Summary
Apresentado aqui é um procedimento para determinações reprodutíveis e estatisticamente válidas de distribuições de tamanho de grânulo de amido, e para especificar as distribuições de tamanhonormal de enrasculado determinados do granulo usando uma forma multiplicativa de dois parâmetros. É aplicável a todas as análises de dimensionamento de grânulos de amostras de amido em escala grama para pesquisa em ciência vegetal e alimentar.
Abstract
Amido de todas as fontes de plantas são compostos de grânulos em uma variedade de tamanhos e formas com diferentes frequências de ocorrência, ou seja, exibindo um tamanho e uma distribuição deforma. Os dados de tamanho do grânulo de amido determinados usando vários tipos de técnicas de dimensionamento de partículas são muitas vezes problemáticos devido à baixa reprodutibilidade ou falta de significância estatística resultante de alguns erros sistemáticos intransponíveis, incluindo sensibilidade às formas de grânulo e limites de tamanhos amostrais de grânulo. Delineamos um procedimento para determinações reprodutíveis e estatisticamente válidas das distribuições de tamanho do grânulo de amido usando a técnica da zona de sensoriamento elétrico, e para especificar as distribuições determinadas de tamanho de lognormal do grânulo usando uma forma multiplicativa de dois parâmetros adotada com melhor precisão e comparabilidade. É aplicável a todas as análises de dimensionamento de grânulos de amostras de amido em escala grama e, portanto, poderia facilitar estudos sobre como os tamanhos do grânulo de amido são moldados pelo aparelho e mecanismos de biosíntese de amido; e como eles impactam propriedades e funcionalidades de amidos para alimentos e usos industriais. Os resultados representativos são apresentados a partir de análises de réplica das distribuições de tamanho de granuloso de amostras de amido de doce de pote de milho utilizando o procedimento descrito. Discutimos ainda vários aspectos técnicos fundamentais do procedimento, especialmente, a especificação multiplicativa das distribuições de tamanhonormal do granulo lognormal e alguns meios técnicos para superar o bloqueio frequente de abertura por agregados de grânulos.
Introduction
Os grânulos de amido são a estrutura física na qual dois polímeros homoglucanos de reserva principal em fotossíntese vegetal e tecidos de armazenamento, a amilolose linear ou pouco ramificada e a amilódeina altamente ramificada, são embaladas ordenadamente junto com alguns componentes menores, incluindo lipídios e proteínas. Grânulos de amido de várias espécies vegetais exibem muitas formas tridimensionais (3D) (revisadas em ref.1,2), incluindo esferas, elipsoides, poliedros, plaquetas, cubos, cuboides e tubulos irregulares. Mesmo aqueles do mesmo tecido ou tecidos diferentes da mesma espécie vegetal poderiam ter um conjunto de formas com frequências de ocorrência variadas. Em outras palavras, grânulos de amido de uma espécie de planta podem ter uma distribuição estatística característica, em vez de uma forma específica. As formas de grânulo não uniforme e não esférica dificultam a medição adequada e a definição dos tamanhos do grânulo do amido. Além disso, os grânulos de amido dos mesmos tecidos de uma espécie vegetal são de uma gama de tamanhos com diferentes proporções, ou seja, exibindo uma distribuição de tamanho característica. Essa distribuição de tamanho complica ainda mais a análise e descrição dos tamanhos do grânulo de amido.
Os tamanhos do grânulo de amido foram analisados utilizando várias categorias de técnicas de dimensionamento de partículas (revisadas no ref.3), incluindo microscopia, sedimentação/fracionamento de fluxo de campo esterico (Sd/StFFF), difração a laser e zona de sensoriamento elétrico (ESZ). No entanto, essas técnicas não são igualmente adequadas para a determinação de tamanhos de grânulos de amido na presença de uma forma de grânulo e uma distribuição de tamanho. A microscopia, incluindo microscopia eletrônica leve, confocal e de varredura, é excelente para os estudos de morfologia4,5,6,7, estrutura8,9 e desenvolvimento10,11 de grânulos de amido, mas dificilmente adequado para definir suas distribuições de tamanho devido a algumas deficiências inerentes. Medições diretas de imagens de grânulos microscópicos ou análise de imagem assistida por software de dados de microscopia óptica (IAOM), que têm sido usados para a determinação de tamanhos de grânulos de amidos de várias espécies, incluindo milho12, trigo13,14, batata15 e cevada16, pode medir apenas tamanhos 1D (geralmente comprimento máximo) ou 2D (área de superfície) de números muito limitados (dezenas a alguns milhares) de imagens de grânulo de amido. Os pequenos tamanhos de amostragem de grânulos inerentemente constrangidos pelas técnicas raramente poderiam ser estatisticamente representativos, considerando os enormes números de granulo por unidade de peso de amido (~120 x 106 por grama, assumindo todas as esferas de 10 μm em densidade de 1,5 g/cm³), e, portanto, poderia levar à baixa reprodutibilidade dos resultados. A técnica Sd/StFFF pode ter alta velocidade e resolução, e frações de tamanho estreito de grânulos de amido17,mas raramente tem sido usada provavelmente porque sua precisão pode ser severamente afetada por danos, diferentes formas e densidade de grânulos de amido. A técnica de difração a laser é a mais utilizada, e tem sido aplicada para análises de tamanho de granulo de amido para todas as principais espécies de cultura3,14,16. Embora a técnica tenha muitas vantagens, na verdade não é adequada para determinações de tamanhos de grânulo de amido na presença de uma distribuição de forma de grânulo. A maioria dos instrumentos simultâneos de difração a laser dependem da teoria de dispersão de luzMie 18 para partículas esféricas uniformes e a teoria miemodificada 18 para algumas outras formas de uniformidade. A técnica é, portanto, inerentemente muito sensível às formas de partículas, e não é inteiramente adequada mesmo para certas formas de uniformidade19, muito menos para grânulos de amido com um conjunto de formas de proporções variadas. A técnica ESZ mede a perturbação do campo elétrico proporcional ao volume da partícula que passa por uma abertura. Fornece tamanhos de volume de granulo, bem como as informações de distribuição de números e volumes, etc., em altas resoluções. Uma vez que a técnica ESZ é independente de quaisquer propriedades ópticas de partículas, incluindo cor, forma, composição ou índice refrativo, e os resultados são muito reprodutíveis, é particularmente adequado para determinar distribuições de tamanho de grânulos de amido com um conjunto de formas.
Os tamanhos do grânulo de amido também foram definidos usando muitos parâmetros. Muitas vezes foram descritos simplistamente por diâmetros médios, que em alguns casos foram os meios aritméticos dos comprimentos máximos microscopicamente medidos de imagens 2D12,20ou médias de diâmetros equivalentes da esfera3. Em outros casos, as distribuições de tamanho do grânulo foram especificadas utilizando-se faixas de tamanho21,22, o volume médio de distribuição ou diâmetro médio (equivalente de esfera, ponderado por número, volume ou área de superfície) assumindo uma distribuição normal14,23,24,25,26. Estes descritores de tamanhos de grânulo de amido de várias análises são de natureza muito diferente, e não estritamente comparáveis. Poderia ser muito enganoso se esses "tamanhos" de grânulos de amido de diferentes espécies ou mesmo os mesmos tecidos da mesma espécie fossem diretamente comparados. Além disso, o parâmetro de propagação (ou forma) das distribuições normais presumidas, ou seja, o desvio padrão σ (ou desvio padrão gráfico σg) medindo a largura da distribuição (ou seja, a disseminação dos tamanhos), tem sido ignorado na maioria dos estudos.
Para resolver os problemas críticos acima mencionados frente às análises de dimensionamento do grânulo de amido, delineamos um procedimento para determinações reprodutíveis e estatisticamente válidas das distribuições de tamanho de grânulo de amostras de amido usando a técnica ESZ, e para especificar adequadamente as distribuições de tamanho periculoso de granulo determinado usando uma forma multiplicativa de dois parametradosadotadas 27 com melhor precisão e comparabilidade. Para validação e demonstração, realizamos análises de dimensionamento de grânulos de réplica de amostras de amido de doce de pote usando o procedimento, e especificamos as distribuições de volume-volume-diâmetro de volume-quantidade equivalente de volume-equivalente de volume-equivalente lognormal usando seus meios 
geométricos gráficos e desvios padrão multiplicativos s* em uma forma x/ (multiplique e divida) s*
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de amostras de amido
- Prepare duas (ou três) amostras de amido de réplica em escala de grama de tecidos acumulados de amido de várias espécies vegetais seguindo os procedimentos estabelecidos (por exemplo, batatas15, potes de doce28,grãos de trigo13,29e grãos de milho30,etc.).
- Lave completamente amostras de amido com acetona ou tolueno 3-4x para minimizar os agregados de granulo e secá-las completamente.
NOTA: Use procedimentos de extração que produzam mais de 1 g de amido por preparação. Uma ou duas alíquotas de 0,5 g de cada um dos três ou dois extratos de réplica, respectivamente, são amostradas para análise de tamanho de grânulo de um extrato de amido.
2. Preparação de eletrólitos
- Prepare 500 mL de cloreto de lítio de 50 g/L em metanol para quatro corridas de tamanho para amostras de amido de replicação (100 mL por corrida mais 100 mL extras). Preferencialmente, faça o eletrólito em lotes de grande volume, por exemplo, 4 a 8 L por vez, para minimizar a variação de concentração.
- Esfrie o recipiente no gelo ou em um armário de 4 °C para acelerar a dissolução do cloreto de lítio.
3. Configuração do analisador
- Escolha um tubo de abertura com uma faixa de diâmetro de partículas cobrindo a faixa de tamanho de grânulo conhecida (na literatura ou através de ensaios) de amostras de amido a serem analisadas, por exemplo, uma abertura de 100 μm para amidos de doces. Para amostras de amido de faixa de tamanho de grânulo desconhecida, selecione uma abertura apropriada através de testes usando vários tubos de abertura com faixas de diâmetro de partículas sobrepostas.
NOTA: A faixa de diâmetro de partículas de um tubo de abertura é sua faixa de dimensionamento precisa entre 2 a 60% de, e com uma faixa de dimensionamento estendida para 80% do seu diâmetro orifício. A Tabela 1 lista propriedades de três tubos de abertura mais úteis para dimensionar grânulos de grandes amidos de cultura. Se a faixa de tamanho do grânulo de uma amostra de amido for maior do que a faixa de dimensionamento de um único tubo de abertura, realize uma análise de sobreposição de vários tubos combinando até cinco distribuições de tamanho de partículas medidas com aberturas de diferentes tamanhos. Cada abertura é identificável pelo seu diâmetro e número de peça rotulado no tubo. Seu diâmetro e número de série contidos em um código de barras no tubo podem ser escaneados no software do analisador usando o Leitor de Código de Barras no Painel de Controle do analisador. - Escolha um béquer analítico de 100 ou 200 mL (sobre cuvetas) para a determinação dos tamanhos do grânulo de amido, e configure agitação automática (abaixo) para manter uma boa suspensão de granulo durante a medição.
- Crie um MÉTODO operacional padrão (SOM) para especificar configurações de execução e um arquivo Preferências para analisar, visualizar e imprimir os resultados. Combine o arquivo SOM e Preferences em um procedimento operacional padrão (SOP) conforme necessário.
NOTA: Para análises não padronizadas, use o SOM para executar as análises e ajuste as configurações som entre as execuções através da janela Editar a janela SOM (veja abaixo) conforme necessário. Após a conclusão da execução, analise, visualize e imprima os resultados da execução alterando as Preferências conforme desejado. Para análises padronizadas de dimensionamento de grânulos, use um SOP para executar as análises.- Inicie o software do analisador. Na Manu Principal, clique em SOP | Crie o MAGO SOM ou edite o SOM, ou no Painel de Status, clique em Editar SOM. Use o assistente ou a janela Editar a janela SOM para selecionar configurações para um SOM. As configurações tipicamente utilizadas para dimensionar grânulos de amostras de amido de doce de pote são resumidas na Tabela 2.
- Salve o SOM criado em um arquivo na janela SOM Wizard-Summary of Settings ou na janela Editar a janela SOM.
- Na Manu Principal, clique em SOP | Criar preferências do assistente ou editar preferências. Use o assistente ou as guias na janela de edição Preferências para selecionar configurações de preferência como as da Tabela 3 ou outras conforme desejado.
- Salvar as Preferências selecionadas em um arquivo na janela Criar preferências Assistente-Resumo de Configurações ou na janela Editar preferências.
- No menu principal, clique em SOP | Criar assistente SOP. Seguindo o guia passo a passo do assistente, digite uma descrição, selecione o arquivo SOM e Preferências para criar e salvar um SOP.
4. Análises de dimensionamento de grânulos das amostras de amido
- Prepare o Analisador
- Ligue o analisador, abra o software no computador e verifique o status Pronto na parte superior do Painel de Status após sua conexão automática com o analisador.
- Encha o frasco de eletrólitos com eletrólitos, esvazie o frasco de resíduos se necessário.
- Instale e fixe corretamente o tubo de abertura escolhido seguindo o guia no manual do usuário. Para um novo tubo de abertura não calibrado, calibra-o seguindo o guia passo-a-passo em Calibração | Calibrar a abertura no menu principal. Para obter um tubo de abertura calibrado, verifique a calibração seguindo o guia passo-a-passo do assistente do tubo de abertura de alteração sob o | de execução ou calibração Verifique a calibração da abertura no menu principal.
- Desbloqueie a plataforma de ensaio empurrando o clipe de liberação de bloqueio (na frente média da parede do compartimento da amostra esquerda) e baixe manualmente a plataforma para a parte inferior. Coloque um béquer analítico contendo 100 mL de eletrólito na plataforma, mova o agitador para a posição de agitação e levante manualmente a plataforma para a posição superior auto-travada para imergir o tubo de abertura e o agitador no eletrólito.
- Clique em Preencher na barra de ferramentas do instrumento inferior para que o analisador preencha automaticamente o sistema com o eletrólito e clique em Flush para que o analisador lave automaticamente o sistema.
- Carregue o SOM clicando em SOP | Carregue um SOM no Menu Principale use o SOM para executar uma análise sem um arquivo Preferências. Alternativamente, carregue um SOP clicando em SOP | Carregue um SOP no menu principal ou carregue SOP no Painel de Status e use o SOP para executar uma análise.
- Se estiver usando um SOP, clique em SOP | SOM Info ou Informações de Preferência no Menu Principal para verificar as configurações SOM e Preferência. Clique em | de amostra Digite Informações de exemplo no menu principal ou edite informações no painel de status para inserir as informações de amostra para a execução.
- Prepare a amostra de amido-metanol e as suspensões de dimensionamento
- Pesar duas ou uma amostra de 0,5 g de cada um dos dois ou três extratos de amido de réplica, respectivamente.
- Adicione cada uma das alíquotas de amido de 0,5 g a 5 mL de metanol em um tubo de centrífuga cônica de 50 mL e disperse totalmente os grânulos de amido usando vários pulsos de ultrassom de baixa intensidade (12-24 W/cm2) de um processador ultrassônico.
- Usando uma pipeta de transferência descartável, aplique uma pequena gota da suspensão amido-metanol (~0,2 mL) aos 100 mL de 50 g/L LiCl eletrólito de metanol sob constante agitação no béquer. Feche a porta do compartimento de amostra.
- Realize uma corrida de dimensionamento
- Clique em Visualizar na barra de ferramentas de instrumento inferior para iniciar uma execução de pré-visualização. No Painel de Status, verifique se a barra de concentração exibida dinamicamente está em verde e mostra uma faixa de concentração nominal de 5 a 8% para a suspensão.
- Clique em Parar na barra de ferramentas inferior para impedir a execução da pré-visualização. Se necessário, diluir a suspensão de eletrólitos de amido substituindo uma alíquota da suspensão pelo eletrólito e, em seguida, repita uma pré-visualização.
NOTA: A faixa de concentração nominal de 5% a 8% da suspensão é fundamental para a conclusão de uma corrida sem paralisação devido ao bloqueio de abertura por grânulos agregados. Se necessário, ajuste o tamanho da amostra de gota e/ou a concentração da suspensão amido-metanol para fazer uma nova suspensão de onte-eletrólitos com a concentração nominal na faixa ideal. - Após a verificação, clique em Iniciar na barra de ferramentas inferior para iniciar a execução. O analisador completa automaticamente a execução assim que a contagem total de grânulos de tamanho, que é exibida juntamente com o tempo de execução no Painel de Status em uma execução, atinge o conjunto Contagem Total (125.000 ou 250.000) pelo Modo de Controle do SOM. Dependendo da concentração de suspensão (dentro da faixa de 5-8% ou inferior), uma única corrida leva de 2 a 5 minutos ou mais.
NOTA: Quando o analisador detectar automaticamente um bloqueio de abertura por configurações de detecção de bloqueio do SOM, ele abortará a execução, lava para desbloquear a abertura e iniciar uma nova execução. Esta ação de bloqueio é definida para repetir ao máximo por quatro vezes antes que o analisador cancele a operação de execução. Este problema de bloqueio de abortagem pode ser superado por meio de dois métodos técnicos, conforme observado na Tabela 2 e detalhado na discussão. - Se necessário, execute uma repetição técnica (ver Tabela 2 e detalhado em Discussão) usando a mesma suspensão de eletrólitos de amido, simplesmente clicando em Iniciar ou Repetir na barra de ferramentas inferior.
- Após a conclusão de uma corrida ou repetição, esvazie o béquer, enxágue-o com metanol e recarregue-o com uma solução de eletrólito fresco de 100 mL para a próxima corrida.
- Durante uma execução, se uma caixa de notificação de Faixa de Tamanho Estendido aparecer quando a contagem de grânulos maiores que 60 μm exceder 0,1% da contagem total (de acordo com a configuração SOM), clique em Executar de 60% a 80% para executar uma faixa de dimensionamento dinâmico estendida para 80% do diâmetro da abertura.
NOTA: A configuração de faixa de tamanho estendido controla ações para grânulos maiores que 60% do diâmetro de abertura (100 μm, neste caso). A configuração no SOM especifica a inclusão de grânulos de amido superiores a 60 μm quando suas contagens atingem mais de 0,1% da contagem total. A conclusão da corrida ainda é controlada pela contagem total, podendo levar um pouco menos tempo do que de outra forma sem a inclusão dos grânulos maiores totalizando menos de 0,1% (quantidade supostamente insignificante) da contagem total.
- Analise os resultados da execução
- Se um SOM foi usado para controlar as corridas, selecione Configurações de Preferências conforme desejado para visualização, impressão e análises estatísticas dos resultados usando o Assistente de Preferências de Criação ou as Preferências de Edição no SOP no Menu Principal.
- Os resultados de sobreposição de várias corridas em um único gráfico para comparação.
- Clique em Sobreposição na barra de ferramentas principal ou | de arquivos Sobreposição no Menu Principal para acessar a janela Sobreposição. Navegue e selecione vários arquivos de resultados desejados na caixa Arquivos, clique em Adicionar para movê-los para a caixa Arquivos Selecionados e clique em OK para sobrepor os resultados selecionados em um único gráfico.
- Para adicionar um arquivo a uma sobreposição aberta, clique em RunFile | Abra para sobreposição no Menu Executar para acessar a janela Sobreposição, navegar até o arquivo desejado e clicar para adicionar.
- Resultados médios de análises de replicação (2 extratos x 2 amostragem de amido ou 3 extratos x 1 amostragem de amido), e visualizar ou imprimir a distribuição média do tamanho do grânulo e estatísticas em uma lista ou gráfico.
- No menu principal, clique em Arquivo | FileTool | Média para abrir a janela Média. Navegue e selecione vários arquivos de resultados desejados na caixa Arquivos, clique em Adicionar para movê-los para a caixa Arquivos Selecionados e clique em OK para mediar os resultados selecionados e exibir a média em um único gráfico.
- Para incluir um arquivo de resultado adicional em uma distribuição média, no Menu Executar, clique em Executar | Abrir e Adicionar à Média para abrir a janela Adicionar à Média, navegar e adicionar o arquivo. A nova média aparece no gráfico na janela ou listagem de Executar (resultado).
5. Especificando a distribuição média
- Na janela Executar-Menu exibindo a distribuição média, clique em Calcular | Estatísticas médias no Menu Executar para abrir a janela de resumo de estatísticas, que exibe as estatísticas médias em linhas, e as estatísticas de gráficos para a distribuição média nas colunas.
- Use a média geométrica
gráfica () e S.D.(s*)na coluna de estatísticas de gráficos para especificar a distribuição média na forma x/s*. Calcular as variações de medição de CV entre as distribuições médias de replicação dividindo a média (μ, a mesma da distribuição média) das médias das distribuições médias com a média de S.D. (σ) listada na linha média estatística.
NOTA: A média de S.D. (para μ) que avalia variações entre os meios das distribuições de replicação é diferente da S.D. geométrica gráfica (para ) medir a propagação da distribuição média.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para validar o procedimento e demonstrar a reprodutibilidade da distribuição determinada do tamanho do grânulo, foram realizadas análises de dimensionamento de amostras de amido de doces. Preparamos amostras de amido replicante (S1 e S2) de potes doces cultivados em campo de uma linha de reprodução SC1149-19 em idade de desenvolvimento semelhante usando um procedimento descrito anteriormente28. De cada extrato de amido, duas alíquotas de 0,5 g (a e b) foram amostradas, suspensas em 5 mL de metanol e sônicas com vários pulsos de ultrassom de baixa energia para quebrar agregados. Cada um dos dois pares de suspensões de amido-metanol foi amostrado para fazer uma suspensão de eletrólitos de amido, que foi então dimensionada duas vezes (corridas de repetição técnica) usando o SOM descrito acima para uma contagem total de 125.000 grânulos cada. Para cada corrida de tamanho único, uma vez que a contagem total atinja mais de ~65.000 e ~125.000, a média geométrica geométrica(s*)e geométrica da distribuição de volume diferenciado exibida não mudam mais significativamente, respectivamente. Cada par de repetições corre usando uma suspensão de amido-metanol foi mesclado após a conclusão para uma contagem de tamanho total de 250.000.
A Figura 1 mostra distribuições diferenciais de volume-percentual de volume-equivalente-diâmetro da esfera (S1a, S1b, S2a e S2b) para as quatro análises de dimensionamento de réplica das amostras de amido de docepotato e sua distribuição média. O CV para a média dos meios geométricos das quatro distribuições de réplica foi de 3,75 %, demonstrando uma excelente reprodutibilidade dos resultados de dimensionamento. Cada uma das quatro distribuições de réplica foi determinada a partir de um tamanho amostral muito grande de 250.000 grânulos, excedendo muito as contagens mínimas (~65.000 e ~125.000) acima das quais a média geométrica gráfica s.D.(s*)e geométrica () da distribuição diferencial de tamanho de volume exibida em um único tamanho não mudam mais significativamente. Portanto, as distribuições determinadas de tamanho de volume de réplica foram todas estatisticamente válidas. Para maior precisão e comparabilidade (discutidas abaixo) da especificação de determinadas distribuições de tamanho de grânulo lognormal, todas essas distribuições foram especificadas usando seus meios geométricos gráficos () e S.D.(s*)em um formulário x/ (multiplique e divida) comolistado no gráfico. Observe que a distribuição do tamanho do grânulo do amido sweetpotato foi rigorosamente equipada para ser lognormal como descrito anteriormente28.
Figura 1: Distribuições de tamanho de volume-esfera de volume-volume de volume-equivalente de volume-equivalente lognormal a partir de análises de dimensionamento de réplica de amostras de amido de doces. O esquema amostral das quatro análises de dimensionamento de réplica foi detalhado no resultado. As quatro distribuições (S1a, S1b, S2a e S2b) a partir de análises de replicação e sua média foram sobrepostas e especificadas utilizando a forma x/(multiplique e divida) s* . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 2 mostra as distribuições médias (ou médias) cumulativas (<) de tamanho e volume percentual das quatro análises de dimensionamento de réplica, que foram vistas de transformação da distribuição média diferencial de tamanho em volume percentual. A comparação entre o número acumulado e as porcentagens de volume de grânulos de amido mostrou que os grânulos com diâmetros de esfera equivalente de volume menor foram responsáveis por percentuais muito maiores da contagem total do que o volume total. Por exemplo, o número de grânulos com diâmetros de esfera equivalente de volume menor ou igual a 9,976 μm representou 48,53% da contagem total, mas apenas 5,854% do volume total.
Figura 2: Distribuições médias cumulativas (<) de tamanho e volume-percentual de grânulos de amido das quatro análises de dimensionamento de réplica de amostras de amido de doce depotato. As duas distribuições são vistas de transformação da distribuição de tamanho médio na Figura 1. O gráfico compara as porcentagens cumulativas (<) (eixo Y esquerda) com o volume (eixo Y direito) dos grânulos de amido com tamanhos de esfera equivalente de volume menor ou igual a bins de tamanho específico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Diâmetro da abertura (μm) | Faixa de diâmetro de partículas (μm) | Faixa de volume de partículas (μm3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0.524 - 33,5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1.44 - 92.0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
Tabela 1: Três tubos de abertura mais úteis para dimensionar grânulos de amidos de espécies de cultura.
| Configurações SOM | Seleção | |
| Descrição | Descrição SOM | Dimensionamento de grânulos de amido |
| Autor som | - | |
| Descrição da amostra | Amostras de amido de sweetpotato | |
| Eletrólito | 50 g L-1 Cloreto de Lítio | |
| Dispersante | Não | |
| Abertura | 100 μm | |
| Modo de controle | Modo de controle | Contagem Total [250.000] ou [125.000]a |
| Tanque de Resíduos | Quando 80% cheio | |
| Configurações de execução | Digite informações de amostra | Sim |
| Número de corridas | 1 (ou 2, para repetição de corridas) | |
| Tubo de abertura de descarga antes de executar | Sim | |
| Tubo de abertura de descarga após a execução | Sim | |
| Salvar arquivo | Sim, incluindo dados de pulso | |
| Dados de exportação | Sim | |
| Relatório de impressão | Sim | |
| Compare com as especificações da amostra | Não | |
| Ver | Tamanho | |
| Configurações de agitação | Béquer de amostra | 100 ml Multisizer 4 ST |
| Use agitador | Sim | |
| Velocidade | [15], CW (relógio sábio) | |
| Posição de agitador | Automático | |
| Limiar, Corrente e Ganho | Limiar de dimensionamento | 2 μm |
| Corrente de abertura | 1600 mA | |
| Ganho de pré-amísia | 2 | |
| Faixa de tamanho estendido b | Quando a contagem [> 0,1%] da contagem total | |
| Configurações de pulso para tamanho | Caixas de tamanho | 400 |
| Faixa de tamanho | 2 a 60 μm | |
| Espaçamento de lixo | Diâmetro do tronco | |
| Correção de coincidência | Sim | |
| Edição de pulso | Não | |
| Concentração | Quantidade amostral | 0,2 ml |
| Densidade | - | |
| Use fator de pré-diluição | - | |
| Volume analítico | - | |
| Volume de eletrólitos | 100 ml | |
| Use fator de diluição | Não | |
| Bloqueio | Detecção de bloqueio | Automático (Desde o início da corrida) |
| Detecção de bloqueio padrão: quando a taxa de contagem <20%, taxa de abertura >40%, ou pico de concentração >40%. | ||
| Ação de bloqueio | Cancelar, desbloquear e reiniciar,Até [4] vezes | |
| Ícone de show | Sim | |
| Monitor de bloqueio | Taxa de contagem | |
| a: Se repetido desbloquear e reiniciar não conseguiu completar a execução de maior contagem, faça duas repetições de dimensionamento de uma contagem total menor de 125.000 cada uma da mesma suspensão de eletrólitos de amido e mesclam os resultados das corridas de repetição usando [MergeRuns] sob [FileTools] de [Arquivo] no menu principal. Alternativamente, substitua a suspensão de ontelílito-amido por uma nova com menor concentração nominal (2-5%). Ao preparar uma nova suspensão de estetrólito de amido-eletrólito, sonicar o pulso-suspensão de ceto-metanol novamente para quebrar mais agregados. | ||
| b: A Faixa de Tamanho Estendido controla ações para grânulos maiores que 60% do diâmetro de abertura (100 μm neste SOM). A configuração especifica a inclusão de grânulos de amido superiores a 60 μm quando suas contagens são maiores que 0,1% da contagem total. | ||
Tabela 2: Configurações típicas do SOM para controlar o dimensionamento são para amostras de amido de pote doce.
| Configurações de preferência | Seleção | |
| Relatórios impressos | Informações da amostra | Amostra, Número de execução, caixas de tamanho, contagem total |
| Gráficos de tamanho | Volume diferencial %, Log X Eixo, Suave por Grupos de Sete | |
| Estatísticas de tamanho | Volume, Volume % | |
| Estatísticas médias | Valor total, média, S.D. | |
| Estatísticas de sobreposição | Valor total, média, S.D. | |
| Lista | Colunas: Número da lixeira, diâmetro da lixeira (centro), número diff. , número diff. | |
| Bin Grouping: Bin Group Size 7, All Bins, Sum Bins in Group. | ||
| Estatísticas | Tipo | Geométrico |
| Gama | Todos | |
| Resultados para imprimir | Faixa, Valor Total, Média, SD, 95% Limites de Confiança | |
| Resultados no gráfico | Faixa: Tudo, Valor Total, Média, S.D. | |
| Média e Tendência | Peso médiob | Volume % |
| Distribuiçãoc | Diferencial | |
| Limites | 2 S.D. | |
| Média de pulso | Use pulsos de conversão para faixa de tamanho | |
| Exportação | Itens de dados | Informações da amostra, estatísticas, estatísticas médias, listagem de tamanho |
| Extensão de exportação | .xls | |
| Formato de número | 123456.78 | |
| Formato de dados | Tab Delimitado | |
| Pasta de exportação | Pasta atual | |
| Configuração da página | Inclua título personalizado, gráficos de impressão usando a cor da tela inclua data | |
| Tamanho do gráfico: | Meia Página | |
| Opção de gráfico | Exibir: | Impressora de tela e cores |
| Cor da linha | (Padrão) | |
| Estilo de linha | (Padrão) | |
| Lenda | Top Right | |
| Tamanho | (Padrão) | |
| Estilo gráfico | Passo | |
| Estilo limite | Curva | |
| Fontes e Cores | Fontes padrão e cores padrão ou conforme desejado. | |
| Ver opções | Exibição padrão | Tamanho, Gráfico |
| Eixo tamanho X | Diâmetro | |
| Medição | Partículas | |
| Símbolo de litro | L (mL, μL, fL) | |
| Dados de pulso multissizer | Gráfico no máximo 5010 pulsos, listar no máximo 5010 pulsos | |
| Unidades de volume | μm3 | |
| Números | 123456.78 | |
| a: A média geométrica e as estatísticas de S.D. especificadas aqui são gráficas que definem a escala e a forma da determinada distribuição de tamanho de esfera equivalente de volume-percentual de volume diferencial. Eles são usados para especificar a distribuição lognormal no formulário x* x* x* | ||
| b: A ponderação média refere-se à forma como os resultados de várias corridas são mediados por diferentes opções de ponderação. Altere essas configurações no Menu Executar para diferentes opções de média e visualização. | ||
| c: Selecione [Calcular] para abrir [ Estatísticas Médias] no [Menu executar] para ver as estatísticas médias em linhas, as estatísticas de gráfico para a distribuição média na coluna "Média". | ||
Tabela 3: Configurações típicas de preferência para exibição, análises e impressão de resultados de tamanhos para amostras de amido de pote doce.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O procedimento delineado resolveu algumas questões críticas em vários métodos existentes para análises de tamanho de grânulo de amido, incluindo dimensionamento 1D ou 2D inadequado de grânulos 3D, distorção das medidas de dimensionamento devido a formas de grânulo não uniforme, baixa reprodutibilidade e validade estatística duvidosa devido a tamanhos limitados de amostra de granulo, especificações imprecisas ou inadequadas (especialmente o uso do tamanho médio) de tamanhos de grânulo na presença de forma de grânulo e distribuições de tamanhos não normais. Ele usa a técnica ESZ que mede tamanhos 3D (volume) de grânulos de amido e não responde às formas de grânulo. O projeto para derivar a distribuição média do tamanho do grânulo a partir de análises de réplica com um tamanho amostral de granulo muito grande (4 x 250.000) não só torna o resultado estatisticamente válido e mais reprodutível, mas também mitiga tecnicamente distorções de medição por grânulos agregados e danificados para melhorar a precisão de dimensionamento (explicado abaixo). Como demonstrado nos resultados representativos, o CV para a média dos meios geométricos de distribuições de replicação determinadas utilizando o procedimento é geralmente menor que 5%, indicando uma reprodutibilidade satisfatória dos resultados. Além disso, a especificação multiplicativa tanto da escala ( ) quanto da forma(s*) da distribuição de volume-esfera equivalente do grânulo lognormal retrata com mais precisão a verdadeira natureza dos tamanhos de granulo distribuídos em uma amostra de amido, e é simples de usar e universalmente comparável entre as análises de dimensionamento de grânulos de amidos de mesmas ou diferentes fontes. Portanto, o procedimento permite uma determinação mais precisa, reprodutível e estatisticamente válida dos tamanhos do grânulo de amido e especificação adequada das distribuições determinadas de tamanhonormal de enrasco de grânulo. É aplicável a todas as análises de dimensionamento de grânulos de amostras de amido em escala de grama, e pode se tornar uma ferramenta essencial para estudos sobre como as dimensões do grânulo de amido são moldadas pelo aparelho de biossíntese de amido e mecanismos em tecidos acumulados de amido vegetal, e como eles impactam propriedades e funcionalidades de amidos para usos alimentares e industriais.
Grânulos de amido são partículas estéreo com formas não esféricas, de modo que seus tamanhos devem ser definidos e medidos em termos 3D. Assim, os volumes de grânulos de amido definem melhor seus tamanhos, e o diâmetro da esfera equivalente de volume é o único parâmetro de tamanho 1D que pode ser usado para descrever adequadamente os tamanhos do grânulo 3D, uma vez que nenhum objeto estéreo além da esfera pode ser definido com um único parâmetro de tamanho 1D. Além disso, grânulos de amido de todas as espécies vegetais possuem um conjunto de formas com várias frequências de ocorrência. Na presença de tal distribuição de formas, quaisquer técnicas de dimensionamento de partículas que respondam às formas de partículas, por exemplo, a técnica de difração a laser, não são adequadas para determinações reprodutíveis e estatisticamente válidas das distribuições de tamanho do grânulo de amido, pois o erro do sistema inerente a essas técnicas não pode ser facilmente corrigido com um fator de forma. De fato, a taxa de erro (CV) entre as análises de réplica dos tamanhos do granulo da mesma amostra de amido de docinho doce usando a técnica de difração a laser pode chegar a 15-20%28, indicando resultados de dimensionamento muito pouco reprodutíveis. Infelizmente, o impacto das formas de grânulo no dimensionamento de grânulos de amido foram negligenciados, o que resultou em um grande corpo de dados duvidosos de tamanho de grânulo de amido adquiridos usando técnicas de dimensionamento de partículas responsivas na literatura.
A especificação multiplicativa de dois parâmetros define tanto a escala ( ) quanto a forma(s*) de distribuições lognormal, e é até agora mais precisa e significativa do que um único descritor de tamanho médio ou uma faixa de tamanho26. Os intervalos multiplicativo x/s*, x/ (s*)2, e x/ (( s*)3, correspondentes a ± 
s, ± 2s, e ± intervalos de 3s de distribuição normal, abrangem aproximadamente 68,3%, 95,5%, e intervalos de confiança de 99,7% de uma distribuição lognormal,respectivamente 27. A média geométrica ( ) e S.D. (s*) de uma distribuição de tamanho de grânulo lognormal correspondem à média geométrica gráfica e S.D. da curva de distribuição de tamanho, que são calculadas pelo software analisador e podem ser selecionadas para exibir no gráfico tamanho na tela durante uma execução de dimensionamento ou análises dos resultados. É, portanto, bastante conveniente e simples usar a especificação multiplicativa. Além disso, o e s* foram demonstrados ter diferentes implicações fisiológicas associadas ao aparelho de biosíntese de amido28. As distribuições em tamanho de volume de grânulos de várias espécies vegetais podem muito bem ser todas lognormal, uma vez que a formação de grânulos de amido em tecidos acumulados de amido vegetal cai em um sistema complexo de evolução não constrangido31 ou uma rede de reação catalítica intracelular32 característica de uma distribuição lognormal. As distribuições do tamanho do grânulo bimodal de amidos de algumas espécies vegetais, como as do trigo13,14,poderiam ser consideradas como duas distribuições lognormais. Portanto, a especificação multiplicativa das distribuições de tamanho de volume-esfera de volume equivalente de volume-equivalente do grânulo também pode permitir uma comparação universal estatisticamente válida dos tamanhos de granulosos determinados a partir de amidos de várias fontes vegetais e por diferentes medições, uma vez que a forma de volume-equivalente de diâmetro e s* é sem demensão.
Uma contagem total apropriada de dimensionamento de grânulos para a análise de uma amostra de amido (em metanol), que representa o tamanho da amostra do grânulo, é mais crítica para a determinação bem sucedida da distribuição do tamanho do grânulo da significância estatística para a amostra de amido. No caso das amostras de amido de oz-amido de doce, uma vez que a contagem total em uma única corrida atinge mais de ~65.000 e ~125.000, a média geométrica geométrica (s*)e geométrica da curva de distribuição de volume-tamanho diferencial exibida não muda mais significativamente, respectivamente, indicando contagens mínimas para o s* e de significância estatística. A redundância amostral no dimensionamento de 250.000 grânulos para uma amostra de amido-metanol no procedimento destina-se a descontar para os grânulos agregados e danificados na piscina de granulos do tamanho. Mesmo assumindo que os grânulos agregados e danificados ou quebrados representaram 50% da contagem total de 250.000 grânulos em uma execução completa ou duas repetições mescladas, a S.D. geométrica gráfica e a média da distribuição determinada não teriam sido significativamente impactadas, pois teriam sido ancorados pelos grânulos intactos de metade da contagem total. Além disso, quanto mais redução do tamanho do volume dos grânulos danificados ou quebrados, menor o impacto que eles têm na distribuição. Isso ocorre porque grânulos menores levam uma porcentagem numédula maior, mas menores percentuais de volume dos grânulos de tamanho total. Como demonstrado pela comparação entre o número e o volume de distribuições cumulativas para a mesma distribuição média na Figura 2,os grânulos de amido com diâmetro de esfera equivalente menor ou igual a 9,967 μm representaram cerca de 48,53% do número total, mas apenas 5,854% do volume total. Assim, quaisquer grânulos danificados ou quebrados inferiores a 10 μm teriam um impacto muito pequeno na distribuição diferencial de tamanho em volume percentual. Para amostras de amido de outras fontes vegetais, uma contagem total apropriada para suas análises de dimensionamento pode ser a que dobra a contagem mínima sobre a qual a média geométrica gráfica () da distribuição de tamanho exibido em um ensaio não muda mais significativamente.
Tecnicamente, o passo mais crítico para uma corrida de dimensionamento é deixar cair uma quantidade adequada da suspensão amido-metanol para o eletrólito para uma faixa ideal de 5 a 8% de concentração nominal para a suspensão de o amido-eletrólito. Para alcançar o objetivo, o tamanho da queda e a concentração da suspensão amido-metanol podem ter que ser ajustados através de corridas de teste. Concentrações das suspensões de ontelílitos de amido maiores do que a faixa ideal aumentam os riscos de redução da precisão de dimensionamento, e bloqueios frequentes de abertura levando à realização de abortos, o que poderia tornar muito difícil completar uma corrida. Mas, uma concentração muito baixa (por exemplo, <2%) da suspensão do onte-eletrólito de amido pode prolongar uma corrida demais, e distorcer frequências de grânulos em várias caixas de tamanho devido à amostragem não aleatória de grânulos, o que poderia levar a uma taxa de erro inaceitável (o CV médio > 5%) para uma análise de réplica. A contagem total para uma corrida de dimensionamento também tem um grande impacto na concentração ideal de uma suspensão de esteldo de amido, daí sobre a quantidade e concentração do amido-metanol adicionado. Quanto maior a contagem total para uma corrida, maior o tempo para a conclusão da corrida e, portanto, mais riscos para bloqueios de abertura levando à realização de abortos. O problema do bloqueio de abertura por agregados piora quando tubos de abertura de diâmetros menores são usados para grânulos de amido de tamanhos menores, o que torna muito difícil analisar pequenos grânulos de amido (< 2 μm). Esta é, de fato, a maior desvantagem ou limitação do procedimento. O problema do bloqueio de abertura pode ser aliviada até certo ponto usando alguns meios técnicos. Pode-se usar mais sônica para quebrar agregados (inevitavelmente mais grânulos danificados também) em uma suspensão de amido-metanol, e/ou uma suspensão de eletrólitos de amido diluído em concentrações nominais de 2-5%. Alternativamente, pode-se usar corridas de repetição técnica de dimensionamento da contagem total mínima para distribuiçõesestáveis * e das distribuições de tamanho para um tipo de amido (por exemplo, cerca de 125.000 contagens para amido de docepotato) a partir da mesma suspensão de o amido-eletrólito, e mesclar os resultados das repetições. Cada uma das quatro distribuições de réplica (S1a, S1b, S2a e S2b) mostradas na Figura 1 foram de duas repetições técnicas mescladas de dimensionamento de 125.000 grânulos cada uma da mesma suspensão de estetrólitos de amido. Ambos os métodos precisam ser bem testados, pois podem aumentar a taxa de erro de replicação para um nível inaceitável (ou seja, o CV > médio; 5%).
Análises técnicas e biológicas de dimensionamento de amostras de amido de fontes vegetais em condições fisiológicas semelhantes melhoram a reprodutibilidade e a precisão da distribuição determinada do tamanho médio do grânulo. Na prática, três ou quatro réplicas biológicas de amostras de amido podem ser extraídas independentemente do mesmo tecido sob uma condição específica. Mas, verificamos anteriormente que não havia diferença significativa nas taxas de erro (CV e Erros Padrão para a média), e s* entre a distribuição média do tamanho do grânulo derivada de distribuições de quatro réplicas biológicas (ou seja, um dimensionamento x uma suspensão x 4 extratos) e a de duas amostragem técnica cada uma de duas réplicas biológicas (ou seja, uma de tamanho x 2 suspensões de amido-metanol x 2 extratos)28. Assim, as amostras de replicação biológica poderiam ser reduzidas a duas, pelo menos para o amido de doces. Outras etapas e parâmetros técnicos que poderiam ser modificados ou ajustados foram especificamente observados abaixo de cada uma das etapas ou do parâmetro específico no procedimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar
Acknowledgments
Este trabalho é parcialmente apoiado pelo Centro de Pesquisa agropecuária cooperativa e pelo Centro Integrado de Pesquisa em Segurança Alimentar da Faculdade de Agricultura e Ciências Humanas da Prairie View A&M University. Agradecemos a Hua Tian por seu apoio técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. BeMiller, J., Whistler, R. , Academic Press. Ch. 3 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch - Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R. Starch: Metabolism and Structure. Nakamura, Y. , Ch. 13 425-441 (2015).
- Wang, S. -q, Wanf, L. -l, Fan, W. -h, Cao, H., Cao, B. -s Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T. The Mie Theory: Basics and Applications. Wolfram, H., Wriedt, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. ÅS., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch - Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , QLD. Australia. 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
