Summary
Aquí se presenta un procedimiento para determinaciones reproducibles y estadísticamente válidas de distribuciones de tamaño de gránulo de almidón y para especificar las distribuciones de tamaño lognormal de gránulo determinada mediante un formulario multiplicativo de dos parámetros. Es aplicable a todos los análisis de tamaño de gránulos de muestras de almidón a escala de gram para la investigación de la ciencia vegetal y alimentaria.
Abstract
El almidón de todas las fuentes vegetales se compone de gránulos en una gama de tamaños y formas que tienen diferentes frecuencias de ocurrencia, es decir, exhibiendo un tamaño y una distribución de laforma. Los datos de tamaño de gránulo de almidón determinados utilizando varios tipos de técnicas de dimensionamiento de partículas a menudo son problemáticos debido a la mala reproducibilidad o la falta de significación estadística resultante de algunos errores sistemáticos insuperables, incluyendo sensibilidad a las formas de gránulos y límites de tamaños de muestras de gránulos. Delineamos un procedimiento para determinaciones reproducibles y estadísticamente válidas de distribuciones de tamaño de gránulo de almidón utilizando la técnica de zona de detección eléctrica, y para especificar las distribuciones de tamaño lognormal de gránulos determinadas utilizando una forma multiplicativa de dos parámetros adoptada con mayor precisión y comparabilidad. Es aplicable a todos los análisis de tamaño de gránulos de muestras de almidón a escala de gram, y, por lo tanto, podría facilitar estudios sobre cómo los tamaños de gránulos de almidón son moldeados por el aparato y mecanismos de biosíntesis de almidón; y cómo afectan a las propiedades y funcionalidades de los almidones para usos alimentarios e industriales. Los resultados representativos se presentan a partir de análisis de réplicas de distribuciones de tamaño de gránulo de muestras de almidón de camote utilizando el procedimiento descrito. Además, discutimos varios aspectos técnicos clave del procedimiento, especialmente, la especificación multiplicativa de las distribuciones de tamaño lognormal de gránulos y algunos medios técnicos para superar el bloqueo frecuente de apertura por agregados de gránulos.
Introduction
Los gránulos de almidón son la estructura física en la que dos polímeros homoglucanos de reserva principal en la fotosíntesis vegetal y los tejidos de almacenamiento, la amilosa lineal o escasamente ramificada y la amiloidpectina altamente ramificada, están embalados ordenadamente junto con algunos componentes menores, incluyendo lípidos y proteínas. Los gránulos de almidón de varias especies vegetales exhiben muchas formas tridimensionales (3D) (revisadas en los puntos1,2),incluyendo esferas, elipsoides, poliedro, plaquetas, cubos, cuboides y túbulos irregulares. Incluso aquellos del mismo tejido o diferentes tejidos de la misma especie vegetal podrían tener un conjunto de formas con diferentes frecuencias de ocurrencia. En otras palabras, los gránulos de almidón de una especie vegetal pueden tener una distribución característica de la forma estadística, en lugar de una forma específica. Las formas de gránulos no uniformes y no esféricos hacen que sea difícil medir y definir correctamente los tamaños de gránulos de almidón. Además, los gránulos de almidón de los mismos tejidos de una especie vegetal son de una gama de tamaños con diferentes proporciones, es decir, exhibiendo una distribución de tamaño característica. Esta distribución del tamaño complica aún más el análisis y la descripción de los tamaños de gránulos de almidón.
Los tamaños de gránulos de almidón se han analizado utilizando varias categorías de técnicas de dimensionamiento de partículas (revisadas en la referencia3),incluyendo microscopía, sedimentación/fraccionamiento de flujo de campo estetérico (Sd/StFFF), difracción láser y zona de detección eléctrica (ESZ). Sin embargo, estas técnicas no son igualmente adecuadas para la determinación de tamaños de gránulos de almidón en presencia de una forma de gránulo y una distribución de tamaño. La microscopía, incluyendo microscopía electrónica ligera, confocal y de barrido, es excelente para los estudios de morfología4,5,6,7,estructura8,9 y desarrollo10,11 de gránulos de almidón, pero difícilmente adecuado para definir sus distribuciones de tamaño debido a algunas deficiencias inherentes. Mediciones directas de imágenes microscópicas de gránulos o análisis de imágenes asistidas por software de datos de microscopía óptica (IAOM), que se han utilizado para la determinación de tamaños de gránulos de almidones de varias especies, incluyendo maíz12,trigo13,14,papa15 y cebada16,puede medir sólo 1D (generalmente longitud máxima) o 2D (superficie) tamaños de números muy limitados (decenas a unos pocos miles) de imágenes de gránulos de almidón. Los pequeños tamaños de muestreo de gránulos que están inherentemente limitados por las técnicas rara vez podrían ser estadísticamente representativos, teniendo en cuenta los enormes números de gránulos por unidad de peso de almidón (~ 120 x 106 por gramo, asumiendo todas las esferas de 10 μm a 1,5 g/cm³ de densidad), y, por lo tanto, podría conducir a la mala reproducibilidad de los resultados. La técnica Sd/StFFF puede tener alta velocidad y resolución, y fracciones de tamaño estrecho de gránulos de almidón17,pero rara vez se ha utilizado probablemente porque su precisión podría verse gravemente afectada por daños, diferentes formas y densidad de gránulos de almidón. La técnica de difracción láser es la más utilizada, y se ha aplicado para análisis del tamaño del gránulo de almidón para todas las especies de cultivos principales3,14,16. Aunque la técnica tiene muchas ventajas, en realidad no es adecuada para determinaciones de tamaños de gránulos de almidón en presencia de una distribución de forma de gránulo. La mayoría de los instrumentos de difracción láser concurrentes se basan en la teoría de dispersión de luz Mie18 para partículas esféricas uniformes y la teoría mie modificada18 para algunas otras formas de uniformidad. La técnica es, por lo tanto, inherentemente muy sensible a las formas de partículas, y no es del todo adecuada incluso para ciertas formas de uniformidad19,y mucho menos para los gránulos de almidón que tienen un conjunto de formas de diferentes proporciones. La técnica ESZ mide la perturbación del campo eléctrico proporcional al volumen de la partícula que pasa a través de una abertura. Proporciona tamaños de volumen de gránulos, así como la información de distribución de número y volumen, etc., a altas resoluciones. Dado que la técnica ESZ es independiente de cualquier propiedad óptica de partículas como el color, la forma, la composición o el índice refractario, y los resultados son muy reproducibles, es particularmente adecuado para determinar las distribuciones de tamaño de los gránulos de almidón que tienen un conjunto de formas.
Los tamaños de gránulo de almidón también se han definido mediante el uso de muchos parámetros. A menudo fueron descritos simplistamente por diámetros medios, que en algunos casos eran los medios aritméticos de las longitudes máximas microscópicamente medidas de imágenes 2D12,20, o promedios de diámetros de esfera equivalentes3. En otros casos, las distribuciones de tamaño de gránulo se especificaron utilizando rangos de tamaño21,22, el volumen medio de distribución o diámetro medio (equivalente a esfera, ponderado por número, volumen o superficie) suponiendo una distribución normal14,23,24,25,26. Estos descriptores de tamaños de gránulos de almidón de varios análisis son de una naturaleza muy diferente, y no estrictamente comparables. Podría ser muy engañoso si estos "tamaños" de gránulos de almidón de diferentes especies o incluso los mismos tejidos de la misma especie fueran comparados directamente. Además, el parámetro de dispersión (o forma) de las distribuciones normales asumidas, es decir, la desviación estándar σ (o desviación estándar gráfica σg)que mide el ancho de la distribución (es decir, la dispersión de los tamaños), se ha ignorado en la mayoría de los estudios.
Para resolver los problemas críticos antes mencionados que enfrentan los análisis de tamaño de gránulos de almidón, delineamos un procedimiento para determinar reproducibles y estadísticamente válidos las distribuciones de tamaño de gránulo de muestras de almidón utilizando la técnica ESZ, y para especificar correctamente las distribuciones de tamaño lognormal de gránulos determinadas utilizando una forma multiplicativa de dos parámetros adoptada27 con mayor precisión y comparabilidad. Para la validación y demostración, realizamos análisis de tamaño de gránulo de réplica de muestras de almidón de camote utilizando el procedimiento, y especificamos las distribuciones de volumen diferencial lognormal de volumen-volumen equivalente-esfera de diámetro utilizando sus medios geométricos gráficos 
y desviaciones estándar multiplicativas s* en una forma x/ (multiplicar y dividir).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de muestras de almidón
- Preparar dos (o tres) muestras de almidón de réplica a escala de gramo de tejidos acumulados por almidón de diversas especies vegetales siguiendo los procedimientos establecidos (por ejemplo, patatas15,camotes28,granos de trigo13,29y granos de maíz30,etc.).
- Lave bien las muestras de almidón con acetona o tolueno 3-4x para minimizar los agregados de gránulos y secarlos por completo.
NOTA: Utilice procedimientos de extracción que produzcan más de 1 g de almidón por preparación. Uno o dos coartadas de 0,5 g de cada uno de los tres o dos extractos de réplica, respectivamente, se muestrean para el análisis de tamaño de gránulos de un extracto de almidón.
2. Preparación de electrolitos
- Prepare 500 ml de cloruro de litio de 50 g/L en metanol para cuatro tiradas de tamaño para muestras de almidón de replicación (100 ml por carrera más 100 ml adicionales). Preferiblemente, hacer el electrolito en lotes de gran volumen, por ejemplo, de 4 a 8 L a la vez, para minimizar la variación de concentración.
- Enfríe el recipiente sobre hielo o en un armario de 4 °C para acelerar la disolución del cloruro de litio.
3. Configuración del analizador
- Elija un tubo de apertura con un rango de diámetro de partículas que cubra el rango de tamaño de gránulo conocido (en la literatura o a través de ejecuciones de ensayo) de muestras de almidón que se analizarán, por ejemplo, una apertura de 100 μm para almidones de camote. Para muestras de almidón de rango de tamaño de gránulo desconocido, seleccione una apertura adecuada a través de ejecuciones de prueba utilizando varios tubos de apertura con rangos de diámetro de partículas superpuestos.
NOTA: El rango de diámetro de partículas de un tubo de apertura es su rango de tamaño preciso entre el 2 y el 60% de, y con un rango de tamaño extendido al 80% de su diámetro de orificio. En la Tabla 1 se enumeran las propiedades de tres tubos de apertura más útiles para dimensionar gránulos de almidones de cultivos principales. Si el rango de tamaño de gránulo de una muestra de almidón es más amplio que el rango de tamaño de un solo tubo de apertura, realice un análisis de superposición multitubo que combina hasta cinco distribuciones de tamaño de partícula medidas con aberturas de diferentes tamaños. Cada abertura es identificable por su diámetro y número de pieza etiquetados en el tubo. Su diámetro y número de serie contenidos en un código de barras del tubo se pueden escanear en el software del analizador utilizando el Lector de código de barras en el Panel de control del analizador. - Eligió un vaso de precipitados analítico de 100 o 200 ml (sobre cubetas) para la determinación de tamaños de gránulos de almidón, y configure la agitación automática (abajo) para mantener una buena suspensión de gránulos durante la medición.
- Cree un método operativo estándar (SOM) para especificar la configuración de ejecución y un archivo de preferencias para analizar, ver e imprimir los resultados. Combine el archivo SOM y preferences en un procedimiento operativo estándar (SOP) según sea necesario.
NOTA: Para análisis no estandarizables, utilice SOM para ejecutar los análisis y ajuste la configuración de SOM entre las ejecuciones a través de la ventana Editar SOM (véase más adelante) según sea necesario. Después de la finalización de la ejecución, analice, vea e imprima los resultados de la ejecución cambiando las Preferencias como desee. Para análisis de tamaño de gránulos estandarizables, utilice un SOP para ejecutar los análisis.- Inicie el software del analizador. En el Manu principal, haga clic en SOP | Cree som Wizard o edite el SOM, o en el panel de estado, haga clic en Editar SOM. Utilice el asistente o la ventana Editar SOM para seleccionar la configuración de un SOM. Los ajustes utilizados normalmente para dimensionar gránulos de muestras de almidón de camote se resumen en la Tabla 2.
- Guarde el SOM creado en un archivo en la ventana Som Wizard-Summary of Settings, o en la ventana Edit the SOM.
- En el Manu principal, haga clic en SOP | Crear asistente de preferencias o Editar preferencias. Utilice el asistente o las pestañas de la ventana de edición Preferencias para seleccionar la configuración de preferencias como las de la Tabla 3 u otras como desee.
- Guarde las Preferencias seleccionadas en un archivo en la ventana Crear resumen de configuración del Asistente para preferencias o en la ventana Editar preferencias.
- En el menú principal, haga clic en SOP | Crear asistente SOP. Siguiendo la guía paso a paso del asistente, escriba una descripción, seleccione el archivo SOM y Preferencias para crear y guardar unSOP.
4. Análisis de tamaño de gránulos de las muestras de almidón
- Preparar el analizador
- Encienda el analizador, abra el software en el equipo y verifique el estado Listo en la parte superior del Panel de estado después de su conexión automática al analizador.
- Llene el frasco de electrolitos con electrolito, vacíe el frasco de residuos si es necesario.
- Instale y asegure correctamente el tubo de apertura elegido siguiendo la guía del manual del usuario. Para un tubo de apertura nuevo no calibrado, calibrarlo siguiendo la guía paso a paso en Calibración | Calibrar apertura en el menú principal. Para un tubo de apertura calibrado, verifique la calibración siguiendo la guía paso a paso del Asistente para cambiar tubo de apertura en el | Ejecutar o Calibración| Verifique la calibración de apertura en el menú principal.
- Desbloquee la plataforma de ensayo empujando el clip de liberación de bloqueo (en la parte frontal central de la pared del compartimiento de muestra izquierdo) y baje manualmente la plataforma hasta la parte inferior. Coloque un vaso de precipitados analítico que contenga 100 ml de electrolito en la plataforma, mueva el agitador a la posición de agitación y levante manualmente la plataforma hasta la posición superior autobloqueante para sumergir el tubo de apertura y el agitador en el electrolito.
- Haga clic en Rellenar en la barra de herramientas del instrumento inferior para que el analizador llene automáticamente el sistema con el electrolito y haga clic en Vaciar para que el analizador vacíe automáticamente el sistema.
- Cargue el SOM haciendo clic en SOP | Cargue un SOM en elmenú principal y utilice el SOM para ejecutar un análisis sin un archivo de preferencias. Alternativamente, cargue un SOP haciendo clic en SOP | Cargue un SOP en el menú principal o cargue el SOP en el panel de estado, y utilice el SOP para ejecutar un análisis.
- Si utiliza un SOP, haga clic en SOP | información de SOM o información de preferencias en el menú principal para verificar la configuración de SOM y preferencia. Haga clic en | de ejemplo Introduzca Información de ejemplo en el menú principal o Editar información en el panel de estado para introducir la información de ejemplo de la ejecución.
- Preparar la muestra de almidón-metanol y las suspensiones de tamaño
- Pesar dos o uno muestra de 0,5 g de cada uno de los dos o tres extractos de almidón de réplica, respectivamente.
- Agregue cada uno de los alíquesas de almidón de 0,5 g a 5 ml de metanol en un tubo centrífugo cónico de 50 ml y disperse completamente los gránulos de almidón utilizando varios pulsos de ultrasonido de baja intensidad (12-24 W/cm2)de un procesador ultrasónico.
- Con una pipeta de transferencia desechable, aplique una pequeña gota de la suspensión de almidón-metanol (~0,2 ml) al electrolito de metanol de 100 ml de 50 g/L licl bajo agitación constante en el vaso de precipitados. Cierre la puerta del compartimiento de muestras.
- Realizar una carrera de tamaño
- Haga clic en Vista previa en la barra de herramientas inferior del instrumento para iniciar una ejecución de vista previa. En el Panel de estado, compruebe que la barra de concentración mostrada dinámicamente está en verde y muestra un rango de concentración nominal del 5 al 8 % para la suspensión.
- Haga clic en Detener en la barra de herramientas inferior para detener la ejecución de vista previa. Si es necesario, diluya la suspensión de almidón y electrolito reemplazando una alícuota de la suspensión por el electrolito y, a continuación, repita una ejecución de previsualización.
NOTA: El rango de concentración nominal del 5% al 8% de la suspensión es crítico para completar una carrera sin interrupción debido al bloqueo de apertura por gránulos agregados. Si es necesario, ajuste el tamaño de la muestra de caída y/o la concentración de la suspensión de almidón-metanol para realizar una nueva suspensión de almidón-electrolito que tenga la concentración nominal en el rango óptimo. - Después de la verificación, haga clic en Iniciar en la barra de herramientas inferior para iniciar la ejecución. El analizador completa automáticamente la ejecución una vez que el recuento total de gránulos de tamaño, que se muestra junto con el tiempo de ejecución en el Panel de estado en una ejecución, alcanza el recuento total establecido (125.000 o 250.000) por el modo de control del SOM. Dependiendo de la concentración de suspensión (dentro del rango del 5-8% o inferior), una sola carrera tarda de 2 a 5 minutos o más.
NOTA: Cuando el analizador detecta automáticamente una obstrucción de apertura por configuración de detección de bloqueo del SOM, anulará la ejecución, se vaciará para desbloquear la apertura e iniciar una nueva ejecución. Esta acción de bloqueo se establece para repetirse al máximo durante cuatro veces antes de que el analizador cancele la operación de ejecución. Este problema de bloqueo de anulación de ejecución puede superarse mediante el uso de dos métodos técnicos, como se indica en el Cuadro 2 y detallado en el debate. - Si es necesario, realice una ejecución de repetición técnica (consulte la Tabla 2 y se detalla en Discusión) utilizando la misma suspensión de electrolito de almidón simplemente haciendo clic en Iniciar o Repetir en la barra de herramientas inferior.
- Después de completar una carrera o repetir carreras, vacíe el vaso de precipitados, enjuáguelo con metanol y rellene con solución de electrolito fresco de 100 ml para la siguiente ejecución.
- Durante una ejecución, si aparece un cuadro de diálogo de notificación Rango de tamaño extendido cuando el recuento de gránulos de más de 60 μm supera el 0,1% del recuento total (según la configuración de SOM), haga clic en Ejecutar del 60% al 80% para ejecutar un rango de tamaño dinámico extendido al 80% del diámetro de apertura.
NOTA: El ajuste Rango de tamaño extendido controla acciones para gránulos superiores al 60% del diámetro de apertura (100 μm, en este caso). La configuración del SOM especifica la inclusión de gránulos de almidón superiores a 60 μm cuando sus recuentos alcanzan más del 0,1% del recuento total. La finalización de la ejecución todavía está controlada por el recuento total, y puede tomar un poco menos de tiempo que de otra manera sin incluir los gránulos más grandes que suman menos del 0,1% (cantidad esticamente insignificante) del recuento total.
- Analizar los resultados de la ejecución
- Si se utilizó un SOM para controlar las ejecuciones, seleccione Configuración de preferencias como desee para ver, imprimir y analizar estadísticamente los resultados mediante el Asistente para crear preferencias o el Asistente para editar preferencias en el SOP del menú principal.
- Superposición resulta de varias ejecuciones en un solo gráfico para la comparación.
- Haga clic en Superposición en la barra de herramientas principal o en | archivo Superposición en el menú principal para acceder a la ventana Superposición. Vaya a y seleccione varios archivos de resultado deseados en el cuadro Archivos, haga clic en Agregar para moverlos al cuadro Archivos seleccionados y haga clic en Aceptar para superponer los resultados seleccionados en un solo gráfico.
- Para agregar un archivo a una superposición abierta, haga clic en RunFile | Abra para Superposición en el menú Ejecutar para acceder a la ventana Superposición, vaya al archivo deseado y haga clic para agregar.
- Resultados medios de análisis de réplicas (2 extractos x 2 muestreo de almidón o 3 extractos x 1 muestreo de almidón), y ver o imprimir la distribución y estadísticas de tamaño medio de gránulos en una lista o gráfico.
- En el menú principal, haga clic en Archivo | FileTool | Promedio para abrir la ventana Promedio. Vaya a y seleccione varios archivos de resultado deseados en el cuadro Archivos, haga clic en Agregar para moverlos al cuadro Archivos seleccionados y haga clic en Aceptar para promediar los resultados seleccionados y mostrar el promedio en un solo gráfico.
- Para incluir un archivo de resultado adicional en una distribución media, en el menú Ejecutar, haga clic en Ejecutar | Abrir y Agregar a promedio para abrir la ventana Agregar a promedio, vaya a y agregue el archivo. El nuevo promedio aparece en el gráfico en la ventana Ejecutar (resultado) o en la lista.
5. Especificar la distribución media
- En la ventana Menú de ejecución que muestra la distribución media, haga clic en Calcular | Estadísticas promediadas en el menú Ejecutar para abrir la ventana de resumen de estadísticas, que muestra las estadísticas promedio en las filas y las estadísticas de gráfico para la distribución media en las columnas.
- Utilice la media geométrica gráfica (
) y S.D. (s*) en la columna de estadísticas de gráficos para especificar la distribución media en el formulario x/ s*. Calcule las variaciones de medición de CV entre las distribuciones de réplica promediadas dividiendo la media (μ, la misma que la de la distribución media) de los medios geométricos de las distribuciones promediadas con el S.D. promedio (σ) enumerado en la fila de estadísticas promedio.
NOTA: El S.D. promedio (para μ) que evalúa las variaciones entre los medios de las distribuciones de réplica es diferente de la S.D. geométrica gráfica (para) medir la propagación de la distribución media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para validar el procedimiento y demostrar la reproducibilidad de la distribución determinada del tamaño del gránulo, realizamos análisis de tamaño de réplica de muestras de almidón de camote. Preparamos muestras de almidón de réplica (S1 y S2) de camotes cultivados en campo de una línea de cría SC1149-19 a una edad de desarrollo similar utilizando un procedimiento descrito previamente28. De cada extracto de almidón, dos aliquots de 0,5 g (a y b) fueron muestreados, suspendidos en 5 ml de metanol y sonicados con varios pulsos de ultrasonido de baja energía para romper los agregados. Cada uno de los dos pares de suspensiones de almidón-metanol fue muestreado para hacer una suspensión de almidón-electrolito, que luego se dimensionó dos veces (ejecuciones técnicas repetidas) utilizando el SOM descrito anteriormente para un recuento total de 125.000 gránulos cada uno. Para cada ejecución de tamaño único, una vez que el recuento total alcanza más de ~65,000 y ~125,000, la S.D. geométrica gráfica (s*) y la media geométrica ( ) de la distribución del tamaño de volumen diferencial mostrada ya no cambian significativamente, respectivamente. Cada par de corridas repetidas con una suspensión de almidón-metanol se fusionó después de la finalización para un recuento total de tamaño de 250.000.
La Figura 1 muestra distribuciones diferenciales de volumen-porcentaje de volumen equivalente-diámetro de esfera (S1a, S1b, S2a y S2b) para los cuatro análisis de tamaño de réplica de las muestras de almidón de camote, y su distribución media. El CV para la media de medios geométricos de las cuatro distribuciones de réplica fue del 3,75 %, lo que demuestra una excelente reproducibilidad de los resultados del tamaño. Cada una de las cuatro distribuciones de réplica se determinó a partir de un tamaño de muestreo muy grande de 250.000 gránulos, superando con creces los recuentos mínimos (~65.000 y ~125.000) por encima de los cuales el S.D. geométrico gráfico (s*) y la media geométrica ( ) de la distribución diferencial de tamaño de volumen mostrada en una sola tirada ya no cambian significativamente. Por lo tanto, las distribuciones de tamaño de volumen de réplica determinadas eran todas estadísticamente válidas. Para una mayor precisión y comparabilidad (discutida a continuación) de la especificación de distribuciones de tamaño de gránulo lognormal determinadas, todas estas distribuciones se especificaron utilizando sus medios geométricos gráficos ( ) y S.D. (s*) en una forma x/ (multiplicar y dividir) s* como se muestra en el gráfico. Tenga en cuenta que la distribución del tamaño del gránulo del almidón de camote se ha ajustado rigurosamente para ser lognormal como se describió anteriormente28.
Figura 1: Distribuciones de tamaño de esfera equivalente a volumen diferencial lognormal de réplicas de análisis de tamaño de muestras de almidón de camote. En el resultado se detalló el esquema de muestreo para los cuatro análisis de tamaño de réplica. Las cuatro distribuciones (S1a, S1b, S2a y S2b) de los análisis de réplica y su promedio fueron superpuestas y especificadas utilizando el formulario x/ (multiplicar y dividir). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 2 muestra las distribuciones medias (o medias) de tamaño acumulado (<) de tamaño de número y porcentaje de volumen de los cuatro análisis de tamaño de réplica, que fueron vistas de transformación de la distribución de tamaño de porcentaje de volumen diferencial promedio. La comparación entre el número acumulado y los porcentajes de volumen de gránulos de almidón mostró que los gránulos con diámetros de esfera equivalentes a volumen más pequeños representaban porcentajes mucho mayores del recuento total que el volumen total. Por ejemplo, el número de gránulos que tienen diámetros de esfera equivalentes a volumen más pequeños o iguales a 9.976 μm representaron el 48,53% del recuento total, pero sólo el 5,854% del volumen total.
Figura 2: Distribuciones promedio acumuladas (<) de tamaño de número y porcentaje de volumen de gránulos de almidón de los cuatro análisis de tamaño de réplica de muestras de almidón de camote. Las dos distribuciones son vistas de transformación de la distribución de tamaño medio en la Figura 1. El gráfico compara el número acumulativo (<) (eje Y izquierdo) con porcentajes de volumen (eje Y derecho) de gránulos de almidón que tienen tamaños de esfera equivalentes a volumen inferiores o iguales a ubicaciones de tamaño particular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Diámetro de apertura (μm) | Rango de diámetro de partículas (μm) | Rango de volumen de partículas (μm3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0.524 - 33.5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1.44 - 92.0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
Tabla 1: Tres tubos de apertura más útiles para dimensionar gránulos de almidones de especies de cultivos.
| Configuración de SOM | Selección | |
| Descripción | Descripción del SOM | Tamaño de gránulos de almidón |
| Autor del SOM | - | |
| Descripción de la muestra | Muestras de almidón de camote | |
| Electrólito | 50 g L-1 cloruro de litio | |
| Dispersor | No | |
| Apertura | 100 μm | |
| Modo de control | Modo de control | Recuento total [250.000] o [125.000] |
| Tanque de residuos | Cuando el 80% está lleno | |
| Configuración de ejecución | Introduzca la información del ejemplo | Sí |
| Número de corridas | 1 (o 2, para corridas repetidas) | |
| Enjuague el tubo de apertura antes de correr | Sí | |
| Tubo de apertura al ras después de la carrera | Sí | |
| Guardar archivo | Sí, incluidos los datos de pulsos | |
| Datos de exportación | Sí | |
| Imprimir informe | Sí | |
| Comparar con las especificaciones de la muestra | No | |
| Vista | Tamaño | |
| Ajustes del agitador | Vaso de muestras | 100 ml Multisizer 4 ST |
| Usar agitador | Sí | |
| Velocidad | [15], CW (en cuanto al reloj) | |
| Posición del agitador | Automático | |
| Umbral, corriente y ganancia | Umbral de tamaño | 2 μm |
| Corriente de apertura | 1600 mA | |
| Ganancia de preamplificador | 2 | |
| Rango de tamaño extendido b | Cuando se cuenta [> 0,1%] del recuento total | |
| Ajustes de pulso a tamaño | Contenedores de tamaño | 400 |
| Rango de tamaño | 2 a 60 μm | |
| Espaciado de contenedores | Diámetro del registro | |
| Corrección por coincidencia | Sí | |
| Edición de pulsos | No | |
| Concentración | Importe de la muestra | 0,2 ml |
| Densidad | - | |
| Usar factor de pre-dilución | - | |
| Volumen analítico | - | |
| Volumen de electrolitos | 100 ml | |
| Utilizar factor de dilución | No | |
| Obstrucción | Detección de bloqueo | Automático (Desde el inicio de la ejecución) |
| Detección de bloqueo predeterminada: cuando la tasa de recuento <20%, la tasa de apertura >40% o el pico de concentración >40%. | ||
| Acción de bloqueo | Cancelar, desbloquear y reiniciar, hasta [4] veces | |
| Mostrar icono | Sí | |
| Monitor de bloqueo | Tasa de recuento | |
| a: Si el desbloqueo y reinicio repetidos no pudieron completar la ejecución de mayor recuento, realice dos ejecuciones repetidas de tamaño de un recuento total menor de 125.000 cada una desde la misma suspensión de electrolitos de almidón y combine los resultados de las ejecuciones repetidas mediante [MergeRuns] en [FileTools] de [Archivo] en el menú principal. Alternativamente, reemplace la suspensión de almidón-electrolito por una nueva que tenga una concentración nominal más baja (2-5%). Al preparar una nueva suspensión de electrolito de almidón de muestra caída, vuelva a sonicar el pulso de la suspensión de almidón-metanol para romper más agregados. | ||
| b: El rango de tamaño extendido controla las acciones de los gránulos superiores al 60% del diámetro de apertura (100 μm en este SOM). La configuración especifica la inclusión de gránulos de almidón superiores a 60 μm cuando sus recuentos son superiores al 0,1% del recuento total. | ||
Tabla 2: Los ajustes típicos de SOM para controlar el tamaño se ejecuta para muestras de almidón de camote.
| Configuración de preferencias | Selección | |
| Informes impresos | Información de muestra | Ejemplo, Número de ejecución, Ubicaciones de tamaño, Recuentos totales |
| Gráficos de tamaño | Volumen diferencial %, Eje log X, suave por grupos de siete | |
| Estadísticas de tamaño | Volumen, Volumen % | |
| Estadísticas medias | Importe total, media, S.D. | |
| Estadísticas de superposición | Importe total, media, S.D. | |
| Listado | Columnas: Bin Number, Bin Diameter (centro), Diff. Number, Diff. Number %, Diff. Volume %. | |
| Agrupación de ubicaciones: Tamaño del grupo bin 7, Todos los contenedores, Ubicaciones de suma en grupo. | ||
| Estadísticas | Tipo | Geométrico |
| Gama | todo | |
| Resultados para imprimir | Rango, Monto total, Media, S.D., Límites de confianza del 95% | |
| Resultados en el gráfico | Rango: Todos, Importe total, Media, S.D. | |
| Promedio y tendencia | Ponderación mediab | Volumen % |
| Distribuciónc | Diferencial | |
| Límites | 2 S.D. | |
| Promedio de pulsos | Utilice Convertir pulsos en rango de tamaño | |
| exportar | Elementos de datos | Información de muestra, Estadísticas, Estadísticas promedio, Lista de tamaños |
| Extensión de la exportación | .xls | |
| Formato de número | 123456.78 | |
| Formato de datos | Pestaña Delimitada | |
| Carpeta de exportación | Carpeta actual | |
| Configuración de página | Incluir título personalizado, imprimir gráficos utilizando el color de la pantalla incluir fecha | |
| Tamaño del gráfico: | Media página | |
| Opción de gráfico | Monitor: | Impresora de pantalla y color |
| Color de línea | (Predeterminado) | |
| Estilo de línea | (Predeterminado) | |
| Leyenda | Arriba a la derecha | |
| Tamaño | (Predeterminado) | |
| Estilo gráfico | Paso | |
| Estilo límite | Curva | |
| Fuentes y colores | Fuentes predeterminadas y colores predeterminados o como desee. | |
| Ver opciones | Vista predeterminada | Tamaño, Gráfico |
| Eje tamaño X | Diámetro | |
| Medición | Partículas | |
| Símbolo del litro | L (ml, μL, fL) | |
| Datos de pulsos multisizer | Gráfico a lo sumo 5010 pulsos, Lista como máximo 5010 pulsos | |
| Unidades de volumen | μm3 | |
| Números | 123456.78 | |
| a: Las estadísticas de media geométrica y S.D. especificadas aquí son gráficas que definen la escala y la forma de la distribución de tamaño de esfera equivalente de porcentaje de volumen diferencial determinada. Se utilizan para especificar la distribución lognormal en el formulario x ̅* x/ s*. | ||
| b: La ponderación media se refiere a cómo los resultados de varias ejecuciones se promedian mediante diferentes opciones de ponderación. Cambie esta configuración en el menú Ejecutar para diferentes opciones de promediación y vista. | ||
| c: Seleccione [Calcular] para abrir [ Estadísticas medias] en el [Menú ejecutar] para ver las estadísticas promedio en filas, las estadísticas de gráficos para la distribución media en la columna "Promedio". | ||
Tabla 3: Ajustes de preferencias típicos para ver, analizar e imprimir los resultados de las corridas de tamaño para muestras de almidón de camote.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El procedimiento descrito ha resuelto algunos problemas críticos en varios métodos existentes para los análisis del tamaño de gránulos de almidón, incluyendo el tamaño inadecuado 1D o 2D de gránulos 3D, la distorsión de las mediciones de tamaño debido a formas de gránulos no uniformes, mala reproducibilidad y dudosa validez estadística debido a tamaños limitados de muestras de gránulos, especificación inexacta o incorrecta (especialmente el uso del tamaño promedio) de tamaños de gránulos en presencia de forma de gránulo y distribuciones de tamaño no normales. Utiliza la técnica ESZ que mide tamaños 3D (volumen) de gránulos de almidón y no responde a las formas de gránulos. El diseño para derivar la distribución media del tamaño del gránulo de los análisis de réplicas con un tamaño de muestra de gránulo muy grande (4 x 250.000) no sólo hace que el resultado sea estadísticamente válido y más reproducible, sino que también mitiga técnicamente las distorsiones de medición por gránulos agregados y dañados para mejorar la precisión del tamaño (explicado a continuación). Como se demuestra en los resultados representativos, el CV para la media de medios geométricos de distribuciones de réplica determinadas mediante el procedimiento suele ser inferior al 5%, lo que indica una reproducibilidad satisfactoria de los resultados. Además, la especificación multiplicativa tanto de la escala ( ) como de la forma (s*) de la distribución del tamaño del granulo lognormal equivalente a volumen-esfera representa con mayor precisión la verdadera naturaleza de los tamaños de gránulo distribuidos en una muestra de almidón, y es fácil de usar y universalmente comparable entre los análisis de tamaño de gránulos de almidones de las mismas o diferentes fuentes. Por lo tanto, el procedimiento permite una determinación más precisa, reproducible y estadísticamente válida de los tamaños de gránulos de almidón, y la especificación adecuada de las distribuciones de tamaño lognormal de gránulos determinadas. Es aplicable a todos los análisis de tamaño de gránulos de muestras de almidón a escala de gram, y podría convertirse en una herramienta esencial para los estudios sobre cómo las dimensiones del gránulo de almidón son moldeadas por el aparato de biosíntesis de almidón y los mecanismos en los tejidos que acumulan almidón vegetal, y cómo afectan a las propiedades y funcionalidades de los almidones para usos alimentarios e industriales.
Los gránulos de almidón son partículas estéreo que tienen principalmente formas no esféricas, por lo que sus tamaños deben definirse y medirse en términos 3D. Por lo tanto, los volúmenes de gránulos de almidón definen mejor sus tamaños, y el diámetro de esfera equivalente al volumen es el único parámetro de tamaño 1D único que se puede utilizar para describir correctamente los tamaños 3D del gránulo, ya que no se pueden definir objetos estéreo distintos de la esfera con un único parámetro de tamaño 1D. Además, los gránulos de almidón de todas las especies vegetales poseen un conjunto de formas con varias frecuencias de ocurrencia. En presencia de tal distribución de forma, cualquier técnica de dimensionamiento de partículas que responda a formas de partículas, por ejemplo, la técnica de difracción láser, no son adecuadas para determinaciones reproducibles y estadísticamente válidas de distribuciones de tamaño de gránulo de almidón, ya que el error del sistema inherente a estas técnicas no se puede corregir fácilmente con un factor de forma. De hecho, la tasa de error (CV) entre los análisis de réplicas de tamaños de gránulos de la misma muestra de almidón de camote utilizando la técnica de difracción láser podría alcanzar hasta el 15-20%28,lo que indica resultados de tamaño muy poco reproducibles. Desafortunadamente, el impacto de las formas de gránulos en el tamaño de gránulos de almidón se ha pasado por alto en su mayoría, lo que resultó en un gran cuerpo de datos dudosos del tamaño del gránulo de almidón adquiridos utilizando técnicas de dimensionamiento de partículas sensibles a la forma en la literatura.
La especificación multiplicativa de dos parámetros define tanto la escala ( ) como la forma (s*) de las distribuciones lognormales y, por lo tanto, es mucho más precisa y significativa que un único descriptor de tamaño medio o un rango de tamaño26. El multiplicativo x/ s*, x/ (s*)2, y x/ (s*)3 intervalos, correspondientes a 
± s, ± 2s, y ± intervalos de 3s de una distribución normal, cubre aproximadamente 68.3%, 95.5%, y 99.7% intervalos de confianza de una distribución lognormal, respectivamente27. La media geométrica ( ) y S.D. ( s* ) de una distribución de tamaño de gránulo lognormal corresponden a la media geométrica gráfica y S.D. de la curva de distribución de tamaño, que son calculadas por el software analizador y se pueden seleccionar para mostrar en el gráfico de tamaño en pantalla durante una ejecución de tamaño o análisis de resultados. Por lo tanto, es bastante conveniente y fácil de usar la especificación multiplicativa. Además, se ha demostrado que los y s* tienen diferentes implicaciones fisiológicas asociadas con el aparato de biosíntesis de almidón28. Las distribuciones del tamaño del volumen de gránulos de almidones de varias especies vegetales bien pueden ser todo lognormal ya que la formación de gránulos de almidón en tejidos acumulados de almidón vegetal cae en un sistema complejo en evolución no restringido31 o una red de reacción catalítica intracelular32 característica de una distribución lognormal. Las distribuciones bimodal del tamaño de los gránulos de almidones de algunas especies vegetales, como las del trigo13,14,podrían considerarse como dos distribuciones lognormales. Por lo tanto, la especificación multiplicativa de las distribuciones de tamaño de volumen lognormal de granulo lognormal equivalente a esfera también puede permitir una comparación universal estadísticamente válida de los tamaños de gránulo determinados a partir de almidones de diversas fuentes vegetales y por diferentes mediciones, ya que la es en forma de diámetro de esfera equivalente a volumen y s* no tiene sentido.
Un recuento total apropiado de tamaño de gránulos para el análisis de una muestra de almidón (en metanol), que representa el tamaño de la muestra de gránulos, es más crítico para la determinación exitosa de la distribución del tamaño del gránulo de importancia estadística para la muestra de almidón. En el caso de las muestras de almidón de camote, una vez que el recuento total en una sola tirada alcanza más de ~65,000 y ~125,000, el S.D. geométrico gráfico ( s*) y la media geométrica ( ) de la curva de distribución de tamaño de volumen diferencial mostrada ya no cambian significativamente, respectivamente, indicando recuentos mínimos para la s* y de importancia estadística. La redundancia de muestreo en el tamaño de 250.000 gránulos para una muestra de almidón-metanol en el procedimiento está destinada a descontar para los gránulos agregados y dañados en el grupo de gránulos de tamaño. Aun suponiendo que los gránulos agregados y dañados o rotos representaran el 50% del recuento total de 250.000 gránulos en una ejecución completada o dos corridas repetidas combinadas, la S.D. geométrica gráfica y la media de la distribución determinada no se habrían visto significativamente afectadas ya que habrían sido anclados por los gránulos intactos de la mitad del recuento total. Además, cuanto más reducción del tamaño del volumen de los gránulos dañados o rotos, menos impacto tienen en la distribución. Esto se debe a que los gránulos más pequeños tienen un porcentaje de número mayor, pero porcentajes de volumen más pequeños de los gránulos de tamaño total. Como lo demuestra la comparación entre las distribuciones acumuladas de número y volumen para la misma distribución media en la Figura 2,los gránulos de almidón con un diámetro de esfera equivalente inferior o igual a 9.967 μm representaron aproximadamente el 48,53% del número total, pero sólo el 5,854% del volumen total. Por lo tanto, cualquier gránulo dañado o descompuesto inferior a 10 μm tendría un impacto muy pequeño en la distribución diferencial del volumen-porcentaje de tamaño. Para las muestras de almidón de otras fuentes vegetales, un recuento total adecuado para sus análisis de tamaño puede ser el que duplique el recuento mínimo sobre el que la media geométrica gráfica () de la distribución de tamaño mostrada en una ejecución de prueba ya no cambia significativamente.
Técnicamente, el paso más crítico para una carrera de tamaño es dejar caer una cantidad adecuada de la suspensión de almidón-metanol al electrolito para un rango óptimo de concentración nominal de 5 a 8% para la suspensión de almidón-electrolito. Para alcanzar la meta, el tamaño de la caída y la concentración de la suspensión de almidón-metanol pueden tener que ajustarse a través de las pruebas de prueba. Las concentraciones de las suspensiones de almidón-electrolitos superiores al rango óptimo aumentan los riesgos de reducción de la precisión del tamaño, y bloqueos frecuentes de apertura que conducen a abortos, lo que podría hacer que sea muy difícil completar una carrera. Pero, una concentración demasiado baja (por ejemplo, <2%) de la suspensión de almidón-electrolito puede prolongar una carrera demasiado, y distorsionar las frecuencias de gránulos en contenedores de varios tamaños debido al muestreo no aleatorio de gránulos, lo que podría conducir a una tasa de error inaceptable (el CV promedio > 5 %) para un análisis de réplica. El recuento total para una carrera de tamaño también tiene un impacto importante en la concentración óptima de una suspensión de almidón-electrolito, de ahí la cantidad y concentración del almidón-metanol añadido. Cuanto mayor sea el recuento total para una carrera, más tiempo habrá para la finalización de la carrera y, por lo tanto, mayores riesgos para los bloqueos de apertura que conducen a la realización de abortos. El problema de bloqueo de apertura por áridos empeora cuando los tubos de apertura de diámetros más pequeños se utilizan para gránulos de almidón de tamaños más pequeños, lo que hace muy difícil analizar pequeños gránulos de almidón (< 2 μm). Este es, de hecho, el principal inconveniente o limitación del procedimiento. El problema del bloqueo de apertura podría aliviarse hasta cierto punto utilizando algunos medios técnicos. Uno puede utilizar más sonicación para romper los agregados (inevitablemente más gránulos dañados también) en una suspensión de almidón-metanol, y / o una suspensión diluida de almidón-electrolito a 2-5% concentraciones nominales. Alternativamente, se pueden utilizar ejecuciones técnicas repetidas de tamaño del recuento total mínimo para s* estable y de las distribuciones de tamaño para un tipo de almidón (por ejemplo, alrededor de 125.0000 recuentos para almidón de camote) de la misma suspensión de almidón-electrolito, y combinar los resultados de las corridas de repetición. Cada una de las cuatro distribuciones de réplica (S1a, S1b, S2a y S2b) mostradas en la Figura 1 procedían de dos repeticiones técnicas combinadas de tamaño de 125.000 gránulos cada una de la misma suspensión de almidón-electrolitos. Ambos métodos deben ser bien probados, ya que pueden aumentar la tasa de error de replicación a un nivel inaceptable (es decir, el CV promedio > 5%).
Los análisis técnicos y biológicos de tamaño de las muestras de almidón procedentes de fuentes vegetales en condiciones fisiológicas similares mejoran la reproducibilidad y precisión de la distribución del tamaño medio determinado del gránulo. En la práctica, tres o cuatro réplicas biológicas de muestras de almidón se pueden extraer independientemente del mismo tejido bajo una condición específica. Pero, anteriormente encontramos que no había ninguna diferencia significativa en las tasas de error (CV y errores estándar para el promedio), y s* entre la distribución media del tamaño del gránulo derivada de distribuciones de cuatro réplicas biológicas (es decir, una tamaño x una suspensión x 4 extractos) y la de dos muestreos técnicos cada una de dos réplicas biológicas (es decir, una tamaño x 2 suspensiones de almidón-metanol x 2 extractos)28. Por lo tanto, las muestras de réplica biológica podrían reducirse a dos, al menos para el almidón de camote. Otros pasos y parámetros técnicos que podrían modificarse o ajustarse se observaron específicamente debajo de cada uno de los pasos o el parámetro particular en el procedimiento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Este trabajo cuenta con el apoyo parcial del Centro de Investigación Cooperativa de Agricultura y el Centro Integrado de Investigación en Seguridad Alimentaria de la Facultad de Agricultura y Ciencias Humanas de la Universidad Prairie View A&M. Agradecemos a Hua Tian por su apoyo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. BeMiller, J., Whistler, R. , Academic Press. Ch. 3 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch - Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R. Starch: Metabolism and Structure. Nakamura, Y. , Ch. 13 425-441 (2015).
- Wang, S. -q, Wanf, L. -l, Fan, W. -h, Cao, H., Cao, B. -s Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T. The Mie Theory: Basics and Applications. Wolfram, H., Wriedt, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. ÅS., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch - Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , QLD. Australia. 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
