Summary
在这里，我们描述了一种 肺炎链球菌 血清型1菌株519/43，该菌株可以通过利用其自然获取DNA和自杀质粒的能力进行基因改造。作为原理证明，在肺溶血素（ply）基因中制造了同基因突变体。
Abstract
肺炎链球菌血清1型仍然是低收入和中等收入国家的一个大问题，特别是在撒哈拉以南非洲。尽管它很重要，但由于缺乏遗传工具来修饰它，这种血清型的研究受到了阻碍。在这项研究中，我们描述了一种对血清型1临床分离株（菌株519/43）进行基因修饰的方法。有趣的是，这是通过利用肺炎球菌自然获取DNA的能力来实现的。然而，与大多数肺炎球菌不同，线性DNA的使用并不成功;为了突变这种重要的菌株，必须使用自杀质粒。这种方法为更深入地了解这种难以捉摸的血清型提供了手段，无论是在生物学上还是在致病性方面。为了验证该方法，已知的主要肺炎球菌毒素肺溶血素发生了突变，因为它具有众所周知且易于遵循的表型。我们表明，正如预期的那样，突变体失去了裂解红细胞的能力。通过能够突变感兴趣的血清型中的重要基因，我们能够观察到腹膜内和鼻内感染时功能丧失突变体的不同表型与其他血清型观察到的表型不同。综上所述，本研究证明菌株519/43（血清型1）可以进行基因改造。
Introduction
肺炎链球菌（肺炎链球菌，肺炎球菌）是全球发病和死亡的主要原因之一。直到最近，已经发现了近100种肺炎链球菌血清型1，2，3，4，5，6，7。侵袭性肺炎球菌病（IPD）每年造成约70万人死亡，其中5岁以下儿童8。肺炎链球菌是全球细菌性肺炎、中耳炎、脑膜炎和败血症的主要原因9。
在非洲脑膜炎地带，血清型1是脑膜炎暴发的原因，其中序列型（ST）ST217是一种毒性极强的序列类型，占主导地位10，11，12，13，14，15。它在脑膜炎病理学中的重要性被比作非洲脑膜炎带脑膜炎奈瑟菌的重要性16。血清 1 型通常是 IPD 的主要原因;然而，它在运输中很少发现。事实上，在冈比亚，这种血清型占所有侵袭性疾病的20%，但仅在0.5%的健康携带者中发现14，17，18，19。感受态肺炎球菌的遗传交换和重组通常发生在携带中，而不是在侵袭性疾病中发生20。此外，血清型 1 已被证明是肺炎球菌中描述的最短携带率之一（仅 9 天）。因此，有人提出这种血清型的重组率可能比其他血清型低得多21。
有必要进行深入研究，以了解血清型1菌株携带率低的原因及其在撒哈拉以南非洲侵袭性疾病中的重要性。
在这里，我们报告了一种协议，该协议允许特定血清型1菌株的全基因组诱变，519/43。这种菌株可以很容易地获得新的DNA并将其重组到其基因组中。这种方法还不是菌株间，但在519/43背景下完成时非常有效（其他靶标已经突变，手稿正在准备中）。通过简单地使用519/43菌株，并利用其自然能力，以及替代提供外源DNA的方式，我们能够突变该血清型1菌株中的肺溶血素基因（ply）。该方法代表了Harvey等人提出的方法的改进22 ，因为它是一步完成的，无需通过不同的血清型传代DNA。然而，由于菌株间变异性，没有一种方法适用于所有菌株。突变特定基因并观察其影响的能力将使人们深入了解血清型 1型肺炎链球菌 菌株，并将为这些菌株在撒哈拉以南非洲脑膜炎中的作用提供答案。
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Protocol
1. 通过SOE-PCR23 生成突变扩增子和扩增壮观霉素盒
- 首先进行PCR以扩增菌株519/43中层基因侧翼区域的同源臂（分别为ply 5'（488 bp）和ply3'（715 bp））。Use primers plyFw1_NOTI （TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG）， ply5'R1_BamHI （CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA）， ply3'F1_BamHI （TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTTTCG） 和plyRv2_NotI （TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC）.
- 对ply5'使用以下PCR条件：在94°C下变性60秒，步骤2：在94°C下变性30秒，步骤3：在58°C下退火30秒，步骤4：在72°C下延伸30秒，步骤5：返回步骤2并重复35个循环，步骤6：在72°C下最终延伸30秒。
- 对 ply3' 使用相同的 PCR 条件，但步骤 4 和步骤 6 的延长时间应为 60 秒。
- 通过凝胶电泳分析PCR产物并从凝胶中切除扩增子。
- 按照制造商说明（材料表）中描述的方案纯化PCR扩增子。
- 在SOE-PCR中使用等摩尔量的两个同源臂作为模板。使用引物plyFw1_NOTI （TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG）和plyRv2_NotI（TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC）的引物融合两个扩增子。
- 使用以下SOE-PCR条件（步骤1：在94°C变性2分钟，步骤2：在94°C变性30秒，步骤3：退火58°C退火30秒，步骤4：在68°C下延伸60秒，步骤5：返回步骤2并重复25个循环，步骤6：最终在68°C下延伸90秒）。
- 通过凝胶电泳分析SOE-PCR产物。使用凝胶提取试剂盒将其从凝胶中切除，并按照提供的说明进行操作。
- 使用以下PCR条件扩增质粒pR412中的大观霉素盒：步骤1：在94°C变性60秒，步骤2：在94°C变性30秒，步骤3：在55°C下退火30秒，步骤4：在68°C下延伸60秒，步骤5：返回步骤2并重复25个循环， 步骤6：在68°C下最终延伸60秒。
- 使用引物BamHI_SP2F2（GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC）和BamHI_SP2R2（GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC）。质粒pR412购自Marc PrudHomme博士（法国国家科学研究中心保罗·萨巴蒂埃图卢兹大学）。
- 通过凝胶电泳分析PCR扩增子。如上所述切除和纯化所得的PCR扩增子。
2. 质粒pSD1的生成和 大肠杆菌 Dh5α的化学转化
- 按照pGEMT简易系统I制造商说明（材料表）进行连接。在微量离心管中，加入 5 μL 2x 连接缓冲液、1 μL pGEMTeasy、2 μL ply_SOE产物、1 μL T4 DNA 连接酶和水，总体积为 20 μL。在4°C孵育过夜。 生成质粒pSD1。
- 用pSD1转化化学含量 的大肠杆菌 Dh5α。首先将 50 μL 化学含量大 肠杆菌 Dh5α 与 3 μL pSD1 连接反应在冰上孵育 15 分钟。然后继续将细胞暴露于热冲击（42°C，30秒）。将细胞放在冰上2分钟。
- 从冰上取出细胞并加入 350 μL S.O.C 培养基。将培养物在37°C，120rpm下孵育2小时。
- 将转化接种在补充有 0.4 mM IPTG、0.24 mg/mL X-Gal 用于蓝/白选择和 100 μg/mL 氨苄青霉素的 Luria Bertani 琼脂 （LBA） 上，以确保平板中生长的所有菌落都具有质粒骨架。白色菌落含有pSD1。
- 挑选三个白色菌落，在 10 mL LB 中建立过夜生长，并补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素。将培养物在37°C振荡孵育过夜。
- 第二天以3，082× g 离心培养物，并使用沉淀进行质粒提取。
3. 质粒DNA提取、pSD1和壮观霉素基因的限制性酶切及pSD2组装
- 按照商业试剂盒随附的说明提取质粒DNA（材料表）。
- 为先前扩增和纯化的pSD1质粒和大观霉素盒设置BamHI限制性酶切。使用以下条件和数量如 表1所示。
- 将限制性酶切反应和对照在37°C孵育3小时。
- 通过电泳分析限制性内切物，切除条带并按照商业试剂盒提供的说明进行纯化（材料表）。
- 接下来，按照制造商说明（材料表）使用BamHI-消化的pSD1和大观霉素（来自步骤3.2）制备连接反应。在微量离心管中，加入以下反应组分：5 μL 2x 连接缓冲液、2 μL pSD1、2 μL 大观霉素盒、1 μL T4 DNA 连接酶，并在 4 °C 下孵育过夜。 生成质粒pSD2。
- 如步骤2.2中所述，将质粒pSD2转化为化学感受态大 肠杆菌 Dh5α。
- 根据携带质粒pSD2的转化体在补充有100μg/mL大观霉素和氨苄青霉素的LBA中生长的能力来选择转化体。
- 按照上述说明并按照制造商的说明（μL）进行质粒DNA提取（pSD2）。
4. 肺炎链球菌 菌株的转化 519/43
- 在BHI中制备肺炎链球菌519/43的过夜培养物，并使其在37°C，5%CO2下静态生长。
- 第二天，将培养物在 10 mL 新鲜 BHI 肉汤中以 1：50 和 1：100 稀释。在37°C下静态孵育培养物，直到OD595nm 在0.05和0.1之间（最佳DNA采集接近0.1 OD）。
- 一旦OD达到0.1，取860μL并转移到微量离心管中。在同一微量离心管中，添加：100 μL 100 mM NaOH、10 μL 20% （w/v） BSA、10 μL 100 mM CaCl 2、2 μL 50 ng/mL CSP124 和 500 ng pSD2。
- 将反应在37°C下静态孵育3小时。
- 将 330 μL 板铺在补充有 100 μg/mL 壮观霉素的 5% 血琼脂平板 （BA） 上，在 3 个孵育小时内每小时一次。
- 将板在37°C，5%CO2下孵育过夜。将大观霉素耐药菌落贴在补充有 100 μg/mL 大观霉素的另一块 BA 平板上以及补充有 100 μg/mL 氨苄西林的 BA 平板上。在上述条件下孵育两组板过夜。氨苄西林板用于测试质粒骨架的存在。
- 使用NOTI plyFw1_（TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATGG） 和SPEC_REV（TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG）的引物通过PCR确认大观霉素盒的存在。使用附着在突变区域外的引物plySCN1（CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA）和plySCN2（ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT）通过PCR确认突变。
- 通过使用引物plySCN1（CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA），plySCN2（ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT）以及引物及其在大观霉素盒sqr1（CCTGATCCAACATGTAGTAGTACC）sqf2（CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA）spec_sqf1（GGTACTTACATGTGTGGATCAGG）和spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG中的引物测序，确认基因组正确位置的整合。
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Representative Results
这里描述的方案首先使用PCR扩增左右同源臂，同时从 层 基因的中间区域删除191 bp。在进行PCR时，在左同源臂的3'和右同源臂的5'端引入BamHI位点（图1A）。接下来是PCR-SOE，其中左和右同源臂融合成一个扩增子（图1B）。然后将该SOE-PCR扩增子克隆到pGEMTeasy中使用TA克隆以生成质粒pSD1（图1C）。成功转化将产生对氨苄青霉素耐药的白色菌落。任何蓝色菌落都是含有空pGEMTeasy质粒的转化体。然后，pSD1将在SOE-PCR时引入的BamHI位点被消化（图1D）并连接到壮观霉素盒（也为兼容端消化BamHI）。新的质粒称为pSD2（图1E）。通过限制性酶切确认pSD2的正确组装（图2A）。pSD2作为自杀质粒工作，因为它不包含革兰氏阳性兼容的复制起源，用于转化519/43WT（先前准备胜任）。阳性转化体是在孵育过夜后在 100 μg/mL 壮观霉素上生长的菌落。将所有菌落贴在补充有 100 μg/mL 大观霉素的新新鲜血琼脂底板上以及补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素的血琼脂基板上。在补充有壮观霉素的第二个过夜平板上生长的任何菌落都是可能的阳性。在氨苄青霉素平板上生长的任何菌落都表示全质粒的整合或基因组中其他部位氨苄青霉素盒的重组。到目前为止，使用菌株519/43，补充有氨苄青霉素的平板上没有菌落生长。所有通过PCR阳性的菌落必须通过测序（图2C）来确认，以评估和确认插入的位置。为此，引物的结合位点必须在同源区之外（图2C）。所选靶标具有非常明显的表型（红细胞溶血（RBC）），因此突变也可以确认表型（图2B）。突变体失去了裂解红细胞的能力。
| 组件 | 反应（微升） | 对照（微升） | 反应（微升） | 对照（微升） |
| 缓冲区 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| pSD1 | 4 | 4 | - | |
| 大观霉素盒 | - | - | 6 | 6 |
| 砰 | 1 | - | 1 | - |
| 水 | 13 | 14 | 11 | 12 |
| 总体积 | 20 | 20 | 20 | 20 |
表1：pSD1和大观霉素盒的限制性酶切反应组分。
图 1：诱变策略概述。 A）同源臂的扩增（Ply3'和Ply5'（泳道2至5）;以及通过重叠延伸PCR（泳道6和7）进行剪接。L-超梯I（Bioline），泳道1-反应的阴性对照，泳道2和3-ply5'（488 bp）和ply3'（715 bp）同源臂从D39 gDNA扩增，泳道4和5-ply5'（488 bp）和ply3'（715 bp）同源臂从519/43 gDNA扩增。右侧泳道 6- D39 SOE PCR 产物，泳道 7- 519/43 SOE PCR 产物 （1235 bp）。 B）描述最终获得的SOE-PCR构建体的示意图（ply_SOE）;箭头表示的是用于获得两个同源臂之间的同源区以及所选的限制性酶切的引物。 C）质粒pSD1，描述ply_SOE的克隆; D）pSD1和壮观霉素盒的限制性消化。 E）最终构建pSD2，然后用作自杀质粒来转化 肺炎链球菌。 请点击此处查看此图的大图。
图2：A）确认pSD2中存在大观霉素盒。L-超级梯子1kb（生物线）;1-pSD1用BamHI消化;用BamHI消化的2-pSD2;L 超级梯 1 kb （生物线）;3-从pR412扩增的壮观霉素盒， 4-用BamHI消化的大观霉素盒; B） 通过测定 D39、519/43WT 和突变体 519/43Δply 的溶血活性来确认肺溶血素突变的表型确认。这与0.5%皂苷的红细胞溶血进行比较。皂苷来源的溶血被认为是100%，并针对它计算了519/43Wt和519/43Δply的比率。每个数据点是 5 次技术重复和 3 次生物重复的平均值。 C）测序数据映射到肺溶血素中断的突变基因组区域。引物以箭头和名称表示。PLYSCN1和PLYSCN2在同源臂外结合。从引物PLYSCN1和2获得的测序表明，在同源区之外的邻近区域存在不间断的序列，直到大观霉素盒，表明插入基因组。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
肺炎链球菌，特别是血清1型，仍然是引起侵袭性肺炎球菌疾病和脑膜炎的全球威胁。尽管在非洲引入了各种疫苗，可以预防血清型1，但这种血清型仍然能够引起导致高发病率和死亡率的暴发13。由于其临床相关性，遗传操纵这种血清型的能力至关重要。本研究中描述的方法允许对该血清型中的代表性菌株进行遗传操作。侵袭性菌株 519/43 （ST5316），一种来自丹麦脑膜炎患者的临床分离株25.
这里介绍的方法之所以成功，主要是由于所选择的菌株，因为它可以获得外源DNA，但也由于对用于 肺炎链球菌 转化的传统方案进行了更改，我们的转化方案的典型成功率约为70%。
使用这种方法，使用自杀质粒而不是通常的线性DNA至关重要。传统上，将使用线性DNA26，27，28;然而，所有以这种形式使用外源DNA的尝试都没有成功。此外，在较低吸光度下利用肺炎链球菌519/43的天然特性的尝试没有成功。故障排除表明，当OD595为0.1时，菌株519/43的自然能力更高，这与在非常低的OD24下观察到的最高自然能力的其他肺炎链球菌血清型的数据不同。
为了验证该方法的有效性，构建了一种肺溶血素突变体，因为它表现出易于遵循的表型;然而，为了证明该方法可以应用于该菌株内的任何基因，其他基因已被成功靶向（手稿正在准备中）。这种方法使用没有革兰氏阳性兼容起源的自杀载体，也可用于染色体互补，目的基因的过表达以及报告系统的引入，所有这些都通过使用相邻基因作为同源区域。
将遗传工具扩展到肺炎链球菌血清型1，菌株519/43很重要，因为我们现在可以直接遗传操纵代表性菌株。菌株 519/43 令人感兴趣，因为它具有遗传柔韧性，具有致病性，因为它是从脑膜炎患者中分离出来的，其操作将为更好地了解脑膜炎的发展和建立提供线索。以前，了解物种内的某些决定因素是通过将所讨论的基因插入一种特征很好的肺炎链球菌菌株中来完成的，例如D39（血清型2）。Paton等人使用了这种方法，因为血清型129的诱变困难。他们报告的结果与519/43层相比，携带血清型1层的溶血性等位基因较少∆与我们30提出的结果不同，突出了能够在原始菌株背景中突变基因的重要性。后来，同一组能够突变非谱系A血清型1菌株22。有趣的是，他们的方案与我们的方案截然不同，因为它是一种两步方法，要求首先在血清型2菌株中进行突变，然后将其用作在其血清型1菌株中转化的模板。
目前，所提出的方法存在一个限制。目前，此方法仅适用于 519/43 代表性菌株。在其他菌株中尝试了完全相同的方案，即来自ST3081和ST303的临床分离株，但没有成功。此外，在所有三种序列类型上也尝试了电穿孔作为将外源性DNA递送到细胞的方法，仅在519/43中观察到阳性结果。将该方法扩展到所有血清型1菌株并使其标准化至关重要，因为整个组存在巨大的差异。目前正在进行研究，以扩大该方法对血清型1内所有菌株的适用性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢脑膜炎信托基金和MRC为这项工作提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuPrime Pfx DNA polymerase | Invitrogen | 12344024 | Used for amplification of the fragments |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Used for bacterial selection on stage 1(pSD1) |
| Blood Agar Base | Oxoid | CM0055 | Used to plate S. pneumoniae transformants |
| Bovine Serum Albumine | sigma | 55470 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Brain Heart Infusion | Oxoid | CM1135 | used to grow S. pneumoniae cells |
| Calcium Chloride Cacl2 | Sigma | 449709 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Competence stimulating peptide 1 | AnaSpec | AS-63779 | used for S. pneumoniae Transformation |
| Luria Broth Agar | Gibco | 22700025 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Luria Broth Base (Miller's formulation) | Gibco | 12795027 | used for plating and selection of pSD1 and pSD2 |
| Monarch Gel Extraction Kit | NEB | T1020S | Used to extract the bands from the DNA gel |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Used to extract plasmid from the cells |
| pGEM T-easy | Promega | A1360 | used as suicide plasmid |
| S.O.C. | Invitrogen | 15544034 | used for recovery of cells after transformation |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S0899 | used for S.pneumoniae Transformation |
| Spectinomycin Hydrochloride | SigmaAldrich | PHR1426 | Used for bacterial selection |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265017 | used for the creation of pSD1 and pSD2 |
References
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