renhed. For eksempel, hvis 100- og 200-nm filtre ikke er samlet korrekt, kan der opstå en mere heterogen og forkert størrelse batch af liposomer. For det fjerde er fuldstændig fjernelse af Ca-acetat før lægemiddelpåfyldning nødvendig for at maksimere overførslen af tesaglitazar til liposomerne. For at teste for fuldstændig fjernelse af Ca-acetat skal du bruge højhastighedssedimentering til at fjerne liposomerne og derefter måle Ca-acetatniveauer i den ikke-liposomale opløsning. For det femte er det vigtigt at veje og registrere massen af alle materialer, der tilsættes liposompræparatet ved hvert trin. Dette sikrer, at korrekte koncentrationer kan beregnes, og at de nødvendige forhold mellem materialer opretholdes. Endelig, hvis teknikken ikke udføres korrekt, kan der være et uønsket niveau af heterogenitet. Det er vigtigt at kontrollere denne parameter grundigt ved hjælp af DLS og andre tilgange såsom elektronmikroskopi. For at forbedre homogeniteten kan du overveje at justere den valgte filterstørrelse eller stable to filtre.
Derudover er det afgørende, at kontroller og et antistofpanel til flowcytometri planlægges og optimeres, inden denne protokol udføres fuldt ud (tabel 1, tabel 3). Antistoffer bør testes for at sikre, at der anvendes korrekte koncentrationer til farvning, og at overlapningen mellem fluoroforer er minimal. Excitationen og emissionen af farvestoffet, der anvendes under liposompræparation, skal også indregnes i panelplanlægningen. I vores resultater brugte vi DiD, som har en lignende excitation og emission til fluoroforer som Allophycocyanin (APC) og AlexaFluor 647. Således valgte vi ikke antistoffer konjugeret mod disse fluoroforer i vores antistofpanel. Desuden er isotypekontroller ikke omfattet af denne protokol. Dette skyldes, at de antistoffer, der er valgt til denne protokol, er velvaliderede, kommercielt tilgængelige antistoffer. Men hvis du er interesseret i at bruge et antistof, der ikke tidligere er optimeret, skal du overveje at teste antistoffet mod en isotypekontrol på det interessante væv, inden du udfører det fulde eksperiment.
Mens denne protokol viser, hvordan man ekstraherer og behandler blod, milt, lyskefedt og epididymalt fedtvæv fra musens efterbehandling, kan denne generelle tilgang anvendes på andre væv. Afhængigt af det interessante væv kan det være nødvendigt at ændre behandlings- og fordøjelsesprotokollerne, som det er offentliggjort for følgende væv: lunge21, lever22, bughule 3, knoglemarv3,23, hjerne 24.
En vigtig begrænsning ved denne metode er, at optagelsen kun kan vurderes på ét tidspunkt pr. dyr. Det kan således være en fordel at koble denne protokol med andre ikke-invasive billeddannelsesteknikker eller planlægge i overensstemmelse hermed for at sikre tilstrækkelige ressourcer til at gennemføre vurderingen. Tidspunktet for cellulær optagelse og cellulær omsætning er vigtige faktorer at overveje: liposomer cirkulerer gennem hele kroppen i de første 24 timer, og afhængigt af levetiden for de celler, der optager liposomer, eller hvordan de reagerer på optagelse, kan celledød eller yderligere fagocytose forekomme. Vores tidligere undersøgelse viste ændringer i populationskarakteristika for DiD + populationer på forskellige tidspunkter3. Derfor er det vigtigt at evaluere optagelsen på tidligere tidspunkter eller tidspunkter, der er mest relevante for interessemekanismens biologi. Derudover, mens kvantificering af celleoptagelse i hele vævet kan udføres med denne protokol, kan flowcytometri ikke afsløre vævslokalisering. Kobling af denne tilgang med histologiske metoder kan bidrage til at løse denne begrænsning.
Generelt supplerer denne protokol eksisterende metoder såsom histologi og helkropsfluorescensbilleddannelse. Med de fortsatte fremskridt inden for flowcytometriværktøjer og -metoder vil udviklingen af større paneler til flere og flere specifikke cellepopulationer blive mulig. Vi foreslår, at denne protokol bruges ud over de ovennævnte metoder, da dette vil forbedre evalueringen af cellulær optagelse og også give mulighed for at validere de resultater, der observeres ved flowcytometri. For eksempel skal det konstateres, at et flertal af partiklerne i fedtvæv blev optaget af makrofager ved flowcytometri. Immunofluorescens af en yderligere delprøve af det samme fedtvæv kunne gemmes, fikseres, sektioneres og farves til makrofagmarkører for at verificere, at celletypen faktisk optager liposomer. Denne tilgang bør tilføje stringens til nanopartikelbiodistributionsassays udført: validering af cellespecifik målretning, kvantificering af cellulær optagelse, identifikation af optagelse uden for målet og forhåbentlig tilvejebringelse af information til generering af mekanistiske hypoteser for observerede terapeutiske resultater. Denne protokol kan også tilpasses til fremtidige undersøgelser ved hjælp af forskellige liposomer, undersøge optagelse i andre væv og teste nye forbindelser i forbindelse med fedme og dysmetabolisme eller enhver anden sygdom, hvor nanopartikellevering er en mulig terapeutisk mulighed.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Michael Solga og resten af Flow Cytometry Core-personalet for at levere flowcytometritræning og -tjenester. Forfatterne vil også gerne anerkende Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye og Prasad Srikakulapu for deres hjælp med liposompræparation (SSKD, DKB), vævshøst (MAM, JCG) og flowcytometrifarvning og prøveerhvervelse (AU, PS, CM). Dette arbejde blev støttet af tilskud fra AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 og R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 og T32 HL007284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL syringe | BD | 309659 | |
| 10-mL syringe | BD | 302995 | |
| 25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
| 27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
| Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
| Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
| Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
| Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
| Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
| Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
| Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
| Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
| Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
| Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
| FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
| Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
| Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
| Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
| Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
| Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
| Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
| Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
| Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
| Sonicator | Misonix | XL2020 | |
| T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
| Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
| Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
| ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |
References
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 286 (2015).
- Osinski, V., et al. In vivo liposomal delivery of PPARα/γ dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects. Theranostics. 10 (2), (2020).
- Bauknight, D. K., et al. Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects. PLoS ONE. 14 (11), (2019).
- Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity. BioMed Research International. , (2017).
- He, H., Ghosh, S., Yang, H. Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases. Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).
- Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases. Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).
- Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes. BBA - Biomembranes. , (1994).
- Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).
- Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging. PLoS One. 6 (6), 20594 (2011).
- Larmann, J., et al. In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation. Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).
- Feng, B., et al. Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice. PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).
- Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance. The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).
- Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice. Biomaterials. 110, 81-88 (2016).
- Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues. Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).
- Nakhlband, A., et al. Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective. BioImpacts. , (2018).
- Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment. International Journal of Nanomedicine. , (2018).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. Journal of Cell Biology. , (1986).
- Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2019).
- Dasa, S. S. K., et al. Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer. Theranostics. , (2018).
- Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis. Journal of Clinical Investigation. , (2003).
- Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jirón Tamburini, B. A. Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e58621 (2019).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation research. , (2019).
- O'Brien, C. A., Harris, T. H. ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain. PLoS ONE. , (2020).
