Summary
このプロトコルの目的は、蛍光標識されたリポソームを合成し、フローサイトメトリーを使用して細胞レベルでリポソームのin vivo局在を同定することです。
Abstract
特に標的治療アプローチのために、in vivoで化合物を送達するためにリポソームを使用することへの関心が高まっています。リポソーム製剤に応じて、リポソームは、体内の異なる細胞型によって優先的に取り込まれ得る。これは、さまざまな疾患の進行が組織および細胞型特異的であるため、治療粒子の有効性に影響を与える可能性があります。このプロトコールでは、DSPC、コレステロール、およびPEG-2000 DSPEと脂質色素DiDを蛍光標識として使用して、リポソームを合成および蛍光標識する方法の1つを紹介します。このプロトコルは、in vivoでリポソームを送達し、フローサイトメトリーを使用してリポソームの細胞特異的取り込みを評価するためのアプローチも提示します。このアプローチは、リポソームを取り込む細胞の種類を決定し、細胞型および組織にわたるリポソーム取り込みの分布および割合を定量化するために使用することができる。このプロトコルでは言及されていませんが、免疫蛍光やサイトメーターでのシングルセル蛍光イメージングなどの追加のアッセイは、細胞内染色の評価を可能にするため、得られた所見や結論を強化します。プロトコルは、目的の組織に応じて適合させる必要がある場合もあります。
Introduction
ナノ粒子の薬物送達を利用する治療法の開発への関心が高まるにつれて、粒子の分布と取り込みを調製および評価する方法は、進歩し続け、拡大し、研究コミュニティが利用できるようにする必要があります1,2。このプロトコルは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)-α/γアゴニストであるテサグリタザールを装填したDiD標識リポソームによる治療後にin vivoでリポソームを取り込んだ正確な細胞型を評価するために開発されました3,4。これらの研究では、どの細胞型がリポソームテサグリタザール治療によって直接影響を受けたか、標的部分の有効性を評価し、観察された治療結果を説明する仮説を立てることができました。さらに、様々な細胞種において確立された生物学的機能は、マクロファージ、樹状細胞、および肝臓特異的クッパー細胞などの貪食細胞がリポソームの大部分を占めることを示唆している5,6,7。このプロトコルを利用して、非古典的食細胞もリポソームを取り込むことができることを実証しました3,4。
このプロトコルは、テサグリタザールの可溶化、逆相蒸発によるリポソームの調製、および遠隔薬物ローディングの誘引剤として酢酸カルシウムを使用するための最適化された方法を提示します。提示された方法は、多くのラボでアクセス可能であり、入手が困難な材料や高温を必要とするステップが不足しています。このプロトコルは、in vivo8での循環の増加に最適なサイズのリポソームを生成します。さらに、Suらによって要約されているように、今日まで、インビボリポソーム分布および組織取り込みを評価する方法が詳細に研究および試験されてきた9。陽電子放出断層撮影法(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)、および蛍光分子断層撮影法(FMT)法を適用して、組織特異的な生体分布と取り込みを定量化します9,10,11。これらの方法は、in vivoでの検出を最大化するように最適化されていますが、細胞分解能でin vivoでのリポソーム取り込みを定量化する能力はまだありません。ここで紹介するプロトコルは、フローサイトメトリーを使用してこのニーズを達成することを目的としています。最後に、このプロトコルでは、細胞の取り込みを脂肪組織を含むいくつかの組織に絞り込みました。肥満、代謝異常、および炎症の設定で治療を提供するためにナノ粒子を使用する可能性を調査した文献が増えています12、13、14、15、16、17。そのため、これらの病態に重要な役割を果たす組織の一つである脂肪組織を処理・分析するための効果的な方法を共有することが重要であると考えました。
Protocol
このプロトコルのすべてのステップは、バージニア大学の動物管理および使用委員会によって承認され、ガイドラインに従っています。
注:後の分析ステップで考慮すべきいくつかの重要なコントロールがあり、 それらは表1 に要約されており、リポソーム投与の前に考慮する必要があります。
1. 酢酸カルシウムとテサグリタザールを充填した蛍光標識リポソームの調製
- DSPC(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)、コレステロール、PEG-2000-DSPE、およびDiDを組み合わせます。このために、DSPC、コレステロール、およびPEG-2000 DSPEを2:1:1の質量比で組み合わせます。リポソーム1 mLあたり1 mgのDiDの濃度でDiD脂質色素を添加します(DSPC:DiDのモル比46:1)。
注:DiDは、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'テトラメチルインドカルボシアニン染料の受け入れられた略語です。この製剤で使用されるDSPCと同じ長さの2つのオクタデシル「脂肪テール」を有するので、それは主に脂質膜に取り込まれるべきである。DiO、DiD、DiIなどの脂質色素は、リポソーム研究に日常的に使用されており8 、交換不可能と考えられています18。 - 倒立相エマルジョンおよびリポソーム調製には、20 mLのシンチレーションバイアルを使用します。このバイアルで、脂質の2:1エーテル-クロロホルム溶液を酢酸カルシウム水溶液(Ca-アセテート、1 M、pH 7.4)と混合します。有機相と水相の比率は4:1、例えば、4 mLの有機相と1 mLの水相であるべきです。
- 室温で30秒間超音波処理することにより、脂質のエーテル - クロロホルム溶液を乳化する。超音波処理器を20KHzおよび50%の電力で操作し、1/2インチを使用します。プローブ。
注:泡立ちを避けるために、超音波処理器プローブの先端をバイアルの底に近づけてください。超音波処理中にプローブの先端でガラスに触れないでください、それは壊れる可能性があります。さらに、クロロホルムを共溶媒としてエーテルに添加する必要があります:コレステロールの存在下では、エーテルのみのエマルジョンが急速に分離し、手順のこのステップを不可能にします。 - 均質化された油中水型エマルジョンを含むバイアルを、特別なアダプター、圧力計ゲージ、および圧力調整バルブを備えたロータリーエバポレーターに直ちに置きます。蒸発器は、有機溶媒を除去するために真空ラインに接続する必要があります。回転数を100rpm、真空度を0.5気圧に設定し、乳化起泡が過剰に見える場合は解放します。ゲルが形成されて消えたら、真空を0.9気圧に上げます。
注意: 揮発性有機相の除去中は、バイアルからロータリーエバポレーター本体への内容物の損失につながる可能性があるため、急速な発泡を避けるために、真空レベルを徐々に調整する必要があります。最終的に、エーテルとクロロホルムが部分的に蒸発し、水相と有機溶媒相の体積比が1:1に近づくと、ゲルが形成されます。ゲルが消え、残りの水性媒体が再び完全に液体になるまで蒸発を続ける必要があります。追加の混合は、有機溶媒の除去を加速するのに役立つ場合があります。これは、ポリテトラフルオロエチレン攪拌子を蒸発フラスコに配置して、回転蒸発中の粘性ゲルの対流を高めることによって達成できます。 - 得られたリポソームをトラックエッチングされたポリカーボネート膜を用いて濾過し、均質なサイズ分布を達成する。
- リポソーム水分散液を2本の気密シリンジを備えたリポソーム押出機内の200nm細孔ポリカーボネートフィルターに複数回通すことでろ過を行う。
注:ろ過に十分な圧力の生成を保証するため、より小さなシリンジ(0.5 mLなど)が推奨されます。リポソーム膜中のコレステロール含量が高い場合、高温は必要なく、この手順は室温で行うことができる。奇数の濾過(例えば、21回)が行われ、その結果、得られた物質は最初からフィルターの反対側に行き着き、予め滅菌されている場合は、濾過されたサイズ調整されたリポソームの滅菌サンプルを収集することができる。得られるリポソームのサイズは、典型的には、選択されたフィルター孔径に近い。フィルターを1つではなく2つ積み重ねて、粒子径を小さくするための微調整を行うことができます。 - 動的レーザー光散乱(DLS)3,4を用いてサイズ分布を確認します。
- 1〜3 mLの生理食塩水を、4つの透明な側面を持つ1 cmのキュベットに加えます。これに10〜20μLのリポソームを加え、慎重に混ぜます。サンプルを装置に入れ、測定する次のパラメータを選択します:溶媒粘度、屈折率、脂質の屈折率。[ スタート ]ボタンをクリックします。測定は数分続き、100回以上の実行で構成されます。
- リポソーム水分散液を2本の気密シリンジを備えたリポソーム押出機内の200nm細孔ポリカーボネートフィルターに複数回通すことでろ過を行う。
- 脱塩スピンカラムを使用して外部のCa-アセテートを除去します。バッチの半分に、10 mM HEPESバッファー(pH 7.4)中の水性テサグリタザールを加え、混合しながら37°Cで1時間インキュベートします。バッチの後半を薬物を含まない対照リポソーム製剤として使用する。
注:使用前に、2 mL 脱塩スピンカラムを 10 mM HEPES バッファー、pH 7.4 で事前に平衡化してください。これを行うには、1 mLのHEPESバッファーをカラムに入れ、1000 x g の遠心分離機で2分間回転させます。パススルー バッファーを削除し、これを 4 回繰り返します。 - 2 mLのスピンカラムを使用してリポソームから捕捉されていないテサグリタザールを除去し、捕捉された薬物の濃度を分光光度法で測定します。
- 0.5 mL以下のリポソームサンプルをドライカラムゲルベッドに加え、すべてのサンプルがゲルに入るまで待ちます。先ほどと全く同じ条件で遠心分離(1000 x g、2分)し、低分子量化合物から精製したパススルーでリポソーム試料を回収した。
- 最終的な粒子の特徴を定量化:DLSとゼータ電位を使用して粒子サイズと濃度を、10 mM HEPESバッファーpH 7.4および25°Cで組み合わせたDLS電気泳動光散乱(ELS)システム3,4を使用します。
- ステップ1.5.2と同様に、測定バッファー中のリポソーム分散液(例:緩衝液1 mLあたり10 μLのリポソーム)を、使い捨てルアーシリンジまたはカットチップ付きのピペットを使用してU字型キュベットに希釈します。電流の流れに途切れのない解決策があるように、「U」に気泡がないことを確認してください。
- キュベットをユニットに入れます(電極がユニットに正しく接続されるように、キュベットの前面と背面に注意してください)。計器のドアを閉めます。この後、測定はガイダンスソフトウェアの制御下で(複数回の繰り返しで)行われます。
2. in vivo投与用のリポソームを調製する
- バイオセーフティキャビネット内で、滅菌生理食塩水中のリポソームを、in vivo投与用の最終容量50μLの適切な濃度に希釈します。
注:以前の研究では、私たちのリポソーム製剤には2 mg / mLのテサグリタザールが含まれており、これは約4.89 μmolのテサグリタザール/ mLに相当し、1 μmolの薬物/ kgの用量でリポソームを投与しました。40 gのマウスの場合、生理食塩水中で8.2 μLのリポソームを最終容量50 μLまで持っていきます。DLS/ELSを使用して、薬物およびビヒクルロードリポソームの調製のために単位体積あたりのリポソームの数も定量化して、マウス体重1グラムあたりに同じ数のビヒクルリポソームが薬物ロードリポソームと比較して投与されるようにする必要があります。 - リポソーム溶液をバイオセーフティキャビネット内の27G針にロードします。マウスに冷たい溶液を注入しないように、これを室温に保ちます。
3.眼窩後静脈注射によるリポソームの投与
注:必要に応じて、尾静脈注射などの他の方法で静脈内注射を行うことも適切です。このプロトコルではカバーされていないが、この方法を説明する公開されたプロトコル19 が利用可能である。
- リポソームを送達するためのワークスペースを設定します。
- 作業台を70%エタノールで清掃します。イソフルラン麻酔システムの使用を許可するスペースを選択してください。
- ウォーミングパッドをオンにし、その上に清潔なパッドまたはタオルを置き、マウスをきれいな面に置きます。マウスでの作業を開始する前に、パッドがウォームアップするのに十分な時間を確保してください。
- チャンバーが近く、ノーズコーンが加温パッドの上になるように麻酔システムをセットアップします。
- システムの他のすべての側面の準備ができていることを確認してください(たとえば、気化器内のイソフルランレベルが十分に高い、チャコールフィルターの計量が完了している、チューブが正しく接続されている)。
- プロトコルのこのセクションに必要な他の材料を収集します:眼科用潤滑剤ゲル、投与後治療用の局所麻酔薬、滅菌ガーゼパッド。
- 誘導チャンバー内でイソフルランを使用してマウスを鎮静させる。軽くたたいても反応しなくなったら、ノーズコーンを通して鎮静を維持しながら、マウスをワークスペースにすばやく移します。
注:動物は1.5%から2.5%のイソフルランに維持され、手順を進める前に(つま先のつまみに対する反応の欠如を介して)適切な麻酔の深さについて評価されるべきです。. - リポソーム投与のためにマウスを片側に移す。麻酔中はマウスがまばたきしないため、少量の眼科用潤滑剤を両目に塗布して、残りの手順の間、マウスを保湿します。
- 露出した目の上下の皮膚をそっと押し下げます。目は顔の平面より上に持ち上がるはずです。
- 針の先端を内側眼瞼に慎重に挿入し、針が目の下にあり、触れていないことを確認します。針が眼の下に挿入されたら、リポソームをゆっくりと眼窩後腔に注入します。針を引き抜くと、止血を達成するために数秒間まぶたを閉じる必要があるかもしれません。
- 針が十分に挿入されていないと、溶液が目の周りに現れることがあります。これが見られた場合はすぐに注射を中止し、針の位置を変えてください。
- プロパラカインなどの局所麻酔薬を目に塗布して、処置後の痛みや不快感を防ぎます。
- マウスを加温パッドの上に置き、目覚めるまで監視して、マウスが正常で適切な体温を維持していることを確認します。
- 目的の時点が到着するまで、マウスをケージと通常の収容環境に戻します。
注意: これは、地域のIACUCガイドラインに沿って行う必要があります。
4. 組織採取、組織処理、フローサイトメトリー染色のための材料の準備
- 採取、処理、および染色のための溶液を調製します(セクション5〜5):リン酸緩衝生理食塩水(PBS)-ヘパリン、HEPESバッファー、2 mg / mLコラゲナーゼタイプI、AKC溶解バッファー、FACSバッファー、PBS、固定バッファー(表2)。手順中は、固定バッファーを除くすべての溶液を4°Cまたは氷上に保管してください。
- 組織を収穫および処理するためのバッファーおよびその他の材料を含むチューブを準備します。
- 各マウスの血液については、採血用の1.5 mLまたは1.7 mLマイクロ遠心チューブに10 μLの0.5 M EDTAを加えます。EDTAは血液の凝固を防ぎます。25 Gの針と15 mLの円錐管を備えた1 mLのシリンジも必要です。
- 脾臓の場合は、1 mLのHEPESバッファーを含む1.5または1.7 mLのマイクロ遠心チューブ1本、1 mLのシリンジ、2本の50 mLコニカルチューブ、および2本の70 μmフィルターを脾臓ごとに集めます。
- 各脂肪組織デポーについて、組織をミンチするための1.5 mLのHEPESバッファーを含む20 mLのポリエチレンバイアル、50 mLのコニカルチューブ、およびマウスごとの脂肪組織タイプごとに70 μmのフィルターを集めます。
- 収穫のためにワークスペースを準備します。
- 70%エタノールでベンチスペースをきれいにします。収穫中にマウスを70%エタノールで取り除き、吸収パッドまたはペーパータオルで覆って、マウスを固定するためのゴムトレイを準備します。少なくとも5つのピンが使用できることを確認してください。
- 10 mLシリンジにPBS-ヘパリンを満たし、灌流のために25 Gの針に固定します。
- 収穫時に使用する道具や材料を集めます。鉗子(2組)、はさみ、ペーパータオル、糸くずの出ないワイプ、EDTAを含むマイクロ遠心チューブ、HEPESバッファーを含むマイクロ遠心チューブ、およびHEPESバッファーを含むポリエチレンバイアルが必要です。
5.組織を収穫します
- CO2窒息によりマウスを安楽死させる。頸部脱臼は、後のステップで効果的な採血と組織灌流を妨げる可能性があるため、行わないでください。
- マウスがよく見える十分な作業スペースと照明を備えた清潔なベンチエリアに、ゴム製の解剖トレイ、サンプルを保管するための氷の入ったバケツ、70%エタノールが入ったスプレーボトルを設置します。マウスに70%エタノールをスプレーして、汚染を減らし、髪の広がりを制御します。マウスをゴム製のトレイに仰向けに置き、体から離れて広げた足を固定します。
- 採血の準備をするために、マウスの胸郭の尾端の端にある皮膚を慎重に切開します。胸筋が露出するまで、マウスの頭に向かって小さな直線(約1 cm)を切ります。
- 最初の切開部位で、頭に向かって線に垂直に2つの小さな切り込みを入れます。次に、露出した部分の胸郭の片側にある胸筋を慎重に切り取ります。これにより、針を挿入する場所へのアクセスと視覚化が向上します。
- 採血するには、筋肉を取り除いた側の3番目と4番目の肋骨の間に針を挿入します。マウスの心臓は胸腔の中心にあるため、針を胸郭の中心線にできるだけ近づけてください。挿入したら、シリンジをそっと引き上げて採血を開始します。
- 採取したら、EDTAで準備した微量遠心チューブに血液を移し、氷上で保存します。
注意: 約100μLの容量を引き上げて注射器に血液が入らない場合は、針の開口部が心臓の壁に押し付けられている場合に備えて、注射器を右または左に回転させてみてください。これで解決しない場合は、針をゆっくりと胸腔内に動かすか、取り外し始めます。この時点で血液がシリンジに集まり始めたら、シリンジをゆっくりと引き戻し続けます。抜歯を成功させるために、シリンジと針を回転させることを検討してください。最後に、採血がない場合は、心臓を逃した可能性があるため、針を外します。針を再度挿入し、前述のプロセスをもう一度繰り返してみてください。
- 次に、マウスを灌流するには、胸腔を開いて心臓にアクセスします。
- これを行うには、胸郭の端に沿って両側のマウス側まで皮膚を切り取ります。次に、鉗子を使用して胸骨を作業面から離して持ち上げます。胸骨の端のすぐ下に小さく浅い切開を行い、腹腔を切り取ります。マウスの両側の胸郭の端に沿って腹膜に沿って切断します。これは肝臓と胆嚢を露出させるはずです。これらの組織のいずれかに切り込まないように注意してください。
- 次に、横隔膜に小さく浅い切り込みを入れ、肝臓に頭蓋にします。次に、胸郭の端に沿って横隔膜を切断して胸腔を開きます。胸腔内の臓器を切らないようにしてください。
- 胸郭に沿って、マウスの中心線から約2〜3 mm、長さ約0.75 cmの頭に向かって2つの切り込みを入れます。
注意: 切り上げすぎると、胸郭の上部にある動脈が切断されます。これは灌流の有効性を妨げるでしょう。 - 胸郭の中央部分を持ち上げて胸腔を露出させます。脂肪や組織を移動して心臓にアクセスします。
- マウスの心臓の右心房に小さな切り込みを入れて、血液を押し出すための開口部を作ります。
- PBS-ヘパリンの10 mLシリンジを使用して、マウスの心臓の左心室に針を挿入します。
- PBSをできるだけゆっくりと心臓に押し込み始めます。
注:血液は右心房から出て胸腔を満たすのを観察する必要があります。心臓から大動脈を通るPBS-ヘパリンの流れを阻害しないように、心臓を生理学的位置に保つようにしてください。 - 10 mLのPBS-ヘパリンをすべてマウスに灌流したら、シリンジと針を廃棄し、ペーパータオルまたは糸くずの出ないワイプを使用して胸腔から余分な血液とPBS-ヘパリンを取り除きます。
- 次に、組織の抽出を開始するには、マウスの尾に向かって皮膚と腹膜を切り取り、腹腔を開きます。
- まず、マウスの両側から鼠径脂肪組織パッドを抽出する。
注:このプロセスを注意深く読んでください:結果で脂肪組織の細胞構成を歪めないように、各デポから鼠径リンパ節を抽出するようにしてください。- 2セット目の鉗子を使用して、1セットの鉗子で腹膜を保持し、その側の膜の上に他の鉗子で皮膚の端を重ねます。皮膚を腹膜からそっと引き離して、これらの層を互いに分離します。皮膚に沿って鼠径脂肪組織デポーを探します。皮膚の外縁をピンで留めて、脂肪貯蔵所にアクセスしやすくします。
- 摘出前に、脂肪デポの中央にある鼠径リンパ節を見つけ、必要に応じて鉗子やハサミを使って摘出します。
注意: 可能であれば、デポの外縁から中心に向かって伸びる3つの大きな動脈を見つけます。リンパ節は、これらの動脈が出会う場所の周りにあります。 - リンパ節が除去された後、鉗子で固定されたポイントに最も近い脂肪デポーの端を注意深く持ち、脂肪組織と皮膚の間の結合膜に小さな切り込みを入れ始めます。切り込みを入れながら脂肪組織を皮膚から持ち上げて、膜にアクセスしやすくし、デポー全体が確実に抽出されるようにします。
- 脂肪デポーを氷上でHEPESバッファーを含む準備されたポリエチレンバイアルに入れて、残りの収穫中に組織を生存可能に保ちます。
- マウスの反対側でこのプロセスを繰り返して、両方のデポを抽出します。デポは、一緒に、または別々に消化して処理することができます。各デポを個別に処理する場合は、さらにチューブを準備する必要があります。
- 次に、腹腔の尾端から精巣上体脂肪デポーを抽出する。鉗子を使用して、マウスの背側端から最初の精巣上体脂肪デポーをそっと引っ張り、このデポに付着している精巣上体と輸精管を見つけます。
注:精巣上体脂肪デポは2つあります:各精巣上体と輸精管に1つずつ取り付けられています。- 脂肪デポーと精巣上体および精管の間を注意深く切断して、脂肪をこれらの他の組織から分離します。脂肪デポーを氷の上のHEPESバッファーを含むポリエチレンバイアルに入れて、残りの収穫の間、組織を生存可能に保ちます。
- 最後に、横隔膜近くの胃の左側にある脾臓を抽出します。鉗子を使用して、腹腔の中心に向かって胃をそっと引っ張り、脾臓を露出させます。
- 脾臓の一方の端をそっと持ち、胃から少し引き離します。臓器が剥離するまで脾臓とその隣接組織の間の膜を切断します。HEPESバッファーを備えた準備したマイクロ遠心チューブに脾臓を入れ、氷上で保管します。
- 次のマウスから組織を処理したり、組織を採取したりする前に、枝肉と汚れたペーパータオルまたはパッドを廃棄します。ツールも拭き取ります。
注意: 複数のマウスがいる場合は、次の処理ステップに進む前に、マウスごとにこれらの収穫ステップを繰り返します。対照マウス/マウスが含まれる場合は、汚染を避けるために、リポソーム処理マウスの前にこれらを採取することを検討してください。
6.プロセス組織
注:脂肪組織は消化インキュベーションが長いため、最初にそのプロセスから始めて、消化期間中に血液と脾臓の処理に取り組むことをお勧めします。
- まず、脂肪組織をひき肉にして消化します。1対または2対のはさみを使用して、組織がサイズが0.5 mm未満の小片になるまで、各ポリエチレンバイアルで脂肪組織を細かく刻みます。これにより、より効率的な消化が可能になります。
- すべてのバイアル内の組織を細かく刻んだら、各バイアルに1.5 mLの2 mg/mLコラゲナーゼバッファーを追加します。バイアルを37°Cおよび150rpmに設定した振とうインキュベーターに入れます。30〜45分間インキュベートします。
注:脂肪組織が特に大きい場合は、組織が完全に水没し、十分な酵素が存在することを確認するために、さらに0.5 mLから1.5 mLのHEPESバッファーと等量のコラゲナーゼバッファーをバイアルに追加することを検討してください。消化時のコラゲナーゼタイプIの最終濃度は、最終溶液量に関係なく1 mg / mLである必要があります。さらに、振とうインキュベーターが利用できない場合は、サンプルを37°Cに加熱したウォーターバスに入れることができます。 5分ごとにサンプルを穏やかに振って、消化を混合して再懸濁します。 - 30分でサンプルを確認してください。1 mLピペットを使用して、サンプルを上下にピペッティングします。それでも組織片が大きすぎてピペッティングができない場合は、サンプルをさらに15分間インキュベーターに戻します。
- サンプルが完全に消化されたら、サンプルをさらに10回上下にピペッティングして、単一細胞懸濁液が作成されたことを確認します。
注:(オプション)30分でサンプルを確認してください。1 mLピペットを使用して、サンプルを上下にピペで移動します。それでも組織片が大きすぎてピペッティングができない場合は、サンプルをさらに15分間インキュベーターに戻します。 - 細胞懸濁液を70 μmフィルターを通して50 mLのコニカルチューブにピペットします。5 mLのFACSバッファーを空の消化バイアルに加えて、バイアルを洗い流します。この洗浄バッファーをフィルターに移し、細胞懸濁液に加えます。
- 他のサンプルが処理されている間、サンプルを氷上に保管します。すべてのサンプルをろ過したら、400 x g、4°Cで5分間スピンダウンします。
- 吸引によって脂肪細胞上清を除去し、次に吸引によって脂肪細胞上清とペレットの間のインフラナタントを注意深く除去して、間質血管画分(SVF)ペレットを残します。
- このペレットを1 mLのFACSバッファーに再懸濁し、清潔な1.5または1.7 mLの微量遠心チューブに移します。必要に応じて、細胞を今すぐアリコートします。すべてのサンプルがフローサイトメトリー染色の準備が整うまで、氷上に保管してください。
注:消化された脂肪デポが大きい場合は、フローサイトメトリー染色と分析にサンプルの50%または25%のみを使用することを検討してください。さらに、フローサイトメトリー分析用の蛍光マイナス1(FMO)コントロールまたは追加のコントロール(表1)が必要な場合は、処理のために余分なサンプルを別のチューブに分注してください。FMOは、実験で利用される完全なパネル内で、個々の蛍光色素標識抗体の陰性シグナルと陽性シグナルを区別するために使用されます。
- すべてのバイアル内の組織を細かく刻んだら、各バイアルに1.5 mLの2 mg/mLコラゲナーゼバッファーを追加します。バイアルを37°Cおよび150rpmに設定した振とうインキュベーターに入れます。30〜45分間インキュベートします。
- 第二に、血液を処理します。
- 50 μLの血液を15 mLのコニカルチューブに移します。
- 各チューブに 1 mL の AKC 溶解バッファーを加え、上下にピペットで移動して単一細胞懸濁液に到達させます。各チューブにさらに4 mLのAKC溶解バッファーを加え、5〜10分間インキュベートします。シェーカーまたはローテーターが利用可能な場合は、チューブキャップをしっかりと密閉し、チューブをこれらのいずれかに配置して、混合を強化します。
- 5 mLのFACSバッファーを加えて溶解プロセスをクエンチし、サンプルを400 x g、4°Cで5分間回転させます。上清を取り除き、ペレットを確認します。それでもかなり赤い場合は、溶解プロセスを繰り返します。それ以外の場合は、ペレットを1 mLのFACSバッファーに再懸濁し、清潔な1.5または1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。すべてのサンプルがフローサイトメトリー染色の準備が整うまで、氷上に保管してください。
- 最後に、脾臓を処理します。脾臓を50 mLコニカルチューブ上の70 μmフィルターに移します。1 mLのFACSバッファーで組織を洗浄し、1 mLシリンジのプランジャーエンドを使用してフィルターを通して脾臓をマッシュします。マッシングプロセス全体を通して、より多くのFACSバッファーを使用して細胞を50 mLコニカルチューブに洗浄します。円錐管の最終容量は10 mLです。
- 細胞を300 x g 、4°Cで5分間回転させます。上清を除去し、1 mLのAKC溶解バッファーに再懸濁します。さらに4 mLのAKC溶解バッファーを加え、5分間インキュベートします。5 mLのFACSバッファーを加えて溶解プロセスをクエンチし、サンプルを300 x gで4°Cで5分間回転させます。
- 上清を除去し、ペレットを1 mLのFACSバッファーに再懸濁します。懸濁液を2番目の清浄な70 μmフィルターを通して50 mLのコニカルチューブに移します。4 mLのFACSバッファーを加えて元のチューブを洗い流し、バッファーをフィルターに移して最終容量5 mLにします。
- 50 μLの細胞懸濁液を清潔な1.5または1.7 mLマイクロ遠心チューブに移し、すべてのサンプルがフローサイトメトリー染色の準備が整うまで氷上に保ちます。追加のアリコートは、さらに必要または必要な場合はチューブに移すことができます。
注:脾細胞は、生/死の単一染色に使用するのに優れた細胞です。このコントロールに追加のアリコートを転送することを検討してください。
7. フローサイトメトリーのために組織から細胞を染色する
- 分注したサンプルを400 x g、4°Cで5分間スピンダウンします。
- 上清を除去し、サンプルを50 μLのFcブロック(希釈)に再懸濁します(表2)。氷上で5分間インキュベートします。
- 各サンプルに50 μLの2x抗体ミックス(表3)を加えます。暗闇の中で氷の上で20分間インキュベートします。
注:単一の染色剤は、この抗体ミックスで染色しないでください。さらに、FMOを使用する場合は、FMO抗体ミックスを別途調製する必要があります。 - サンプルを1 mLのPBSで洗浄し、400 x g、4°Cで5分間回転させます。上清を除去し、サンプルを200 μLの生存率染色液に再懸濁します(表3)。暗闇の中で氷の上で20分間インキュベートします。
注:このステップでは、Live/Deadシングル染色用に取っておいた細胞を染色することを忘れないでください。 - サンプルを1 mLのFACSバッファーで洗浄し、400 x g、4°Cで5分間スピンします。上清を除去し、サンプル(生/死の単一染色を除く)を50 μLの固定培地(試薬A)に再懸濁してサンプルを固定します。室温で暗所で15分間インキュベートします。
- 生/死の単一染色を100 μLの2%PFAに再懸濁します。室温で暗所で5分間インキュベートします。
- サンプルを1 mLのFACSバッファーで洗浄し、800 x g、4°Cで5分間スピンします。上清を除去し、サンプルを250〜500 μLのFACSバッファーに再懸濁します。サンプルをフローサイトメーターで分析できるようになるまで、4°Cで保存してください。
- サンプルを1 mLのFACSバッファーで洗浄し、800 x g、4°Cで5分間スピンします。上清を除去し、サンプルを50 μLの透過処理培地(試薬B)と細胞内タンパク質に対する抗体に再懸濁します。室温で暗所で20分間インキュベートします。
- サンプルを1 mLのFACSバッファーで洗浄し、800 x g で4°Cで5分間スピンします。上清を除去し、サンプルを100 μLの2%パラホルムアルデヒド(PFA)に再懸濁します。室温で暗所で5分間インキュベートします。
- サンプルを1 mLのFACSバッファーで洗浄し、800 x g、4°Cで5分間スピンします。上清を除去し、サンプルを250〜500 μLのFACSバッファーに再懸濁します。サンプルをフローサイトメーターで分析できるようになるまで、4°Cで保存してください。
Representative Results
リポソーム生産
ここで発表された結果は、以前に公開された研究3,4,20の結果と同様です。ここで提示したプロトコルを利用することで、約150〜160 nmのリポソームが作製できると期待しています。DLSは、163.2 nmの平均リポソーム直径と-19.2 mVのゼータ電位を明らかにします(図1A)。極低温電子顕微鏡(クライオEM)イメージングは円形リポソームを明らかにし(図1B)、DLS図は平均直径からの比較的小さな標準偏差を明らかにします(図1C)。
リポソーム結合の陽性にはPBS処理コントロールが必要
このプロトコルを採用した私たちのグループの以前の研究では、脂肪SVF、脾臓、および血液中のどの細胞サブセットがin vivo投与の1週間後にリポソームに結合したかを調査しました3,4。PBS処理マウスを用いて、腹腔および脾臓細胞を、リポソーム処理マウスからのサンプルに用いたのと同じ抗体パネルで染色した。組織は、1週間の処理後に採取した(図2A)。PBS処理マウスからのサンプルは、正のDiDゲートを作成するためのDiD FMOとして機能しました(図2B、C)。正のゲートはDiD陽性の信号を使用して作成できますが、DiD信号を欠くサンプルを使用して、正のゲートにDiD陰性のサンプルが含まれていないことを確認する必要もあります。
蛍光シグナルを最適化するには滴定が必要
完全な実験を実行する前に、細胞染色中に使用される蛍光標識抗体の濃度やリポソーム調製中に使用される脂質色素の濃度など、さまざまな条件を最適化する必要があります。フローサイトメーターは蛍光強度の検出に上限があるため、リポソームに組み込まれた色素が多すぎると、サイトメーターを通過するサンプルのDiDシグナルのレベルが定量化できなくなります。さらに、リポソーム内のDiDが多すぎると、高レベルの非特異的色素移動につながる可能性があり、細胞の取り込み結果が歪む可能性があります。図3は、使用したフローサイトメーターの検出範囲内で最適なシグナルを生成する濃度を特定するために脂質色素の濃度を滴定した実験の結果を報告しています。これは、最終実験の対象組織である血液(図3A)、鼠径脂肪SVF(図3B)、および精巣上体脂肪SVF(図3C)で実施されました。試験用に選択された濃度は、リポソーム1mLあたり10mgのDiD(高、赤)、1mgのDiD(中、青)、または0.1mgのDiD(低、灰色)であった。リポソームに使用された最高濃度は高すぎ、3つの組織すべてでサイトメーターの定量可能範囲を超えました(図3A\u2012C、赤)。DiDの最低濃度は何らかのシグナルを示したが(図3 A\u2012C、灰色)、PBS処理細胞(図3A-u2012C、黒)を超える明確な集団は観察されなかった。定量すると、各組織および濃度のDiD MFIの算術平均は、PBSコントロールとDiDの中間濃度との間の明確な区別を示した(図3D)。したがって、プロトコルに示されているように、リポソーム調製に使用する中間濃度(図3、青色)を選択しました。
多抗体パネルを使用することで、異なる細胞サブセットによるリポソーム取り込みの同定が可能
表3に概説したパネルを用いて、細胞を、マクロファージ、B細胞、T細胞、樹状細胞、単球、および内皮細胞に対するマーカーに対する抗体で染色した(図4)。組織タイプごとにわずかに異なるゲーティング戦略が必要ですが、同じ細胞タイプのほとんどをそれぞれで識別できます。いくつかの例外には、通常血液中に見られない内皮細胞、および通常他の組織よりも血中で高い頻度にある単球が含まれます。集団が特定されると、各細胞集団の合計サイズとそれらがDiD+である頻度を定量化できます。DiD+集団を特徴付けるために、さらなる計算を実行することができます:DiD+細胞の何パーセントがマクロファージ、内皮細胞などであるか。これらはゲーティング戦略の例ですが、サンプルを分析する唯一の方法ではないことに注意してください。分析は、選択したパネルと利用可能なフローサイトメーターによって決定されます。
図1:調製したリポソームの特性例。
(A)サイズとゼータ電位は上記のように測定され、表形式で報告されています。各パラメータは、平均±標準偏差として表されます。 (B) クライオEMを用いて調製したリポソームを画像化した。白いスケールバーの長さは50nmです。(c)DLSを用いて、この調製におけるリポソームの直径のヒストグラムを生成した。この図はOsinskiら3から改作されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PBSまたはリポソーム処理マウスからの代表的なDiD染色。
(A)PBSおよびリポソーム処理の実験概略図。PBSまたはリポソームを1週間かけて3回注射した。組織は治療の8日目に採取された。(B、C)代表的なフロープロットは、リポソーム処理(C)マウスでは陽性のDiD染色を示していますが、PBS処理(B)マウスでは陽性ではありません。FSC、前方散乱。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:リポソーム中のDiDの滴定。
3つの異なる濃度のDiDを用いてリポソームを調製し、マウスに注射した。灰色はリポソーム1 mLあたり0.1 mg DiDの低濃度を示し、青は1 mg DiD/mLリポソームの中間濃度を示し、赤は10 mg DiD/mLリポソームでの高濃度を示す。PBS処理マウスを陰性対照(黒)として用いた。血液(A、円)、鼠径脂肪(B、三角)、および精巣上体脂肪(C、四角)を注射後24時間で採取し、処理して単一細胞懸濁液を単離した。これらのサンプルを、検出可能なDiDのレベルまでフローサイトメーターで実行した。各治療群のオーバーレイを含む組織特異的ヒストグラムを提示して、濃度あたりの蛍光強度(A-u2012C)を示します。DiDの算術平均も組織及び濃度ごとに定量し、プロットした(D)。SSC = 側方散乱。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:脂肪SVF、血液、および脾臓における細胞サブセットの代表的なフローサイトメトリー分析。
(A\u2012C)脂肪SVF(A)、脾臓(B)、および血液(C)中の細胞サブセットおよびDiD+細胞を同定するためのゲーティング戦略の概略表。略語:FSC =前方散乱;LD =生きている/死んでいる。L-DC =リンパ系樹状細胞;M-DC =骨髄性樹状細胞;SSC = 側方散乱。この図はOsinskiら3から改作されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| コントロール | 目的 |
| PBSまたは生理食塩水で治療したマウス | このマウスの細胞を以下のフローサイトメトリーコントロールに使用します。 |
| 1. 染色されていない細胞 | |
| 2. 生きている/死んだ単一の汚れ | |
| 3. フルパネルで染色されたが、分析中に陽性のリポソームシグナルを決定するためのリポソーム蛍光を欠いている細胞 | |
| これ/これらのマウス/マウスは、実験で非リポソームコントロールがあるため、リポソームがin vivoで効果があるかどうかを判断するためにも使用されます。 | |
| アンロードされたリポソーム | リポソームに化合物を装填する場合は、リポソームバッチの一部を化合物なしで合成する必要があります。これは、リポソーム単独の任意のインビボ効果を説明する。 |
| DiD 単独 | DiDは細胞膜にも取り込まれる可能性があるため、一部のマウスにリポソームに見られる量と同じ量の遊離色素を投与するように割り当てると、バックグラウンド膜染色を説明するのに役立ちます。 |
| 蛍光マイナス1(FMO)コントロール | これらは、パネル内の1つを除くすべての抗体で染色された細胞です。上のボックスの#3と同様に、これは分析中にその抗体の真陽性シグナルを決定するのに役立ちます |
表 1: このプロトコルで使用するコントロール。
| 解決 | コンポーネント | バッチ/マウスごとに必要なおおよその量 |
| リポソーム製剤 | ||
| 酢酸カルシウム | H2O中の1 M酢酸カルシウム | 50ミリリットル |
| ヘペスバッファー | H 2 O、pH7.4中の10 mM HEPES | 50ミリリットル |
| ヘペスのテサグリタザール | 10 mM ヘペスで | 10ミリリットル |
| 組織の採取、処理、染色 | ||
| リン酸緩衝溶液(PBS) | 蒸留H2O中137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mMKH2PO4 | 2ミリリットル |
| PBS-ヘパリン | PBS中の0.1 mMヘパリン | 10ミリリットル |
| ヘペスバッファー | PBS中の20 mM HEPES | 5ミリリットル |
| 消化バッファー | 2 mg/mL コラゲナーゼ タイプ I (HEPES バッファー中) | 5ミリリットル |
| AKC 溶解バッファー | 0.158 M NH 3 Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na 2 EDTA 中 ddH 2 O, pH7.2 | 15ミリリットル |
| FACS バッファ | PBS中の1%BSA、0.05%NaN3 | 15ミリリットル |
| Fcブロック(希釈) | FACS バッファ内の 1:50 Fc ブロック | 250 μL |
| 固定バッファー | PBS中の2%パラホルムアルデヒド | 200 μL |
表2:準備するソリューション。
| ある | B | C | D |
| 細胞外染色(2x抗体ミックス) | |||
| 抗原 | フルオロフォア | 100 μLテストあたりのAb容量 | 必要な総量: |
| CD45 | パーCP | 0.5 μL | 列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数 |
| CD11b | パーCP Cy5.5 | 0.25 μL | (0.5 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル) |
| F4/80 キー | PE Cy7 | 0.25 μL | (0.25 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル) |
| CD19 | PE-CF594 | 1 μL | (0.25 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル) |
| CD3 | ティッカー | 1 μL | (1.0 μL/テスト) x (1.2) x (# サンプル) |
| CD31 | BV605 | 0.25 μL | 等。。。 |
| CD11c | APC ef780 | 1 μL | |
| CD115 | ティッカー | 1.5 μL | |
| 抗体ミックスを作成するには、カラムDで計算した抗体をFACSバッファーまたはブリリアントバイオレット染色バッファー*と組み合わせて、最終容量(50 μL x 1.2 x 合計#サンプル)にします。 | |||
| ライブ/デッド染色 (1x) | |||
| ライブ/デッド | フルオロフォア | 200 uLテストあたりのL / Dボリューム | 必要な総量: |
| ライブ/デッド | アクア | 0.67 μL | 列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数 |
| 細胞内染色 (1x) | |||
| 抗原 | フルオロフォア | 50 μLテストあたりのAb容量 | 必要な総量: |
| αSMA | ティッカー | 0.125 | 列 C x 1.2 x 合計 # サンプル数 |
| *ブリリアントバイオレット染色バッファーは、ブリリアントバイオレット蛍光色素に結合した複数の抗体をパネルで使用する場合に使用してください。 | |||
表3:フロー染色に使用する抗体パネルの例と染色ミックスの計算。
Discussion
ここでは、(i)蛍光脂質色素で標識され、抗糖尿病化合物テサグリタザールを装填したリポソームを調製し、(ii)眼窩逆注射を介してマウスにリポソームを投与し、(iii)フローサイトメトリーによって細胞レベルでリポソームの取り込みを検出するための組織の採取、処理、および染色の3つの部分からなるプロトコルについて説明します。このプロトコルでは、約150μmのリポソームの調製と、脂肪、血液、および脾臓への取り込みの評価を確認します。リポソーム調製はスケーラブルで、主に室温で実行され、逆相蒸発を利用して薬物の負荷と有機溶媒の除去を最大化します。このプロトコルを使用すると、精製リポソームサンプルで最大2 mg/mLのテサグリタザール濃度を達成できます。調製したリポソームは、HEPESバッファーに4°Cで1年以上保存できます。私たちの経験では、彼らは平均粒子サイズの最小限の変動を示しました。薬物含量損失の10%未満は、10kDa遠心フィルターで外用薬物からリポソームを限外濾過分離した後、分光光度法で実証された。
リポソームの調製中、考慮すべきいくつかの重要なステップと要因があります。まず、プロトコルステップの順序は重要であり、遵守する必要があります。第二に、テサグリタザールの負荷時に使用される溶液のpHは、溶解度と効果的な負荷を最大化するために7.4に維持する必要があります。第三に、機器とフィルターを適切に組み立てることで、各ステップの出力が適切なサイズと純度になります。例えば、100 nmおよび200 nmのフィルターが適切に組み立てられていない場合、より不均一で不適切なサイズのリポソームのバッチが生じる可能性があります。第四に、リポソームへのテサグリタザールの移動を最大化するには、薬物ローディングの前に酢酸Caを完全に除去する必要があります。Ca-アセテートの完全な除去をテストするには、高速沈降を使用してリポソームを除去し、非リポソーム溶液中のCa-アセテートレベルを測定します。第五に、各ステップでリポソーム調製物に添加されたすべての材料の質量を秤量して記録することが重要です。これにより、適切な濃度が計算され、必要な材料の比率が維持されます。最後に、手法が適切に実行されない場合、望ましくないレベルの異質性が存在する可能性があります。DLSや電子顕微鏡などの他のアプローチを使用して、このパラメータを徹底的に確認することが重要です。均質性を向上させるには、選択したフィルターサイズを調整するか、2つのフィルターを積み重ねることを検討してください。
さらに、このプロトコルを完全に実施する前に、フローサイトメトリー用のコントロールと抗体パネルを計画および最適化することが重要です(表1、 表3)。抗体は、染色に適切な濃度が使用され、蛍光色素間のオーバーラップが最小限であることを確認するために試験する必要があります。リポソーム調製中に使用される色素の励起と放出も、パネル計画に考慮する必要があります。私たちの結果では、アロフィコシアニン(APC)やAlexaFluor 647などの蛍光色素と同様の励起と発光を持つDiDを利用しました。したがって、抗体パネルでは、これらの蛍光色素に結合した抗体を選択しませんでした。さらに、アイソタイプコントロールはこのプロトコルに含まれていません。これは、このプロトコル用に選択された抗体が十分に検証された市販の抗体であるためです。ただし、以前に最適化されていない抗体の使用に関心がある場合は、完全な実験を行う前に、目的の組織のアイソタイプコントロールに対して抗体をテストすることを検討してください。
このプロトコルは、マウスの後処理から血液、脾臓、鼠径脂肪、および精巣上体脂肪組織を抽出して処理する方法を示していますが、この一般的なアプローチは他の組織にも適用できます。目的の組織に応じて、次の組織について公開されているように処理および消化プロトコルを変更する必要がある場合があります:肺21、肝臓22、腹腔3、骨髄3,23、脳24。
考慮すべきこの方法の重要な制限は、摂取が動物ごとに1つの時点でしか評価できないことです。したがって、このプロトコルを他の非侵襲的イメージング技術と組み合わせるか、評価を実施するための十分なリソースを確保するためにそれに応じて計画することが有利な場合があります。リポソームは最初の24時間で全身を循環し、リポソームを取り込む細胞の寿命や取り込みに対する反応によっては、細胞死やさらなる食作用が起こる可能性があります。私たちの以前の研究は、異なる時点でのDiD+ 集団の集団特性の変化を示しました3。そのため、より早い時点または関心のあるメカニズムの生物学に最も関連する時点での取り込みを評価することが重要です。さらに、このプロトコルでは組織全体の細胞取り込みの定量化を行うことができますが、フローサイトメトリーでは組織の局在を明らかにすることはできません。このアプローチを組織学的手法と組み合わせると、この制限に対処するのに役立ちます。
一般に、このプロトコルは、組織学や全身蛍光イメージングなどの既存の方法論を補完します。フローサイトメトリーのツールと方法の継続的な進歩により、より多くの特異的な細胞集団に対するより大きなパネルの開発が可能になります。このプロトコルは、細胞取り込みの評価を改善し、フローサイトメトリーによって観察された結果を検証する機会も提供するため、前述の方法に加えて使用することを提案します。例えば、脂肪組織中の粒子の大部分がフローサイトメトリーによってマクロファージによって取り込まれたことがわかった場合。同じ脂肪組織の追加のアリコートの免疫蛍光を保存、固定、切片化、およびマクロファージマーカー用に染色して、細胞型が実際にリポソームを取り込むことを確認することができます。このアプローチは、実施されるナノ粒子生体分布アッセイに厳密さを追加するはずです:細胞特異的ターゲティングの検証、細胞取り込みの定量化、オフターゲット取り込みの特定、そしてうまくいけば、観察された治療結果のための機構的仮説を生成するための情報を提供します。このプロトコルは、さまざまなリポソームを使用した将来の研究、他の組織での取り込みの調査、肥満や代謝異常、またはナノ粒子送達が実行可能な治療オプションであるその他の疾患の設定における新しい化合物のテストにも適応できます。
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、フローサイトメトリーのトレーニングとサービスを提供してくれたMichael Solgaと他のフローサイトメトリーコアスタッフに感謝したいと思います。著者らはまた、シヴァ・サイ・クリシュナ・ダーサ、ダスティン・K・ボークナイト、メリッサ・A・マーシャル、ジェームズ・C・ガーメイ、シャンテル・マクスキミング、アディティ・ウパディエ、プラサド・スリカクラプのリポソーム調製(SSKD、DKB)、組織採取(MAM、JCG)、フローサイトメトリー染色とサンプル取得(AU、PS、CM)を支援してくれたことに感謝したい。この研究は、アストラゼネカ、R01HL 136098、R01HL 141123およびR01HL 148109、AHA 16PRE30770007、およびT32 HL007284助成金の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL syringe | BD | 309659 | |
| 10-mL syringe | BD | 302995 | |
| 25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
| 27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
| Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
| Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
| Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
| Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
| Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
| Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
| Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
| Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
| Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
| Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
| FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
| Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
| Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
| Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
| Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
| Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
| Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
| Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
| Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
| Sonicator | Misonix | XL2020 | |
| T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
| Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
| Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
| ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |
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