Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

بناء الطفرات في سلالة العقدية الرئوية من النمط المصلي 1 519/43

Published: September 11, 2020 doi: 10.3791/61594
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1
1Faculty of Infections and Tropical Diseases, Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Division of Medicine, University College London, 3Division of Infection and Immunity, University College London UCL

Summary

هنا ، نصف سلالة S. pneumoniae من النمط المصلي 1 519/43 التي يمكن تعديلها وراثيا باستخدام قدرتها على الحصول بشكل طبيعي على الحمض النووي والبلازميد الانتحاري. كدليل على المبدأ ، تم إجراء طفرة متجانسة في جين pneumolysin (رقائق).

Abstract

لا يزال النمط المصلي 1 للمكورات العقدية الرئوية يمثل مشكلة كبيرة في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل، ولا سيما في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى. على الرغم من أهميته ، فقد أعيقت الدراسات في هذا النمط المصلي بسبب عدم وجود أدوات وراثية لتعديله. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة لتعديل العزلة السريرية من النمط المصلي 1 وراثيا (السلالة 519/43). ومن المثير للاهتمام ، تم تحقيق ذلك من خلال استغلال قدرة المكورات الرئوية على اكتساب الحمض النووي بشكل طبيعي. ومع ذلك ، على عكس معظم المكورات الرئوية ، لم يكن استخدام الحمض النووي الخطي ناجحا. لتحور هذه السلالة المهمة ، كان لا بد من استخدام بلازميد انتحاري. وقد وفرت هذه المنهجية الوسائل لفهم أعمق لهذا النمط المصلي المراوغ ، سواء من حيث بيولوجيته أو إمراضيته. للتحقق من صحة الطريقة ، تم تحور سم المكورات الرئوية الرئيسي المعروف ، pneumolysin ، لأنه يحتوي على نمط ظاهري معروف وسهل المتابعة. أظهرنا أن المتحور ، كما هو متوقع ، فقد قدرته على تحلل خلايا الدم الحمراء. من خلال القدرة على تحور جين مهم في النمط المصلي محل الاهتمام ، تمكنا من ملاحظة أنماط ظاهرية مختلفة لفقدان الطفرات الوظيفية عند العدوى داخل الصفاق وداخل الأنف من تلك التي لوحظت للأنماط المصلية الأخرى. باختصار ، تثبت هذه الدراسة أن السلالة 519/43 (النمط المصلي 1) يمكن تعديلها وراثيا.

Introduction

العقدية الرئوية (S. pneumoniae ، المكورات الرئوية) هي واحدة من الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات على مستوى العالم. حتى وقت قريب ، تم اكتشاف ما يقرب من 100 نمط مصلي من S. pneumoniae 1،2،3،4،5،6،7. سنويا ، يودي مرض المكورات الرئوية الغازية (IPD) بحوالي 700000 حالة وفاة ، من الأطفال الذين تقل أعمارهم عن 5 سنوات8. العقدية الرئوية هي السبب الرئيسي للالتهاب الرئوي الجرثومي والتهاب الأذن الوسطى والتهاب السحايا وتسمم الدم في جميع أنحاء العالم9.

في حزام التهاب السحايا الأفريقي ، يكون النمط المصلي 1 مسؤولا عن تفشي التهاب السحايا ، حيث يكون نوع التسلسل (ST) ST217 ، وهو نوع تسلسل شديد الضراوة ، هو السائد 10،11،12،13،14،15. وقد تم تشبيه أهميته في علم أمراض التهاب السحايا بأهميته النيسرية السحائية في حزام التهاب السحايا الأفريقي16. غالبا ما يكون النمط المصلي 1 هو السبب الرئيسي ل IPD. ومع ذلك ، نادرا ما توجد في النقل. في الواقع ، في غامبيا ، هذا النمط المصلي مسؤول عن 20 ٪ من جميع الأمراض الغازية ، ولكن تم العثور عليه فقط في 0.5 ٪ من الناقلين الأصحاء14،17،18،19. يحدث التبادل الجيني وإعادة التركيب في المكورات الرئوية المختصة بشكل عام في النقل وليس في المرضالغازي 20. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن النمط المصلي 1 يحتوي على واحد من أقصر معدلات النقل الموصوفة بين المكورات الرئوية (9 أيام فقط). لذلك ، تم اقتراح أن هذا النمط المصلي قد يكون له معدل إعادة تركيب أقل بكثير من الآخرين21.

من الضروري إجراء دراسات متعمقة لفهم السبب وراء انخفاض معدل نقل سلالات النمط المصلي 1 وأهميته في الأمراض الغازية في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى.

نبلغ هنا عن بروتوكول يسمح بالطفرات على مستوى الجينوم لسلالة معينة من النمط المصلي 1 ، 519/43. يمكن لهذه السلالة بسهولة الحصول على الحمض النووي الجديد وإعادة تجميعه في جينومها. هذه الطريقة ليست بعد بين الإجهاد ، لكنها فعالة للغاية عند القيام بها في خلفية 519/43 (تم تحور أهداف أخرى ، والمخطوطات قيد الإعداد). ببساطة باستخدام سلالة 519/43 ، واستغلال كفاءتها الطبيعية ، وكذلك استبدال الطريقة التي يتم بها توفير الحمض النووي الخارجي ، تمكنا من تحور جين pneumolysin (رقائق) في هذه السلالة المصلية 1. تمثل هذه الطريقة تحسينا على الطريقة التي قدمها Harvey et al.22 حيث يتم إجراؤها في خطوة واحدة دون الحاجة إلى تمرير الحمض النووي عبر نمط مصلي مختلف. ومع ذلك ، وبسبب التباين بين السلالات ، لم يتم توحيد أي طريقة لجميع السلالات. إن القدرة على تحور جينات معينة ومراقبة آثارها ستسمح بفهم عميق لسلالات النمط المصلي 1 S. الرئوية وستوفر إجابات لدور هذه السلالات في التهاب السحايا في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليد الأمبليكون المتحور بواسطة SOE-PCR23 وتضخيم كاسيت سبكتينومايسين

  1. ابدأ بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم أذرع التماثل (رقائق 5 '(488 نقطة أساس) ورقائق 3' (715 نقطة أساس) على التوالي) للمناطق الجانبية لجين الرقائقي من السلالة 519/43. استخدم الاشعال plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) ، ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA) ، ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTTTCTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) و plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
  2. استخدم شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية للرقائق 5 ': تغيير طبيعة عند 94 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، الخطوة 2: تغيير طبيعة عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، الخطوة 3: التلدين عند 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، الخطوة 4: التمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، الخطوة 5: ارجع إلى الخطوة 2 وكرر لمدة 35 دورة ، الخطوة 6: التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
    1. استخدم نفس شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل ل ply3 'باستثناء وقت التمديد في الخطوة 4 والخطوة 6 حيث يجب أن يكون 60 ثانية.
  3. تحليل منتجات PCR عن طريق هلام الكهربائي واستئصال amplicon من هلام.
  4. تنقية مضخمات PCR باتباع البروتوكول الموضح في تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
  5. استخدم كميات متساوية المولي من كلا ذراعي التماثل كقوالب في SOE-PCR. دمج اثنين من amplicons باستخدام الاشعال plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) ، و plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
  6. استخدم شروط SOE-PCR التالية (الخطوة 1: تغيير طبيعة عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، الخطوة 2: تغيير طبيعة عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، الخطوة 3: التلدين 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، الخطوة 4: التمديد عند 68 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، الخطوة 5: ارجع إلى الخطوة 2 وكرر لمدة 25 دورة ، الخطوة 6: التمديد النهائي عند 68 درجة مئوية لمدة 90 ثانية).
  7. تحليل منتج SOE-PCR عن طريق هلام الكهربائي. قم باستئصاله من الجل باستخدام مجموعة استخراج الجل واتبع التعليمات المقدمة.
  8. تضخيم كاسيت سبكتينومايسين من البلازميد pR412 باستخدام شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: الخطوة 1: تغيير طبيعة عند 94 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، الخطوة 2: تغيير طبيعة عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، الخطوة 3: التلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، الخطوة 4: التمديد عند 68 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، الخطوة 5: ارجع إلى الخطوة 2 وكرر لمدة 25 دورة ، الخطوة 6: التمديد النهائي عند 68 درجة مئوية لمدة 60 ثانية.
    1. استخدم البادئات BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) و BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). تم الحصول على البلازميد pR412 من الدكتور مارك برودوم (CNRS-جامعة بول ساباتييه تولوز فرنسا).
  9. تحليل amplicons PCR عن طريق هلام الكهربائي. استئصال وتنقية amplicon PCR الناتجة كما هو موضح أعلاه.

2. توليد البلازميد pSD1 والتحول الكيميائي للإشريكية القولونية Dh5α

  1. قم بإجراء ربط باتباع تعليمات الشركة المصنعة لنظام pGEMT-easy I (جدول المواد). في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، أضف 5 ميكرولتر من مخزن الربط 2x ، و 1 ميكرولتر من pGEMTeasy ، و 2 ميكرولتر من المنتج ply_SOE ، و 1 ميكرولتر من T4 DNA ligase والماء إلى حجم إجمالي 20 ميكرولتر. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. هذا يولد البلازميد pSD1.
  2. تحويل الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا Dh5α مع pSD1. ابدأ باحتضان 50 ميكرولتر من الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا Dh5α مع 3 ميكرولتر من تفاعل ربط pSD1 لمدة 15 دقيقة على الجليد. ثم استمر في تعريض الخلايا لصدمة حرارية (42 درجة مئوية ، 30 ثانية). ضع الخلايا على الثلج لمدة 2 دقيقة.
  3. قم بإزالة الخلايا من الثلج وأضف 350 ميكرولتر من وسائط S.O.C. احتضان الثقافة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 120 دورة في الدقيقة.
  4. صفيحة التحول على Luria Bertani Agar (LBA) مكملة ب 0.4 mM IPTG ، 0.24 مجم / مل X-Gal للاختيار الأزرق / الأبيض و 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين لضمان أن جميع المستعمرات التي تنمو في الصفيحة لها العمود الفقري البلازميد. تحتوي المستعمرات البيضاء على pSD1.
  5. اختر ثلاث مستعمرات بيضاء وقم بإعداد نمو بين عشية وضحاها في 10 مل من LB ، مع استكمال 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الهز.
  6. في اليوم التالي ، قم بطرد الثقافات عند 3082 × جم واستخدم الحبيبات لاستخراج البلازميد.

3. استخراج الحمض النووي البلازميد ، وتقييد هضم pSD1 وجين سبكتينومايسين وتجميع pSD2

  1. استخرج الحمض النووي البلازميد باتباع التعليمات المرفقة مع المجموعة التجارية (جدول المواد).
  2. قم بإعداد هضم تقييد BamHI لكل من بلازميد pSD1 وكاسيت سبكتينومايسين الذي تم تضخيمه وتنقيته مسبقا. استخدم الشروط والكميات التالية الموضحة في الجدول 1.
  3. احتضان تفاعلات الهضم التقييدية والضوابط عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  4. قم بتحليل هضم التقييد عن طريق الرحلان الكهربائي ، وقم باستئصال الشريط وتنقيته باتباع التعليمات المرفقة مع المجموعة التجارية (جدول المواد).
  5. بعد ذلك ، قم بإعداد تفاعل ربط باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد) باستخدام pSD1 المهضوم BamHI والسبكتينومايسين (من الخطوة 3.2). في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، أضف مكونات التفاعل التالية: 5 ميكرولتر من 2x ربط العازلة ، 2 ميكرولتر pSD1 ، 2 ميكرولتر من كاسيت سبكتينومايسين ، 1 ميكرولتر من T4 DNA ligase واحتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. هذا يولد البلازميد pSD2.
  6. تحويل البلازميد pSD2 إلى E. coli Dh5α المختص كيميائيا كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  7. حدد المحولات التي تحمل البلازميد pSD2 بناء على قدرتها على النمو في LBA المكمل ب 100 ميكروغرام / مل من سبكتينومايسين والأمبيسلين.
  8. قم بإجراء استخراج الحمض النووي البلازميد (pSD2) كما هو موضح أعلاه واتباع تعليمات الشركة المصنعة (ميكرولتر).

4. تحول سلالة S. الرئوية 519/43

  1. قم بإعداد ثقافة بين عشية وضحاها من S. pneumoniae 519/43 في BHI واسمح لها بالنمو بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  2. في اليوم التالي تمييع الثقافات 1:50 و 1: 100 في 10 مل من مرق BHI الطازج. احتضان المزارع بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية حتى يكون OD595nm بين 0.05 و 0.1 (الاكتساب الأمثل للحمض النووي أقرب إلى 0.1 OD).
  3. بمجرد الوصول إلى OD من 0.1 ، خذ 860 ميكرولتر وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. في نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق هذا ، أضف: 100 ميكرولتر من 100 مللي مول هيدروكسيد الصوديوم ، 10 ميكرولتر من 20٪ (وزن / حجم) BSA ، 10 ميكرولتر من 100 مللي متر CaCl 2 ،2 ميكرولتر من 50 نانوغرام / مل CSP124 و 500 نانوغرام من pSD2.
  4. احتضان التفاعل بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  5. صفيحة 330 ميكرولتر على ألواح أجار الدم 5٪ (BA) مكملة ب 100 ميكروغرام / مل سبكتينومايسين ، كل ساعة على مدار 3 ساعات حضانة.
  6. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2. رقعة المستعمرات المقاومة للسبكتينومايسين على صفيحة BA أخرى مكملة ب 100 ميكروغرام / مل سبكتينومايسين وكذلك على ألواح BA مكملة ب 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين. احتضان كلتا المجموعتين من اللوحات بين عشية وضحاها وفقا للشروط المذكورة أعلاه. لوحات الأمبيسلين هي لاختبار وجود العمود الفقري البلازميد.
  7. تأكد من وجود كاسيت سبكتينومايسين بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) و SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). تأكد من الطفرة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البرايمات plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) و plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) التي تلتصق خارج المنطقة المتحورة.
  8. قم بتأكيد التكامل في الموقع الصحيح للجينوم عن طريق التسلسل باستخدام الباشير plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) ، plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) ، بالإضافة إلى البادئات مع موقع ارتباطها في كاسيت سبكتينومايسين sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG) و spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يبدأ البروتوكول الموصوف هنا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم أذرع التماثل الأيسر والأيمن ، مع حذف 191 نقطة أساس في نفس الوقت من المنطقة الوسطى من جين الرقائق . أثناء إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم تقديم موقع BamHI عند 3 'من ذراع التماثل الأيسر وفي نهاية 5' من ذراع التماثل الأيمن (الشكل 1 أ). يتبع ذلك PCR-SOE حيث يتم دمج أذرع التماثل اليمنى واليسرى في مضخم واحد (الشكل 1B). ثم يتم استنساخ أمبليكون SOE-PCR هذا في pGEMTeasy باستخدام استنساخ TA لتوليد pSD1 البلازميد (الشكل 1C). سيؤدي التحول الناجح إلى إنتاج مستعمرات بيضاء مقاومة للأمبيسيلين. أي مستعمرات زرقاء ستكون محولات تحتوي على بلازميد pGEMTeasy فارغ. سيتم بعد ذلك هضم pSD1 في موقع BamHI الذي تم تقديمه في وقت تفاعل البوليميراز المتسلسل للشركات المملوكة للدولة (الشكل 1D) وربطه بشريط سبكتينومايسين (أيضا هضم BamHI للنهايات المتوافقة). يطلق على البلازميد الجديد pSD2 (الشكل 1E). يتم تأكيد التجميع الصحيح ل pSD2 عن طريق تقييد الهضم (الشكل 2 أ). تم استخدام pSD2 ، الذي يعمل كبلازميد انتحاري لأنه لا يحتوي على أصل متوافق مع الجرام للنسخ المتماثل ، لتحويل 519/43WT (تم إعداده مسبقا ليكون مختصا). المحولات الإيجابية هي مستعمرات تنمو على 100 ميكروغرام / مل سبكتينومايسين بعد الحضانة بين عشية وضحاها. يتم ترقيع جميع المستعمرات على صفائح قاعدة أجار الدم الطازجة حديثا مع استكمال 100 ميكروغرام / مل سبكتينومايسين وكذلك قاعدة أجار الدم مع 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين. أي مستعمرات تنمو على اللوحات الليلية الثانية المكملة بسبكتينومايسين هي إيجابيات محتملة. أي مستعمرات تنمو على ألواح الأمبيسلين ستشير إلى تكامل البلازميد الكامل أو إعادة تركيب كاسيت الأمبيسلين في مكان آخر في الجينوم. حتى الآن وباستخدام سلالة 519/43 لم تنمو أي مستعمرات على لوحات تستكمل مع الأمبيسلين. يجب تأكيد جميع المستعمرات الإيجابية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق التسلسل (الشكل 2C) لتقييم وتأكيد موقع الإدخال. تحقيقا لهذه الغاية ، يجب أن يكون للبادئات موقع ارتباطها خارج منطقة التماثل (الشكل 2C). الهدف المختار له نمط ظاهري ملحوظ للغاية (انحلال خلايا الدم الحمراء (RBC)) ، وبالتالي يمكن أيضا تأكيد الطفرة ظاهريا (الشكل 2B). فقد المسخ قدرته على تحلل كرات الدم الحمراء.

مكونات رد الفعل (ميكرولتر) التحكم (ميكرولتر) رد الفعل (ميكرولتر) التحكم (ميكرولتر)
مخزن مؤقت 2 2 2 2
pSD1 4 4 -
سبكتينومايسين كاسيت - - 6 6
بامه-HF 1 - 1 -
الماء 13 14 11 12
الحجم الكلي 20 20 20 20

الجدول 1: مكونات تفاعل هضم التقييد ل pSD1 وكاسيت سبكتينومايسين.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على استراتيجية الطفرات. أ) تضخيم أذرع التماثل (Ply3 'و Ply5' (الممرات من 2 إلى 5) ؛ والربط عن طريق تداخل تمديد PCR (الممرات 6 و 7). L- hyperladder I (Bioline) ، الحارة 1- التحكم السلبي للتفاعل ، الحارة 2 و 3- ply5 '(488 bp) و ply3' (715 bp) أذرع التماثل المضخمة من D39 gDNA ، الممرات 4 و 5- رقائق 5 '(488 bp) و ply3' (715 bp) أذرع التماثل المضخمة من 519/43 gDNA. الممر الأيمن 6- منتج D39 SOE PCR ، الحارة 7- 519/43 منتج SOE PCR (1235 نقطة أساس). ب) رسم تخطيطي يصور البناء النهائي ل SOE-PCR الذي تم الحصول عليه (ply_SOE) ؛ يشار إليها بالأسهم هي البادئات المستخدمة للحصول على منطقة التماثل بين كل من أذرع التماثل وكذلك هضم التقييد المختار. ج) البلازميد pSD1 ، يصور استنساخ ply_SOE ؛ د) تقييد هضم pSD1 وكاسيت سبكتينومايسين. ه) البناء النهائي pSD2 الذي يستخدم بعد ذلك كبلازميد انتحاري لتحويل S. الرئوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: أ) تأكيد وجود كاسيت سبكتينومايسين في pSD2. L- فرط السلم 1 كيلو بايت (بيولين) ؛ 1- pSD1 هضم مع BamHI ؛ 2-pSD2 هضمها مع BamHI ؛ L فرط السلم 1 كيلو بايت (بيولين) ؛ 3- كاسيت سبكتينومايسين مضخم من pR412 ، 4- كاسيت سبكتينومايسين مهضوم مع BamHI ؛ ب) تأكيد النمط الظاهري لطفرة الانحلال الرئوي عن طريق تحديد نشاط انحلال الدم ل D39 ، 519 / 43WT والطافر 519 / 43Δply. تمت مقارنة هذا بانحلال خلايا الدم الحمراء بنسبة 0.5٪ سابونين. يعتبر انحلال الدم المشتق من الصابونين 100٪ وتم حساب معدلات 519/43Wt و 519/43Δply ضده. كل نقطة بيانات هي متوسط 5 نسخ تقنية و 3 نسخ بيولوجية. ج) بيانات التسلسل المعينة لمنطقة الجينوم الطافرة حيث انقطع الانحلال الرئوي. يشار إلى الاشعال كسهام وبالاسم. يرتبط PLYSCN1 و PLYSCN2 خارج أذرع التماثل. أظهر التسلسل الذي تم الحصول عليه من البادئات PLYSCN1 و 2 أنه كان هناك تسلسل غير منقطع من المناطق المجاورة خارج منطقة التماثل حتى كاسيت سبكتينومايسين ، مما يدل على الإدخال في الجينوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لا تزال العقدية الرئوية ، ولا سيما النمط المصلي 1 ، تشكل تهديدا عالميا يسبب مرض المكورات الرئوية الغازية والتهاب السحايا. على الرغم من إدخال لقاحات مختلفة يجب أن تكون وقائية ضد النمط المصلي 1 ، في إفريقيا ، لا يزال هذا النمط المصلي قادرا على التسبب في تفشي الأمراض التي تؤدي إلى ارتفاع معدلات المراضة والوفيات13. القدرة على التلاعب الوراثي بهذا النمط المصلي لها أهمية حاسمة بسبب أهميتها السريرية. تسمح الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة بالتلاعب الجيني لسلالة تمثيلية داخل هذا النمط المصلي. سلالة غازية 519/43 (ST5316) ، عزل سريري من مريض التهاب السحايا في الدنمارك25.

كانت المنهجية المقدمة هنا ناجحة في الغالب بسبب السلالة المختارة حيث يمكنها الحصول على الحمض النووي الخارجي ، ولكن أيضا بسبب التغييرات التي تم إجراؤها على البروتوكولات التقليدية المستخدمة لتحويل S. pneumoniae ، فإن معدل النجاح النموذجي لبروتوكول التحويل لدينا يبلغ حوالي 70٪.

مع هذه المنهجية ، من الأهمية بمكان استخدام بلازميد انتحاري بدلا من الحمض النووي الخطي المعتاد. تقليديا ، كان من الممكن استخدام الحمض النووي الخطي26،27،28 ؛ ومع ذلك ، لم تنجح جميع محاولات استخدام الحمض النووي الخارجي في هذا الشكل. علاوة على ذلك ، لم تنجح محاولات استغلال الكفاءة الطبيعية للمكورات الرئوية 519/43 عند امتصاص أقل. أظهر استكشاف الأخطاء وإصلاحها أن الكفاءة الطبيعية للسلالة 519/43 كانت أعلى عندما كان OD595 0.1 ، وهو ما يختلف عن البيانات التي لوحظت للأنماط المصلية الأخرى من S. pneumoniae حيث لوحظت أعلى كفاءة طبيعية عند OD24 منخفض جدا.

من أجل التحقق من صحة الطريقة ، تم إنشاء متحولة pneumolysin لأنها تظهر النمط الظاهري سهلة المتابعة. ومع ذلك ، لإثبات أنه يمكن تطبيق الطريقة على أي جين داخل هذه السلالة ، تم استهداف جينات أخرى بنجاح (المخطوطات قيد الإعداد). يمكن أيضا استخدام مثل هذه الطريقة ، باستخدام ناقل انتحاري ليس له أصل متوافق مع إيجابية الجرام ، لتكملة الكروموسومات ، والإفراط في التعبير عن الجينات ذات الأهمية ، وكذلك إدخال أنظمة المراسلة ، كل ذلك باستخدام الجينات المجاورة كمناطق تماثل.

إن توسيع الأدوات الوراثية إلى S. pneumoniae serotype 1 ، سلالة 519/43 مهم لأنه يمكننا الآن معالجة السلالات التمثيلية وراثيا مباشرة. السلالة 519/43 ذات أهمية لأنها مرنة وراثيا ، وهي مسببة للأمراض حيث تم عزلها عن مريض التهاب السحايا ، وسيوفر التلاعب بها أدلة لفهم تطور التهاب السحايا وإنشائه بشكل أفضل. في السابق ، تم فهم محددات معينة داخل الأنواع عن طريق إدخال الجين المعني في واحدة من سلالات S. pneumoniae المميزة جيدا ، مثل D39 (النمط المصلي 2). تم استخدام هذا النهج من قبل Paton et al. ، بسبب الصعوبات مع الطفرات على النمط المصلي 129. النتائج التي أبلغوا عنها على D39 تحمل أليل انحلال أقل من طبقات النمط المصلي 1 مقارنة ب 519/43 ∆ply تختلف عن تلك التي قدمناها30 مما يسلط الضوء على أهمية القدرة على تحور جين داخل خلفية السلالة الأصلية. في وقت لاحق ، تمكنت نفس المجموعة من تحور سلالة غير سلالة A من النمط المصلي1 22. ومن المثير للاهتمام ، أن بروتوكولهم مختلف تماما عن بروتوكولنا ، لأنه نهج من خطوتين يتطلب إجراء الطفرة أولا في سلالات النمط المصلي 2 ، ثم يتم استخدام هذا كقالب ليتم تحويله في سلالة النمط المصلي 1.

حاليا ، هناك قيد واحد في الطريقة المقدمة. في الوقت الحالي ، تعمل هذه الطريقة فقط مع السلالة التمثيلية 519/43. تمت تجربة نفس البروتوكول الدقيق في سلالات أخرى ، وهي العزلات السريرية من ST3081 و ST303 ولم تكن ناجحة. علاوة على ذلك ، تمت محاولة التثقيب الكهربائي كطريقة لتوصيل الحمض النووي الخارجي إلى الخلية على جميع أنواع التسلسل الثلاثة ، مع ملاحظة نتائج إيجابية فقط ل 519/43. إن توسيع وتوحيد المنهجية لجميع سلالات النمط المصلي 1 له أهمية قصوى نظرا لوجود تباين هائل في جميع أنحاء المجموعة. وتجري حاليا دراسات لتوسيع نطاق تطبيق الطريقة على جميع السلالات داخل النمط المصلي 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر الصندوق الاستئماني لالتهاب السحايا و MRC على توفير التمويل لهذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrime Pfx DNA polymerase Invitrogen 12344024 Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base Oxoid CM0055 Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine sigma 55470 used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion Oxoid CM1135 used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2 Sigma 449709 used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1 AnaSpec AS-63779 used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar Gibco 22700025 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation) Gibco 12795027 used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit NEB T1020S Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy Promega A1360 used as suicide plasmid
S.O.C. Invitrogen 15544034 used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S0899 used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride SigmaAldrich PHR1426 Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265017 used for the creation of pSD1 and pSD2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31 (2006).
  2. Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
  3. Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
  4. Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
  5. Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
  6. Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
  7. Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
  8. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
  9. Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215 (2013).
  10. Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
  11. Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
  12. Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81 (2008).
  13. Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575 (2016).
  14. Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198 (2008).
  15. Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
  16. Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22 (2010).
  17. Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
  18. Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90 (2015).
  19. Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
  20. Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
  21. Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
  22. Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
  23. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
  24. Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
  25. Lund, E. Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
  26. Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
  27. Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
  28. Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
  29. Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122 (2011).
  30. Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999 (2020).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 163 ، النمط المصلي 1 ، العقدية الرئوية ، التولد الطفري ، الكفاءة الطبيعية ، حزام التهاب السحايا
بناء الطفرات <em>في سلالة</em> العقدية الرئوية من النمط المصلي 1 519/43
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, … More

Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43. J. Vis. Exp. (163), e61594, doi:10.3791/61594 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter