Summary
Målet med denne protokollen er å syntetisere fluorescerende merkede liposomer og bruke flowcytometri for å identifisere in vivo lokalisering av liposomer på mobilnivå.
Abstract
Det er en økende interesse for å bruke liposomer til å levere forbindelser in vivo, spesielt for målrettede behandlingsmetoder. Avhengig av liposomformuleringen kan liposomer fortrinnsvis tas opp av forskjellige celletyper i kroppen. Dette kan påvirke effekten av den terapeutiske partikkelen da progresjonen av ulike sykdommer er vevs- og celletypespesifikk. I denne protokollen presenterer vi en metode for syntetisering og fluorescerende merking av liposomer ved bruk av DSPC, kolesterol og PEG-2000 DSPE og lipidfargestoffet DiD som fluorescerende etikett. Denne protokollen presenterer også en tilnærming for å levere liposomer in vivo og vurdere cellespesifikt opptak av liposomer ved bruk av flowcytometri. Denne tilnærmingen kan brukes til å bestemme hvilke typer celler som tar opp liposomer og kvantifisere fordelingen og andelen liposomopptak på tvers av celletyper og vev. Selv om det ikke er nevnt i denne protokollen, vil ytterligere analyser som immunfluorescens og encellet fluorescensavbildning på et cytometer styrke eventuelle funn eller konklusjoner som er gjort da de tillater vurdering av intracellulær farging. Protokoller kan også trenge å tilpasses avhengig av vevet (e) av interesse.
Introduction
Etter hvert som interessen for å utvikle terapier som bruker nanopartikler, vokser medisinene, må metodene for å forberede og vurdere partikkelfordeling og opptak fortsette å avansere, utvide og være tilgjengelige for forskningsmiljøet 1,2. Denne protokollen ble utviklet for å vurdere de eksakte celletypene som tok opp liposomer in vivo etter en behandling med DiD-merkede liposomer lastet med tesaglitazar, en peroksisomproliferatoraktivert reseptor (PPAR)-α/γ agonist 3,4. I disse studiene var vi i stand til å vurdere hvilke celletyper som ble direkte påvirket av liposomal tesaglitazarbehandling, effekten av å målrette moieties og generere hypoteser for å forklare behandlingsresultatene vi observerte. Videre antyder etablerte biologiske funksjoner i en rekke celletyper at fagocytiske celler som makrofager, dendrittiske celler og leverspesifikke Kupffer-celler tar opp de fleste liposomene 5,6,7. Ved hjelp av denne protokollen har vi vist at ikke-klassiske fagocytter også kan ta opp liposomer 3,4.
Denne protokollen presenterer en optimalisert metode for oppløseliggjøring av tesaglitazar, fremstilling av liposomer ved omvendt fasefordampning og bruk av kalsiumacetat som et tiltrekkende middel for ekstern legemiddelbelastning. Metodene som presenteres er tilgjengelige for mange laboratorier og mangler vanskelig å skaffe materialer og trinn som krever høye temperaturer. Protokollen produserer liposomer av størrelser som er optimale for økt sirkulasjon in vivo8. Videre, som oppsummert av Su et al., har hittil metoder for å evaluere in vivo liposomfordeling og vevsopptak blitt studert og testet i dybde9. Positronemisjonstomografi (PET), magnetisk resonansavbildning (MRI) og fluorescensmolekylær tomografi (FMT) metoder brukes for å kvantifisere vevsspesifikk biodistribusjon og opptak 9,10,11. Selv om disse metodene er optimalisert for å maksimere deteksjon in vivo, mangler de fortsatt evnen til å kvantifisere liposomopptak in vivo ved cellulær oppløsning. Protokollen som presenteres her tar sikte på å oppnå dette behovet gjennom bruk av flowcytometri. Til slutt, for denne protokollen, ble cellulært opptak innsnevret til noen få vev, inkludert fettvev. Det er en voksende litteratur som undersøker potensialet for bruk av nanopartikler for å levere terapier i forbindelse med fedme, dysmetabolisme og betennelse 12,13,14,15,16,17. Som sådan følte vi det viktig å dele en protokoll med effektive metoder for behandling og analyse av fettvev - et av vevene som spiller en viktig rolle i disse patologiene.
Protocol
Alle trinnene i denne protokollen er godkjent av og følger retningslinjene til Animal Care and Use Committee ved University of Virginia.
MERK: Det er noen viktige kontroller å vurdere for senere analysetrinn, som er oppsummert i tabell 1 og bør vurderes før liposomadministrasjon.
1. Fremstilling av fluorescerende merkede liposomer, lastet med kalsiumacetat og tesaglitazar
- Kombiner DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin), kolesterol, PEG-2000-DSPE og DiD. For dette, kombime DSPC, kolesterol og PEG-2000 DSPE i et masseforhold på 2: 1: 1. Tilsett DiD-lipidfargestoff i en konsentrasjon på 1 mg DiD per 1 ml liposomer (molforholdet 46: 1 DSPC: DiD).
MERK: DiD er en akseptert forkortelse for 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'tetrametylindokarbocyaninfargestoff. Siden den har to oktadecyl "fetthaler" av samme lengde som DSPC som brukes i denne formuleringen, bør den for det meste innlemme i lipidmembranen. Lipidfargestoffer som DiO, DiD og DiI brukes rutinemessig til liposomforskning8 , og de regnes som ikke-utskiftbare18. - Bruk et hetteglass med 20 ml scintillasjon til invertert faseemulsjon og liposompreparering. I dette hetteglasset blandes en 2: 1 eter-kloroformoppløsning av lipider med vandig kalsiumacetat (Ca-acetat, 1 M, pH 7,4). Forholdet mellom organisk og vandig fase bør være 4: 1, for eksempel 4 ml organisk fase og 1 ml vandig fase.
- Emulgerer eter-kloroformoppløsningen av lipider ved sonikering i 30 s ved romtemperatur. Bruk sonikatoren ved 20 KHz og 50% effekt og bruk en 1/2 tommer. sonde.
MERK: Hold spissen av sonatorsonden nærmere bunnen av hetteglasset for å unngå skumdannelse. Ikke rør glasset med sondespissen under sonikering, det kan bryte. I tillegg må kloroform tilsettes eteren som et ko-løsningsmiddel: i nærvær av kolesterol separerer en eter-bare emulsjon raskt, noe som gjør dette trinnet i prosedyren umulig. - Plasser hetteglasset umiddelbart med homogenisert vann-i-olje-emulsjon på en roterende fordamper med en spesiell adapter, manometermåler og en trykkregulatorventil. Fordamperen skal kobles til en vakuumledning for å fjerne de organiske løsningsmidlene. Sett rotasjonshastigheten ved 100 o / min og vakuumet ved 0,5 atm, og slipp ut hvis emulsjonskumming ser overdrevet ut. Etter at en gel dannes og forsvinner, øker du vakuumet til 0,9 atm.
MERK: Under fjerning av flyktig organisk fase bør vakuumnivået justeres gradvis for å unngå rask skumdannelse, da det kan føre til tap av innhold fra hetteglasset inn i rotasjonsfordamperens kropp. Til slutt, når eteren og kloroformen delvis fordamper og volumforholdet mellom vandig og organisk løsningsmiddelfase er nær 1: 1, vil en gel dannes. Fordampning bør fortsette til gelen forsvinner og gjenværende vandige medier er helt flytende igjen. Ytterligere blanding kan bidra til å akselerere fjerning av organiske løsemidler. Dette kan oppnås ved å plassere en polytetrafluoretylenrørestang i fordampningskolben, for å øke konveksjonen av den viskøse gelen under roterende fordampning. - Filtrer de resulterende liposomene ved hjelp av sporetsede polykarbonatmembraner for å oppnå homogen størrelsesfordeling.
- Utfør filtrering ved å føre liposomets vandige dispersjon frem og tilbake flere ganger gjennom et 200 nm-pore polykarbonatfilter i en liposomekstruder utstyrt med to gasstette sprøyter.
MERK: Mindre sprøyter foretrekkes (f.eks. 0,5 ml) da de sikrer generering av tilstrekkelig trykk for filtrering. Med høyt kolesterolinnhold i liposommembranen er det ikke nødvendig med høy temperatur, og prosedyren kan utføres ved romtemperatur. Et merkelig antall filtreringer (f.eks. 21) utføres, slik at det resulterende materialet havner på motsatt side av filteret fra starten, og hvis det steriliseres før, kan den sterile prøven av justerte liposomer med filtrert størrelse samles inn. Størrelsen på de resulterende liposomene er vanligvis nær den valgte filterporestørrelsen. To filtre kan stables (i stedet for ett) for å utføre finjustering for å redusere partikkelstørrelsen. - Bekreft størrelsesfordeling ved hjelp av dynamisk laserlysspredning (DLS)3,4.
- Tilsett 1 til 3 ml saltvann til en 1 cm kyvette med fire gjennomsiktige sider. Til det, tilsett 10\u201220 μL liposomer og bland forsiktig. Plasser prøven i apparatet og velg følgende parametere som skal måles: løsningsmiddelviskositet, brytningsindeks, brytningsindeks for lipider. Klikk på Start-knappen . Målingene vil vare i flere minutter og bestå av 100 eller flere løp.
- Utfør filtrering ved å føre liposomets vandige dispersjon frem og tilbake flere ganger gjennom et 200 nm-pore polykarbonatfilter i en liposomekstruder utstyrt med to gasstette sprøyter.
- Fjern eksternt Ca-acetat ved hjelp av en avsaltingsspinnkolonne. Tilsett vandig tesaglitazar i 10 mM HEPES-buffer (pH 7,4) til halvparten av batchen og inkuber med blanding ved 37 °C i 1 time. Bruk den andre halvdelen av batchen som en stofffri kontrollliposomformulering.
MERK: Forhåndsbalanser 2 ml avsaltingsspinnkolonnen med 10 mM HEPES-buffer, pH 7,4, før bruk. For å gjøre dette, plasser 1 ml HEPES-buffer i kolonnen og spinn i en sentrifuge ved 1000 x g i 2 minutter. Fjern gjennomgangsbufferen og gjenta dette fire ganger. - Fjern tesaglitazar uten innkapsling fra liposomer ved hjelp av en 2 ml spinnkolonne, og bestem konsentrasjonen av innkapslet legemiddel spektrofotometrisk.
- Tilsett ikke mer enn 0,5 ml liposomprøve til den tørre kolonnegelsengen og vent til all prøven kommer inn i gelen. Sentrifuge ved nøyaktig samme forhold som tidligere (1000 x g, 2 min) og samle liposomprøven i gjennomgangen renset fra små molekylmasseforbindelser.
- Kvantifiser endelige partikkelegenskaper: partikkelstørrelse og konsentrasjon ved bruk av DLS og zetapotensial med et kombinert DLS-elektroforerektisk lysspredningssystem (ELS)3,4 i 10 mM HEPES-buffer pH 7,4 og ved 25 °C.
- I likhet med trinn 1.5.2 fortynnes liposomdispersjonen i målebufferen (f.eks. 10 μL liposomer per 1 ml bufferløsning) til en U-formet kyvette ved hjelp av en Luersprøyte til engangsbruk eller en pipette med kuttspiss. Pass på at det ikke er bobler i "U" slik at det er uavbrutt løsning for elektrisk strømstrøm.
- Plasser kyvetten i enheten (vær oppmerksom på forsiden og baksiden av kyvetten, slik at elektroder er riktig koblet til enheten). Lukk instrumentdøren; Etter dette skjer målingen (med flere repetisjoner), under kontroll av veiledningsprogramvaren.
2. Klargjør liposomer for in vivo administrering
- Liposomer i steril saltoppløsning skal fortynnes i et biosikkerhetskabinett til riktig konsentrasjon i et endelig volum på 50 mikrol for in vivo administrering.
MERK: I tidligere studier inneholdt liposompreparatet vårt 2 mg/ml tesaglitazar, som tilsvarer ca. 4,89 μmol tesaglitazar/ml, og vi administrerte liposomer i en dose på 1 μmol medikament/kg. For en 40 g mus ville vi bringe 8,2 μL liposomer opp til et endelig volum på 50 μL i saltvann. Ved bruk av DLS/ELS bør antall liposomer per volumenhet også kvantifiseres for preparater av liposomer lastet med legemidler og kjøretøy for å sikre at et likt antall liposomer administreres per gram musevekt sammenlignet med de legemiddellastede liposomene. - Legg liposomoppløsningen i en 27 G kanyle i biosikkerhetskabinettet. Oppbevar dette ved romtemperatur for å unngå å injisere kald oppløsning i musen.
3. Administrer liposomer via retro-orbital intravenøs injeksjon
MERK: Det er også hensiktsmessig å utføre intravenøs injeksjon ved hjelp av andre metoder, for eksempel haleveneinjeksjoner hvis det er å foretrekke. Selv om det ikke dekkes av denne protokollen, er publiserte protokoller som forklarer denne metoden19 tilgjengelige.
- Konfigurer arbeidsområdet for levering av liposomer.
- Rengjør arbeidsbenken med 70% etanol. Sørg for å velge et sted som tillater bruk av et isoflurananestesisystem.
- Slå på en varmepute og legg en ren pute eller et håndkle over den for å holde musen på en ren overflate. Tillat nok tid til at puten varmes opp før du begynner å jobbe med mus.
- Sett opp anestesisystemet slik at kammeret er i nærheten og nesekeglen er på varmeputen.
- Forsikre deg om at alle andre aspekter av systemet er klare (for eksempel er isoflurannivået høyt nok i fordamperen, kullfilteret er veid, slangen er riktig tilkoblet).
- Samle de andre materialene som trengs for denne delen av protokollen: oftalmisk smøremiddelgel, lokalbedøvelse for behandling etter administrering, sterile gasbindputer.
- Bedøv musen ved hjelp av isofluran i induksjonskammeret. Når den ikke reagerer på et forsiktig fottrykk, overfører du musen raskt til arbeidsområdet mens du opprettholder sedasjon gjennom en nesekjegle.
MERK: Dyret bør opprettholdes på 1,5 % til 2,5 % isofluran og vurderes for en passende anestesidybde (via manglende respons på tåklemme) før prosedyren fortsetter. - Flytt musen til den ene siden for liposomadministrasjon. Fordi musen ikke vil blinke mens den er bedøvet, må du bruke en liten mengde oftalmisk smøremiddel på begge øynene for å holde dem fuktige under resten av prosedyren.
- Trykk forsiktig ned på huden over og under det eksponerte øyet. Øyet skal løfte seg over ansiktsplanet.
- Sett forsiktig spissen av nålen mot den mediale canthus, pass på at nålen er under øyet og ikke berører den. Når nålen er satt inn under øyet, injiser liposomene sakte inn i retro-orbitalrommet. Ved uttak av nålen kan det være nødvendig å lukke øyelokkene i noen sekunder for å oppnå hemostase.
- Hvis nålen ikke stikkes langt nok inn, kan oppløsningen komme opp rundt øyet. Stopp injeksjonen umiddelbart hvis dette sees, og plasser kanylen på nytt.
- Påfør lokalbedøvelse, for eksempel proparakain, til øyet for å forhindre smerte og ubehag etter prosedyren.
- Hold musen på en varmepute og overvåke til den våkner for å sikre at den er godt og opprettholder riktig kroppstemperatur.
- Sett musen tilbake i buret og det normale boligmiljøet til interessepunktet kommer.
MERK: Dette bør gjøres i tråd med lokale IACUC retningslinjer.
4. Forbered materialer for vevshøsting, vevsbehandling og farging av flowcytometri
- Forbered løsninger for høsting, prosessering og farging (seksjon 5\u20127): fosfatbufret saltvann (PBS)-heparin, HEPES-buffer, 2 mg/ml kollagenase type I, AKC lysisbuffer, FACS-buffer, PBS, fikseringsbuffer (tabell 2). Oppbevar alle oppløsninger unntatt fikseringsbufferen ved 4 °C eller på is under prosedyren.
- Forbered rør med buffere og andre materialer for høsting og behandling av vev.
- For blod fra hver mus, tilsett 10 μL 0,5 M EDTA til et 1,5 eller 1,7 ml mikrosentrifugerør for å samle blodet. EDTA vil forhindre at blodet koagulerer. En 1 ml sprøyte med en 25 G nål og en 15 ml konisk slange er også nødvendig.
- For milten, samle ett 1,5 eller 1,7 ml mikrosentrifugerør med 1 ml HEPES-buffer, en 1 ml sprøyte, to 50 ml koniske rør og to 70 μm filtre per milt.
- For hvert fettvevsdepot samles et 20 ml hetteglass av polyetylen med 1,5 ml HEPES-buffer for hakking av vevet, et 50 ml konisk rør og et 70 μm filter per fettvevstype per mus.
- Forbered arbeidsområdet for høsten.
- Rengjør benkplassen med 70% etanol. Forbered et gummibrett for å feste musen under høsting ved å rengjøre den av med 70% etanol og dekke den med en absorberende pute eller papirhåndklær. Forsikre deg om at minst 5 pinner er tilgjengelige for å jobbe med.
- Fyll en 10 ml sprøyte med PBS-heparin og fest den på en 25 G kanyle til perfusjon.
- Samle verktøy og materialer som skal brukes under innhøstingen. Tang (to par), saks, tørkepapir, lofrie våtservietter, mikrosentrifugerør(er) med EDTA, mikrosentrifugerør(er) med HEPES-buffer og hetteglass(er) av polyetylen med HEPES-buffer er nødvendig.
5. Høst vevet
- Avlive musen ved CO2 kvelning. Ikke utfør en cervikal dislokasjon, da dette kan forhindre effektiv blodinnsamling og vevsperfusjon ved senere trinn.
- På et rengjort benkområde med nok arbeidsplass og belysning for å se musen godt, sett opp et gummidisseksjonsbrett, en bøtte med is for lagring av prøver og en sprayflaske med 70% etanol. Spray musen ned med 70% etanol for å redusere forurensning og kontrollere hårspredningen. Plasser musen på ryggen på gummibrettet og fest potene spredt ut fra kroppen.
- For å forberede deg på å samle blod, gjør du forsiktig et snitt i huden på kanten av den kaudale enden av musens brystkasse. Klipp en liten, rett linje opp mot musens hode (ca. 1 cm) til brystmusklene er eksponert.
- På det første snittstedet, gjør to små kutt vinkelrett på linjen mot hodet. Deretter kutter du forsiktig bort pectoralis-muskelen på den ene siden av ribbeholderen i det eksponerte området. Dette gir bedre tilgang og visualisering for hvor nålen skal settes inn.
- For å samle blod, sett nålen mellom den tredje og fjerde ribben på siden der muskelen ble fjernet. Siden musens hjerte er funnet i midten av brysthulen, hold nålen så nær midtlinjen i ribbeholderen som mulig. Når sprøyten er satt inn, trekkes den forsiktig opp på sprøyten for å begynne å samle blod.
- Når det er samlet, overfør blodet til det tilberedte mikrosentrifugerøret med EDTA og lagre på is.
MERK: Hvis ca. 100 mikrol volum trekkes opp og det ikke kommer blod inn i sprøyten, kan du prøve å rotere sprøyten til høyre eller venstre i tilfelle nåleåpningen presses opp mot hjerteveggen. Hvis dette ikke hjelper, flytt nålen sakte lenger inn i brysthulen eller begynn å fjerne. Hvis det begynner å samle seg blod i sprøyten på dette tidspunktet, fortsett å trekke sprøyten sakte tilbake. Vurder å rotere sprøyten og nålen for vellykket ekstraksjon. Til slutt, hvis det ikke samles blod, fjern nålen, da den kan ha savnet hjertet. Prøv å sette inn nålen igjen og gjenta den nevnte prosessen igjen.
- Neste, for å perfusere musen, åpne brysthulen for å få tilgang til hjertet.
- For å gjøre dette, kutt huden langs enden av ribbeholderen ned til musens side på hver side. Bruk deretter tangen til å holde brystbenet oppe vekk fra arbeidsflaten. Lag et lite, grunt snitt like under enden av brystbenet for å kutte gjennom bukhulen. Skjær langs bukhinnen langs enden av ribbeholderen på hver av musens sider. Dette bør utsette leveren og galleblæren. Vær forsiktig så du ikke kutter i noen av disse vevene.
- Deretter lager du et lite, grunt kutt i membranen, kranial til leveren. Deretter kutter du membranen langs kanten av ribbeholderen for å åpne brysthulen. Pass på å unngå å kutte noen av organene i brysthulen.
- Lag to kutt langs ribbeholderen mot hodet ca 2-3 mm fra musens midtlinje og ca 0,75 cm lang.
MERK: Hvis kuttet opp for høyt, vil arteriene som ligger på toppen av ribbeholderen bli kuttet. Dette vil forstyrre effekten av perfusjonen. - Løft tilbake midtstykket av ribbeholderen for å avsløre brysthulen. Flytt fett eller vev bort for å få tilgang til hjertet.
- Lag et lite kutt i høyre atrium i musens hjerte for å skape en åpning for å presse ut blodet.
- Bruk en 10 ml sprøyte med PBS-heparin, stikk nålen inn i venstre ventrikkel i musens hjerte.
- Begynn forsiktig å skyve PBS inn i hjertet så sakte som mulig.
MERK: Blod bør observeres som kommer fra høyre atria og fyller brysthulen. Sørg for å holde hjertet på sin fysiologiske plassering for å unngå å hemme strømmen av PBS-heparin fra hjertet gjennom aorta. - Når alle 10 ml PBS-heparin har blitt perfusert gjennom musen, kast sprøyten og nålen og fjern overflødig blod og PBS-heparin fra brysthulen ved hjelp av papirhåndklær eller lofrie kluter.
- Deretter, for å begynne å trekke ut vev, kutt ned huden og bukhinnen mot musens hale for å åpne bukhulen.
- Først trekker du ut inguinal adipose tissue pad fra hver side av musen.
MERK: Les denne prosessen nøye: sørg for å trekke ut lyskelymfeknuten fra hvert depot for å unngå å forskyve fettvevets cellulære sminke i resultatene.- Bruk et andre sett med tang, hold bukhinnen membranen med ett sett tang og kanten av huden lagt over membranen på den siden med de andre tangene. Trekk huden forsiktig bort fra bukhinnen for å skille disse lagene fra hverandre. Se etter inguinal adipose tissue depot langs huden. Fest den ytre kanten av huden for bedre å få tilgang til fettdepotet.
- Før ekstraksjon, finn lyskelymfeknuten i midten av fettdepotet og fjern den ved hjelp av tang og saks etter behov.
MERK: Hvis mulig, finn de tre større arteriene som går fra ytterkantene av depotet mot midten. Lymfeknuten ligger rundt der disse arteriene møtes. - Etter at lymfeknuten er fjernet, hold forsiktig enden av fettdepotet nærmest det festede punktet med tangen og begynn å lage små kutt i bindemembranen mellom fettvevet og huden. Løft fettvevet bort fra huden mens du gjør kutt for å få bedre tilgang til membranen og sikre at hele depotet trekkes ut.
- Plasser fettdepotet i et tilberedt hetteglass av polyetylen med HEPES-buffer på is for å holde vevet levedyktig under resten av høstingen.
- Gjenta denne prosessen på den andre siden av musen for å trekke ut begge depotene. Depoter kan enten fordøyes og behandles sammen eller hver for seg. Hvis hvert depot skal behandles separat, må flere rør prepareres.
- Deretter trekker du ut de epididymale fettdepotene fra den kaudale enden av bukhulen. Bruk tang, trekk forsiktig det første bitestikkelen adipose depot vei fra den dorsale enden av musen og finn epididymis og vas deferens festet til dette depotet.
MERK: Det er to epididymal adipose depoter: en festet til hver epididymis og vas deferens.- Skjær forsiktig mellom fettdepotet og bitestikkelen og vas-deferensene for å skille adiposen fra disse andre vevene. Plasser fettdepotet i et hetteglass av polyetylen med HEPES-buffer på is for å holde vevet levedyktig under resten av høstingen.
- Til slutt trekker du ut milten, som finnes til venstre for magen nær membranen. Bruk tang, trekk forsiktig magen mot midten av bukhulen for å avsløre milten.
- Hold forsiktig den ene enden av milten og trekk den litt bort fra magen. Klipp membranen mellom milten og dens tilstøtende vev til orgelet er løsrevet. Plasser milten i det forberedte mikrosentrifugerøret med HEPES-buffer og oppbevar på is.
- Før du behandler vev eller høster vev fra neste mus, kast og eventuelle skitne papirhåndklær eller pads. Tørk av verktøy også.
MERK: Hvis det er flere mus, gjenta disse høstetrinnene for hver mus før du går videre til neste behandlingstrinn. Hvis en kontrollmus / mus er inkludert, bør du vurdere å høste disse før liposombehandlede mus for å unngå forurensning.
6. Behandle vev
MERK: Siden fettvevet har en lang fordøyelsesinkubasjon, anbefales det å starte med den prosessen først og arbeide med å behandle blodet og milten i fordøyelsesperioden.
- Først hakker og fordøyer fettvevet. Bruk ett eller to par saks, hakk fettvevet i hvert hetteglass av polyetylen til vevet er i små biter på mindre enn 0,5 mm i størrelse. Dette muliggjør mer effektiv fordøyelse.
- Når vevet i alle hetteglassene er hakket, tilsett 1,5 ml 2 mg/ml kollagenasebuffer til hvert hetteglass. Plasser hetteglassene i en ristende inkubator satt til 37 °C og 150 o / min. Inkuber i 30 til 45 minutter.
MERK: Hvis fettvevet er spesielt stort, bør du vurdere å legge til ytterligere 0,5 ml til 1,5 ml HEPES-buffer og et likt volum kollagenasebuffer til hetteglasset (e) for å sikre at vevet er helt nedsenket og nok enzym er tilstede. Den endelige konsentrasjonen av kollagenase type I ved fordøyelsen bør være 1 mg/ml uavhengig av det endelige oppløsningsvolumet. Videre, hvis en ristende inkubator ikke er tilgjengelig, kan prøvene plasseres i et vannbad oppvarmet til 37 ° C. Rist prøvene forsiktig hvert 5. minutt for å blande og resuspendere fordøyelsen. - Sjekk prøvene på 30 min. Bruk en 1 ml pipette til å pipette prøven opp og ned. Hvis vevstykkene fortsatt er for store for enkel pipettering, returner prøvene til inkubatoren i ytterligere 15 minutter.
- Når prøvene er fullstendig fordøyd, fortsett å pipe prøven opp og ned ytterligere 10 ganger for å sikre at en enkeltcellesuspensjon er opprettet.
MERK: (Valgfritt) Sjekk prøvene på 30 min. Bruk en 1 ml pipette til å pipette prøven opp og ned. Hvis vevstykkene fortsatt er for store for enkel pipettering, returner prøvene til inkubatoren i ytterligere 15 minutter. - Pipet cellesuspensjonen gjennom et 70 μm filter inn i et 50 ml konisk rør. Tilsett 5 ml FACS-buffer til det tomme hetteglasset med fordøyelse for å vaske hetteglasset ut. Overfør denne vaskebufferen gjennom filteret for å legge til cellesuspensjonen.
- Lagre prøver på is mens andre blir behandlet. Når alle prøvene er filtrert, spinner du dem ned ved 400 x g, 4 °C i 5 minutter.
- Fjern adipocyttsupernatanten ved aspirasjon og fjern deretter infranatanten forsiktig mellom adipocyttersupernatanten og pelleten ved aspirasjon for å forlate den stromal-vaskulære fraksjonen (SVF) pellet.
- Resuspender denne pelleten i 1 ml FACS-buffer og overfør til et rent mikrosentrifugerør på 1,5 eller 1,7 ml. Aliquot celler nå hvis ønskelig eller nødvendig. Oppbevares på is til alle prøver er klare for farging av flowcytometri.
MERK: Hvis fettdepotene som ble fordøyd var store, bør du bare bruke 50 % eller 25 % av prøven til flowcytometrisk farging og analyse. I tillegg, hvis det er behov for fluorescens-minus-one (FMO) kontroller eller ekstra kontroller for flowcytometrianalyse (tabell 1), må du sørge for å aliquot ekstra prøve i et eget rør for behandling. FMOer brukes til å skille mellom negativt og positivt signal for et individuelt fluoroforkonjugert antistoff i det ellers komplette panelet som brukes i forsøket.
- Når vevet i alle hetteglassene er hakket, tilsett 1,5 ml 2 mg/ml kollagenasebuffer til hvert hetteglass. Plasser hetteglassene i en ristende inkubator satt til 37 °C og 150 o / min. Inkuber i 30 til 45 minutter.
- For det andre, behandle blodet.
- Overfør 50 μL blod til et 15 ml konisk rør.
- Tilsett 1 ml AKC-lysisbuffer til hvert rør og pipett opp og ned for å nå en encellesuspensjon. Legg til ytterligere 4 ml AKC lysisbuffer til hvert rør og inkuber i 5-1210 minutter. Hvis en shaker eller rotator er tilgjengelig, forsegl slangehettene tett og plasser slangene på en av disse for å forbedre blandingen.
- Tilsett 5 ml FACS-buffer for å slukke lysisprosessen og spinn prøvene ved 400 x g, 4 °C i 5 minutter. Fjern supernatanten og kontroller pelleten. Hvis det fortsatt er ganske rødt, gjenta lysisprosessen. Ellers resuspenderes pellets i 1 ml FACS-buffer og overføres til et rent 1,5 eller 1,7 ml mikrosentrifugerør. Oppbevares på is til alle prøver er klare for farging av flowcytometri.
- Til slutt, behandle milten. Overfør milten til et 70 μm filter over et 50 ml konisk rør. Vask vevet med 1 ml FACS-buffer og bland deretter milten gjennom filteret ved hjelp av stempelenden av en 1 ml sprøyte. Gjennom moseprosessen, vask cellene inn i 50 ml konisk rør med mer FACS-buffer. Det endelige volumet i det koniske røret skal være 10 ml.
- Spinn cellene ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspender i 1 ml AKC lysisbuffer. Tilsett ytterligere 4 ml AKC lysisbuffer og inkuber i 5 minutter. Tilsett 5 ml FACS-buffer for å slukke lyseringsprosessen og spinn prøvene ved 300 x g ved 4 °C i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml FACS-buffer. Overfør suspensjonen gjennom et annet, rent 70 μm filter til et 50 ml konisk rør. Tilsett 4 ml FACS-buffer for å vaske ut originalrøret og overfør bufferen gjennom filteret for et endelig volum på 5 ml.
- Overfør 50 μl av cellesuspensjonen til et rent mikrosentrifugerør på 1,5 eller 1,7 ml og la det legges på is til alle prøvene er klare for farging av flowcytometri. Ytterligere alikoter kan overføres til rør hvis flere er ønsket eller nødvendig.
MERK: Splenocytter er utmerkede celler å bruke til en levende / død enkeltflekk. Vurder å overføre en ekstra alikot for denne kontrollen.
7. Flekkceller fra vev for flowcytometri
- Spinn ned aliterte prøver ved 400 x g, 4 °C i 5 min.
- Fjern supernatant- og resuspenderingsprøver i 50 mikrol Fc-blokk (fortynnet) (tabell 2). Inkuber på is i 5 min.
- Tilsett 50 μL 2x antistoffblanding (tabell 3) i hver prøve. Inkuber på is i mørket i 20 min.
MERK: Eventuelle enkeltflekker skal IKKE farges med denne antistoffblandingen. I tillegg, hvis FMOer skal brukes, må FMO antistoffblandinger fremstilles separat. - Vask prøvene med 1 ml PBS og sentrifugerer ved 400 x g, 4 °C i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspender prøvene i 200 μL levedyktighetsflekk (tabell 3). Inkuber på is i mørket i 20 min.
MERK: Ikke glem å flekke celler som ble satt til side for en Live/Dead enkeltflekk under dette trinnet. - Vask prøvene med 1 ml FACS-buffer og sentrifugering ved 400 x g, 4 °C i 5 minutter. Fjern supernatant- og resuspenderingsprøver (unntatt levende/døde enkeltflekker) i 50 mikrol fikseringsmedium (reagens A) for å fikse prøver. Inkuber ved romtemperatur i mørket i 15 minutter.
- Heng opp igjen Live/Dead-flekken i 100 μL med 2 % PFA. Inkuber ved romtemperatur i mørket i 5 minutter.
- Vask prøven med 1 ml FACS-buffer og sentrifugering ved 800 x g, 4 °C i 5 minutter. Fjern supernatant og resuspender prøver i 250 til 500 mikrol FACS-buffer. Oppbevares ved 4 °C til prøver kan kjøres på flowcytometeret.
- Vask prøvene med 1 ml FACS-buffer og sentrifugering ved 800 x g, 4 °C i 5 minutter. Fjern supernatant- og resuspenderingsprøvene i 50 mikrol permeabiliseringsmedium (Reagens B) pluss antistoff/IES mot intracellulære proteiner. Inkuber ved romtemperatur i mørket i 20 minutter.
- Vask prøvene med 1 ml FACS-buffer og sentrifugering ved 800 x g ved 4 °C i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspender prøvene i 100 mikrol 2% paraformaldehyd (PFA). Inkuber ved romtemperatur i mørket i 5 minutter.
- Vask prøvene med 1 ml FACS-buffer og sentrifugering ved 800 x g, 4 °C i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspender prøvene i 250 til 500 mikrol FACS-buffer. Oppbevares ved 4 °C til prøver kan kjøres på flowcytometeret.
Representative Results
Liposomproduksjon
Resultatene som publiseres her ligner de i vårt tidligere publiserte arbeid 3,4,20. Ved hjelp av protokollen som presenteres her, forventer vi å produsere liposomer på omtrent 150-12160 nm i størrelse. DLS viser en gjennomsnittlig liposomdiameter på 163,2 nm og et zetapotensial på -19,2 mV (figur 1A). Avbildning av kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) viser sirkulære liposomer (figur 1B), og DLS-diagrammet viser et relativt lite standardavvik fra gjennomsnittsdiameteren (figur 1C).
Positiv liposombinding krever en PBS-behandlet kontroll
Tidligere studier fra vår gruppe som brukte denne protokollen, undersøkte hvilke celleundergrupper i fett-SVF, milt og blod bundet til liposomer etter en uke med in vivo-administrasjon 3,4. Ved hjelp av en PBS-behandlet mus ble bukhulen og miltcellene farget med det samme antistoffpanelet som ble brukt på prøver fra liposombehandlede mus. Vev ble høstet etter en ukes behandling (figur 2A). Prøvene fra den PBS-behandlede musen fungerte som en DiD FMO for å skape positive DiD-porter (figur 2B,C). En positiv port kan opprettes ved hjelp av DiD-positivt signal, men prøver som mangler DiD-signal må også brukes til å verifisere at den positive porten ikke inneholder noen DiD-negative prøver.
Titreringer er nødvendig for å optimalisere fluorescenssignaler
Før et fullstendig eksperiment utføres, må forskjellige forhold, inkludert konsentrasjonen av fluorescerende konjugerte antistoffer som brukes under cellefarging og lipidfargestoff som brukes under liposompreparasjon, optimaliseres. Flowcytometre har en øvre deteksjonsgrense for fluorescensintensitet, så for mye fargestoff innlemmet i liposomene vil føre til ikke-kvantifiserbare nivåer av DiD-signal i prøver som går gjennom cytometeret. Videre kan for mye DiD i liposomene føre til høye nivåer av ikke-spesifikk fargestoffoverføring, noe som kan forskyve cellulære opptaksresultater. Figur 3 rapporterer resultater fra et eksperiment der konsentrasjoner av lipidfargestoff ble titrert for å identifisere konsentrasjonen som ville gi et optimalt signal innenfor deteksjonsområdet for strømningscytometeret som ble brukt. Dette ble utført på vevene av interesse for det endelige forsøket: Blod (figur 3A), inguinal adipose SVF (figur 3B) og epididymal adipose SVF (figur 3C). Konsentrasjonene valgt for testing var 10 mg DiD (høy, rød), 1 mg DiD (midtre, blå) eller 0,1 mg DiD (lav, grå) per 1 ml liposomer. Den høyeste konsentrasjonen som ble brukt i liposomene var for høy og overgikk cytometerets kvantifiserbare område i alle tre vev (figur 3A\u2012C, rød). Den laveste konsentrasjonen av DiD viste noe signal (figur 3 A\u2012C, grå), men en klar populasjon utover de PBS-behandlede cellene (figur 3A\u2012C, svart) ble ikke observert. Når det ble kvantifisert, viste det aritmetiske gjennomsnittet av DiD MFI for hvert vev og konsentrasjon et klart skille mellom PBS-kontroller og den midterste konsentrasjonen av DiD (figur 3D). Som angitt i protokollen valgte vi derfor den midterste konsentrasjonen (figur 3, blå) som skulle brukes i liposompreparatet.
Bruken av multiantistoffpanel gjør det mulig å identifisere liposomopptak av forskjellige celleundergrupper
Ved hjelp av panelet skissert i tabell 3 ble cellene farget med antistoffer mot markører for makrofager, B-celler, T-celler, dendrittiske celler, monocytter og endotelceller (figur 4). Litt forskjellige gatingstrategier kreves for hver vevstype, men de fleste av de samme celletypene kan identifiseres i hver. Noen unntak inkluderer endotelceller, som normalt ikke finnes i blodet, og monocytter, som vanligvis har høyere frekvens i blodet enn andre vev. Når populasjoner er identifisert, kan total størrelse på hver cellepopulasjon og frekvensen de er DiD + kvantifiseres. Ytterligere beregninger kan utføres for å karakterisere DiD + -populasjonen: hvilken prosentandel av DiD + -celler er makrofager, endotelceller, etc. Vær oppmerksom på at dette er eksempler på gating-strategier, men ikke den eneste måten å analysere prøvene på. Analysen vil bli diktert av det valgte panelet og flowcytometeret (e) som er tilgjengelig.
Figur 1: Eksempel på kjennetegn ved preparerte liposomer.
(A) Størrelse og zetapotensial ble målt som beskrevet ovenfor og er rapportert i tabellform. Hver parameter presenteres som gjennomsnittet ± standardavviket. (B) Cryo-EM ble brukt til å avbilde de preparerte liposomene. Den hvite skalastangen er 50 nm lang. (C) DLS ble brukt til å generere et histogram av diameteren av liposomer i denne prep. Denne figuren er tilpasset fra Osinski et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ DiD-farging fra PBS- eller liposombehandlede mus.
(A) Eksperimentell skjematisk for PBS og liposombehandlinger. PBS eller liposomer ble injisert tre ganger i løpet av en uke. Vev ble høstet på behandlingsdag 8. (B, C) Representative strømningsplott viser positiv DiD-farging hos liposombehandlede (C), men ikke PBS-behandlede (B) mus. FSC, fremover spredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Titrering av DiD i liposomer.
Liposomer ble fremstilt med tre forskjellige konsentrasjoner av DiD og injisert i mus. Grått indikerer den lave konsentrasjonen ved 0,1 mg DiD per 1 ml liposomer, blått indikerer den midterste konsentrasjonen ved 1 mg DiD/ml liposomer, og rødt indikerer den høye konsentrasjonen ved 10 mg DiD/ml liposomer. En PBS-behandlet mus ble brukt som negativ kontroll (svart). Blod (A, sirkel), lyskeadipose (B, triang) og epididymal adipose (C, kvadrat) ble høstet 24 timer etter injeksjon og behandlet for å isolere en encellesuspensjon. Disse prøvene ble kjørt på et flowcytometer til nivået av detekterbar DiD. Vevsspesifikke histogrammer med overlegg av hver behandlingsgruppe presenteres for å demonstrere fluorescensintensitet per konsentrasjon (A\u2012C). Det aritmetiske gjennomsnittet av DiD ble også kvantifisert for hvert vev og konsentrasjon og plottet (D). SSC = sidespredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Representativ flowcytometrianalyse av celleundergrupper i fettsvf, blod og milt.
(A\u2012C) Skjematisk representant for gatingstrategi for å identifisere celleundergrupper og DiD + celler i adipose SVF (A), milt (B) og blod (C). Forkortelser: FSC = fremoverspredning; LD = levende / død; L-DCs = lymfoide dendrittiske celler; M-DCs = myeloide dendrittiske celler; SSC = sidespredning. Denne figuren er tilpasset fra Osinski et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kontroll | Hensikt |
| Mus behandlet med PBS eller saltvann | Bruk cellene fra denne musen til følgende flowcytometrikontroller: |
| 1. Ufargede celler | |
| 2. Levende / død enkelt flekk | |
| 3. Celler farget med hele panelet, men mangler liposomfluorescens for å bestemme positivt liposomsignal under analyse | |
| Dette/disse musene/musene vil også bli brukt til å avgjøre om liposomer har noen effekter in vivo, da du vil ha en ikke-liposomkontroll i eksperimentet. | |
| Lossede liposomer | Hvis du legger inn en forbindelse i liposomene dine, bør en del av liposompartiet syntetiseres uten forbindelsen. Dette står for noen in vivo effekter av liposomene alene. |
| DiD alene | Siden DiD også kan tas opp av cellulære membraner, vil tildeling av noen mus for å motta fritt fargestoff i en mengde som er lik den som finnes i liposomene, bidra til å redegjøre for bakgrunnsmembranfarging. |
| Fluorescens-minus-one (FMO) kontroller | Dette er celler farget med alle unntatt ett av antistoffene i panelet ditt. Som # 3 i boksen ovenfor, hjelper dette med å bestemme sant positivt signal for det antistoffet under analysen |
Tabell 1: Kontroller som skal brukes i denne protokollen.
| Løsning | Komponenter | Omtrentlig volum som trengs per batch/mus |
| Liposomforberedelse | ||
| Kalsiumacetat | 1 M kalsiumacetat i H2O | 50 ml |
| HEPES buffer | 10 mM HEPES i H2O, pH 7,4 | 50 ml |
| Tesaglitazar i HEPES | i 10 mM HEPES | 10 ml |
| Vevshøsting, bearbeiding og farging | ||
| Fosfatbufret løsning (PBS) | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 i destillert H 2O | 2 ml |
| PBS-heparin | 0,1 mM heparin i PBS | 10 ml |
| HEPES buffer | 20 mM HEPES i PBS | 5 ml |
| Fordøyelse buffer | 2 mg/ml kollagenase type I i HEPES-buffer | 5 ml |
| AKC lysis buffer | 0,158 M NH 3 Cl,10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA i ddH 2 O, pH7,2 | 15 ml |
| FACS-buffer | 1 % BSA, 0,05 % NaN3 i PBS | 15 ml |
| Fc-blokk (fortynnet) | 1:50 Fc-blokk i FACS-buffer | 250 μL |
| Fiksering Buffer | 2% paraformaldehyd i PBS | 200 μL |
Tabell 2: Løsninger som skal forberedes.
| En | B | C | D |
| Ekstracellulær farging (2x antistoffblanding) | |||
| Antigen | Fluorofor | Ab volum per 100 μL test | Totalt volum som trengs: |
| CD45 | PerCP | 0,5 μL | Kolonne C x 1,2 x Totalt # prøver |
| CD11b | PerCP Cy5.5 | 0,25 μL | (0,5 μL/test) x (1,2) x (# prøver) |
| F4/80 | PE Cy7 | 0,25 μL | (0,25 μL/test) x (1,2) x (# prøver) |
| CD19 | PE-CF594 | 1 μL | (0,25 μL/test) x (1,2) x (# prøver) |
| CD3 | FITC | 1 μL | (1,0 μL/test) x (1,2) x (# prøver) |
| CD31 | BV605 | 0,25 μL | etc... |
| CD11c | APC ef780 | 1 μL | |
| CD115 | PE | 1,5 μL | |
| For å lage antistoffblandingen kombinerer du antistoffene beregnet i kolonne D med FACS-buffer eller Brilliant Violet Staining Buffer* til et endelig volum på (50 μL x 1,2 x Totalt # prøver) | |||
| Levende/død farging (1x) | |||
| Levende/død | Fluorofor | L / D-volum per 200 uL test | Totalt volum som trengs: |
| Levende/død | Aqua | 0,67 μL | Kolonne C x 1,2 x Totalt # prøver |
| Intracellulær farging (1x) | |||
| Antigen | Fluorofor | Ab volum per 50 μL test | Totalt volum som trengs: |
| αSMA | FITC | 0.125 | Kolonne C x 1,2 x Totalt # prøver |
| *Brilliant Violet Staining Buffer bør brukes hvis mer enn ett antistoff konjugert til en Brilliant Violet fluorophore blir brukt i panelet. | |||
Tabell 3: Eksempel på antistoffpanel og beregninger av fargeblandinger til bruk for strømningsfarging.
Discussion
Her beskriver vi en tredelt protokoll for å (i) forberede liposomer som er merket med et fluorescerende lipidfargestoff og lastet med en antidiabetisk forbindelse, tesaglitazar, (ii) administrere liposomer til en mus via retro-orbital injeksjon, og (iii) høste, behandle og flekke vev for å oppdage liposomopptak på cellenivå ved flowcytometri. Denne protokollen gjennomgår fremstilling av ca. 150 μm liposomer og vurdering av opptak i fett, blod og milt. Liposompreparatet er skalerbart, utføres hovedsakelig ved romtemperatur, og benytter omvendt fasefordampning for å maksimere stoffbelastning og fjerning av organiske løsningsmidler. Ved bruk av denne protokollen kan opptil 2 mg/ml konsentrasjon av tesaglitazar oppnås i den rensede liposomprøven. De preparerte liposomene kan lagres i HEPES-buffer ved 4 °C i over ett år. Vår erfaring var at de viste minimal variasjon i gjennomsnittlig partikkelstørrelse. Under 10% av legemiddelinnholdstapet ble demonstrert spektrofotometrisk etter ultrafiltreringsseparasjon av liposomer fra eksternt legemiddel med et 10 kDa sentrifugalfilter.
Under liposomforberedelse er det noen kritiske trinn og faktorer å vurdere. For det første er rekkefølgen på protokolltrinnene viktig og må overholdes. For det andre må pH i oppløsningen som brukes ved lasting av tesaglitazar opprettholdes på 7,4 for å maksimere løseligheten og effektiv belastning. For det tredje sikrer riktig montering av utstyr og filtre at utgangen av hvert trinn er av riktig størrelse og renhet. For eksempel, hvis 100- og 200 nm filtre ikke er montert riktig, kan det oppstå en mer heterogen og feil størrelse batch av liposomer. For det fjerde er fullstendig fjerning av Ca-acetat før legemiddelbelastning nødvendig for å maksimere overføringen av tesaglitazar til liposomene. For å teste for fullstendig fjerning av Ca-acetat, bruk høyhastighets sedimentering for å fjerne liposomene og deretter måle Ca-acetatnivåer i ikke-liposomal løsning. For det femte er det viktig å veie og registrere massen av alle materialer som legges til liposompreparatet ved hvert trinn. Dette sikrer at riktige konsentrasjoner kan beregnes og nødvendige forhold mellom materialer opprettholdes. Til slutt, hvis teknikken ikke er riktig utført, kan det være et uønsket nivå av heterogenitet. Det er viktig å sjekke denne parameteren grundig ved hjelp av DLS og andre tilnærminger som elektronmikroskopi. Hvis du vil forbedre homogeniteten, bør du vurdere å justere den valgte filterstørrelsen eller stable to filtre.
I tillegg er det avgjørende at kontroller og antistoffpanel for flowcytometri planlegges og optimaliseres før denne protokollen gjennomføres i sin helhet (tabell 1, tabell 3). Antistoffer bør testes for å sikre at riktige konsentrasjoner brukes til farging og at overlapping mellom fluoroforer er minimal. Eksitering og utslipp av fargestoffet som brukes under liposompreparasjon må også tas med i panelplanleggingen. I våre resultater brukte vi DiD, som har en lignende eksitasjon og utslipp til fluoroforer som Allophycocyanin (APC) og AlexaFluor 647. Dermed valgte vi ikke antistoffer konjugert mot disse fluoroforene i antistoffpanelet vårt. Videre er isotypekontroller ikke inkludert i denne protokollen. Dette skyldes at antistoffene som er valgt for denne protokollen er godt validerte, kommersielt tilgjengelige antistoffer. Men hvis du er interessert i å bruke et antistoff som ikke har blitt optimalisert tidligere, bør du vurdere å teste antistoffet mot en isotypekontroll på vevene av interesse før du gjennomfører hele eksperimentet.
Mens denne protokollen demonstrerer hvordan man trekker ut og behandler blod, milt, inguinal adipose og epididymal fettvev fra musen etter behandling, kan denne generelle tilnærmingen brukes på andre vev. Avhengig av vevet av interesse, kan det hende at behandlings- og fordøyelsesprotokoller må endres som publisert for følgende vev: lunge21, lever22, bukhule 3, benmarg3,23, hjerne 24.
En viktig begrensning ved denne metoden å vurdere er at opptak bare kan vurderes på ett tidspunkt per dyr. Det kan derfor være fordelaktig å koble denne protokollen med andre ikke-invasive bildebehandlingsteknikker eller planlegge deretter for å sikre tilstrekkelige ressurser til å gjennomføre vurderingen. Tidspunktet for cellulært opptak og cellulær omsetning er viktige faktorer å vurdere: liposomer vil sirkulere gjennom hele kroppen i løpet av de første 24 timene, og avhengig av levetiden til cellene som tar opp liposomer eller hvordan de reagerer på opptak, kan celledød eller ytterligere fagocytose forekomme. Vår tidligere studie viste endringer i populasjonsegenskapene til DiD + populasjoner på forskjellige tidspunkter3. Av den grunn er det viktig å evaluere opptak på tidligere tidspunkter eller tidspunkter som er mest relevante for interessemekanismens biologi. I tillegg, mens kvantifisering av celleopptak i hele vevet kan utføres med denne protokollen, kan flowcytometri ikke avsløre vevslokalisasjon. Kobling av denne tilnærmingen med histologiske metoder kan bidra til å løse denne begrensningen.
Generelt utfyller denne protokollen eksisterende metodikk som histologi og helkroppsfluorescensavbildning. Med de fortsatte fremskrittene innen flowcytometriverktøy og -metoder, vil utvikling av større paneler til flere og mer spesifikke cellepopulasjoner bli mulig. Vi foreslår at denne protokollen brukes i tillegg til de nevnte metodene, da dette vil forbedre evalueringen av cellulært opptak og også gi mulighet til å validere resultatene observert ved flowcytometri. Skulle man for eksempel finne at et flertall av partiklene i fettvev ble tatt opp av makrofager ved flowcytometri. Immunfluorescens av en ekstra alikot av samme fettvev kan lagres, fikseres, snittes og farges for makrofagmarkører for å verifisere at celletypen faktisk tar opp liposomer. Denne tilnærmingen bør legge til strenghet til nanopartikkelbiodistribusjonsanalyser utført: validere cellespesifikk målretting, kvantifisere cellulært opptak, identifisere opptak utenfor målet og forhåpentligvis gi informasjon for å generere mekanistiske hypoteser for observerte terapeutiske resultater. Denne protokollen kan også tilpasses for fremtidige studier ved bruk av forskjellige liposomer, undersøkelse av opptak i andre vev og testing av nye forbindelser i forbindelse med fedme og dysmetabolisme eller annen sykdom der nanopartikkellevering er et mulig terapeutisk alternativ.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne Michael Solga og resten av Flow Cytometry Core-staben for å gi flowcytometriopplæring og tjenester. Forfatterne vil også gjerne anerkjenne Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye og Prasad Srikakulapu for deres hjelp med liposompreparasjon (SSKD, DKB), vevshøsting (MAM, JCG) og flowcytometrifarging og prøveinnsamling (AU, PS, CM). Dette arbeidet ble støttet av tilskuddene AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 og R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 og T32 HL007284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL syringe | BD | 309659 | |
| 10-mL syringe | BD | 302995 | |
| 25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
| 27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
| Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
| Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
| Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
| Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
| Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
| Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
| Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
| Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
| Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
| Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
| FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
| Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
| Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
| Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
| Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
| Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
| Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
| Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
| Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
| Sonicator | Misonix | XL2020 | |
| T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
| Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
| Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
| ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |
References
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 286 (2015).
- Osinski, V., et al. In vivo liposomal delivery of PPARα/γ dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects. Theranostics. 10 (2), (2020).
- Bauknight, D. K., et al. Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects. PLoS ONE. 14 (11), (2019).
- Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity. BioMed Research International. , (2017).
- He, H., Ghosh, S., Yang, H. Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases. Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).
- Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases. Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).
- Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes. BBA - Biomembranes. , (1994).
- Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).
- Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging. PLoS One. 6 (6), 20594 (2011).
- Larmann, J., et al. In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation. Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).
- Feng, B., et al. Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice. PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).
- Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance. The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).
- Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice. Biomaterials. 110, 81-88 (2016).
- Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues. Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).
- Nakhlband, A., et al. Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective. BioImpacts. , (2018).
- Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment. International Journal of Nanomedicine. , (2018).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. Journal of Cell Biology. , (1986).
- Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2019).
- Dasa, S. S. K., et al. Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer. Theranostics. , (2018).
- Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis. Journal of Clinical Investigation. , (2003).
- Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jirón Tamburini, B. A. Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e58621 (2019).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation research. , (2019).
- O'Brien, C. A., Harris, T. H. ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain. PLoS ONE. , (2020).
